CN115308331B - 一种采用一测多评法测定白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方颗粒中5种成分含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种采用一测多评法测定白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方颗粒中5种成分含量的方法，属于白花蛇舌草含量检测技术领域。该方法，先分别制备去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸、对香豆酸的对照品溶液，采用HPLC检测得到5种对照品的回归方程，以对香豆酸为内参物，计算其余四种组分的相对校正因子；并对白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方颗粒的供试品溶液，使用对香豆酸为对照品，根据相对校正因子，计算得到去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸和车叶草苷酸的含量。该方法为白花蛇舌草配方颗粒的质量控制标准提供了依据，便于白花蛇舌草配方颗粒生产和检测的进行。

Description

一种采用一测多评法测定白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方 颗粒中5种成分含量的方法
技术领域
本申请涉及一种采用一测多评法测定白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方颗粒中5种成分含量的方法，属于白花蛇舌草含量检测技术领域。
背景技术
中药饮片是中医药发挥临床疗效的重要药用物质，其安全性、有效性已得到广泛认可，其习用方式以汤剂为主。单味中药配方颗粒是单味中药饮片的水提物，为使中药配方颗粒能够承载中药饮片的安全性、有效性，需要以标准汤剂为桥接，该标准汤剂为衡量单味中药配方颗粒是否与其相对应的单味中药饮片临床汤剂基本一致的物质基准。标准汤剂中的“标准”主要涵盖了投料中药饮片的道地性、提取工艺的统一性及质量控制的严谨性。
为规范中药配方颗粒的质量控制与标准研究，2021年2月国家局发布《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，明确了标准汤剂制备与其在制剂标准研究建立中的应用方法，从而为中药配方颗粒质量标准研究制订和全过程质量控制提供了新的思路和方法。
白花蛇舌草植物来源为茜草科耳草属植物白花蛇舌草HedyotisdiffusaWilld.的干燥全草。其味苦、甘，性寒；归心、肝、脾经，具有清热、利湿、解毒等功效，临床用于肺热咳喘，扁桃体炎，咽喉炎，阑尾炎，痢疾，黄疸，***，***。外用疮疖臃肿，毒蛇咬伤。白花蛇舌草的化学组分比较复杂，含有萜类、酚酸类、多糖、蒽醌类、黄酮类等多种化合物。其中去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、车叶草苷酸、原儿茶酸、对香豆酸是其主要的有效成分。白花蛇舌草配方颗粒目前各省标准均为去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、车叶草苷酸3成分含量测定，经文献研究和分析发现，单纯以去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、车叶草苷酸含量难以全面评价白花蛇舌草标准汤剂及配方颗粒的质量现状。随着临床应用和研究的深入，建立科学合理、方便可行的质控方法对于控制白花蛇舌草标准汤剂及其配方颗粒质量、保障临床疗效具有重要的意义。
发明内容
为了解决上述问题，提供了一种采用一测多评法测定白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方颗粒中5种成分含量的方法，该方法以对香豆酸为内参物，能够快速检测白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方颗粒中去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸、对香豆酸的含量，为白花蛇舌草配方颗粒的质量控制标准提供了依据，便于白花蛇舌草配方颗粒生产和检测的进行。
本申请提供了一种采用一测多评法测定白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方颗粒中5种成分含量的方法，包括下述步骤：
(1)精密称定去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸、对香豆酸对照品适量，制备5种对照品溶液；
(2)精密吸取步骤(1)制备的5种对照品溶液，分别采用HPLC检测，得到5种对照品的回归方程，以对香豆酸为内参物，计算去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸和车叶草苷酸的相对校正因子；
(3)取白花蛇舌草标准汤剂或配方颗粒制备供试品溶液，制备对香豆酸对照品溶液，采用HPLC检测得到色谱图，以对香豆酸对照品的峰面积为对照，按照步骤(2)中的相对校正因子，分别计算得到去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸和车叶草苷酸的含量。
可选地，所述HPLC检测中，按对香豆酸计算，理论板数不低于3000，该设置下色谱峰较好，便于5种成分含量的定量计算。
可选地，所述相对校正因子的计算公式为式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0003796108030000031
其中，Ws为对香豆酸的浓度，As为对香豆酸的峰面积，Wk为待测组分的浓度，Ak为待测组分的峰面积；s为对香豆酸，k为待测组分，fs为对香豆酸的校正因子，fk为待测组分的校正因子。
可选地，所述对香豆酸的保留时间差为0.00，相对校正因子为1.00；
所述去乙酰车叶草酸的保留时间差为-22.16，相对校正因子为1.72；
所述去乙酰车叶草酸甲酯的保留时间差为-15.01，相对校正因子为0.96；
所述原儿茶酸的保留时间差为-14.01，相对校正因子为0.77；
所述车叶草苷酸的保留时间差为-11.28，相对校正因子为1.30。
可选地，步骤(2)中，计算所得的去乙酰车叶草酸的相对校正因子的RSD为0.77％，去乙酰车叶草酸甲酯的相对校正因子的RSD为0.88％，原儿茶酸的相对校正因子的RSD为1.48％，车叶草苷酸的相对校正因子的RSD为0.78％。
可选地，所述HPLC检测的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长240nm，流速为每分钟1ml，柱温为35℃。
可选地，所述梯度洗脱具体条件为：
0～32分钟，流动相A：2％～26％，流动相B：98％～74％；
32～40分钟，流动相A：26％～80％，流动相B：74％～20％。
可选地，步骤(3)中，所述供试品溶液的制备方法为：
将白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方颗粒研磨为细粉，精密称定0.2g，置具塞锥形瓶中，加入30％甲醇25ml，称定重量，超声处理45分钟，冷却，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得所述供试品溶液。
可选地，所述白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方颗粒研磨后细粉的粒径小于0.212mm。
可选地，步骤(3)中，将对香豆酸溶于甲醇中，得到浓度为25μg/ml的对香豆酸对照品溶液。
可选地，将去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸、对香豆酸5种对照品溶于甲醇中，分别得到浓度为1.313mg/ml的去乙酰车叶草酸对照品溶液、0.9418mg/ml的去乙酰车叶草酸甲酯对照品溶液、0.9934mg/ml的原儿茶酸对照品溶液、0.6835mg/ml的车叶草苷酸对照品溶液、1.0145mg/ml的对香豆酸对照品溶液。
可选地，步骤(2)中，去乙酰车叶草酸的回归方程为y＝12.506x+0.8846，去乙酰车叶草酸甲酯的回归方程为y＝14.83x-0.9566，原儿茶酸的回归方程为y＝16.486x-0.658，车叶草苷酸的回归方程为y＝13.03x+3.8627，对香豆酸的回归方程为y＝14.225x+3.0779。
本申请的有益效果包括但不限于：
1.根据本申请的采用一测多评法测定白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方颗粒中5种成分含量的方法，能够确定对香豆酸与去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸之间的相对校正因子，采用对香豆酸一种对照品，即可实现5种成分含量的定量检测，提高检测效率。
2.根据本申请的采用一测多评法测定白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方颗粒中5种成分含量的方法，HPLC检测的条件稳定性、重复性、精密度和可靠性好，检测结果准确，适用于大批量检测白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方颗粒。
3.根据本申请的采用一测多评法测定白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方颗粒中5种成分含量的方法，快速便捷的测定出白花蛇舌草配方颗粒中主要起药理作用的成分，为白花蛇舌草药材、饮片、制剂的质量控制提供了依据，可根据检测结果优化白花蛇舌草配方颗粒的制备流程，从而提高产品质量。
4.根据本申请的采用一测多评法测定白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方颗粒中5种成分含量的方法，能够定量检测白花蛇舌草中的5种重要成分，有利于对白花蛇舌草进行***化分析，为白花蛇舌草配方颗粒的药理学研究提供了研究方向。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为本申请实施例1涉及的回流和超声提取方法得到的供试品溶液的色谱图。
图2为本申请实施例2涉及的专属性验证中各样品的色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料和仪器如下：
仪器：
Agilent1260高效液相色谱仪，Waters e2695高效液相色谱仪，BSA224S-CW电子天平(赛多利斯科技仪器(北京)有限公司)，XS105电子天平(METTLERTOLEDO)，KQ-300DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：Inertsil ODS-3SN：20G0129098(4.6*250mm，5μm)
Inertsil ODS-3SN：21E0206484(4.6*250mm，5μm)。
药品：
去乙酰车叶草酸对照品(批号：ST19450220，上海诗丹德标准技术服务有限公司，纯度，95.0％)；
去乙酰车叶草酸甲酯对照品(批号：ST80910105，上海诗丹德标准技术服务有限公司，纯度，98.0％)；
原儿茶酸对照品(批号：200440，江苏永健医药科技有限公司，纯度，94.7％)；
车叶草苷酸对照品(批号：ST80910105，上海诗丹德标准技术服务有限公司，纯度，98.0％)；
对香豆酸对照品(批号：112037-202102，中国食品药品检定研究院)。
试剂：
乙腈(Fisher Chemical)、甲酸(Fisher Scientific)为色谱纯，甲醇为分析纯，水为屈臣氏纯化水。
白花蛇舌草标准汤剂冻干粉的制备方法为：
称取白花蛇舌草饮片100g，置于砂锅中，浸泡30分钟，煎煮两次，第一次加24倍量水，武火煮沸后再改为文火煎煮20分钟，滤过，滤液备用；第二次加20倍量水，武火煮沸后再文火煎煮15分钟，滤过，合并两次滤液，混匀；减压浓缩至料液比约为1:1的清膏，冷冻干燥，即得。采用同样的方法分批次制备标准汤剂冻干粉，分别命名为冻干粉1#-15#。
白花蛇舌草配方颗粒的制备方法为：
取白花蛇舌草饮片6250g，加水煎煮，滤过，滤液浓缩成清膏，干浸膏出膏率为8.0％～15.0％，加入辅料0～500g，干燥并粉碎，混匀，制粒，制成1000g，即得。采用同样的方法分批次制备白花蛇舌草配方颗粒，分别命名为配方颗粒1#-3#。
实施例1
本实施例涉及白花蛇舌草标准汤剂冻干粉和配方颗粒提取方法的研究，以确定白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方颗粒的最佳提取条件，由于白花蛇舌草标准汤剂冻干粉和配方颗粒的性质相同，下述仅以白花蛇舌草配方颗粒为例进行研究。
HPLC检测条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)，以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长240nm，流速为每分钟1ml，柱温为35℃，对不同提取液进行检测。
5种对照品储备液：将去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸、对香豆酸5种对照品溶于甲醇中，分别得到浓度为1.313mg/ml的去乙酰车叶草酸对照品溶液、0.9418mg/ml的去乙酰车叶草酸甲酯对照品溶液、0.9934mg/ml的原儿茶酸对照品溶液、0.6835mg/ml的车叶草苷酸对照品溶液、1.0145mg/ml的对香豆酸对照品溶液。
混合对照品溶液：取1ml去乙酰车叶草酸对照品溶液、1ml去乙酰车叶草酸甲酯对照品溶液、0.5ml原儿茶酸对照品溶液、1ml车叶草苷酸对照品溶液、0.5ml对香豆酸对照品溶液至25ml量瓶中，甲醇定容至刻度，得混合对照品溶液。
(1)提取方法
取白花蛇舌草配方颗粒1#0.2g，使用30％甲醇做提取溶剂，分别采用加热回流和超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟制备供试品溶液，注入液相色谱仪进行测定，计算去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸、对香豆酸的含量，结果见表1和图1，图1中上方曲线为回流提取方式得到的供试品溶液检测所得的色谱图，下方曲线为超声提取方式得到的供试品溶液检测所得的色谱图，能够得知，超声提取各待测成分含量较高，故选择提取方式为超声提取。
表1提取方式
Figure BDA0003796108030000071
(2)提取溶剂
取白花蛇舌草配方颗粒1#0.2g，分别采用5％甲醇、30％甲醇、50％甲醇、80％甲醇、甲醇超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟制备供试品溶液，测定供试品峰面积，计算去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸、对香豆酸的含量，结果见表2，不同提取溶剂对各成分影响较大，综合分析各待测成分含量，采用30％甲醇提取时各待测成分提取相对更完全，故选择提取溶剂为30％甲醇。
表2提取溶剂
Figure BDA0003796108030000081
(3)提取时间
取白花蛇舌草配方颗粒1#0.2g，使用25ml 30％甲醇做溶剂，在功率250W和频率40kHz下分别超声处理30分钟、45分钟、60分钟，制备供试品溶液，测定供试品峰面积，计算去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸、对香豆酸的含量。结果见表3，超声时间为45分钟时各待测成分含量较高，故选择超声时间为45分钟。
表3提取时间
Figure BDA0003796108030000082
(4)样品称样量
分别取白花蛇舌草配方颗粒1#0.1g、0.2g、0.5g，使用25ml 30％甲醇做提取溶剂，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定，计算去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸、对香豆酸的含量，结果见表4，不同样品称样量对各待测成分含量影响不大，最终选择样品称样量为0.2g。
表4样品重量
Figure BDA0003796108030000083
Figure BDA0003796108030000091
实施例2
本实施例涉及HPLC检测条件的方法学验证，本实施例中HPLC检测条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)，以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长240nm，流速为每分钟1ml，柱温为35℃。
根据实施例1的分析确定本实施例中供试品溶液的制备方法为：将白花蛇舌草配方颗粒研磨为细粉，过65目筛，精密称定0.2g，置具塞锥形瓶中，加入30％甲醇25ml，称定重量，超声处理45分钟，冷却，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
分别精密称定去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸、对香豆酸对照品适量，分别加甲醇制成浓度为1.313mg/ml、0.9418mg/ml、0.9934mg/ml、0.6835mg/ml、1.0145mg/ml的对照品储备液。
精密吸取去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸、对香豆酸对照品储备液各1ml至5ml量瓶中，制成浓度分别为262.58μg/ml、188.36μg/ml、198.68μg/ml、136.7μg/ml、202.9μg/ml的混合对照品溶液①；
精密吸取混合对照品溶液①1ml置2ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，计为混合对照品溶液②；
精密吸取混合对照品溶液②1ml置2ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，计为混合对照品溶液③；
精密吸取混合对照品溶液③2ml置5ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，计为混合对照品溶液④；
精密吸取混合对照品溶液④2ml置5ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，计为混合对照品溶液⑤。
精密吸取混合对照品溶液①～⑤各10μl，注入高效液相色谱仪，以对照品浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表5。
表5 5种成分线性关系及线性范围
成分 回归方程 相关系数r 线性范围(μg/ml)
去乙酰车叶草酸 y＝12.506x+0.8846 0.9996 13.129-328.225
去乙酰车叶草酸甲酯 y＝14.83x-0.9566 0.9998 9.4178-941.78
原儿茶酸 y＝16.486x-0.658 0.9996 9.934-993.403
车叶草苷酸 y＝13.03x+3.8627 0.9991 5.468-136.710
对香豆酸 y＝14.225x+3.0779 1.0000 10.145-1014.500
(1)专属性验证
取白花蛇舌草配方颗粒所使用的辅料(糊精)适量，按照上述供试品溶液的制备方法制备成阴性对照溶液；采用实施例1制备的混合对照品溶液作对照；采用30％甲醇溶剂作空白溶剂。
将上述供试品溶液、阴性对照溶液、混合对照品溶液、空白溶剂进行HPLC检测得到获得其色谱图，结果见图2，阴性对照溶液与空白溶剂在去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸、对香豆酸保留时间处无色谱峰，证明本申请HPLC检测方法的专属性良好。
(2)重复性试验
平行制备6份供试品溶液，进行HPLC检测，采用实施例1制备的混合对照品溶液作对照，结果见表6。去乙酰车叶草酸含量的RSD为1.05％，去乙酰车叶草酸甲酯含量的RSD为0.47％，原儿茶酸含量的RSD为2.20％，车叶草苷酸含量的RSD为0.26％，对香豆酸含量的RSD为2.86％，证明本申请的HPLC检测条件重复性较好，符合分析要求。
表6重复性试验
Figure BDA0003796108030000101
Figure BDA0003796108030000111
(3)中间精密度
平行制备6份供试品溶液，不同分析人员在不同时间利用另一台高效液相色谱仪，进行重复性试验，采用实施例1制备的混合对照品溶液作对照，结果见表7，不同仪器测定白花蛇舌草配方颗粒中去乙酰车叶草酸含量的RSD为1.07％，去乙酰车叶草酸甲酯含量的RSD为0.72％，原儿茶酸含量的RSD为2.16％，车叶草苷酸含量的RSD为0.02％，对香豆酸含量的RSD为1.58％，符合分析要求。
表7中间精密度
Figure BDA0003796108030000112
(4)回收率
将白花蛇舌草配方颗粒研磨为细粉，过四号筛，精密称定0.1g，置具塞锥形瓶中，加入30％甲醇25ml，称定重量，超声处理45分钟，冷却，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液，采用实施例1制备的混合对照品溶液作对照。在供试品溶液中分别加入去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸、对香豆酸对照品溶液适量，测定5种成分的含量，并计算回收率，每种成分做6组平行实验。
结果表明见表8-12，去乙酰车叶草酸回收率在95.04％～101.94％之间，去乙酰车叶草酸甲酯回收率在98.69％～104.17％之间，原儿茶酸回收率在98.09％～101.62％之间，车叶草苷酸回收率在98.30％～102.10％之间，对香豆酸回收率在100.39％～104.78％之间，证明本申请的HPLC检测条件符合分析要求。
回收率的计算公式如下：
回收率(％)＝[(实测值-供试品中所含被测成分的量)/对照品中所含被测组分的量]×100％
表8去乙酰车叶草酸回收率
Figure BDA0003796108030000121
表9去乙酰车叶草酸甲酯回收率
Figure BDA0003796108030000122
表10原儿茶酸回收率
Figure BDA0003796108030000123
表11车叶草苷酸回收率
Figure BDA0003796108030000131
表12对香豆酸回收率
Figure BDA0003796108030000132
(5)稳定性
将制备的供试品溶液，分别在第0h、2h、4h、8h、12h、24h各进样一次，采用实施例1制备的混合对照品溶液作对照，测定样品中待测组分含量，计算RSD，结果见表13，在24小时之内，去乙酰车叶草酸含量的RSD为0.92％，去乙酰车叶草酸甲酯含量的RSD为0.84％，原儿茶酸含量的RSD为1.83％，车叶草苷酸含量的RSD为0.47％，对香豆酸含量的RSD为0.44％，证明本实施例制备的供试品溶液稳定性良好，符合分析要求。
表13稳定性
Figure BDA0003796108030000133
实施例3
本实施例涉及相对校正因子的计算及重现性考察，按照表5中5种成分的标准曲线和回归方程，以对香豆酸为内参物，计算去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸的相对校正因子，相对校正因子的计算公式为式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0003796108030000141
其中，Ws为对香豆酸的浓度，As为对香豆酸的峰面积，Wk为待测组分的浓度，Ak为待测组分的峰面积；s为对香豆酸，k为待测组分，fs为对香豆酸的校正因子，fk为待测组分的校正因子。取实施例2项下不同浓度混合对照品溶液①-⑤，注入液相色谱仪，测定，以对香豆酸为内参物，计算去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸的相对校正因子，测试结果见表14。
表14相对校正因子
Figure BDA0003796108030000142
(1)不同仪器和色谱柱对相对校正因子的影响
分别采用不同的仪器和不同色谱柱对相对校正因子进行测定，HPLC的检测条件与实施例1相同，供试品溶液的制备方法与实施例2相同，采用实施例1的混合对照品溶液作对照，结果见表15，测得的相对校正因子RSD值在0.74％～1.23％之间，表明各待测组分相对校正因子在不同仪器和不同色谱柱之间重现性良好。
表15不同仪器和不同色谱柱对待测成分相对校正因子的影响
Figure BDA0003796108030000151
(2)不同流速
分别采用不同流速对相对校正因子进行测定，HPLC的其余检测条件与实施例1相同，供试品溶液的制备方法与实施例2相同，采用实施例1的混合对照品溶液作对照，结果见表16，测得的相对校正因子RSD值在0.61％～1.23％之间，表明各待测组分相对校正因子在不同流速之间重现性良好。
表16不同流速对待测成分相对校正因子的影响
Figure BDA0003796108030000152
(3)不同柱温
分别采用不同柱温对相对校正因子进行测定，HPLC的其余检测条件与实施例1相同，供试品溶液的制备方法与实施例2相同，采用实施例1的混合对照品溶液作对照，结果见表17，测得的相对校正因子RSD值在0.74％～1.04％之间，表明各待测组分相对校正因子在不同柱温之间重现性良好。
表17不同柱温对待测成分相对校正因子的影响
Figure BDA0003796108030000161
实施例4
本实施例涉及待测组分色谱峰定位，计算实施例1中去乙酰车叶草酸对照品溶液、去乙酰车叶草酸甲酯对照品溶液、原儿茶酸对照品溶液、车叶草苷酸对照品溶液与内参物对香豆酸的相对保留值(r)与保留时间差(ΔtR)，HPLC检测条件与实施例1相同，并考察其在不同仪器和不同色谱柱之间的重现性，结果见表18-19，保留时间差波动较小，最终选择不同仪器和不同色谱柱中各待测成分的保留时间差值的平均值作为峰定位依据。
表18不同仪器和不同色谱柱中各待测成分的相对保留时间
Figure BDA0003796108030000162
表19不同仪器和不同色谱柱中各待测成分的保留时间差
Figure BDA0003796108030000163
Figure BDA0003796108030000171
实施例5
本实施例涉及一测多评法和外标法的测定结果验证，分别取白花蛇舌草标准汤剂冻干粉1#-15#及白花蛇舌草配方颗粒1#-3#，供试品溶液的制备方法为：
将白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方颗粒研磨为细粉，过65目筛，精密称定0.2g，置具塞锥形瓶中，加入30％甲醇25ml，称定重量，超声处理45分钟，冷却，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。HPLC的测试条件与实施例1相同。
一测多评法(QAMS)：配制浓度为25μg/ml的对香豆酸对照品溶液，根据表14中计算的相对校正因子的平均值计算去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸、对香豆酸的含量。
外标法(ESM)：采用实施例1的混合对照品溶液作对照，取混合对照品溶液和供试品溶液各进样10μl，计算去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸、对香豆酸的含量。
上述两种方法检测的供试品溶液中5种成分的含量见表20，外标法与一测多评法计算的含量经t检验比较，P远大于0.05，表明两种方法测得的含量无明显差异，且两组含量之间相对误差<3％，表明本申请所建立的一测多评方法准确性良好，可用于白花蛇舌草配方颗粒及标准汤剂冻干粉的含量测定。表20中RE表示相对误差。
表20一测多评法与外标法测定5种成分含量
Figure BDA0003796108030000172
/>
Figure BDA0003796108030000181
以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种采用一测多评法测定白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方颗粒中5种成分含量的方法，其特征在于，包括下述步骤：
（1）精密称定去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸、对香豆酸，分别制备5种对照品溶液；
（2）精密吸取步骤（1）制备的5种对照品溶液，分别采用HPLC检测，得到5种对照品的回归方程，以对香豆酸为内参物，计算去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸和车叶草苷酸的相对校正因子；
（3）取白花蛇舌草标准汤剂或配方颗粒制备供试品溶液，所述供试品溶液由30%甲醇溶剂提取得到，制备对香豆酸的对照品溶液，采用HPLC检测得到色谱图，以对香豆酸对照品的峰面积为对照，按照步骤（2）中的相对校正因子，分别计算得到去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸和车叶草苷酸的含量；
所述HPLC检测以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱具体条件为：
0~32分钟，流动相A：2%~26%，流动相B：98%~74%；
32~40分钟，流动相A：26%~80%，流动相B：74%~20%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述相对校正因子的计算公式为式（Ⅰ）所示：
Figure QLYQS_1
式（Ⅰ），
其中，Ws为对香豆酸的浓度，As为对香豆酸的峰面积，Wk为待测组分的浓度，Ak为待测组分的峰面积；s为对香豆酸，k为待测组分，fs为对香豆酸的校正因子，fk为待测组分的校正因子。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述对香豆酸的保留时间差为0.00，相对校正因子为1.00；
所述去乙酰车叶草酸的保留时间差为-22.16，相对校正因子为1.72；
所述去乙酰车叶草酸甲酯的保留时间差为-15.01，相对校正因子为0.96；
所述原儿茶酸的保留时间差为-14.01，相对校正因子为0.77；
所述车叶草苷酸的保留时间差为-11.28，相对校正因子为1.30。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，计算所得的去乙酰车叶草酸的相对校正因子的RSD为0.77%，去乙酰车叶草酸甲酯的相对校正因子的RSD为0.88%，原儿茶酸的相对校正因子的RSD为1.48%，车叶草苷酸的相对校正因子的RSD为0.78%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HPLC检测的条件为：检测波长240nm，流速为每分钟1ml，柱温为35℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述供试品溶液的制备方法为：
将白花蛇舌草标准汤剂冻干粉或配方颗粒研磨为细粉，精密称定0.2g，置具塞锥形瓶中，加入30%甲醇25ml，称定重量，超声处理45分钟，冷却，用30%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得所述供试品溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，将对香豆酸溶于甲醇中，得到浓度为25µg/ml的对香豆酸对照品溶液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，将去乙酰车叶草酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、车叶草苷酸、对香豆酸5种对照品溶于甲醇中，分别得到浓度为1.313mg/ml的去乙酰车叶草酸对照品溶液、0.9418mg/ml的去乙酰车叶草酸甲酯对照品溶液、0.9934mg/ml的原儿茶酸对照品溶液、0.6835mg/ml的车叶草苷酸对照品溶液、1.0145mg/ml的对香豆酸对照品溶液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，去乙酰车叶草酸的回归方程为y =12.506x+0.8846，去乙酰车叶草酸甲酯的回归方程为y=14.83x-0.9566，原儿茶酸的回归方程为y=16.486x+0.658，车叶草苷酸的回归方程为y=13.03x+3.8627，对香豆酸的回归方程为y=14.225x+3.0779。
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