CN111164215A - 用于从发酵液产生有机酸盐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于产生丁酸盐、乳酸盐、丙酸盐、戊酸盐、乙酸盐、乙醇酸盐、山梨酸盐、延胡索酸盐、甲酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、所述有机酸的衍生物的盐及其混合物的方法,所述方法包括至少以下连续步骤:·i)在足以获得包含所述有机酸的发酵液的时间内在包含碳源和氮源的适当培养基中培养微生物;·ii)预处理所述发酵液,至少包括澄清所述发酵液和通过蒸发经澄清的发酵液然后冷凝含有有机酸的挥发性级分来分离有机酸(CVAF);·v)向CVAF添加无机碱;·vii)除去CVAF的残留水,并回收所述有机酸盐。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于从发酵液以高纯度发酵产生有机酸盐的方法。
背景技术
有机酸被定义为在碳骨架上构建的化合物,它含有具有酸性性质(通常比无机酸弱)的官能团。
有机酸作为微生物、植物或动物组织的正常成分在自然界中广泛分布。它们是在碳水化合物的代谢期间、通过微生物发酵,以及在氨基酸和其他有机化合物的降解期间产生的。
由于已经确定了若干工业用途,因此有机酸及其衍生物的可用性具有重大的经济意义。
有机酸(诸如琥珀酸和乳酸)可用于产生可生物降解的聚合物。乙醇酸用于制备聚乙醇酸和其他生物相容性共聚物(如PLGA)。
有机酸由于其抗细菌活性从而可用于食物保存。
此外,在动物饲养中成功使用有机酸代替了抗生素,并且未产生同样的健康问题。在2006年欧洲禁止使用抗生素生长促进剂之后,在动物营养中有机酸的使用在饲料行业中已获得显著的重要性。在有机酸中,丁酸由于其减少病原细菌定殖的显著能力而显得特别重要。
有机酸可以从天然来源中分离,通过化学合成来产生,或通过微生物发酵来获得。
有利地,微生物发酵可以允许在微生物的基因工程后产生有机酸的特定对映异构体(L或D),这些分离的异构体(L或D)各自表现出特定的特征,如例如异构体L-乳酸和D-乳酸。
为了提高有机酸产生的收率,还使用了微生物的遗传修饰。
另外,已对培养过程进行了改善,例如控制用于产生乙醇酸的发酵培养基的pH(WO2011/036213)。
为了优化所产生的有机酸的回收,已经开发了用于纯化和回收这些有机酸的不同技术。
EP 1 094 054和EP 350 355分别公开了对于分离和纯化通过发酵产生的乳酸和丁酸的方法。
US 4,490,295公开了一种用于从克拉维链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的发酵液中产生克拉维酸及其锂盐的方法。已经观察到,如果克拉维酸被预先转化为可以在几乎不与杂质一起共沉淀的情况下沉淀出来的其盐即克拉维酸锂,即可大大地促进克拉维酸的分离。
有机酸盐是有机酸与一种或多种阳离子的共轭碱的结合形式,其为电中性。
有机酸盐比其对应的有机酸更易于回收,并且还可用作诸如动物饲料的添加剂。
US 2004/0048344涉及一种用于产生D-泛酸盐的方法,该方法包括以下步骤:
-发酵特定微生物(优选地来自芽孢杆菌(Bacillus)属);
-使发酵液通过阳离子交换剂,通过与阳离子分离来形成游离的泛酸;
-添加钙碱和/或镁碱以将pH调节至3-10,从而获得泛酸钙盐和/或泛酸镁盐;
-使溶液进行干燥和/或调配。
US 2004/0077057公开了一种用于产生D-泛酸盐的方法,该方法包括以下步骤:
-发酵特定微生物(优选地来自芽孢杆菌(Bacillus)属);
-使发酵液通过阴离子交换剂;
-使用含有盐(钙盐和/或镁盐)的溶液或HCl溶液来洗脱与阴离子交换剂结合的D-泛酸盐;
-使洗脱液进行干燥和/或调配。
所有这些技术都涉及发酵液的直接处理。然而,有机酸在发酵培养基中被稀释,即它们以在约0.1%和约10%之间的包含浓度存在,因此在该方法结束时,所回收的有机酸盐的收率较低。
包括例如通过超滤来澄清发酵液的步骤的方法此前已有所报道。
专利US 3,720,584涉及一种用于从节杆菌(Arthrobacter)属、产碱杆菌(Alcaligenes)属或镰孢菌(Fusarium)属微生物的经澄清的发酵液产生羧酸盐(尤其是乳酸盐)的方法。然而,该方法不包括经澄清的发酵液的蒸发步骤,因此有机酸在经处理的培养基中仍然是高度稀释的。
此外,专利申请CN101475464和WO 2013/169447公开了从发酵液产生琥珀酸盐的方法,这些方法包括澄清所述发酵液的步骤。然而,这些方法不涉及选自以下的有机酸盐的产生:丁酸盐、乳酸盐、丙酸盐、戊酸盐、乙酸盐、乙醇酸盐、山梨酸盐、延胡索酸盐、甲酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、其衍生物和混合物。
最后,通过已知的方法,所回收的有机酸盐的纯度较低,因为未经处理的发酵培养基中的杂质和副产物的水平是显要的。
本申请旨在提高从发酵液回收的有机酸盐的收率和纯度,所述有机酸盐选自丁酸盐、乳酸盐、丙酸盐、戊酸盐、乙酸盐、乙醇酸盐、山梨酸盐、延胡索酸盐、甲酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、所述有机酸的衍生物的盐以及其混合物。
发明内容
本发明涉及一种产生有机酸盐的方法,该方法包括至少以下连续步骤:
i)在足以获得包含有机酸的发酵液的时间内在包含碳源和氮源的适当培养基中培养微生物;
ii)通过至少以下步骤来预处理所述发酵液:
a.澄清发酵液;
b.任选地,调节经澄清的发酵液的pH;以及
c.通过蒸发经澄清的发酵液然后冷凝含有所述有机酸的挥发性级分(此后被称为冷凝的挥发性酸级分(CVAF))来分离有机酸;
iii)任选地,使CVAF通过能够结合铵阳离子的阳离子交换剂;
iv)任选地,使CVAF或阳离子树脂处理的级分通过能够结合所述有机酸的共轭碱的阴离子交换剂;
v)将无机碱添加至所述CVAF或所述阳离子树脂处理的级分或所述阴离子交换剂,以洗脱结合的共轭碱;
vi)除去CVAF或阳离子树脂处理的级分或洗脱液的残留水,并回收所形成的有机酸盐,
其中所述有机酸盐选自:丁酸盐、乳酸盐、丙酸盐、戊酸盐、乙酸盐、乙醇酸盐、山梨酸盐、延胡索酸盐、甲酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、所述有机酸的衍生物的盐以及其混合物。
有趣的是,本文公开的用于从发酵液回收有机酸盐的方法包括步骤(ii)发酵液的预处理:在该预处理期间,(a)澄清发酵液,(b)任选地,调节发酵液的pH,并且(c)使发酵液进行蒸发/冷凝步骤,该步骤允许分离挥发性有机酸并除去废料,尤其是盐和重化合物(heavy compound)(无机盐、糖......)。
这些预处理步骤允许在进行有机酸盐生成的步骤(v)和(vi)之前浓缩溶液中的有机酸。
发酵液的这些预处理步骤的使用显著提高了所回收的有机酸盐的收率和纯度。此外,该方法允许增加其他发酵方法的收益:根据本发明的用于产生有机酸盐的方法允许使用来源于其他方法的废水,这些废水将成为有价值的产品。
本发明还涉及诸如通过如上文所述的方法获得的至少两种有机酸盐的混合物。
这种至少两种有机酸盐的混合物的特征尤其在于如下事实:丁酸盐及其衍生物是所述混合物的主要成分。
附图说明
图1.根据方案1的方法中包括的步骤的示意图
图2.根据方案2的方法中包括的步骤的示意图
图3.根据方案3的方法中包括的步骤的示意图
图4.根据方案4的方法中包括的步骤的示意图
图5.根据方案5的方法中包括的步骤的示意图
具体实施方式
在详细描述本发明之前,应当理解,除非另外指明,否则本发明的实践采用在本领域的技术范围内的常规微生物和化学纯化技术。此类技术是技术人员熟知的,并且在文献中有充分说明。
此外,在权利要求和本发明的描述中,除上下文由于明确的语言或必要的含义另外要求之外,否则词语“包含”、“涉及”或“包括”或变化形式(诸如“含有”)以包含的含义使用,即,以指定所述特征的存在,但不排除在本发明的多个实施方案中存在或添加其他特征。
在权利要求和描述中,术语“过程”和“方法”可互换使用。
本发明涉及一种产生有机酸盐的方法,该方法包括至少以下连续步骤:
i)在足以获得包含有机酸的发酵液的时间内在包含碳源和氮源的适当培养基中培养微生物;
ii)通过至少以下步骤来预处理所述发酵液:
a.澄清发酵液;
b.任选地,调节经澄清的发酵液的pH;以及
c.通过蒸发经澄清的发酵液然后冷凝含有所述有机酸的挥发性级分(此后被称为冷凝的挥发性酸级分(CVAF))来分离有机酸;
iii)任选地,使CVAF通过能够结合铵阳离子的阳离子交换剂;
iv)任选地,使CVAF或阳离子树脂处理的级分通过能够结合有机酸的共轭碱的阴离子交换剂;
v)将无机碱添加至所述CVAF或所述阳离子树脂处理的级分或所述阴离子交换剂,以洗脱结合的共轭碱;
vi)除去CVAF(冷凝的挥发性酸级分)或阳离子树脂处理的级分或洗脱液的残留水,并回收所形成的有机酸盐,
其中所述有机酸盐选自:丁酸盐、乳酸盐、丙酸盐、戊酸盐、乙酸盐、乙醇酸盐、山梨酸盐、延胡索酸盐、甲酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、所述有机酸的衍生物的盐以及其混合物。
有机酸
术语“有机酸”通常是指具有酸性性质的有机化合物。该术语尤其包括羧酸和含有基团-SO2OH的磺酸。
最常见的有机酸是羧酸,羧酸的特征是存在由两个官能团组成的羧基基团(-COOH):即与羰基基团(C=O)键合的羟基基团(-OH)。有机酸以简式R-COOH书写。根据碳骨架(R)的结构,羧酸包括脂肪族羧酸、芳族羧酸和脂环族羧酸。
发酵液中常见的有机酸如下:乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酸、丁酸、甲基丁酸、羟基丁酸、氨基丁酸(尤其是GABA、γ-氨基丁酸)、戊酸、甲酸、天冬氨酸、延胡索酸、草酸、乳清酸、酮戊二酸类、柠檬酸、谷氨酸、乙醛酸、乙醇酸、丙酮酸、苹果酸、山梨酸和酒石酸。
有机酸以两种化学形式存在于水溶液中:AH和A-。所述A-形式被称为酸AH的“共轭碱”。例如,对于乙酸AH,共轭碱A-将被称为乙酸盐。
在本申请中,应当理解,当有机酸被称为“酸”时,它表示两种形式AH和A-在水溶液中的平衡组合。AH形式被称为酸的“缔合或质子化形式”,A-形式被称为酸的共轭碱或“解离或去质子化形式”。AH形式与A-形式的比例取决于溶液的pH值和有机酸A的pKa。
带负电的共轭碱倾向于与带正电的离子(阳离子)(诸如钠离子(Na+)、铵离子(NH4 +)、钙离子(Ca2+)、钾离子(K+)和镁离子(Mg2+))缔合。
有机酸的盐被定义为有机酸的共轭碱和一种或多种阳离子的电中性组合。
在本申请的一个实施方案中,用于产生有机酸盐的方法是用于产生羧酸盐的方法。
在本申请的另一个实施方案中,所述方法是用于产生有机酸盐的方法,所述有机酸盐选自:乳酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、丙酸盐、丁酸盐、甲基丁酸盐、羟基丁酸盐、氨基丁酸盐(尤其是GABA、γ-氨基丁酸盐)、戊酸盐、甲酸盐、天冬氨酸盐、延胡索酸盐、草酸盐、乳清酸盐、酮戊二酸类盐、柠檬酸盐、谷氨酸盐、乙醛酸盐、乙醇酸盐、丙酮酸盐、苹果酸盐、山梨酸盐、酒石酸盐、所述有机酸的衍生物的盐以及其混合物。
本发明的方法特别意欲用于产生有机酸盐,所述有机酸盐选自丁酸盐、乳酸盐、丙酸盐、戊酸盐、乙酸盐、乙醇酸盐、山梨酸盐、延胡索酸盐、甲酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、所述有机酸的衍生物的盐以及其混合物。
丁酸(N°CAS 107-92-6)作为仅通过野生型或重组专性厌氧菌进行的发酵过程的最终产物而产生。产生丁酸的细菌菌种的实例如下:
·丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
·丁酸梭菌(Clostridium butyricum)
·克鲁维梭菌(Clostridium kluyveri)
·巴斯德梭菌(Clostridium pasteurianum)
·普拉粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)
·核粒梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)
·溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)
·粘液真杆菌(Eubacterium limosum)
乳酸以两种异构体形式存在:异构体L(+)(N°CAS 79-33-4)、异构体D(-)(N°CAS10326-41-7)以及外消旋混合物:DL-乳酸(N°CAS 50-21-5)。产生乳酸的细菌可大致分为两类:
-异型发酵细菌,其除乳酸之外还产生其他产物;和
-同型发酵细菌,其专用于只产生乳酸,诸如乳杆菌属种(Lactobacillus sp.)。
丙酸(CAS N°79-09-4)及其盐即丙酸盐是天然存在的化合物。在工业上,丙酸主要通过乙烯的氢羧基化,或通过丙醛的需氧氧化来化学产生。丙酸还以辅酶A酯、丙酰CoA的形式,从某些脂肪酸的代谢分解以及从某些氨基酸的降解来生物产生。丙酸杆菌(Propionibacterium)属细菌产生作为其厌氧代谢的最终产物的丙酸。
戊酸(CAS N°109-52-4,也称为缬草酸)的化学式为C5H10O2。虽然对于通过发酵产生戊酸的可能性知之甚少,但是专利申请WO 2012/030860报道了使用特定酶生物合成其衍生物乙酰丙酸(也称为4-氧代戊酸)。
醋酸(***名称为乙酸,N°CAS 64-19-7)可以通过合成和通过使用需氧固氮菌进行的细菌发酵来产生。在许多能够产生乙酸的菌株中,可以提及葡糖杆菌属(Gluconobacter)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)和醋杆菌属(Acetobacter)(醋化醋杆菌(A.aceti)、过氧化醋杆菌(A.peroxidans)、巴斯德醋杆菌(A.pasteurianus))(即醋酸杆菌科(Acetobacteraceae)中包括的革兰氏阴性菌组)。
乙醇酸(N°CAS 79-14-1)通过化学合成来产生,从天然来源纯化,或通过生物转化来获得。它也可以从酵母菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的发酵获得。用于使用细菌(大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum))或酵母(酿酒酵母(S.cerevisiae))从可再生资源通过发酵产生乙醇酸的方法在申请人的专利申请(WO 2007/141316、WO 2010/108909、WO 2011/157728、WO 2011/036213、WO 2012/025780)中有所公开。
山梨酸(N°CAS 110-44-1)或2,4-己二烯酸被用作食品防腐剂。它首先从花楸树(Sorbus aucuparia)的未成熟浆果中分离。
延胡索酸(N°CAS 110-17-8)或反丁烯二酸被用作食品酸化剂。它天然存在于球果紫堇(Fumaria officinalis)、牛肝菌蘑菇、地衣和冰岛苔藓中。延胡索酸是柠檬酸循环的中间体:它由琥珀酸的氧化形成,然后被转化为苹果酸。延胡索酸也是尿素循环的产物。所以,很多微生物都能产生延胡索酸,目前考虑通过发酵(例如通过根霉(Rhizopus)属种发酵)来产生延胡索酸。
蚁酸(N°CAS 64-18-6),***名称为甲酸,以其共轭碱甲酸盐广泛存在于自然界中。它可以通过生物质材料(诸如葡萄糖、淀粉和纤维素)的水热氧化来产生。此外,通过伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)的发酵,可以通过使用二氧化碳还原酶进行的CO2的氢化来获得甲酸。
苹果酸(N°CAS 617-48-1和6915-15-7)目前在饮料和食品行业中主要用作酸化剂和增味剂。当添加到食品中时,苹果酸以E编号E296表示。苹果酸是很多水果中的主要酸类。它可促进青苹果和大黄的酸味。苹果酸天然存在于所有水果和很多蔬菜中,并且在水果代谢中产生。苹果酸是卡尔文循环和柠檬酸循环中的中间体。它也可以经由回补反应从丙酮酸形成。1924年,苹果酸被鉴定为酵母发酵的产物。从那时起,就观察到很多广泛的微生物中的苹果酸产生。苹果酸的发酵产生已经在黄曲霉(Aspergillus flavus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)中得到最成功的证实。
酒石酸(N°CAS 526-83-0)天然存在于很多植物中,最显著地存在于葡萄中,并且在食品中被用作酸化剂。它可以通过发酵产生,尤其是由属于假单胞菌属(Pseudomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)或根瘤菌属(Rhizobium)的微生物产生。
柠檬酸(N°CAS 77-92-9)首先从柠檬汁中分离出来。柠檬酸由于其令人愉快的酸味和在水中的高溶解度而被主要用于食品行业。柠檬酸是以吨计产生的最重要的有机酸,并且被广泛用于食品和制药行业。它主要通过使用黑曲霉(Aspergillus niger)、复膜孢酵母属种(Saccharomycopsis sp)或念珠菌属种(Candida sp)发酵,从不同来源的碳水化合物产生。它也可以通过酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和相关物种的发酵来产生。
在本发明的含义中,术语“有机酸的衍生物”表示具有提供与所考虑的有机酸相同的碳原子数的碳骨架和相同的酰基官能团的化合物,但其化学式是通过以下方式改性的:
-用取代基(诸如卤素原子、烷氧基和氨基以及酰基氧基基团)取代羟基基团;或
-添加其他官能团,诸如羟基基团。
常见的有机酸衍生物类别包括:
-α-羟基酸(AHA),其中羧酸包含在羧基基团的邻近碳上的羟基基团;
-酰卤,其中羟基已被卤素(F、Cl、Br或I)取代;
-酸酐,其中两个有机酸通过两个酰基基团之间的氧原子连接;
-酯,其中羟基基团已被烷氧基基团取代;以及
-酰胺,其中羟基基团已被基团NH2或NR2取代,R为氢或烷基。
应当理解,本发明的方法不包括特定有机酸盐的选择步骤。因此,以至少两种不同的有机酸盐及其衍生物的混合物形式回收所产生的有机酸盐。然而,混合物中通常存在一种或两种主要化合物。这一点将在下文更广泛地讨论。
方法的步骤(i):微生物的培养
如本文所用,术语“微生物”是指细菌、酵母或真菌。微生物可以选自属于真细菌科(Eubacteriaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)或棒杆菌科(Corynebacteriaceae)的细菌。或者,微生物可以选自属于酵母科(Saccharomycetaceae)的酵母。或者,微生物可以选自属于子囊菌(Ascomycota)科的真菌。
在一个实施方案中,在本发明的方法中培养的微生物是细菌,优选地选自以下菌种:大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、巴斯德梭菌(Clostridium pasteurianum)和粘液真杆菌(Eubacterium limosum)。
优先地,在本发明的方法中培养的微生物来自菌种丙酮丁醇梭菌、粘液真杆菌或大肠杆菌。
在本发明的一个具体实施方案中,培养的微生物是丙酮丁醇梭菌。
在一个实施方案中,在本发明的方法中培养的微生物是酵母,优选地选自以下菌种:酿酒酵母、库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。
在一个实施方案中,在本发明的方法中培养的微生物是真菌,优选地来自黑曲霉(Aspergillus niger)菌种。
根据本发明,培养的微生物是野生型微生物或经遗传修饰的重组微生物。
优选地,在根据本发明的方法的步骤i)培养的微生物是培养物中的唯一微生物,这意味着发酵单一微生物菌株。
根据本发明,术语“发酵产生”、“培养”或“发酵”可互换使用,表示微生物的生长。这种生长通常在发酵罐中进行,所述发酵罐具有适用于微生物的适当培养基,并且含有至少一种碳源和一种氮源。
“适当培养基”是指包含对于细胞的维持和/或生长必需的或有益的营养素的培养基(如,无菌液体培养基),所述营养素诸如碳源或碳底物、氮源(例如蛋白胨、酵母提取物、肉浸膏、麦芽提取物、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵);磷源(例如磷酸二氢钾或磷酸氢二钾);微量元素(如,金属盐)(例如镁盐、钴盐和/或锰盐);以及生长因子(诸如氨基酸和维生素)。
根据本发明的术语“碳源”或“碳底物”或“碳的来源”表示本领域的技术人员所使用的支持微生物的正常生长的任何碳的来源,包括单糖(诸如葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖或乳糖)、寡糖、二糖(诸如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖)、多元醇(诸如甘油或丙三醇)、糖蜜、淀粉或其衍生物、半纤维素以及它们的组合。特别优选的简单碳源是葡萄糖。另一个优选的简单碳源是蔗糖。
碳源可以来源于可再生原料。可再生原料被定义为某些工业过程所需的原材料,所述原材料可以在短时间内以足以允许其转化为所期望的产物的量再生。例如,经处理或未经处理的植物生物质是可以用作碳源的可再生原料。
术语“氮源”对应于铵盐或氨气。氮源以铵、氨或尿素形式提供。
根据本发明,术语“发酵培养基”、“培养基”、“发酵液(fermentation broth)”、“发酵液(fermentative broth)”和“培养液”可互换使用,并且表示包含培养的微生物的发酵培养基。这些术语意味着已在足以使微生物生长和合成有机酸的时间内进行了微生物的培养。
根据本发明,短语“足以获得包含有机酸的发酵液的时间”表示足以使微生物显著生长,尤其是复制和定殖所有发酵培养基的培养时间。该时间将取决于微生物的性质、培养物的体积以及其他培养条件(温度、振荡、pH)。所述足够的时间可以由微生物培养领域的技术人员确定。例如,对于1000升培养体积,足够的时间通常为在大肠杆菌的最佳培养条件下培养约2天,并且通常为在丙酮丁酸梭菌的最佳培养条件下培养约7天。
具体而言,微生物在20℃和55℃之间,优先地在25℃至40℃之间的温度下发酵,更具体而言,对于梭菌(Clostridium)约35℃,对于真杆菌(Eubacterium)约37℃,对于大肠杆菌约37℃。对于热诱导菌株,在该过程的某些点,培养温度有利地为约30℃。
对于大肠杆菌,培养基的组成可以与M9培养基(Anderson,1946年)、M63培养基(Miller,1992年);或诸如(Schaefer等人,1999年)中定义的培养基相同或相似。
对于丙酮丁醇梭菌,培养基的组成可以与CGM(梭菌生长培养基)或诸如(Zhao等人,2016年)中定义的RCM(强化梭菌培养基)相同或相似。
对于粘液真杆菌,培养基的组成可以与(Pacaud等人,1985年)中描述的矿物培养基相同或相似。
当酸通过发酵制备时,累积的酸会使培养基的pH降低至微生物不再生长并且酸产生最终停止的点。由于这个原因,在发酵反应中添加试剂是必要的,所述试剂将至少部分中和酸并且将pH保持在足以允许微生物连续生长的水平。
常用的中和试剂是化学式为NH3的氨的碱性溶液。
有利地,在该培养步骤期间,在不干扰培养过程尤其是不从培养容器中除去生物质的情况下连续收集发酵液。
或者,可以在某些时间点收集发酵液,而且也不干扰培养过程。
根据这些实施方案,培养步骤被称为“连续的”。
这种实施方式的工业和经济有益效果是时间和原材料的获得,因为培养仅进行一次开始阶段;另一个有益效果是降低微生物培养的污染风险。
根据本发明的另一个实施方案,用于产生有机酸盐的方法在分批或补料分批条件下实现。在这种情况下,在培养结束时收集发酵液。
方法的步骤(ii):发酵液的预处理
根据本发明的方法的特征在于发酵液的预处理步骤(ii),其至少包括以下子步骤:
a.澄清步骤;
c.通过蒸发经澄清的发酵液然后冷凝含有所述有机酸的挥发性级分(CVAF)来分离有机酸,从而从发酵液中除去非挥发性固体杂质(主要是盐)。
发酵液的澄清步骤(a)意指澄清发酵培养基并从所述发酵培养基除去不溶性有机杂质。通过本领域的技术人员已知的任何方法来进行培养基的澄清,所述方法例如选自加热、絮凝、倾析、膜技术(微滤、超滤、渗滤、纳滤和反渗透)和离心。
可以进行任选的步骤(b)pH调节,其包括将无机酸添加至培养液中,以将pH降低至培养液中含有的要回收的有机酸的pKa以下。
进行该任选的步骤的目的是使一种或多种有机酸在其质子化形式下的比例最大化,因此优化它们在步骤(c)的冷凝的挥发性级分中的回收。
这种pH调节(酸化)可以通过本领域的技术人员已知的任何方法进行,例如通过添加无机酸来选择所述方法,所述无机酸选自硫酸、硝酸、磷酸和盐酸。
本领域的技术人员知晓待回收的不同有机酸的pKa,并且能够根据任何pKa来调节pH,从而使经澄清的培养液的pH低于待回收的有机酸的pKa。
下表1提供了多种有机酸的pKa。该表列出了包括多种氨基酸在内的有机化合物的酸碱解离常数。所有数据均适用于稀水溶液,并且以pKa形式提供,所述pKa是酸解离常数Ka的负对数。
表1.多种有机酸的pKa
步骤(c)是通过两个连续的蒸发和冷凝步骤来进行分离的步骤。
首先,在蒸发单元中加热经澄清的发酵液以分离气态部分和固态部分。蒸发单元的运行参数针对每种经处理的经澄清的培养液而进行优化。可以施加低压(<1巴),并且温度取决于压力值(例如,在500毫巴下,对于特定的梭菌发酵液,浓缩物的温度为约110℃)。根据目标有机酸,本领域的技术人员可以修改条件以使挥发性级分中的所述目标有机酸的蒸发最大化。
其次,收集含有水、铵(ammonium)和有机酸的气态挥发性部分,同时除去含有杂质(诸如盐)的固态不溶性部分。
然后将所收集的气态部分通过部分的冷藏来进行冷凝,以获得液态部分,此后被称为冷凝的挥发性酸级分(CVAF)。
在一个实施方案中,该分离步骤可以通过蒸馏来实现,所述蒸馏是利用培养液组分的挥发性差异通过选择性蒸发和冷凝从发酵液中分离挥发性组分的过程。根据该实施方案,将从其他挥发性化合物中选择所回收的有机酸,并且CVAF将仅包含有机酸和与有机酸具有相同的挥发性的化合物。
可以将其他步骤施加于发酵液的预处理,以改善有机杂质的消除。这些步骤是任选的。当发酵液含有大量醇时,它们可以是特别重要的。它们包括尤其是一个或多个蒸馏的子步骤以提高有机酸的回收收率(主要在发酵液是梭菌培养液时使用)和/或反渗透的子步骤以除去水和浓缩有机酸。
任选步骤(iii)
应当理解,本发明的方法由至少四个连续步骤的顺序定义,但是任选的补充步骤可以整合在所述方法的顺序中。
具体而言,可以在发酵液的预处理的步骤(ii)之后立即进行一个或多个补充步骤。
当发酵液提供高水平的杂质或氨时,这些任选步骤旨在提高所回收的有机酸盐的收率和纯度。
如上文所述,在发酵期间,所产生的有机酸在培养基中累积并使pH值降低至微生物不再生长的点。由于这个原因,在发酵期间连续添加氨或尿素的碱性溶液或氨气,以将pH维持在足以允许微生物的连续生长的水平。
因此,发酵液可以含有高水平的氨,所述氨在酸溶液中转化为铵阳离子NH4 +。
在本发明的一个实施方案中,所述方法包括除去CVAF中存在的铵阳离子的步骤(iii)。
该步骤在发酵液的预处理的步骤(ii)之后,通过使CVAF通过能够结合铵阳离子的阳离子交换剂(优先地强阳离子树脂)来进行。
由此获得“阳离子树脂处理的级分”。
任选步骤(iv)
在本发明的一个实施方案中,进行任选步骤(iv)以纯化包含在CVAF或阳离子树脂处理的级分中的有机酸。
该步骤由使来自任选步骤(iii)的CVAF或阳离子树脂处理的级分通过能够结合有机酸的共轭碱的阴离子交换剂(优先地强阴离子树脂)组成。
阴离子交换剂是一种能够固定有机酸的共轭碱(形式A-)的离子交换树脂;这些共轭碱的解偶联(洗脱)通过在所述阴离子交换剂上添加无机碱来实现。在洗脱液级分中,无机碱包含将结合至树脂的阴离子(诸如氢氧根);以及将与共轭碱络合的阳离子(诸如钠阳离子)。
方法的步骤(v):添加无机碱
在发酵液的预处理之后,对所获得的CVAF进行无机碱的添加,以产生有机酸盐。
如果已经进行任选步骤(iii),则将无机碱添加至来自阳离子交换剂的阳离子树脂处理的级分。
如果已经进行任选步骤(iv),则将无机碱添加至已结合共轭碱的阴离子交换剂。无机碱的存在将允许共轭碱以有机酸盐形式洗脱。
在适用于向人和/或动物口服施用的无机碱中有利地选择用于产生有机酸盐的无机碱。
无机碱优选地选自钠盐、钙盐、钾盐、镁盐以及它们的混合物。
用于获得有机酸盐的无机碱优选地选自:氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸钙、碳酸钾、碳酸镁、氧化钠、氧化钙、氧化钾、氧化镁以及它们的混合物。
更优选地,所添加的无机碱选自氢氧化钠、碳酸钠和氧化钠。
在本发明的一个实施方案中,将至少两种不同的无机碱(即混合物)添加至CVAF或阳离子树脂处理的级分或阴离子交换剂。
在本发明的一个实施方案中,在方法的步骤(v)仅添加一种无机碱,所述无机碱选自上文列出的无机碱。
根据该实施方案,诸如通过所述方法获得的有机酸盐的混合物由不同的有机酸与单一阳离子组合而成,所述阳离子包括:钠离子、镁离子、钾离子或钙离子,优先地与钠离子组合而成。
在本发明的一个优选的实施方案中,所添加的无机碱是氢氧化钠(NaOH,其由钠阳离子Na+和氢氧根阴离子OH-组成)。
应当理解,这些无机碱以有效量添加,即以将现有数量的有机酸转化为有机酸盐所需的化学计量比添加。
本领域的技术人员能够确定随级分体积而变化的待添加至CVAF或阳离子树脂处理的级分或阴离子交换剂的无机碱的有效量。该数量还将取决于无机盐的类型以及所培养的微生物的类型,因此取决于主要产生的有机酸的类型。所添加的无机碱的典型数量包含在每千克CVAF 5克至500克之间。
方法的步骤(vi):除去CVAF或阳离子树脂处理的级分或洗脱液的残留水,并回收所形成的有机酸盐
根据本发明的方法的最后基本步骤由从CVAF或阳离子树脂处理的级分或洗脱液回收有机酸盐组成。
因为有机酸盐存在于溶液中,所以除去残留水的步骤是必要的。
残留水的消除可以通过本领域的技术人员已知的任何技术来进行,诸如干燥、蒸发、真空脱水或使用吸湿性化合物。
该步骤(vi)可以包括一个或多个子步骤,所述子步骤选自:蒸发、雾化、造粒、凝聚、结晶、液/固分离、过滤和离心。
蒸发是指除去蒸发单元中的水。控制压力和温度以蒸馏一部分残留水。浓缩物含有有机酸薄层(slat),并且针对不同有机酸盐的溶解度而对浓度进行优化。该步骤可节省下一个步骤的成本。
雾化是指将液体转化为多个小液滴。这种转化通过在液体的表面上形成扰动来进行,随后所述扰动由于来自周围气体的能量和动量传递而被放大。
造粒是指将浓缩的CVAF或级分或洗脱液在喷嘴中加工为粉末的流化床的过程。粉末可以通过雾化获得,或者在喷雾造粒机中直接获得,或者从此前的产生过程中回收。将有机酸盐的溶液在颗粒表面上磨成粉,并且用加热的空气除去水,从而使有机酸盐直接在颗粒上结晶。粒度将通过改变进料流量、喷嘴气压、干燥产物的回收率和在设备中的停留时间来控制。
凝聚是指使粉末颗粒粘附形成较大的多颗粒实体(称为颗粒)的过程。这是通过在颗粒之间产生键来将颗粒收集在一起的过程。通过使用粘合剂(优选地有机酸盐溶液)来形成键。使CVAF或级分或洗脱液中包含的盐的固体颗粒凝聚以产生有机酸盐的颗粒。可以通过湿法造粒或干法造粒来进行凝聚,这取决于所述凝聚在干燥步骤之前还是之后进行。
结晶步骤在于使有机盐结晶,从而以固体形式回收盐。该结晶步骤可以通过选自以下的技术来进行:冷却结晶、蒸发结晶和绝热结晶。在结晶后通常进行离心或过滤步骤,以从液体分离结晶的有机盐。
当有机酸盐为固体颗粒形式时,液/固分离、过滤和离心技术旨在分离有机酸盐,例如在结晶后,从CVAF或级分或洗脱液的残留液体分离有机酸盐。
应当理解,该最后步骤(vi)可以根据本领域的技术人员已知的任何方法来进行,用于回收干燥固体形式的有机酸盐。
具体实施方式
下文提供了例示本发明的方法的五个方案。所有这些步骤顺序包括四个必要的步骤,并且在它们的顺序中还可以包括一些任选步骤。
方案1
根据本发明的一个具体实施方案,用于产生有机酸盐的方法包括以下连续步骤:
i)在足以获得包含有机酸的发酵液的时间内在包含碳源和氮源的适当培养基中培养微生物;
ii)通过至少以下步骤来预处理所述发酵液:
·澄清发酵液;以及
·通过蒸发经澄清的发酵液然后冷凝含有所述有机酸的挥发性级分(此后被称为冷凝的挥发性酸级分(CVAF))来分离有机酸;
v)将无机碱(优选地氢氧化钠)添加至所述CVAF;
vi)雾化或造粒或结晶;并且干燥和/或蒸发所形成的有机酸盐。
在图1提供的该方案中,调节除水步骤(vi)以优化产物的最终呈现。在本发明的一个实施方案中,该步骤包括有机酸盐的雾化或造粒。
有利地,除水步骤可以通过结晶技术然后进行液/固分离或离心然后最终干燥来进行。
应当理解,在该过程期间也可以替代离心或液/固分离而引入过滤子步骤,以分离结晶材料。
根据本发明的一个具体实施方案,用于产生有机酸盐的方法在于方案1中列出的连续步骤。
方案2
根据本发明的一个具体实施方案,用于产生有机酸盐的方法包括以下连续步骤:
i)在足以获得包含有机酸的发酵液的时间内在包含碳源和氮源的适当培养基中培养微生物;
ii)通过至少以下步骤来预处理所述发酵液:
·澄清发酵液;以及
·通过蒸发经澄清的发酵液然后冷凝含有所述挥发性级分(此后被称为冷凝的挥发性酸级分(CVAF))来分离有机酸;
iv)使CVAF通过阴离子交换剂,优先地通过强阴离子树脂;
v)将无机碱添加至阴离子交换剂,以洗脱所结合的所述有机酸的共轭碱,并且获得含有所述共轭碱的洗脱液。
vi)蒸发洗脱液,然后雾化或造粒或结晶,然后离心和干燥以收集所形成的有机酸盐。
图2示意性地展示了该方案。
优选地,使用强阴离子树脂,因为高水平的铵阳离子可以干扰阴离子树脂上的共轭碱的结合。
根据本发明的一个具体实施方案,用于产生有机酸盐的方法在于方案2中列出的连续步骤。
方案3
根据本发明的一个具体实施方案,用于产生有机酸盐的方法包括以下连续步骤:
i)在足以获得包含有机酸的发酵液的时间内在包含碳源和氮源的适当培养基中培养微生物;
ii)通过至少以下步骤来预处理所述发酵液:
·澄清发酵液;以及
·通过蒸发经澄清的发酵液然后冷凝挥发性级分(此后被称为冷凝的挥发性酸级分(CVAF))来分离有机酸;
iii)通过使CVAF通过阳离子交换剂以结合铵阳离子,从而除去CVAF中存在的铵阳离子;
iv)使步骤(iii)中获得的阳离子树脂处理的级分通过阴离子交换剂;
v)将无机碱添加至阴离子交换剂以洗脱所结合的共轭碱;
vi)蒸发洗脱液,然后雾化或造粒或结晶,然后离心和干燥以收集所形成的有机酸盐。
阳离子交换剂是一种能够固定存在于CVAF中的铵阳离子(NH4 +)的离子交换树脂;在通过树脂后,所获得的阳离子树脂处理的级分包含有机酸的共轭碱。阳离子树脂优先是强阳离子树脂。
在步骤(iv)中,使阳离子树脂处理的级分通过能够固定有机酸的共轭碱(形式A-)的阴离子交换剂;这些共轭碱的解偶联(洗脱)可以通过添加无机碱来实现,在洗脱液级分中,所述无机碱包含将被固定至离子交换剂的阴离子(诸如氢氧根);以及将与共轭碱络合的阳离子(诸如钠阳离子)。
在图3提供的该方案中,阴离子交换剂一般是强阴离子树脂或弱阴离子树脂,因为此前已除去铵阳离子。
根据本发明的一个具体实施方案,用于产生有机酸盐的方法在于方案3中列出的连续步骤。
方案4
根据本发明的一个具体实施方案,用于产生有机酸盐的方法包括以下连续步骤:
i)在足以获得包含有机酸的发酵液的时间内在包含碳源和氮源的适当培养基中培养微生物;
ii)通过至少以下步骤来预处理所述发酵液:
·澄清发酵液;以及
·通过蒸发经澄清的发酵液然后冷凝含有所述挥发性级分(此后被称为冷凝的挥发性酸级分(CVAF))来分离有机酸;
iii)通过使调节pH的CVAF通过阳离子交换剂来从CVAF除去铵阳离子;
v)将无机碱添加至阳离子树脂处理的级分;
vi)除去阳离子树脂处理的级分的残留水,并收集所形成的有机酸盐。
图4示意性地展示了该方案。
阳离子交换剂是一种能够固定存在于CVAF中的铵阳离子(NH4 +)的离子交换树脂;在通过树脂后,所获得的阳离子树脂处理的级分包含有机酸的共轭碱。阳离子树脂优先是强阳离子树脂。
根据本发明的一个具体实施方案,用于产生有机酸盐的方法在于方案4中列出的连续步骤。
方案5
根据本发明的另一个具体实施方案,用于产生有机酸盐的方法在于以下连续步骤:
i)在足以获得包含有机酸的发酵液的时间内在包含碳源和氮源的适当培养基中培养微生物;
ii)通过至少以下步骤来预处理所述发酵液:
·澄清发酵液;以及
·通过蒸发经澄清的发酵液然后冷凝含有所述挥发性级分(此后被称为冷凝的挥发性酸级分(CVAF))来分离有机酸;
·通过添加矿物酸来从CVAF除去铵阳离子,然后使调节pH的CVAF蒸发结晶,有机酸将在冷凝的馏出物中回收(针对双冷凝的挥发性酸级分的DCVAF),由铵形成的无机碱将通过离心/晶体的干燥回收;
v)将无机碱添加至所述DCVAF;
vi)除去DCVAF的残留水,并回收所形成的有机酸盐。
在图5提供的该方案5中,在步骤(ii)和步骤(v)之间进行添加矿物(无机)酸的任选步骤。
为了生成铵盐,以铵阳离子的化学计量进行矿物酸(诸如硝酸、硫酸和磷酸)的添加。该步骤允许中和CVAF的pH:然后pH较低,从而使有机酸成为质子形式AH。
在本发明的一个优选的实施方案中,矿物酸是硫酸。
为了回收气态部分(DCVAF)中的挥发性有机酸,并分离结晶物质中包含的铵盐,进行以下蒸发结晶步骤。可以通过过滤和干燥来处理所述结晶物质,以回收在第一蒸馏步骤中直接失去的有机酸,有价值的铵盐而不是废水。
然后,如上文所述,根据步骤(v)和步骤(vi)处理DCVAF。
特定组合
在第一实施方案中,根据本发明的方法是用于产生丁酸盐的方法。
根据本发明的一个具体实施方案,用于产生丁酸盐的方法包括培养梭菌科(Clostridiaceae)的微生物,优先地来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)菌种。
根据本发明的一个更具体的实施方案,所述方法旨在产生丁酸钠盐。
在第二实施方案中,根据本发明的方法是用于产生乙酸盐的方法,或用于产生乙酸盐和丁酸盐的方法。
根据本发明的一个具体实施方案,用于产生乙酸盐和丁酸盐的方法包括培养真杆菌科(Eubacteriaceae)的微生物,优先地粘液真杆菌菌种。
在第三实施方案中,根据本发明的方法是用于产生乙醇酸盐的方法。
根据本发明的一个具体实施方案,用于产生乙醇酸盐的方法包括培养肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的微生物,优先地大肠杆菌菌种。
根据本发明的一个具体实施方案,用于产生乙醇酸盐的方法包括培养酵母科(Saccharomyces)的微生物,优先地库德里阿兹威毕赤酵母菌种。
在第四实施方案中,根据本发明的方法是用于产生乳酸盐的方法,包括培养至少一种产生乳酸的微生物。
在第五实施方案中,根据本发明的方法是用于产生丙酸盐的方法,包括培养至少一种产生丙酸的微生物。
在第六实施方案中,根据本发明的方法是用于产生戊酸盐的方法,包括培养至少一种产生戊酸的微生物。
在第七实施方案中,根据本发明的方法是用于产生乙酸盐的方法,包括培养至少一种产生乙酸的微生物。
所获得的有机酸盐
本发明的方法不包括特定有机酸盐的选择步骤。因此,以至少两种不同的有机酸盐的混合物形式回收所产生的有机酸盐。
本发明涉及诸如通过上文所述的方法获得的有机酸盐的混合物。
这些有机酸盐由有机酸的共轭碱和无机阳离子(诸如钠、镁、钾或钙阳离子)组成。
在一个优选的实施方案中,该有机酸盐的混合物仅由包含单一类型的阳离子(优先地钠阳离子)的多种盐组成。例如,所获得的混合物应包含丁酸钠盐和乙酸钠盐。
在另一个优选的实施方案中,该有机酸盐的混合物包含主要组分,这意味着所述主要组分的重量占混合物重量的50%以上。
在另一个优选的实施方案中,该有机酸盐的混合物包含至少两种主要组分,这意味着所述主要组分的重量占混合物重量的50%以上。
在分离混合物中存在的每种有机酸盐之后,本领域的技术人员可以通过常规技术(诸如HPLC和质谱法)对混合物的每种组分的重量进行评估。
每种回收的有机酸的比例至少取决于所培养的微生物和所述微生物的发酵时间。
在本发明的一个具体实施方案中,混合物的主要组分是丁酸盐以及它们的衍生物。
优先地,这些丁酸盐以及它们的衍生物是丁酸钠盐。
在本发明的另一个实施方案中,混合物的主要组分是丁酸盐和乙酸盐,以及它们的衍生物,优先地丁酸钠盐和乙酸钠盐。
在本发明的另一个实施方案中,混合物的主要组分是乙醇酸盐以及它们的衍生物,优先地乙醇酸钠盐。
实施例
通过以下实施例进一步定义本发明。应当理解,这些实施例虽然表明了本发明的优选实施方案,但仅以举例的方式给出。根据以上公开内容和这些实施例,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改变,以使其适应各种用途和条件,而无需修改本发明的基本含义。
实施例1:使用丙酮丁醇梭菌菌株从产生1,3-丙二醇的发酵液回收有机酸盐
如专利申请EP 2 427 562、EP 2 638 172和尚未公开的EP 17305187.1中所述,在连续发酵罐中发酵丙酮丁醇梭菌重组菌株以产生1,3-丙二醇。
在发酵运行期间产生的若干有机酸被视为副产物,例如,丁酸、甲酸和乙酸。在发酵的方法步骤(i)之后,发酵液的典型组成如下。
表2:步骤i产生的发酵液的典型组成。
化合物 | 滴定度(g/kg) | 相对纯度(%) |
生物质 | 0.20±0.05 | 0.3% |
甘油(残留) | 1.2±0.6 | 1.5% |
1,3-丙二醇 | 51.8±1.8 | 67.4% |
丁酸 | 11.7±0.6 | 15.2% |
乙酸 | 2±0.6 | 2.6% |
甲酸 | 0.2±0.1 | 0.3% |
盐 | 9.5±0.5 | 12.4% |
在澄清发酵液(步骤ii.a.)之后,组成几乎没有变化,因为仅从发酵液中除去了生物质。
进行步骤(ii.c)以使用多于一级蒸发和冷凝再加上一些冷凝物的反渗透步骤来分离挥发性有机酸。在步骤ii.c结束时获得的CVAF大致具有以下组成。
表3:步骤(ii.c)之后的CVAF的典型组成。
挥发性有机酸的纯度相对于发酵液的组成提高大约4倍。
不对该CVAF进行任何可选步骤(选自iii和iv中)。
通过添加苏打(碳酸氢钠)来进行添加无机酸的步骤(v)。为了获得苏打/有机酸的化学计量比,苏打的量为32g/kg CVAF。
步骤(vi):然后通过蒸发来浓缩该溶液。在大气压下使用降膜蒸发器,最终浓缩物的温度为约112℃。在馏出物中回收了水和氨,而在浓缩物中回收了两种有机酸钠盐。浓缩物的组成在下表中给出。
表4:浓缩物的典型组成
通过用钠替代铵,增加了总干物质含量,从而降低了相对纯度。在该步骤后,钠盐中的组成如下表5所示。
表5:浓缩物的钠盐的典型组成
然后使用喷雾造粒嘴在流化床干燥器上处理该浓缩物。所用的设备是来自的Procell Labsystem。使用热空气来干燥产物,同时在室内喷洒有机酸钠盐溶液。在设备的出口处使用分类***,以优化干燥产物的粒度分布。
表6:有机酸盐中的典型最终组成
下表给出了使用有机酸浓度的干燥产物的组成,使得可以将相对纯度与培养液组成进行比较。
表7:使用有机酸浓度的干燥产物的典型组成
通过应用本发明的主要步骤,获得了含有有机酸钠盐的干燥产物,所述产物的纯度相对于发酵液的初始组成提高约4倍。
实施例2:使用丙酮丁醇梭菌菌株从产生1,3-丙二醇的发酵液回收纯丁酸钠盐
根据本发明的方法可以允许从所述特定有机酸(例如丁酸)的纯溶液产生特定有机盐。
根据步骤(ii)预处理来自丙酮丁醇梭菌菌株的发酵液。然后使CVAF进行纯化过程,以回收纯丁酸。
然后进行方法的步骤(v)(添加无机碱,尤其是钠盐),从而获得纯丁酸钠溶液,然后在步骤(vi)中使用与实施例1中所述相同的干燥设备来处理该溶液。
通过喷雾造粒获得的干燥产物的丁酸钠含量为98.5%(1.5%水)。组成在下表8中给出。
表8:丁酸钠盐的组成
所得的纯丁酸钠是由小球组成的白色粉末。
该实施例显示,本发明的方法可以包括补充纯化步骤,并且在那种情况下,可以从相同的发酵液提高产物的纯度。丁酸的纯度相对于其在培养液中的初始纯度提高大于5倍(相对于实施例1中的4倍)。
参考文献
专利
-EP 1 094 054
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-US 4,490,295
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非专利
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Claims (11)
1.一种用于产生有机酸盐的方法,包括至少以下连续步骤:
i)在足以获得包含有机酸的发酵液的时间内在包含碳源和氮源的适当培养基中培养微生物;
ii)通过至少以下步骤来预处理所述发酵液:
a.澄清所述发酵液;
b.任选地,调节所述经澄清的发酵液的pH;以及
c.通过蒸发经澄清的发酵液然后冷凝含有所述有机酸的挥发性级分(此后被称为冷凝的挥发性酸级分(CVAF))来分离有机酸;
iii)任选地,使所述CVAF通过能够结合铵阳离子的阳离子交换剂;
iv)任选地,使所述CVAF或阳离子树脂处理的级分通过能够结合所述有机酸的共轭碱的阴离子交换剂;
v)将无机碱添加至所述CVAF或所述阳离子树脂处理的级分或所述阴离子交换剂,以洗脱所述结合的共轭碱;
vi)除去所述CVAF或所述阳离子树脂处理的级分或洗脱液的残留水,并回收所形成的有机酸盐,
其中所述有机酸盐选自:丁酸盐、乳酸盐、丙酸盐、戊酸盐、乙酸盐、乙醇酸盐、山梨酸盐、延胡索酸盐、甲酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、所述有机酸的衍生物的盐及其混合物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述微生物是细菌,所述细菌优先地选自:大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、巴斯德梭菌(Clostridium pasteurianum)和粘液真杆菌(Eubacterium limosum)。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述微生物是丙酮丁醇梭菌细菌。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述微生物是酵母,所述酵母优先地选自:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述预处理步骤(ii)包括一个或多个蒸馏和/或反渗透的子步骤。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中在步骤(v)中,所添加的无机碱选自:钠盐、钙盐、钾盐、镁盐及其混合物。
7.根据权利要求6所述的方法,其中在步骤(v)中,所添加的无机碱选自氢氧化钠、碳酸钠和氧化钠。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所添加的无机碱是氢氧化钠。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述干燥步骤(vi)包括一个或多个子步骤,所述子步骤选自:蒸发、雾化、造粒、凝聚、结晶、液/固分离、过滤和离心。
10.至少两种通过根据权利要求1至9中任一项所述的方法获得的有机酸盐的混合物。
11.根据权利要求10所述的有机酸盐的混合物,其中丁酸盐及其的衍生物是所述混合物的主要组分。
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---|---|---|---|
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