DE10108225A1 - Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu TierfuttermittelnInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze und deren Verwendung als Zusatz zu Tierfuttermitteln.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von D-
Pantothensäure und/oder deren Salze und die Verwendung als Zusatz zu
Tierfuttermitteln.
Als ein Ausgangsprodukt der Biosynthese von Coenzym A ist D-Pantothenat in der
Pflanzen- und Tierwelt weit verbreitet. Im Gegensatz zum Menschen, der die
Pantothensäure in ausreichenden Mengen über die Nahrung zu sich nimmt, sind
jedoch sowohl für Pflanzen als auch für Tiere häufig Mangelerscheinungen für D-
Pantothenat beschrieben. Die Verfügbarkeit von D-Pantothenat ist daher von großem
wirtschaftlichen Interesse, insbesondere in der Tierfutterindustrie.
Herkömmlicher Weise erfolgt die Herstellung von D-Pantothenat durch chemische
Synthese aus D-Pantolacton und Calcium-β-Alaninat (Ullmann's Encyclopedia of
Industrial Chemistry, 6th edition, 1999, electronic release, Kapitel "Vitamins"). Zur
Bereitstellung von D-Pantolacton ist eine aufwendige, klassische Racematspaltung
über diastereomere Salze erforderlich. Das aus der chemischen Synthese
resultierende Verkaufsprodukt ist meist das Calciumsalz der D-Pantothensäure
Calcium-D-Pantothenat.
Gegenüber der chemischen Synthese liegt der Vorteil biotechnologischer
Herstellungsverfahren mit Mikroorganismen in der selektiven (enantiomerenreinen)
Bereitstellung der für den höheren Organismus verwertbaren D-Form der
Pantothensäure. Eine aufwendige Racematspaltung, wie sie bei der chemischen
Synthese erforderlich ist, entfällt somit.
Fermentative Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure mit Mikroorganismen
sind zahlreich bekannt, so u. a. aus EP 0 590 857, WO 96/33283, US 6,013,492, WO 97/10340,
DE 198 46 499, EP 1 001 027, EP 1 006 189, EP 1 006 192 und EP 1 006 193.
So beschreiben EP 1 006 189 und EP 1 001 027 Verfahren zur Herstellung von
Pantothenat bei dem in der Fermentationslösung ein Gehalt von höchstens 1 g/l, D-
Pantothensäure erreicht wird. Solche geringen Pantothensäure-Gehalte in der
Fermentationslösung, also von weniger als 10 Gew.-% bezogen auf den
Feststoffgehalt sind jedoch für eine wirtschaftliche Herstellung von D-Pantothensäure
enthaltenden Tierfuttersupplementen ungeeignet. Ein weiterer Nachteil bei den
bislang beschriebenen Verfahren ist, daß die Isolierung des Produkts aus dem
Fermentationsmedium zahlreiche aufwendige Aufarbeitungsschritte erfordert. Ein
wirtschaftliches Herstellungsverfahren für den großtechnischen Maßstab ist nicht
offenbart.
In der Offenlegungsschrift DE 100 16 321 ist ein Fermentationsverfahren zur
Herstellung eines D-Pantothensäure-haltigen Tierfuttersupplements beschrieben. Ein
wesentlicher Nachteil diese Verfahrens ist jedoch, wie auch bei den oben
angeführten fermentativen Verfahren zur D-Pantothensäure-Herstellung, daß dem
Mikroorganismus über das Fermentationsmedium die Pantothensäure-Vorstufe β-
Alanin zwingend zugeführt werden muß, um wirtschaftliche Ausbeuten des
gewünschten Produktes zu erhalten.
Ferner beschreiben US 6,013,492 und WO 96/332839 die Aufarbeitung der D-
Pantothensäure aus der Fermentationslösung durch Abfiltern unlöslicher
Bestandteile (z. B. Zellmaterial) vom Kulturmedium, eine Adsorption des Filtrats an
Aktivkohle, eine sich anschließende Elution der D-Pantothensäure mit einem
organischen Lösungsmittel, bevorzugt Methanol, eine Neutralisation mit
Calciumhydroxid und eine abschließende Kristallisation von Calcium-D-Pantothenat.
Wesentliche Nachteile sind die bei der Kristallisation auftretenden
Wertproduktverluste sowie die Verwendung eines organischen Lösungsmittels, das
nur schwer aus dem Produkt zu entfernen ist und eine aufwendige
Lösungsmittelrückgewinnung erforderlich macht.
Die EP 0 590 857 beschreibt ein Fermentationsverfahren zur Herstellung von D-
Pantothensäure, bei dem die Kultivierung eines Mikroorganismus die Zufütterung von
β-Alanin zwingend erfordert. Die Fermentationslösung wird zur Abtrennung der
Biomasse filtriert, dann über einen Kationenaustauscher und anschließend über
einen Anionenaustauscher geleitet, im Anschluß daran mit Calciumhydroxid
neutralisiert, eingedampft, mit Aktivkohle versetzt, nochmals filtriert und unter Zusatz
von Methanol und Calciumchlorid kristallisiert. Das resultierende
Calciumpantothenat-haltige Produkt enthält neben D-Pantothensäure in Form des
Caliumssalzes noch Calciumchlorid in einem Molverhältnis von 1 : 1. Zur Reduzierung
des Calciumchloridgehaltes ist eine Elektrodialyse mit anschließender
Sprühtrocknung erforderlich. Dieses Verfahren hat den Nachteil, wegen der Vielzahl
aufwendiger Verfahrensschritte und der Verwendung organischer Lösungsmittel
weder ökonomisch noch ökologisch zu sein.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines D-Pantothensäure
und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement sowie dessen Herstellung
durch ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder
deren Salzen, das die zuvor genannten Nachteile nicht aufweist. Hierbei ist aus
wirtschaftlichen Gründen ein Verfahren wünschenswert, bei dem eine Zufütterung
von β-Alanin drastisch reduziert oder überhaupt nicht erforderlich ist. Ferner ist die
Herstellung von D-Pantothensäure in Form ihrer zweiwertigen Salze und hierbei vor
allem der Erdalkali-Salze wünschenswert, da die zweiwertigen Salze weniger
hygroskopische Eigenschaften aufweisen als einwertige Salze der Pantothensäure
und für die weitere Verwendung, z. B. als Tierfuttersupplement, somit weniger stark
zu Verklumpungen neigen.
Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung in vorteilhafter Weise gelöst.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von D-
Pantothensäure und/oder deren Salze, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) wenigstens ein D-Pantothensäure produzierender Organismus eingesetzt wird, dessen Pantothensäure-(pan)- und/oder Isoleucin/Valin-(ilv)- Biosynthese dereguliert ist und der wenigstens 2 g/l, an Salzen der D- Pantothensäure durch Fermentation in einem Kulturmedium bildet, wobei dem Kulturmedium 0-20 g/l freies β-Alanin und/oder β-Alanin-Salz zugeführt wird,
- b) die D-Pantothenat enthaltende Fermentationslösung über einen Kationenaustauscher geleitet wird, wobei aus den Salzen der D- Pantothensäure freie D-Pantothensäure entsteht,
- c) die freie D-Pantothensäure enthaltende Lösung durch die Zugabe von Calcium- und/oder Magnesiumbase auf einen pH-Wert von 5-10 eingestellt wird, wobei eine Lösung erhalten wird, die Calcium- und/oder Magnesium- Pantothensäure enthält und
- d) diese Lösung einer Trocknung und/oder Formulierung unterzogen wird.
Dabei kann die Fermentation nach an sich bekannten Vorgehensweisen im batch-,
fed-batch- oder repeated-fed-batch-Betrieb oder bei kontinuierlicher Prozeßführung
durchgeführt werden. Zur Neutralisation der entstehenden Pantothensäure werden
hierbei übliche Puffersysteme, wie z. B. Phosphat-Puffer mit NaOH, KOH oder
Ammoniak benutzt.
In weiteren Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt a)
wenigstens 10 g/l, bevorzugt wenigstens 20 g/l, besonders bevorzugt wenigstens 40 g/l,
höchst besonders bevorzugt wenigstens 60 g/l) und insbesondere wenigstens 70 g/l
an Salzen der D-Pantothensäure durch Fermentation im Kulturmedium gebildet.
Hierbei ist unter der Formulierung "produzieren" erfindungsgemäß zu verstehen, daß
der Organismus größere Mengen D-Pantothensäure und/oder deren Salze
synthetisieren kann, als für den eigenen Stoffwechselbedarf erforderlich sind. In einer
erfindungsgemäß vorteilhaften Variante liegt die synthetisierte Menge an D-
Pantothensäure und/oder deren Salze nicht zellintern vor, sondern wird idealerweise
vollständig aus dem Organismus in das Kulturmedium abgegeben. Dies
Ausschleusung kann aktiv oder passiv nach an sich bekannten Mechanismen
erfolgen.
Erfindungsgemäß werden als D-Pantothensäure produzierende Organismen
Mikroorganismen eingesetzt. Hierzu zählen erfindungsgemäß Pilze, Hefen und/oder
Bakterien. Erfindungsgemäß werden bevorzugt Pilze wie beispielsweise Mucor oder
Hefen, wie z. B. Saccharomyces oder Debaromyces und hierbei bevorzugt
Saccharaomyces cerevisiae eingesetzt. Vorteilhaft werden erfindungsgemäß
coryneforme Bakterien oder Bacillaceae verwendet. Erfindungsgemäß umfaßt sind
bevorzugt z. B. Bakterien der Gattungen Corynebacterium, Escherichia, Bacillus,
Arthrobacter, Bevibacterium, Pseudomonas, Salmonella, Klebsiella, Proteus,
Acinetobacter oder Rhizobium. Besonders bevorzugt sind hierbei beispielsweise
Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium breve oder Bacillus subtilis, B.
licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. lentimorbus, B. lentus, B. firmus,
B. pantothenticus, B. circulans, B. coagulans, B. megaterium, B. pumilus, B.
thuringiensis, B. brevis, B. stearothermophilus und andere Bacillusarten der Gruppe
1, die durch ihre 16sRNA charakerisiert sind oder Actinum mycetalis. Diese
Aufzählung dient der Erläuterung und ist keinesfalls limitierend für die vorliegende
Erfindung.
Darüber hinaus umfaßt die vorliegende Erfindung auch den Einsatz genetisch
veränderter Organismen zur erfindungsgemäßen Herstellung eines
Tierfuttersupplements enthaltend freie D-Pantothensäure und/oder deren Salze.
Solche genetisch veränderten Organismen können beispielsweise durch chemische
Mutagenese und anschließende Selektion durch eine geeignetes
"Screeningverfahren" isoliert werden. Erfindungsgemäß sind auch sogenannte
"Produktionsstämme" umfaßt, die zur Herstellung des Produktes im Sinne der
vorliegenden Erfindung geeignet sind und genetische Veränderungen hinsichtlich
des Stoffwechselflusses in Richtung D-Pantothensäure aufweisen, wobei auch
Veränderungen hinsichtlich der Ausschleusung von D-Pantothensäure und/oder
deren Salzen über die Zellmembran inbegriffen sind. Dies kann z. B. durch
Veränderungen an Schlüsselpositionen in relevanten Stoffwechsel-
Biosynthesewegen des eingesetzten Organismus erreicht werden.
Denkbar ist auch der Einsatz transgener Organismen, die aus der Übertragung
homologer und/oder heterologer Nukleotidsequenzen resultieren, welche zur
Synthese des gewünschten Produktes erforderlich sind oder förderlich sein können.
Hierbei ist die Überexpression und/oder Deregulation ein oder mehrerer Gene
einzeln und/oder in Kombination, lokalisiert im Genom und/oder auf einem Vektor,
denkbar.
Derartige transgene Organismen können in vorteilhafter Weise zusätzliche Kopien
und/oder genetisch veränderte Gene ausgewählt aus der Gruppe von panB, panC,
panD, panE und/oder deren Kombinationen und/oder sogar Organisationseinheiten,
wie das panBCD-Operon enthalten. Ferner können weitere Stoffwechselwege, wie
z. B. der Isoleucin-Valin-Biosyntheseweg in den Organismen vorteilhaft manipuliert
sein, wie beispielsweise in der EP 1 006 189, EP 1 006 192, EP 1 006 193 oder EP 1 001 027
beschrieben ist. Dadurch werden verzweigtkettige Vorläufersubstanzen der
Pantothensäure-Biosynthese vermehrt zur Verfügung gestellt. Vorteilhaft werden
gegebenenfalls die Gene für diesen Biosyntheseweg d. h. ilvB, ilvN, ilvC und/oder
ilvD überexprimiert.
Darüber hinaus sind genetische Veränderungen der Aspartat-α-Decarboxylase
(panD), z. B. durch Überexpression und/oder Deregulation, in dem eingesetzten D-
Pantothensäure produzierenden Organismus erfindungsgemäß umfaßt.
Unter der Formulierung "Deregulation" ist erfindungsgemäß folgendes zu verstehen:
Veränderung oder Modifikation mindestens eines Gens, das für ein Enzym in einem
biosynthetischen Stoffwechselweg kodiert, so daß die Aktivität des Enzyms in dem
Mikroorganismus verändert oder modifiziert ist. Bevorzugt ist, daß mindestens ein
Gen, das für ein Enzym eines biosynthetischen Stoffwechslewegs kodiert, derart
verändert ist, daß das Genprodukt verstärkt gebildet wird oder eine gesteigerte
Aktivität aufweist. Der Begriff "deregulierter Stoffwechselweg" schließt auch einen
biosynthetischen Stoffwechselweg mit ein, in den mehr als ein Gen, das für mehr als
ein Enzym kodiert, so verändert oder modifiziert ist, daß die Aktivitäten von mehr als
einem Enzym verändert oder modifiziert sind.
Veränderungen oder Modifikationen können beinhalten, sind aber nicht beschränkt
auf: Entfernen des endogenen Promotors oder regulatorischer Elemente; Einfügen
starker Promotoren, induzierbarer Promotoren oder mehrerer Promotoren
gleichzeitig; Entfernen regulatorischer Sequenzen, so daß die Expression des
Genprodukts verändert ist; Änderung der chromosomalen Lage des Gens;
Veränderung der DNA-Sequenz in der Nähe des Gens oder innerhalb des Gens wie
z. B. der ribosomalen Bindungsstelle (RBS); Erhöhung der Kopienzahl des Gens im
Genom oder durch Einbringung von Plasmiden verschiedener Kopienzahl;
Modifikation von Proteinen (z. B. regulatorischen Proteinen, Suppressoren,
Enhancern, trankriptionellen Aktivatoren, und ähnliche), die bei der Transkription des
Gens und/oder bei der Translation zum Genprodukt eine Rolle spielen. Dazu zählen
auch alle anderen Möglichkeiten zur Deregulation der Expression von Genen die
Stand der Technik sind wie z. B. die Verwendung von Antisense Oligonukleotiden,
oder die Blockierung von Repressor Proteinen.
Deregulation kann auch Veränderungen in der kodierenden Region von Genen
beinhalten, die z. B. zu Aufhebung von feedback Regulation in dem Genprodukt oder
zu einer größeren oder kleineren spezifischen Aktivität des Genprodukts führen.
Darüber hinaus sind gentechnische Veränderungen an Enzymen erfindungsgemäß
vorteilhaft, die den Abfluß von Vorstufen der Pantothensäure und/oder den Fluß der
Pantothensäure zu Coenzym A beeinflussen. Beispielhaft für solche Enzyme
kodierende Gene sind: alsD, avtA, ilvE, ansB, coaA, coaX und andere mehr. Diese
Aufzählung dient der Erläuterung und ist keinesfalls limitierend für die vorliegende
Erfindung.
Weiterhin sind gentechnische Veränderungen vorteilhaft, welche die zelluläre
Bereitstellung von Cofaktoren (z. B. von Methylentetrahydrofolat, Redoxäquivalenten
u. ä.) in für die Pantothensäure-Produktion optimaler Menge sichern.
In vorteilhafter Weise liegt so β-Alanin bereits in den Zellen in erhöhten
Konzentrationen gegenüber entsprechend nicht-genetisch veränderten Organismen
vor und muß somit nicht als Precursor dem Kulturmedium zugesetzt werden, wie es
z. B. in EP-A-0 590 857 erforderlich ist. Vorteilhaft sind Mikroorganismen, deren
Pantothensäure-(pan)- und/oder Isoleucin-Valin-(ilv)-Biosynthese und/oder Asparat-
α-Decarboxylase (panD) dereguliert ist. Weiterhin ist eine zusätzliche
Überexpression der Ketopanthoat-Reduktase (panE) in den Mikroorganismen von
Vorteil.
Weiterhin erfindungsgemäß von Vorteil ist, wenn gegebenenfalls das coaA-Gen, das
für die Synthese von CoenzymA erforderlich ist, in seiner Aktivität erniedrigt ist oder
(beispielsweise in Bacillus-Arten) ganz ausgeschaltet ist. Bacillus enthält nämlich
neben coaA ein weiteres Gen für diese enzymatische Funktion (= coaX). Auch die
Aktivität dieses Gens coaX oder des korrespondierenden Enzyms kann verändert,
bevorzugt erniedrigt, oder sogar deletiert werden, sofern coaA selbst noch eine
ausreichende, wenn auch erniedrigte Enzymaktivität aufweist, d. h. die Enzymaktivität
von coaA nicht ganz verloren gegangen ist. Neben der Überexpression der
verschiedenen Gene ist auch eine genetische Manipulation der Promotorregionen
dieser Gene in der Art vorteilhaft, daß diese Manipulation zu einer Überexpression
der Genprodukte führt.
In einer Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung finden die gemäß der
Anlage (PCT/US-Anmeldung 0025993) beschriebenen Bakterienstämme, wie z. B.
PA 668 und/oder Derivate davon Einsatz. In einer bevorzugten Ausführungsvariante
findet erfindungsgemäß der Mikroorganismus Bacillus subtilis PA 824, wie gemäß
der Anlage (PCT/US-Anmeldung 0025993) beschrieben, Einsatz in dem
erfindungsgemäßen Verfahren. Dieser Stamm Bacillus subtilis PA 824 wurde wie
folgt hergestellt:
Ausgehend von dem Stamm Bacillus subtilis 168 (Marburg Stamm ATCC 6051), der
den Genotyp trpC2 (Trp-) ausweist, wurde über Transduktion des Trp+ Markers (aus
dem Bacillus subtilis Wildtyp W23) der Stamm PY79 erzeugt. In den Stamm PY79
wurden durch klassische gentechnische Methoden (wie z. B. in Harwood, C. R. and
Cutting, S. M. (editors), Molecular Biological Methods for Bacillus (1990) John Wiley &
Sons, Ltd., Chichester, England beschrieben) ΔpanB und ΔpanE1 Mutationen
eingebracht.
Der resultierende Stamm wurde mit genomischer DNA des Bacillus subtilis Stammes
PA221 (Genotyp P26panBCD, trpC2 (Trp-)) und genomischer DNA des Bacillus
subtilis Stammes PA303 (Genotyp P26panE1) transformiert. Der resultierende Stamm
PA327 hat den Genotyp P26panBCD, P26panE1 und ist Tryptophan auxotroph (Trp-).
Mit dem Bacillus subtilis Stamm PA327 wurde in 10 mL Kulturen mit SVY-Medium
(25 g/L Difco Veal Infusion Broth, 5 g/L Difco Yeast Extract, 5 g/L Na-Glutamat, 2,7 g/L
Ammoniumsulfat auf 740 mL Wasser auffüllen, autoklavieren, anschließend
Zugabe von 200 mL 1 M Kaliumphosphat, pH 7,0 und 60 mL 50% steriler
Glucoselösung), das mit 5 g/L β-Alanin und 5 g/L α-Ketoisovalerat supplementiert
war, Pantothensäure-Titer von bis zu 3,0 g/L (24 h) erreicht.
Die Herstellung des Bacillus subtilis Stammes PA221 (Genotyp P26panBCD, trpC2
(Trp-)) ist in folgendem Abschnitt beschrieben:
Durch klassische gentechnische Methoden wurde mit Hilfe der Sequenzinformation
des panBCD Operons von E. coli (siehe Merkel et al., FEMS Microbiol. Lett., 143,
1996: 247-252) ausgehend von einer Bacillus subtilis GP275 Plasmid-Bibliothek das
panBCD Operon von Bacillus kloniert. Zur Klonierung wurde der E. coli Stamm
BM4062 (birts) und die Information, daß das Bacillus Operon in der Nähe des birA
Gens liegt, verwendet. Das panBCD Operon wurde in ein in E. coli replizierbares
Plasmid eingebracht. Zur Verbesserung der Expression des panBCD Operons
wurden starke, konstitutive Promotoren des Bacillus subtilis Phagen SP01 (P26)
verwendet und die Ribosomenbindungsstelle (= RBS) vor dem panB-Gen durch eine
artifizielle RBS ersetzt. Vor die P26panBCD Kassette auf dem Plasmid wurde ein
DNA Fragment, das unmittelbar upstream des nativen panB Gens in Bacillus liegt,
ligiert. Dieses Plasmid wurde in den Bacillus subtilis Stamm RL-1 (durch klassische
Mutagenese erhaltenes Derivat des Bacillus subtilis 168 (Marburg Stamm ATCC
6051), Genotyp trpC2 (Trp-)) transformiert und durch homologe Rekombination
wurde das native panBCD Operon durch das p26panBCD Operon ersetzt. Der
resultierende Stamm heißt PA221 und hat den Genotyp P26panBCD, trpC2 (Trp-).
Mit dem Bacillus subtilis Stamm PA221 wurde in 10 mL Kulturen mit SVY-Medium,
das mit 5 g/L β-Alanin und 5 g/L α-Ketoisovalerat supplementiert war,
Pantothensäure-Titer von bis zu 0,92 g/L (24 h) erreicht.
Die Herstellung des Bacillus subtilis Stamms PA303 (Genotyp P26panE1) ist in
folgendem Abschnitt beschrieben:
Mit Hilfe der E. coli panE Gensequenz wurde die Bacillus panE Sequenz analog
kloniert. Es zeigte sich, daß in B. subtilis zwei Homologe des panE Gens von E. coli
existieren, die mit panE1 und panE2 bezeichnet wurden. Durch Deletionsanalysen
zeigte sich, daß das panE1 Gen für 90% der Pantothensäure Produktion
verantwortlich ist, während die Deletion des panE2 Gens keinen signifikanten Effekt
auf die Pantothensäure Produktion hatte. Auch hier wurde analog zur Klonierung des
panBCD Operons der Promotor durch den starken konstitutiven Promotor P26 ersetzt
und die Ribosomenbindungsstelle vor dem panE1 Gen durch die artifizielle
Bindungsstelle ersetzt. Das P26panE1 Fragment wurde in einen Vektor kloniert, des
so gestaltet war, daß das P26panEl Fragment in den original panE1 locus im Genom
von Bacillus subtilis integrieren konnte. Der nach Transformation und homologer
Rekombination resultierende Stamm heißt PA303 und hat den Genotyp P26panE1.
Mit dem Bacillus subtilis Stamm PA303 wurde in 10 mL Kulturen mit SVY-Medium,
das mit 5 g/L β-Alanin und 5 g/L α-Ketoisovalerat supplementiert war,
Pantothensäure-Titer von bis zu 1,66 g/L (24 h) erreicht.
Die weitere Stammkonstruktion erfolgte durch Transformation von PA327 mit einem
Plasmid, welches das P26ilvBNC Operon und das Marker-Gen für Spectinomycin
enthielt. Das P26ilvBNC Operon integrierte in den amyE locus, was durch PCR
nachgewiesen wurde. Ein Transformante wurde als PA340 (Genotyp P26panBCD,
P26panE1, P26ilvBNC, specR, trpC2 (Trp-)) bezeichnet.
Mit dem Bacillus subtilis Stamm PA340 wurde in 10 mL Kulturen mit SVY-Medium,
das nur mit 5 g/L β-Alanin supplementiert war, Pantothensäure-Titer von bis zu 3,6 g/L
(24 h) erreicht, in 10 ml Kulturen mit SVY-Medium, das mit 5 g/L β-Alanin und 5 g/L
α-Ketoisovalerat supplementiert war, wurden Pantothensäure-Titer von bis zu 4,1 g/L
(24 h) erreicht.
Des weiteren wurde in den Stamm PA340 eine deregulierte ilvD-Kassette
eingebracht. Dazu wurde ein Plasmid, welches das ilvD Gen unter der Kontrolle des
P26 Promotors mit der artifiziellen RBS2 enthält, in PA340 transformiert. Dabei wurde
das P26ilvD Gen durch homologe Rekombination in den original ilvd locus integriert.
Der resultierende Stamm PA374 hat den Genotyp P26panBCD, P26panE1, P26ilvBNC,
P26ilvD, specR und trpC2 (Trp-).
Mit dem Bacillus subtilis Stamm PA374 wurde in 10 mL Kulturen mit SVY-Medium,
das nur mit 5 g/L β-Alanin supplementiert war, Pantothensäure-Titer von bis zu 2,99 g/L
(24 h) erreicht.
Um mit dem Stamm PA374 β-Alanin zufütterungsfrei Pantothensäure zu
produzieren, wurden zusätzliche Kopien des für die Aspartat-α-decarboxylase
kodierenden Gens panD in den Stamm PA374 eingebracht. Dazu wurde
chromosomale DNA des Stammes PA401 in PA374 transformiert. Durch Selektion
auf Tetrazyklin wurde der Stamm PA377 erhalten.
Der resultierende Stamm PA377 hat den Genotyp P26panBCD, P26panE1, P26ilvBNC,
P26ilvD, specR, tetR und trpC2 (Trp-).
Mit dem Bacillus subtilis Stamm PA377 wurde in 10 mL Kulturen mit SVY-Medium
Vorstufen-zufütterungsfrei Pantothensäure-Titer von bis zu 1,31 g/L (24 h) erreicht.
Die Herstellung des Bacillus subtilis Stamms PA401 (Genotyp P26panD) ist in
folgendem Abschnitt beschrieben:
Das Bacillus subtilis panD Gen wurde aus dem panBCD Operon in einen Vektor, der
das Tetrazyklin Marker Gen trägt, kloniert. Vor das panD Gen wurde der Promotor
P26 und eine oben beschriebene artifizielle RBS kloniert. Durch Restriktionsverdau
wurde ein Fragment, das das Tetrazyklin Marker Gen und das P26panD Gen enthielt,
hergestellt. Dieses Fragment wurde religiert und in den oben beschriebenen Stamm
PA221 transformiert. Dabei integrierte das Fragment in das Genom des Stamms
PA211. Der resultierende Stamm PA401 hat den Genotyp P26panBCD, P26panD,
tetR und trpC2 (Trp-).
Mit dem Bacillus subtilis Stamm PA401 wurde in 10 mL Kulturen in SVY-Medium,
das mit 5 g/L α-Ketoisovalerat supplementiert war, Pantothensäure-Titer von bis zu
0,3 g/L (24 h) erreicht. In 10 mL Kulturen mit SVY-Medium das mit 5 g/L D-
Pantoinsäure und 10 g/L L-Aspartat supplementiert war, wurden Pantothensäure-
Titer von bis zu 2,2 g/L (24 h) erreicht.
Ausgehend von Stamm PA377 wurde durch Transformation mit chromosomaler DNA
von Stamm PY79 ein Tryptophan prototropher Stamm generiert. Dieser Stamm
PA824 hat den Genotyp P26panBCD, P26panE1, P26ilvBNC, P26ilvD, specR, tetR und
Trp+.
Mit dem Bacillus subtilis Stamm PA824 wurde in 10 mL Kulturen in SVY-Medium
Vorstufen-zufütterungsfrei Pantothensäure-Titer von bis zu 4,9 g/L (48 h) (Vergleich
PA377: bis zu 3,6 g/L in 48 h) erreicht.
Die genaue Konstruktion der Stämme ist gemäß der Anlage der PCT/US-Anmeldung
0025993 zu entnehmen.
Mit dem oben beschriebenen Stamm PA377 wird bei Glucose-limitierter
Fermentation in SVY-Medium (25 g/L Difco Veal Infusion Broth, 5 g/L Difco Yeast
Extract, 5 g/L Tryptophan, 5 g/L Na-Glutamat, 2 g/L (NH4)2SO4, 10 g/L KH2PO4, 20 g/L
K2HPO4, 0,1 g/L CaCl2, 1 g/L MgSO4, 1 g/L Natriumcitrat, 0,01 g/L FeSO4.7H2O
und 1 ml/L einer Spurensalzlösung folgender Zusammensetzung 0,15 g Na2MoO4 ×
2H2O, 2,5 g H3BO3, 0,7 g CoCl2 × 6H2O, 0,25 g CuSO4 × 5H2O, 1,6 g MnCl2 × 4
H2O, 0,3 g ZnSO4 × 7H2O, mit Wasser auf 1 l aufgefüllt)) im 10 L Maßstab bei
kontinuierlicher Zufütterung einer Glucose-Lösung in 36 h (48 h) Pantothensäure-
Konzentrationen in der Fermentationsbrühe von 18-19 g/L (22-25 g/L) erreicht.
Bei Glucose-limitierter Fermentation von PA824, dem Tryptophan-prototrophen
Derivat von PA377, in Hefeextrakt-Medium (10 g/L Difco Yeast Extract, 5 g/L Na-
Glutamat, 8 g/L (NH4)2SO4, 10 g/L KH2PO4, 20 g/L K2HPO4, 0,1 g/L CaCl2, 1 g/L
MgSO4, 1 g/L Natriumcitrat, 0,01 g/L FeSO4.7H2O und 1 ml/L der oben
beschriebenen Spurensalzlösung) werden im 10 L Maßstab bei kontinuierlicher
Zufütterung einer Glucose-Lösung in 36 h, 48 h und 72 h folgende Pantothensäure-
Konzentrationen in Fermentationsbrühen erreicht: 20 g/L, 28 g/L und 36 g/L.
Durch weitere Medienoptimierung wird mit Stamm PA824 bei Glucose-limitierter
Fermentation in einem Medium bestehend aus 10 g/L Difco Yeast Extract, 10 g/L NZ
Amine A (Quest International GmbH, Erftstadt), 10 g/L Na-Glutamat, 4 g/L
(NH4)SO4, 10 g/L KH2PO4, 20 g/L K2HPO4, 0,1 g/L CaCl2, 1 g/L MgSO4, 1 g/L
Natriumcitrat, 0,01 g/L FeSO4.7H2O und 1 ml/L der oben beschriebenen
Spurensalzlösung im 10 L Maßstab bei kontinuierlicher Zufütterung einer Glucose-
Lösung in 36 h (48 h) Pantothensäure-Konzentrationen von 37 g/L (48 g/L) in
Fermentationsbrühen erreicht.
Weitere Erhöhungen der Pantothensäure-Konzentration in der Fermentationsbrühe
sind durch weitere Medienoptimierung, durch Erhöhung der Fermentationsdauer,
durch Verfahrens- und Stammverbesserung sowie durch Kombinationen der
einzelnen Schritte denkbar. So sind die oben beschriebenen Pantothensäure-
Konzentrationen auch durch Fermentation von Stämmen zu erreichen, die Derivate
des oben beschriebenen PA824 sind. Derivate können durch klassische
Stammentwicklung sowie durch weitere gentechnische Manipulationen hergestellt
werden. Durch Medien-, Stamm- und Fermentationsverfahrensentwicklung können
die Pantothensäure-Titer in den Fermentationsbrühen auf über 40, 45, 50, 55, 60, 65,
70, 75, 80, 85, und < 90 g/L gesteigert werden.
Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß die
Fermentation in einem Kulturmedium durchgeführt wird, das außer wenigstens einer
Kohlenstoff und Stickstoffquelle als Ausgangsverbindungen keine weiteren
Vorstufen (Precursor) enthält. D. h. die Biosynthese von D-Pantothensäure ist von der
Zufütterung weiterer Vorstufen unabhängig. Unter solchen Vorstufen sind
erfindungsgemäß Substanzen wie z. B. β-Alanin und/oder L-Aspartat und/oder L-
Valin und/oder α-Ketoisovalerat und/oder deren Kombinationen zu verstehen.
In einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahren wird die
Fermentation des D-Pantothensäure produzierenden Organismus in einem
Kulturmedium durchgeführt, welches eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle
enthält, dem aber kein freies β-Alanin und/oder β-Alanin-Salze zugesetzt ist oder im
Verlauf der Fermentation zugeführt wird. D. h. zur Herstellung von D-Pantothensäure
in Bereichen von wenigstens 10 g/l, Kulturmedium, bevorzugt von wenigstens 20 g/l,
besonders bevorzugt von wenigstens 40 g/l, höchst besonders bevorzugt von
wenigstens 60 g/l, und insbesondere von wenigstens 70 g/l,, ist erfindungsgemäß
keine Zufütterung von freiem β-Alanin und/oder β-Alanin-Salzen erforderlich.
Die Unabhängigkeit von der Zufütterung von Vorstufen stellt insbesondere einen
wesentlichen wirtschaftlichen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber
bekannten Verfahren dar, da eine Vielzahl von Vorstufen sehr teuer sind.
Die Zugabe von β-Alanin und/oder β-Alanin-Salzen ist erfindungsgemäß jedoch nicht
ausgeschlossen, so daß folglich die Ausbeute an D-Pantothensäure durch die
Zugabe von β-Alanin und/oder β-Alanin-Salzen noch weiter verbessert werden kann.
Geht man beispielsweise davon aus, daß alle erforderlichen Vorstufen der
Pantothensäure in ausreichender Menge vorhanden sind lediglich die Aktivität des
panD-Gens eine weitere Steigerung der Pantothensäure-Produktion limitiert, so kann
die Ausbeute an Pantothensäure z. B. um weitere 50% durch die Zugabe von freiem
β-Alanin und/oder β-Alanin-Salzen gesteigert werden.
In einer vorteilhaften Variante der vorliegenden Erfindung können bis zu 20 g/l, an
freiem β-Alanin und/oder β-Alanin-Salzen dem Kulturmedium zur zusätzlichen
Steigerung der Pantothensäureausbeute um mehr als 50% zugesetzt werden.
Bevorzugt ist der Zusatz von etwa 15 g/l an freiem β-Alanin und/oder β-Alanin-Salzen
zum Kulturmedium.
Beispiele erfindungsgemäß geeigneter Kohlenstoffquellen zum Einsatz in einem
Kulturmedium zur Fermentation der zuvor genannten Organismen sind Zucker, wie
Stärkehydrolysate (Mono-, Di-, Oligosaccharide), bevorzugt Glucose oder
Saccharose sowie Rüben- oder Rohrzuckermelasse, Proteine, Proteinhydrolysate,
Sojamehl, Maisquellwasser, Fette, freie Fettsäuren, rückgeführte Zellen aus bereits
durchgeführten Fermentationen oder deren Hydrolysate sowie Hefeextrakt. Diese
Aufzählungen sind nicht limitierend für die vorliegende Erfindung.
Ferner zeichnet sich das vorliegende Verfahren in vorteilhafter Weise dadurch aus,
daß der Gesamt-Zuckergehalt bis zum Ende der Fermentation auf ein Minimum
reduziert wird, da dieser anderenfalls die spätere Trocknung und/oder Formulierung
der Fermentationslösung durch Verkleben erschwert. Dies kann erfindungsgemäß
dadurch erreicht werden, daß die Fermentation noch einige Zeit weitergeführt wird,
nachdem die Kohlenstoffquelle verbraucht ist (bei Kultivierung im batch-Betrieb) oder
nachdem die Kohlenstoffzufuhr (bei einer Prozeßführung im fed-batch oder repeated
fed-batch-Betrieb) unterbrochen ist und/oder derart reguliert ist, daß die
Konzentration der Kohlenstoffquelle nahezu Null ist (bei fed-batch, repeated-fed
batch oder kontinuierlicher Prozeßführung).
Dies erfolgt erfindungsgemäß dadurch, daß nach Unterbrechung der Zudosierung
der Kohlenstoffquelle (z. B. Zuckerlösung) die Fermentation bis zum Erreichen der
Gelöstsauerstoffkonzentration (pO2) auf wenigstens 80%, bevorzugt 90% und
besonders bevorzugt 95% des Sättigungswertes in der Fermentationslösung
weitergeführt wird.
Beispiele erfindungsgemäß geeigneter Stickstoffquellen sind Ammoniak,
Ammoniumsulfat, Harnstoff, Proteine, Proteinhydrolysate oder Hefeextrakt. Auch
diese Aufzählung ist nicht limitierend für die vorliegende Erfindung.
Ferner enthält das Fermentationsmedium Mineralsalze und/oder Spurenelemente,
wie Aminosäuren und Vitamine. Die genauen Zusammensetzungen geeigneter
Fermentationsmedien sind zahlreich bekannt und dem Fachmann zugänglich.
Nach Inokkulation des Fermentationsmediums mit einem geeigneten D-
Pantothensäure produzierenden Organismus (mit dem Fachmann bekannten
Zelldichten) erfolgt, ggf. unter Zusatz eines Antischaummittels, die Kultivierung des
Organismus. Eine ggf. erforderliche Regulierung des pH-Wertes des Mediums kann
mit verschiedenen anorganischen oder organischen Laugen oder Säuren erfolgen,
wie z. B. NaOH, KOH, Ammoniak, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Salzsäure,
Ameisensäure, Bersteinsäure, Zitronensäure o. ä.
Aufgrund der während der Fermentation eingesetzten Puffersysteme, die wie zuvor
beschrieben, z. B. NaOH, KOH, Ammoniak, Phosphorsäure, Schwefelsäure,
Salzsäure, Ameisensäure, Bersteinsäure, Zitronensäure o. ä. sein können, liegt die
gebildete D-Pantothensäure in der Fermentationslösung je nach eingesetztem
Puffersystem in Form des/der jeweiligen Salze(s) vor. Da hierbei insbesondere die
Salze der D-Pantothensäure in Form ihrer einwertigen Kationen unvorteilhaft sind,
wird die Fermentationslösung erfindungsgemäß unter Einsatz eines
Kationenaustauschers aufbereitet.
Die vorliegende Erfindung umfaßt hierbei alle gewerblich verfügbaren
Kationenaustauscher. Erfindungsgemäß geeignete Kationentauscher zur Umsalzung
von Pantothenat-Salzen zur Pantothensäure sind in der H+-Form vorliegende, saure
Harze auf Acrylat-Basis mit Carboxyl-Funktionalitäten und/oder Polystyrolharze mit
Sulfonat-Gruppen, bspw. Lewatit CNP 80, CNP 105, VP OC 1505, S 100 und SP 112
(Firma Bayer, Leverkusen, Deutschland), Diaion PK 216 (Firma Mitsubishi Chemical
Corp, Tokyo, Japan), Amberlite 252 (Firma Rohm and Haas, Philadelphia, USA).
Bevorzugte Kationentauscher sind stark saure Ionenaustauscher in der H+-Form auf
Basis sulfonierten Polystyrols. Besonders bevorzugt sind monodisperse
Kationenaustauscher, wie z. B. Lewatit SP 112 Monoplus.
Wie für den Fachmenschen geläufig, können die Ionenaustauscher nach
Erschöpfung mit Mineralsäuren wieder in die H+-Form regeneriert und dadurch
vielfach verwendet werden.
Durch den Einsatz des Kationenaustauschers werden die einwertige Kationen, wie z. B.
Ammonium, Kalium oder Natrium in vorteilhafter Weise nahezu vollständig aus der
Fermentationslösung entfernt, so daß in der Lösung aus den D-Pantothensäure-
Salzen freie D-Pantothensäure gebildet wird. Erfindungsgemäß wird der Gehalt an
einwertigen Kationen, bevorzugt Ammonium-, Kalium- und/oder Natrium-Ionen, auf
eine Konzentration von ≦ 1 g/kg Lösung reduziert.
Die so erhaltene Lösung an freier Pantothensäure wird erfindungsgemäß durch die
Zugabe an Calcium- und/oder Magnesiumbase auf einen pH-Wert von 5-10,
bevorzugt von 6-9, besonders bevorzugt von 7-8 eingestellt, wodurch eine Lösung an
Calcium- und/oder Magnesium-Pantothenat erhalten wird. Bevorzugt wird der
Lösung zur Neutralisation Calciumhydroxid, Calciumcarbonat, Calciumoxid,
Magnesiumhydroxid und/oder basisches Magnesiumcarbonat in Form eines
Feststoffes und/oder als wässrige Dispersion zugegeben.
Hierbei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Neutralisation der freien D-
Pantothensäure enthaltenden Lösung mit Hilfe einer Calcium- und/oder
Magnesiumbase in Form einer wässrigen Dispersion erfolgt. Durch den Einsatz einer
wässrigen Dispersion erfolgt die Neutralisation schneller und ohne größere pH-
Schwankungen als dies bei Einsatz eines entsprechenden Feststoffes der Fall ist.
Erfindungsgemäß zeichnet sich das Verfahren dadurch aus, daß der Lösung in
Schritt c) eine wässrige Suspension enthaltend 2-55 Gew.-%, bevorzugt 10-50 Gew.%
und besonders bevorzugt 20-40 Gew.-% an Calciumhydroxid zugegeben wird.
Erfindungsgemäß umfaßt ist ferner ein Verfahren, bei dem der Lösung in Schritt c)
eine wässrige Suspension enthaltend 2-65 Gew.-%, bevorzugt 10-50 Gew.-% und
besonders bevorzugt 20-40 Gew.-% an Calciumcarbonat zugegeben wird. In einer
weiteren Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung wird der Lösung in Schritt
c) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine wässrige Suspension enthaltend 2-60 Gew.-%,
bevorzugt 10-50 Gew.-% und besonders bevorzugt 20-40 Gew.-% an
Magnesiumhydroxid zugegeben. Erfindungsgemäß umfaßt ist auch ein Verfahren,
wobei der Lösung in Schritt c) eine wässrige Suspension enthaltend 2-25 Gew.-%,
bevorzugt 10-20 Gew.-% an basischem Magnesiumcarbonat zugegeben wird.
Die Trocknung und/oder Formulierung der Calcium- und/oder Magnesium-D-
Pantothenat-haltigen Lösung erfolgt nach an sich bekannten Verfahren, wie
beispielsweise Sprühtrocknung, Sprühgranulation, Wirbelschichttrocknung,
Wirbelschichtgranulation, Trommeltrocknung oder Spin-flash Trocknung (Ullmann's
Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th edition, 1999, electronic release, Kapitel
"Drying of Solid Materials"). Die Gaseintrittstemperatur bei Konvektionstrocknung
liegt im Bereich von 100-280°C, bevorzugt bei 120-210°C. Die
Gasaustrittstemperatur liegt bei 50-180°C, bevorzugt bei 60-150°C. Zur
Einstellung einer gewünschten Partikelgrößenverteilung und der damit verbundenen
Produkteigenschaften können Feinpartikel abgetrennt und zurückgeführt werden.
Ferner kann Grobgut in einer Mühle gemahlen und ebenfalls anschließend
zurückgeführt werden.
Erfindungsgemäß vorteilhaft ist bei dem zuvor dargestellten Verfahren die
Reduzierung aufwendiger Aufarbeitungsschritte, insbesondere der Verzicht auf den
Einsatz organischer Lösungsmittel, bei gleichzeitiger Bereitstellung eines
gewünschten Produktes mit guter biologischer Wertigkeit. Ferner wird
erfindungsgemäß die Menge an anfallendem Abwasser wesentlich reduziert. Dies
resultiert somit in weiteren Einsparungen an aufwendigen Aufbereitungs- und
Entsorgungsanlagen. Somit zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren in
vorteilhafter Weise dadurch aus, daß es einfacher, weniger störanfällig, weniger
zeitaufwendig, deutlich kostengünstiger und damit wirtschaftlicher ist, als
herkömmliche Verfahren.
Dies schließt jedoch nicht aus, daß das erfindungsgemäße Verfahren variiert werden
kann. Die eingangs genannten erfindungsgemäßen Verfahrensschritte a) bis d)
können durch einen oder mehrere der folgenden Verfahrensschritte ergänzt werden,
die für sich genommen dem Fachmenschen vertraut sind. Hierbei sind alle
denkbaren Kombinationen der zusätzlichen (fakultativen) Verfahrensschritte mit den
(essentiellen) Verfahrensschritten a) bis d) erfindungsgemäß umfaßt.
So können die Lösungen resultierend aus den Verfahrensschritten a)-c) z. B. durch
Erhitzen (Sterilisation) oder andere Methoden, wie z. B. Pasteurisierung oder
Sterilfiltration entkeimt werden.
In weiteren Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens kann vor der Trocknung
und/oder Formulierung der Lösung wenigstens einer und/oder Kombinationen der
nachfolgenden Schritte durchgeführt werden, umfassend Lyse und/oder Abtötung der
Biomasse und/oder Abtrennung der Biomasse von der Fermentationslösung
und/oder Zugabe weiterer Zuschlagstoffe und/oder Konzentrierung der
Fermentationslösung, bevorzugt durch Wasserentzug.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch ein Verfahren, wobei die Lyse
und/oder Abtötung der Biomasse noch in der Fermentationslösung oder erst nach
der Abtrennung der Biomasse von der Fermentationslösung durchgeführt wird. Dies
kann beispielsweise durch eine Temperaturbehandlung, bevorzugt bei 80-200°C
und/oder eine Säurebehandlung, bevorzugt mit Schwefelsäure oder Salzsäure
und/oder enzymatisch, bevorzugt mit Lysozym erfolgen.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Zellen der
fermentierten Mikroorganismen durch Filtration, Separation (z. B. Zentrifugieren)
und/oder Dekantieren aus den Lösungen der Schritte a), b) oder c) des
erfindungsgemäßen Verfahrens entfernt werden. Denkbar ist auch, daß die
Lösungen der Schritte a), b) oder c) ohne die Abtrennung der enthaltenen
Organismen direkt über einen Kationenaustauscher geleitet werden.
Sofern dem Aufarbeitungsschritt durch Kationentauscher (Schritt b)) des
erfindungsgemäßen Verfahrens keine Abtrennung der Biomasse vorausgeht, kann
die Biomasse enthaltende Fermentationslösung in vorteilhafter Weise auch von
unten nach oben, also entgegen der Schwerkraft, durch das Ionenaustauscherbett
geleitet werden.
Die aus der Aufarbeitung über den Kationenaustauscher resultierende Lösung kann
im Anschluß an die Neutralisation über einen geeigneten Verdampfer, z. B.
Fallfilmverdampfer, Dünnschichtverdampfer oder Rotationsverdampfer
aufkonzentriert werden. In einer weiteren Variante kann der eigentlichen Trocknung
und/oder Formulierung der Lösung in Schritt d) des eingangs erwähnten
erfindungsgemäßen Verfahrens eine Aufkonzentrierung vorangehen. Hierzu wird die
Lösung aus Schritt c) z. B. in einem Fallfilmverdampfer und/oder einem
Dünnschichtverdampfer aufkonzentriert. Solche Verdampfer werden z. B. von den
Firmen GIG (4800 Attnang Puchheim, Österreich), GEA Canzler (52303 Düren,
Deutschland), Diessel (31103 Hildesheim, Deutschland) und Pitton (35274 Kirchhain,
Deutschland) hergestellt.
Um die farblichen Eigenschaften des Endproduktes zu verbessern, kann ein
zusätzlicher Filtrationsschritt durchgeführt werden, bei dem den während des
Verfahrens erhaltenen Lösungen etwas Aktivkohle zugesetzt wird und diese
Suspension anschließend filtriert wird. Oder die während der Fermentation
erhaltenen Lösungen können über ein kleines Aktivkohlebett geleitet werden. Die
hierzu erforderlichen Mengen eingesetzter Aktivkohle liegen im Bereich weniger
Gew.-% der Lösung und liegen im Wissen und Ermessen des Fachmanns.
Diese Filtrationen können erleichtert werden, indem der jeweiligen Lösung vor der
Filtration ein handelsübliches Flockungshilfsmittel (z. B. Sedipur CF 902 oder
Sedipur CL 930 der Firma BASF AG, Ludwigshafen) zusetzt wird.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der
Fermentationsaustrag (Fermentationsbrühe) durch Erhitzen sterilisiert und dann
durch Zentrifugieren, Filtrieren oder Dekantieren von der Zellmasse befreit. Nach
Zusatz von 50-1000 mg/kg, bevorzugt 100-200 mg/kg eins handelsüblichen
Flockungshilfsmittels bezogen auf den Fermentationsaustrag wird über ein kurzes
Bett von Aktivkohle und Sand filtriert, um eine Biomasse-freie Lösung mit hohem D-
Pantothensäure-Gehalt zu erhalten. Anschließend wird diese aufbereitete Lösung
durch das Ionenaustauscherbett (in H+-Form) gefördert.
Sofern dem erfindungsgemäßen Aufarbeitungsschritt über einen
Kationenaustauscher keine Abtrennung der Biomasse vorausgeht, kann die
Biomasse enthaltende Fermentationslösung in vorteilhafter Weise auch von unten
nach oben, also entgegen der Schwerkraft, durch das Ionenaustauscherbett geleitet
werden.
Die sich anschließende Trocknung dieser Lösung kann beispielsweise durch
Sprühtrocknung erfolgen. Diese kann im Gleichstrom, Gegenstrom oder Mischstrom
erfolgen. Zur Zerstäubung können alle bekannten Zerstäuber herangezogen werden,
insbesondere Zentrifugalzerstäuber (Zerstäuberscheibe), Einstoffdüse oder
Zweistoffdüse. Bevorzugte Trocknungstemperaturbedingungen sind 150-250°C
Turmeintrittstemperatur und 70-130°C Turmaustrittstemperatur. Es kann aber auch
bei höherem oder niedrigeren Temperaturniveau getrocknet werden. Um eine sehr
niedrige Restfeuchte zu erzielen, kann noch ein weiterer Trocknungsschritt in einem
Wirbelbett nachgeschaltet werden.
Die Sprühtrocknung läßt sich auch in einem FSD- oder SBD-Trockner (FSD:
Fluidized Spray Dryer; SBD: Spray Bed Dryer), wie sie von den Firmen Niro
(Kopenhagen, Dänemark) und APV-Anhydro (Kopenhagen, Dänemark) gebaut
werden, durchführen, die eine Kombination von Sprühtrockner und Wirbelbett
darstellen.
Bei der Sprühtrocknung kann ein Fließhilfsmittel zugesetzt werden. Dadurch können
die Beläge an der Trocknerwandung reduziert und das Fließverhalten, gerade bei
feinkörnigen Pulvern verbessert werden. Als Fließhilfsmittel kommen insbesondere
Silikate, Stearate, Phosphate und Maisstärke in Betracht.
Prinzipiell kann die Trocknung auch in einer Sprühwirbelschicht erfolgen, wobei diese
sowohl kontinuierlich als auch diskontinuierlich betrieben werden kann. Das
Einsprühen der Lösung kann sowohl von oben (Topspray), von unten (Bottomspray)
als auch von der Seite (Sidespray) erfolgen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Zusammensetzung für den
Einsatz als Tierfutterzusalz und/oder Tierfutterergänzungsmittel, wobei sie
herstellbar ist, indem
- a) wenigstens ein D-Pantothensäure produzierender Organismus eingesetzt wird, dessen Pantothensäure-(pan)- und/oder Isoleucin/Valin-(ilv)- Biosynthese dereguliert ist und der wenigstens 2 g/l, an Salzen der D- Pantothensäure durch Fermentation in einem Kulturmedium bildet, wobei dem Kulturmedium 0-20 g/l, bevorzugt 0 g/l freies β-Alanin und/oder β- Alanin-Salz zugeführt wird,
- b) die D-Pantothenat enthaltende Fermentationslösung über einen Kationenaustauscher geleitet wird, wobei aus den Salzen der D- Pantothensäure freie D-Pantothensäure entsteht,
- c) die freie D-Pantothensäure enthaltende Lösung durch die Zugabe einer Calcium- und/oder Magnesiumbase auf einen pH-Wert von 5-10 eingestellt wird, wobei eine Lösung erhalten wird, die Calcium- und/oder Magnesium- Pantothenat enthält und
- d) diese Lösung einer Trocknung und/oder Formulierung unterzogen wird.
Die Zusammensetzung zeichnet sich erfindungsgemäß dadurch aus, daß sie Salze
der D-Pantothensäure in einer Konzentration von wenigstens 1-100 Gew.-%,
bevorzugt wenigstens 20-100 Gew.-% und besonders bevorzugt wenigstens 50 Gew.-%
enthält. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung,
die Salze der D-Pantothensäure in Form zweiwertiger Kationen, bevorzugt Calcium-
und/oder Magnesium-D-Pantothenat enthält. Erfindungsgemäß bevorzugt ist eine
Zusammensetzung, die sich dadurch auszeichnet, daß der Gehalt an Salzen der D-
Pantothensäure in Form einwertiger Kationen ≦ 1 g/kg ist.
Erfindungsgemäß wird durch das zuvor beschriebene Verfahren ein Calcium- oder
Magnesium-D-Pantothenat erhalten, das den Ansprüchen für einen
Futtermittelzusatzstoff genügt. Diese Anforderungen sind beispielsweise ein relativ
hoher Gehalt an D-Pantothenat und eine gute Verträglichkeit für den Zielorganismus
sowie eine biologische Wertigkeit im Sinne der "Vitamin-Wirkung" des
erfindungsgemäßen Produktes.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert,
die jedoch nicht limitierend für die Erfindung sind:
In einem Laborfermenter mit Rührer und Begasungseinrichtung mit 14 l Inhalt wird
wässriges Fermentationsmedium mit der folgenden Zusammensetzung vorgelegt:
Nach der Sterilisation werden folgende sterile Medienkomponenten zusätzlich
zugegeben:
Die Spurensalzlösung setzt sich wie folgt zusammen:
0,15 g Na2MoO4 × 2H2O, 2,5 g H3BO3, 0,7 g CoCl2 × 6H2O, 0,25 g CuSO4 × 5H2O, 1,6 g MnCl2 × 4H2O, 0,3 g ZnSO4 × 7H2O werden mit Wasser auf 1 l aufgefüllt. Die Zugabe der Spurensalzlösung erfolgt über eine Sterilfiltration. Das Anfangsflüssigkeitsvolumen beträgt 6 l. Die oben angeführten Gehalte sind auf diesen Wert bezogen.
0,15 g Na2MoO4 × 2H2O, 2,5 g H3BO3, 0,7 g CoCl2 × 6H2O, 0,25 g CuSO4 × 5H2O, 1,6 g MnCl2 × 4H2O, 0,3 g ZnSO4 × 7H2O werden mit Wasser auf 1 l aufgefüllt. Die Zugabe der Spurensalzlösung erfolgt über eine Sterilfiltration. Das Anfangsflüssigkeitsvolumen beträgt 6 l. Die oben angeführten Gehalte sind auf diesen Wert bezogen.
Dieser Lösung wird 60 ml Impfkultur (OD = 10) von Bacillus subtilis PA824 zugesetzt
und bei 43°C unter starkem Rühren bei einer Begasungsrate von 12 l/min
fermentiert. Dieser Stamm ist gemäß der Anlage in der PCT/US-Anmeldung 0025993
beschrieben.
Innerhalb von 47 h werden 6,5 l einer sterilen wässrigen Lösung zudosiert, deren
Zusammensetzung wie folgt ist:
Die Fermentation wird Glukose-limitiert durchgeführt. Während der Fermentation wird
der pH Wert auf einen Wert von 7,2 durch die Zudosierung von 25%iger
Ammoniaklösung bzw. von 20%iger Phosporsäure reguliert. Ammoniak dient
gleichzeitig als Stickstoffquelle für die Fermentation. Die Drehzahl des Rührorgans
wird geregelt, indem der Gelöstsauerstoffgehalt auf 30% des Sättigungswertes
gehalten wird. Nach Abbruch der Zudosierung der Kohlenstoffquelle wird die
Fermentation so lange weitergeführt, bis der Gelöstsauerstoffgehalt (pO2) einen Wert
von 95% des Sättigungswerts erreicht hat. Danach wird die Fermentation beendet
und der Organismus thermisch abgetötet. Dazu wird die Fermentationslösung 45 min
sterilisiert. Die erfolgreiche Abtötung wird durch Ausplattieren nachgewiesen.
Anschließend erfolgt die Zellabtrennung durch Zentrifugation. Nach Zellabtrennung
beträgt die Konzentration an D-Pantothenat nach 48 h 22,8 g/l.
In analoger Weise lassen sich auch Fermentationsbrühen erzeugen, die β-Alanin-
zufütterungsfrei Pantothensäure-Titer von über 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,
70, 75, 80, 85, und <90 g/L aufweisen.
Ein Fermentationsaustrag, der wie oben beschrieben durch Erhitzen sterilisiert und
durch Zentrifugieren von der Biomasse weitgehend befreit worden ist, wird mit
zusätzlicher D-Pantothensäure versetzt und der pH mit 25%-iger
Ammoniumhydroxid-Lösung (Dispersion) auf einen Wert von ca. 7 eingestellt.
Die so erhaltene Lösung wird über ein kleines Bett von Sand/Aktivkohle filtriert. Der
Gehalt an D-Pantothensäure im Filtrat beträgt 70 g/l,, wobei die D-Pantothensäure
hauptsächlich in der Form des Ammoniumsalzes vorliegt.
1000 ml dieses Filtrats werden mittels hydrostatischem Druck durch eine 250 ml
Glassäule geleitet, in der sich ca. 100 ml Ionentauscher Lewatit S100 G1 befinden.
Der Durchfluß wird dabei auf ca. 20 ml/min reguliert.
Aus dem Durchfluß wurden Fraktionen à 100 ml gesammelt und hinsichtlich ihres
pH-Wertes, der Konzentration an D-Pantothenat und der Ionen Ca2+, Mg2+, NH4 +, K+
und Na+ analysiert. Beispielhaft sind die Fraktionen 1-3 in der nachfolgenden Tabelle
angeführt.
75 ml der Fraktion 2, welche 4,8 g Pantothenat enthielt, wurden unter Rühren durch
Zugabe von festem Calciumhydroxid auf einen pH-Wert von 7 gebracht. Die so
erhaltene Calcium-D-Pantothenat-Lösung wurde anschließend durch Abdampfen des
Wassers am Rotationsverdampfer getrocknet und 8,98 g eines leicht bräunlichen
Calcium-D-Pantothenat-Pulver erhalten, das einen Gehalt von 57% Calcium-D-
Pantothenataufweist. Dieses Pulver neigt nicht zu Verklebungen und weist gute
Produkteigenschaften auf.
In einem Laborfermenter mit Rührer und Begasungseinrichtung mit 14 l Inhalt wird
wässriges Fermentationsmedium mit der folgenden Zusammensetzung vorgelegt:
Nach der Sterilisation werden folgende sterile Medienkomponenten zusätzlich
zugegeben:
Die Spurensalzlösung setzt sich wie folgt zusammen:
0,15 g Na2MoO4 × 2H2O, 2,5 g H3BO3, 0,7 g CoCl2 × 6H2O, 0,25 g CuSO4 × 5H2O, 1,6 g MnCl2 × 4H2O, 0,3 g ZnSO4 × 7H2O werden mit Wasser auf 1 l aufgefüllt. Die Zugabe der Spurensalzlösung erfolgt über eine Sterilfiltration. Das Anfangsflüssigkeitsvolumen beträgt 5,5 l. Die oben angeführten Gehalte sind auf diesen Wert bezogen.
0,15 g Na2MoO4 × 2H2O, 2,5 g H3BO3, 0,7 g CoCl2 × 6H2O, 0,25 g CuSO4 × 5H2O, 1,6 g MnCl2 × 4H2O, 0,3 g ZnSO4 × 7H2O werden mit Wasser auf 1 l aufgefüllt. Die Zugabe der Spurensalzlösung erfolgt über eine Sterilfiltration. Das Anfangsflüssigkeitsvolumen beträgt 5,5 l. Die oben angeführten Gehalte sind auf diesen Wert bezogen.
Dieser Lösung wird 55 ml Impfkultur (OD = 10) von Bacillus subtilis PA824 zugesetzt
und bei 43°C unter starkem Rühren bei einer Begasungsrate von 12 l/min
fermentiert. Dieser Stamm ist gemäß der Anlage in der PCT/US-Anmeldung 0025993
beschrieben.
Innerhalb von 48 h werden 6 l einer sterilen wässrigen Lösung zudosiert, deren
Zusammensetzung wie folgt ist:
Die Fermentation wird Glukose-limitiert durchgeführt. Während der Fermentation
wurde der pH durch die Zudosierung von 25%iger Ammoniaklösung bzw. von 20%-
iger Phosporsäure auf einen Wert von ca. 7,2 reguliert. Ammoniak dient gleichzeitig
als Stickstoffquelle für die Fermentation. Die Drehzahl des Rührorgans wird geregelt,
indem der Gelöstsauerstoffgehalt auf 30% des Sättigungswertes gehalten wird. Nach
Abbruch der Zudosierung der Kohlenstoffquelle wird die Fermentation so lange
weitergeführt, bis der Gelöstsauerstoffgehalt (pO2) einen Wert von 95% des
Sättigungswerts erreicht hat. Danach wird die Fermentation beendet und der
Organismus thermisch abgetötet. Dazu wird die Fermentationslösung 30 min
sterilisiert. Die erfolgreiche Abtötung wird durch Ausplattieren nachgewiesen.
Anschließend erfolgt die Zellabtrennung durch Zentrifugation. Nach Zellabtrennung
beträgt die Konzentration an D-Pantothenat bei Abbruch nach 48 h 24,1 g/l.
In analoger Weise lassen sich auch Fermentationsbrühen erzeugen, die β-Alanin-
zufütterungsfrei Pantothensäure-Titer von über 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,
70, 75, 80, 85, und <90 g/L aufweisen.
Von dem Fermenteraustrag werden 2817 ml mit 1183 ml einer
Pantothensäurelösung der Konzentration von 178,9 g/l, versetzt und mit 25%-iger
Ammoniak-Lösung neutralisiert. Anschließend wird über Sand/Aktivkohle filtriert. Der
Gehalt an D-Pantothensäure im Filtrat beträgt 67 g/l,, wobei die D-Pantothensäure
hauptsächlich in der Form des Ammoniumsalzes vorliegt.
1300 ml des Filtrats wurden durch ein Bett (Volumen etwa 1 Liter) des
Ionentauschers Lewatit S100 G1 (in der H+-Form) gefördert und mit Wasser
nachgespült. Der Durchfluß wird auf ca. 20 ml/min reguliert.
Nach einem Vorlauf von 200 ml wurden 1810 g des Eluats aufgefangen. Der Gehalt
an D-Pantothensäure betrug 45 g/l. Folgende Ionenkonzentrationen liegen vor: NH4 +:
66 mg/kg Eluat und K+: < 0,001 g/100 g Eluat. Der Phosphor-Gehalt liegt bei 0,072 g/100 g
Eluat.
Unter Rühren wird mit festem Calciumhydroxid die freie Pantothensäure neutralisiert,
d. h. ein pH-Wert von ungefähr 7 eingestellt.
Erhalten wurden 1840 g einer wässrigen Calcium-D-Pantothenatlösung mit einem
Gehalt an D-Calciumpantothenat von 49 g/l,.
Diese wässrige Calcium-D-Pantothenat-Lösung wird in einem Laborsprühtrockner
der Fa. Niro, Typ Minor, getrocknet. Die Eintrittstemperatur beträgt etwa 200°C, die
Austrittstemperatur 85-90°C. Die Zerstäubung erfolgt mittels einer Zweistoffdüse
bei einem Druck von 4 bar. Der Wassergehalt wurde nach der Methode von Karl-
Fischer durchgeführt. Das pulvrige Produkt hat folgende Spezifikation (Angaben in
Gew.-%):
Wassergehalt: 2%
Calcium-D-Pantothenat: 56,3%
Ammonium-Ionen: 0,049%
Kalium-Ionen: < 0,01%
Natrium-Ionen: < 0,01%.
Wassergehalt: 2%
Calcium-D-Pantothenat: 56,3%
Ammonium-Ionen: 0,049%
Kalium-Ionen: < 0,01%
Natrium-Ionen: < 0,01%.
In einem Laborfermenter mit Rührer und Begasungseinrichtung mit 300 l Inhalt wird
wässriges Fermentationsmedium mit der folgenden Zusammensetzung vorgelegt:
Nach der Sterilisation werden folgende sterile Medienkomponenten zusätzlich
zugegeben:
Die Spurensalzlösung setzt sich wie folgt zusammen:
0,15 g Na2MoO4 × 2H2O, 2,5 g H3BO3, 0,7 g CoCl2 × 6H2O, 0,25 g CuSO4 × 5H2O, 1,6 g MnCl2 × 4H2O, 0,3 g ZnSO4 × 7H2O werden mit Wasser auf 1 l aufgefüllt. Die Zugabe der Spurensalzlösung erfolgt über eine Sterilfiltration. Das Anfangsflüssigkeitsvolumen beträgt 100 l. Die oben angeführten Gehalte sind auf diesen Wert bezogen.
0,15 g Na2MoO4 × 2H2O, 2,5 g H3BO3, 0,7 g CoCl2 × 6H2O, 0,25 g CuSO4 × 5H2O, 1,6 g MnCl2 × 4H2O, 0,3 g ZnSO4 × 7H2O werden mit Wasser auf 1 l aufgefüllt. Die Zugabe der Spurensalzlösung erfolgt über eine Sterilfiltration. Das Anfangsflüssigkeitsvolumen beträgt 100 l. Die oben angeführten Gehalte sind auf diesen Wert bezogen.
Dieser Lösung wird 4 l Impfkultur (OD = 120) von Bacillus subtilis PA824 zugesetzt
und bei 43°C unter starkem Rühren bei einer Begasungsrate von 1,8 m3/h
fermentiert. Dieser Stamm ist gemäß der Anlage in der PCT/US-Anmeldung 0025993
beschrieben.
Innerhalb von 43 h werden 113 l einer sterilen wässrigen Lösung zudosiert, deren
Zusammensetzung wie folgt ist:
Die Fermentation wird Glukose-limitiert durchgeführt. Während der Fermentation wird
der pH Wert bei 7,2 durch die Zudosierung von 25%iger Ammoniaklösung bzw. von
20%iger Phosporsäure reguliert. Ammoniak dient gleichzeitig als Stickstoffquelle für
die Fermentation. Die Drehzahl des Rührorgans wird geregelt, indem der
Gelöstsauerstoffgehalt auf 30% des Sättigungswertes gehalten wird. Nach Abbruch
der Zudosierung der Kohlenstoffquelle wird die Fermentation so lange weitergeführt,
bis der Gelöstsauerstoffgehalt (pO2) einen Wert von 95% des Sättigungswerts
erreicht hat. Nach 43 h wird die Fermentation beendet. Die Zellabtrennung erfolgt
durch Separation in einer Tellerzentrifuge. Danach wird die zellfreie
Fermentationslösung 60 min sterilisiert. Die erfolgreiche Abtötung wird durch
Ausplattieren nachgewiesen.
Die Konzentration an D-Pantothenat nach Zellabtrennung und Sterilisation beträgt 21 g/l.
In analoger Weise lassen sich auch Fermentationsbrühen erzeugen, die β-Alanin-
zufütterungsfrei Pantothensäure-Titer von über 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,
70, 75, 80, 85, und <90 g/L aufweisen.
Anschließend werden 3270 ml des erhaltenen Fermentationsaustrags mit 1750 ml
Natrium-Pantothenat-Lösung einer Konzentration von 170 g/l, aufgestockt. Dann
werden ca. 7 g gepulverte Aktivkohle in diese Lösung eingerührt. Zur Verbesserung
der Filtrierbarkeit der Suspension wird diese zur einen Hälfte mit Sedipur CF 902 (48 g
einer 1%-igen Lösung) und zur anderen Hälfte mit Sedipur CL 930 (1,2 g einer
40%-igen Lösung) versetzt. Nach kurzem Aufrühren werden beide Hälften jeweils
über ein kleines Celite-Bett filtriert und anschließend wieder vereinigt.
Von dem so erhaltene Filtrat mit einem Gehalt an D-Pantothensäure von 65,4 g/l
werden 1800 ml durch ein Bett (Volumen 1 Liter) des Ionentauschers Lewatit S100
G1 (in der H+-Form) gefördert und mit Wasser nachgespült. Der Durchfluß beträgt
ca. 20 ml/min.
Nach einem Vorlauf von 250 ml, der verworfen wird, werden 2,2 l des Eluats
aufgefangen und durch Zugabe einer wässrigen 20-%igen Calciumhydroxid-
Dispersion (Kalkmilch) der pH auf einen Wert von ungefähr 7 eingestellt. Es wird
noch einmal über einen Papierfilter filtriert und als Filtrat 2174 g einer wässrigen
Calcium-D-Pantothenat-Lösung mit einem Gehalt von 58 g/l, Calcium-D-Pantothenat
nach Probennahme erhalten.
Die sich anschließende Sprühtrocknung erfolgt in einem Laborsprühtrockner der Fa.
Niro, Typ Minor. Die Eintrittstemperatur beträgt etwa 185°C, die Austrittstemperatur
ca. 95°C. Die Zerstäubung erfolgt mittels einer Zweistoffdüse bei einem Druck von 2
bar. Der Wassergehalt wurde nach der Methode von Karl-Fischer durchgeführt. Das
erhaltene pulvrige Produkt hat folgende Spezifikation (Angaben in Gew.-%):
Wassergehalt: 1,4%
Calcium-D-Pantothenat: 63,2%
Ammonium-Ionen: 0,043%
Kalium-Ionen: < 0,01%
Natrium-Ionen: < 0,01%.
Wassergehalt: 1,4%
Calcium-D-Pantothenat: 63,2%
Ammonium-Ionen: 0,043%
Kalium-Ionen: < 0,01%
Natrium-Ionen: < 0,01%.
Claims (17)
1. Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze, dadurch
gekennzeichnet, daß
- a) wenigstens ein D-Pantothensäure produzierender Organismus eingesetzt wird, dessen Pantothensäure-(pan)- und/oder Isoleucin/Valin-(ilv)- Biosynthese dereguliert ist und der wenigstens 2 g/l an Salzen der D- Pantothensäure durch Fermentation in einem Kulturmedium bildet, wobei dem Kulturmedium 0-20 g/l freies β-Alanin und/oder β-Alanin-Salz zugeführt wird,
- b) die D-Pantothenat enthaltende Fermentationslösung über einen Kationenaustauscher geleitet wird, wobei aus den Salzen der D- Pantothensäure freie D-Pantothensäure entsteht,
- c) die freie D-Pantothensäure enthaltende Lösung durch die Zugabe einer Calcium- und/oder Magnesiumbase auf einen pH-Wert von 5-10 eingestellt wird, wobei eine Lösung erhalten wird, die Calcium- und/oder Magnesium- Pantothenat enthält und
- d) diese Lösung einer Trocknung und/oder Formulierung unterzogen wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium
kein freies β-Alanin und/oder β-Alanin-Salz zugeführt wird.
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß
als D-Pantothensäure produzierender Organismus ein Bakterium, eine Hefe oder
eine Pilze eingesetzt wird.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als
Mikroorganismus ein Bakterium aus der Familie der Bacillaceae eingesetzt wird.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein
Bakterium der Gattung Bacillus und bevorzugt der Art B. subtils, B. licheniformis
oder B. amyloliquefaciens eingesetzt wird.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in
Schritt a) ein Gehalt an D-Pantothensäure und/oder deren Salzen von wenigstens
10 g/l Kulturmedium, bevorzugt wenigstens 20 g/l,, besonders bevorzugt
wenigstens 40 g/l und höchst bevorzugt von wenigstens 60 g/l, Kulturmedium
gebildet wird.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß in
Schritt b) der Gehalt an einwertigen Kationen, bevorzugt Ammonium-, Kalium-
und/oder Natrium-Ionen, auf eine Konzentration von ≦ 1 g/kg Lösung reduziert
wird.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in
Schritt c) der pH der Lösung auf einen Wert von 6-9, bevorzugt von 7-8,
eingestellt wird.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der
Lösung in Schritt c) zur Neutralisation Calciumhydroxid, Calciumcarbonat,
Calciumoxid, Magnesiumhydroxid und/oder basisches Magnesiumcarbonat in
Form eines Feststoffes und/oder als wässrige Dispersion zugegeben wird.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der
Lösung in Schritt c) eine wässrige Suspension enthaltend 2-55 Gew.-%,
bevorzugt 10-50 Gew.-% und besonders bevorzugt 20-40 Gew.-% an
Calciumhydroxid zugegeben wird.
11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß
der Lösung in Schritt c) eine wässrige Suspension enthaltend 2-65 Gew.-%,
bevorzugt 10-50 Gew.-% und besonders bevorzugt 20-40 Gew.-% an
Calciumcarbonat zugegeben wird.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß
der Lösung in Schritt c) eine wässrige Suspension enthaltend 2-60 Gew.-%,
bevorzugt 10-50 Gew.-% und besonders bevorzugt 20-40 Gew.-% an
Magnesiumhydroxid zugegeben wird.
13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß
der Lösung in Schritt c) eine wässrige Suspension enthaltend 2-25 Gew.-%,
bevorzugt 10-20 Gew.-% an basischem Magnesiumcarbonat zugegeben wird.
14. Zusammensetzung für den Einsatz als Tierfutterzusatz und/oder
Tierfutterergänzungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß sie herstellbar ist,
indem
- a) wenigstens ein D-Pantothensäure produzierender Organismus eingesetzt wird, dessen Pantothensäure-(pan)- und/oder Isoleucin/Valin-(ilv)- Biosynthese dereguliert ist und der wenigstens 2 g/l an Salzen der D- Pantothensäure durch Fermentation in einem Kulturmedium bildet, wobei dem Kulturmedium 0-20 g/l,, bevorzugt 0 g/l freies β-Alanin und/oder β- Alanin-Salz zugeführt wird,
- b) die D-Pantothenat enthaltende Fermentationslösung über einen Kationenaustauscher geleitet wird, wobei aus den Salzen der D- Pantothensäure freie D-Pantothensäure entsteht,
- c) die freie D-Pantothensäure enthaltende Lösung durch die Zugabe einer Calcium- und/oder Magnesiumbase auf einen pH-Wert von 5-10 eingestellt wird, wobei eine Lösung erhalten wird, die Calcium- und/oder Magnesium- Pantothenat enthält und
- d) diese Lösung einer Trocknung und/oder Formulierung unterzogen wird.
15. Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie Salze
der D-Pantothensäure in Form zweiwertiger Kationen, bevorzugt Calcium-
und/oder Magnesium-D-Pantothenat enthält.
16. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch
gekennzeichnet, daß sie Salze der D-Pantothensäure in einer Konzentration von
wenigstens 1-100 Gew.-%, bevorzugt wenigstens 20-100 Gew.-% und besonders
bevorzugt wenigstens 50 Gew.-% enthält.
17. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch
gekennzeichnet, daß der Gehalt an Salzen der D-Pantothensäure in Form
einwertiger Kationen ≦ 1 g/kg ist.
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