KR102381685B1 - 1가 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈 - Google Patents

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퀴잉 샤오
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Abstract

본원에는 뇌 작동인자 물질, 링커, 및 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1개의 1가 결합 물질을 포함하는 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈이 보고되어 있으며, 이때 상기 링커는 작동인자 물질을, 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 물질에 커플링시키고, 상기 1가 결합 물질은 항-트랜스페린 수용체 항체 8D3의 가변 도메인(서열번호 1 및 서열번호 2) 또는 변이체 항-트랜스페린 수용체 또는 항체 8D3v의 가변 도메인(서열번호 1 및 서열번호 3)을 포함하지 않는다.

Description

1가 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈{MONOVALENT BLOOD BRAIN BARRIER SHUTTLE MODULES}
본 발명은, 혈액 뇌 장벽 수용체(blood brain barrier receptor, BBBR)에 특이적으로 결합하는 1개의 결합 특이성을 가지며 상기 결합 특이성에 대해 1가인 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈, 및 상기 구조물을 혈액 뇌 셔틀로서 및 신경 질환의 치료에 사용하는 방법에 관한 것이다.
예를 들면, 거대 생체치료 약물 또는 낮은 뇌 투과율을 갖는 소분자 약물과 같은 신경 질환 약물의 뇌 투과는 신경혈관 단위(neurovascular unit, NVU)의 다른 세포 성분과 함께 광범위하고 불투과성인 혈액 뇌 장벽(BBB)에 의해 엄격하게 제한된다. 상기 장애를 극복하기 위한 많은 방법들이 시험되었으며, 한가지 방법은 뇌 모세혈관 내피 상에서 발현된 내인성 수용체(혈액 뇌 장벽 수용체)에 의해 매개된 트랜스시토시스(transcytosis) 경로를 이용하는 것이다. 뇌에 생체치료제의 수용체-매개 전달을 가능하게 하기 위해 상기 수용체에 대해 단클론성 항체 또는 펩티드와 같은 재조합 단백질이 고안되었다. 그러나, 뇌 내피 세포(BEC) 내에서 정렬오류(miss-sorting), 및 BEC중 특정 세포소기관(특히, 생체치료제의 분해를 유도하는 세포소기관) 내 축적 정도를 최소화하면서 뇌 흡수를 최대화하기 위한 방법은 계속 탐구중이다.
단클론성 항체 및 다른 생체치료제는 중추 신경계(CNS)에서의 병리 치료에 막대한 치료 가능성을 갖는다. 그러나, 뇌속으로의 그들의 경로는 BBB에 의해 방해받는다. 이전의 연구들은 혈류중에 주입된 IgG의 매우 낮은 비율(약 0.1%)이 CNS 구획내로 투과할 수 있음을 예시하였다(문헌 [Felgenhauer, Klin. Wschr. 52 (1974) 1158-1164]). 이것은 분명히 CNS내 항체의 저농도로 인해 임의의 약동학적 효과를 제한할 것이다.
그러므로, BBB를 횡단하여 약물을 뇌로 효과적으로 운반하기 위한 신경 질환 약물의 전달 시스템이 요구된다.
WO 2014/033074 호에는 혈액 뇌 장벽 셔틀이 보고되어 있다.
마우스 8D3 항-트랜스페린 항체 및 그의 가변 경쇄 도메인(VL) 변이체(L596V 및 L598I)가 문헌 [Boado, R.J., et al., Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1251-1258]에 보고되어 있다.
본 발명의 한 양태는 뇌 작동인자 물질, 링커, 및 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1개의 1가 결합 물질을 포함하는 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈로서, 이때 상기 링커는 작동인자 물질을 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 물질에 커플링시키고, 상기 1가 결합 물질은 항-트랜스페린 수용체 항체 8D3의 가변 도메인(서열번호 1 및 서열번호 2) 또는 변이체 항-트랜스페린 수용체 또는 항체 8D3v의 가변 도메인(서열번호 1 및 서열번호 3)을 포함하지 않는다.
항-트랜스페린 수용체 항체 8D3은 하기의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인을 갖는다:
EVQLVESGGG LVQPGNSLTL SCVASGFTFS NYGMHWIRQA PKKGLEWIAM IYYDSSKMNY ADTVKGRFTI SRDNSKNTLY LEMNSLRSED TAMYYCAVPT SHYVVDVWGQ GVSVTVSS
(서열번호 1)
항-트랜스페린 수용체 항체 8D3은 하기의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 갖는다:
DIQMTQSPAS LSASLEEIVT ITCQASQDIG NWLAWYQQKP GKSPQLLIYG ATSLADGVPS RFSGSRSGTQ FSLKISRVQV EDIGIYYCLQ AYNTPWTFGG GTKLELK
(서열번호 2)
변이체 항-트랜스페린 수용체 항체 8D3v는 항체 8D3과 동일한 중쇄 가변 도메인, 및 하기 아미노산 서열을 갖는, 돌연변이체 L104V 및 L106I를 갖는 경쇄 가변 도메인을 갖는다:
DIQMTQSPAS LSASLEEIVT ITCQASQDIG NWLAWYQQKP GKSPQLLIYG ATSLADGVPS RFSGSRSGTQ FSLKISRVQV EDIGIYYCLQ AYNTPWTFGG GTKVEIK
(서열번호 3)
혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 한 태양에서, 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 물질은 폴리펩티드이다.
혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 한 태양에서, 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 물질은 혈액 뇌 장벽 수용체 리간드, 전장 항체, scFv, Fv, scFab 및 VHH로 이루어진 군에서 선택된 분자를 포함한다.
혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 한 태양에서, 혈액 뇌 수용체는 트랜스페린 수용체, 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8, 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1 및 헤파린-결합 상피 성장 인자-유사 성장 인자로 이루어진 군에서 선택된다. 한 태양에서, 혈액 뇌 수용체는 트랜스페린 수용체이다.
한 태양에서, 1가 결합 물질은 인간 트랜스페린 수용체 및 사이노몰거스(cynomolgus) 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합한다.
혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 한 태양에서, 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 물질은 트랜스페린 수용체에 대한 1개의 scFab, 보다 특히 서열번호 4, 5 또는 6의 아미노산 서열내에 포함된 트랜스페린 수용체 중의 에피토프에 특이적으로 결합하는 scFab를 포함한다.
혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 한 태양에서, 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 물질은 트랜스페린 수용체에 대한 1개의 scFab, 보다 특히 서열번호 4, 5 또는 6의 아미노산 서열내에 포함된 트랜스페린 수용체 중의 에피토프를 인식하는 scFab를 포함한다.
혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 한 태양에서, 뇌 작동인자 물질은 신경질환 약물, 신경영양 인자, 성장 인자, 효소, 세포독성 약제, 뇌 표적에 대한 항체, 뇌 표적에 대한 단클론성 항체, 뇌 표적에 대한 펩티드로 이루어진 군에서 선택된다.
혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 한 태양에서, 뇌 표적은 β-세크레타제 1, Aβ(아베타(Abeta)), 상피 성장 인자, 상피 성장 인자 수용체 2, 타우(tau), 포스포릴화 타우, 포스포릴화 타우(pS422), 아포지단백질 E4, 알파 시누클레인, 알파 시누클레인의 올리고머성 단편, CD20, 헌팅틴, 프리온 단백질, 류신 풍부 반복 키나제 2, 파킨, 프레세닐린 2, 감마 세크레타제, 사멸 수용체 6, 아밀로이드 전구체 단백질, p75 뉴로트로핀 수용체 및 카스파제 6으로 이루어진 군에서 선택된다.
혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 특정 태양에서, 뇌 작동인자 물질은 폴리펩티드이다.
혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 한 태양에서, 혈액 뇌 수용체에 결합하는 1가 결합 물질은 폴리펩티드이고, 상기 1가 결합 물질은 직접적으로 또는 링커에 의해 뇌 작동인자 물질의 C-말단에 접합된다.
혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 한 태양에서, 뇌 작동인자 물질은 뇌 표적에 대한 전장 항체를 포함한다. 한 태양에서, 전장 항체는 IgG이다.
혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 한 바람직한 태양에서, 혈액 뇌 장벽 셔틀은 뇌 작동인자 물질로서 전장 IgG 항체, 링커, 및 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 물질로서 1개의 scFab를 포함하며, 이때 상기 scFab는 링커에 의해 IgG 항체의 중쇄들 중 하나의 Fc 영역의 C-말단에 접합된다.
혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 한 태양에서, 뇌 표적에 대한 혈액 뇌 장벽 셔틀의 항체의 제 1 중쇄는 제 1 이량체화 모듈을 포함하고, 뇌 표적에 대한 혈액 뇌 장벽 셔틀의 항체의 제 2 중쇄는 두 중쇄의 헤테로이량체화를 가능하게 하는 제 2 이량체화 모듈을 포함한다.
혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 한 태양에서, 뇌 표적에 대한 혈액 뇌 장벽 셔틀의 항체의 제 1 중쇄의 제 1 이량체화 모듈은 놉(knob)을 포함하고, 뇌 표적에 대한 혈액 뇌 장벽 셔틀의 항체의 제 2 중쇄의 이량체화 모듈은 놉-인투-홀(knob-into-hole) 방법에 따른 홀(hole)을 포함한다.
혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 한 태양에서, 링커는 펩티드 링커이다. 한 태양에서, 상기 펩티드 링커는 25개 이상 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 한 태양에서, 상기 펩티드 링커는 30 내지 50개 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 한 태양에서, 펩티드 링커는 (G4S)6G2(서열번호 7) 또는 (G4S)4(서열번호 8)이다.
하기의 세가지 태양은, 뇌 작동인자 물질이 폴리펩티드이나, 단, 뇌 작동인자 물질이 전장 항체, 특히 전장 IgG는 아닌 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈에 관한 것이다.
혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 한 태양에서, 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 물질은 CH2-CH3 Ig 물질, 및 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1개의 scFab(제 1 링커 포함)를 포함하며, 이때 상기 scFab는 제 2 링커에 의해 CH2-CH3 Ig 물질의 C-말단에 커플링된다.
혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 한 태양에서, 혈액 뇌 장벽 셔틀은 뇌 작동인자 물질, 링커, CH2-CH3 Ig 도메인, 제 2 링커, 및 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1개의 scFab를 포함하며, 이때 상기 뇌 작동인자 물질은 제 1 링커에 의해 CH2-CH3 Ig 도메인의 N-말단에 접합되고, 상기 scFab는 제 2 링커에 의해 CH2-CH3 Ig 도메인의 C-말단에 접합된다.
혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 한 태양에서, CH2-CH3 Ig 물질은 CH2-CH3 IgG 물질이다.
본 발명의 또 다른 양태는, 본원에 보고된 바와 같은 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈을 암호화하는 (단리된) 핵산, 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈을 암호화하는 (단리된) 핵산을 포함하는 숙주 세포, 및 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈을 포함하는 약학 제형이다.
본원에 보고된 바와 같은 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈은 약제로서 사용될 수 있으며, 특히, 예를 들면, 알츠하이머병(Alzheimer's disease)과 같은 신경 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본원에 보고된 바와 같은 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈은 혈액 뇌 장벽을 횡단하여 뇌 작동인자 물질을 운반하기 위해 사용될 수 있다.
특정 태양에서, Fc-영역의 C-말단에서, 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 물질로서 scFab에 접합된 본원에 보고된 바와 같은 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 IgG 항체의 중쇄는 하기 구조를 갖는다:
- IgG 중쇄,
- IgG 중쇄의 Fc-영역의 C-말단을 scFab의 VL 도메인의 N-말단에 접합시키는 링커,
- scFab의 가변 경쇄 도메인(VL) 및 C-카파 경쇄 도메인,
- scFab의 C-카파 경쇄 도메인의 C-말단을 scFab의 VH 도메인의 N-말단에 접합시키는 링커,
- scFab 항체의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 IgG CH1 중쇄 도메인.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는, CH2-CH3 Ig 물질, 링커, 및 혈액 뇌 장벽 수용체에 특이적으로 결합하는 1개의 sFab를 포함하는, 혈액 뇌 장벽을 횡단하여 뇌 작동인자 물질을 운반하기 위한 융합 폴리펩티드로서, 이때 상기 scFab는 링커에 의해 CH2-CH3 Ig 물질의 C-말단에 접합되고, 상기 scFab는 항-트랜스페린 수용체 항체 8D3의 가변 도메인(서열번호 1 및 서열번호 2) 또는 변이체 항-트랜스페린 수용체 항체 8D3v의 가변 도메인(서열번호 1 및 서열번호 3)을 포함하지 않는다.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는, CH2-CH3 Ig 물질, 링커, 및 혈액 뇌 장벽 수용체에 특이적으로 결합하는 1개의 scFv를 포함하는, 혈액 뇌 장벽을 횡단하여 뇌 작동인자 물질을 운반하기 위한 융합 폴리펩티드로서, 이때 상기 scFv는 링커에 의해 CH2-CH3 Ig 물질의 C-말단에 접합되고, 상기 scFv는 항-트랜스페린 수용체 항체 8D3의 가변 도메인(서열번호 1 및 서열번호 2) 또는 변이체 항-트랜스페린 수용체 항체 8D3v의 가변 도메인(서열번호 1 및 서열번호 3)을 포함하지 않는다.
한 태양에서, 상기 융합 폴리펩티드는 또한 뇌 작동인자 물질을 CH2-CH3 Ig 물질의 N-말단에 접합시키기 위한 링커를 CH2-CH3 Ig 물질의 N-말단에 포함한다.
융합 폴리펩티드의 한 태양에서, 뇌 작동인자 물질은 신경 질환 약물, 신경영양 인자, 성장 인자, 효소, 세포독성 약제, scFv, Fv, scFab, Fab, VHH, F(ab')2로 이루어진 군에서 선택된 뇌 표적에 대한 항체 단편 또는 펩티드로 이루어진 군에서 선택된다.
융합 폴리펩티드의 한 태양에서, 혈액 뇌 장벽 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv는 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합한다. 한 태양에서, scFab 또는 scFv는 서열번호 4, 5 또는 6의 아미노산 서열 내에 포함된 트랜스페린 수용체의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
융합 폴리펩티드의 태양에서, 링커는 펩티드 링커이다. 한 태양에서, 상기 펩티드 링커는 15개 이상 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 한 태양에서, 상기 펩티드 링커는 20 내지 50개 아미노산의 길이를 갖는다. 한 태양에서, 상기 펩티드 링커는 아미노산 서열 (G4S)6G2(서열번호 7) 또는 (G4S)4(서열번호 8)을 갖는다.
융합 폴리펩티드의 한 태양에서, CH2-CH3 Ig 물질은 CH2-CH3 IgG 물질이다.
본 발명의 다른 양태는 본원에 보고된 바와 같은 융합 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 핵산, 및 본원에 보고된 바와 같은 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포이다.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 본원에 보고된 바와 같은 융합 폴리펩티드, 및 링커에 의해 본원에 보고된 바와 같은 융합 폴리펩티드의 CH2-CH3 Ig 물질의 N-말단에 접합된 뇌 작동인자 물질을 포함하는 접합체이다.
접합체의 한 태양에서, 뇌 작동인자 물질은 신경영양 인자이고, 상기 신경영양 인자를 CH2-CH3 Ig 물질의 N-말단에 접합시키는 링커는 펩티드 링커이다.
본원에 보고된 바와 같은 다른 양태는 본원에 보고된 바와 같은 접합체 및 약학적 담체를 포함하는 약학 제형, 본원에 보고된 바와 같은 상기 접합체의 용도, 특히 신경퇴행성 질환, 특히 알츠하이머병의 치료를 위한 접합체의 용도이다.
혈액 뇌 장벽 수용체에 특이적으로 결합하는 1가 결합 물질은 직접적으로 또는 펩티드 링커에 의해 항체의 경쇄 또는 중쇄의 임의의 말단에 접합될 수 있다. 한 태양에서, 1가 결합 물질은 중쇄의 C-말단에 접합된다.
항체의 중쇄의 C-말단은 아미노산 잔기 PGK로 종결되는 완전 C-말단일 수 있다. 중쇄의 C-말단은 C-말단 아미노산 잔기의 1개 또는 2개가 제거된 단축된 C-말단일 수 있다. 한 태양에서, 중쇄의 C-말단은 아미노산 잔기 PG로 종결되는 단축된 C-말단이다.
1가 결합 물질은 직접적으로 또는 펩티드 링커에 의해 각각의 항체 쇄에 접합될 수 있다. 한 태양에서, 펩티드 링커는 아미노산 서열 GGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 9)를 갖는다.
1가 결합 물질은 항체 scFv 단편일 수 있다. 한 태양에서, 1가 결합 물질은 N-말단에서 C-말단 순서로 경쇄 가변 도메인 - 경쇄 불변 도메인 - 펩티드 링커 - 중쇄 가변 도메인 - 중쇄 불변 도메인 1을 포함하는 scFv이다.
한 태양에서, 1가 결합 물질은 (G4S)6 펩티드 링커(서열번호 10)를 갖는 항-트랜스페린 수용체-항체의 scFv 단편이다.
한 태양에서, 혈액-뇌-장벽 수용체는 트랜스페린 수용체, 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8, 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1 및 헤파린-결합 상피 성장 인자-유사 성장 인자로 이루어진 군에서 선택된다. 한 태양에서, 혈액-뇌-장벽 수용체는 인간 혈액-뇌-장벽 수용체이다. 한 태양에서, 혈액-뇌-장벽 수용체는 트랜스페린 수용체이고, 항체는 트랜스페린에 대한 트랜스페린 수용체의 결합을 저해하지 않는다. 한 태양에서, 혈액-뇌-장벽 수용체는 인간 트랜스페린 수용체이다.
한 태양에서, 1가 결합 물질을 뇌 작동인자 물질에 접합시키는 펩티드 링커는 15개 이상 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열이다. 한 태양에서, 펩티드 링커는 18 내지 25개 아미노산의 길이를 갖는다.
한 태양에서, 뇌 작동인자 물질은 전장 항체이다. 한 태양에서, 뇌 작동인자 물질은 서브클래스 IgG1 또는 IgG4의 전장 항체이다.
한 태양에서, 1가 결합 물질은 항-혈액 뇌 장벽 수용체 항체 또는 그의 혈액 뇌 장벽 수용체 결합 단편이다. 한 태양에서, 항-혈액 뇌 장벽 수용체 항체 또는 그의 단편은 혈액 뇌 장벽 수용체의 그의 천연 리간드 중 하나 이상에 대한 결합을 손상시키지 않는다. 또 다른 태양에서, 항-혈액 뇌 장벽 수용체 항체는, 인간 트랜스페린에 대한 인간 트랜스페린 수용체의 결합을 저해하지 않는 방식으로 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합한다.
한 태양에서, 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈은 작동인자 잠재성이다.
한 태양에서, 뇌 작동인자 물질은 Fc-영역을 포함하는 전장 항체로서, 이때 Fc-영역이 인간 서브클래스 IgG1에 속하는 경우 상기 Fc-영역은 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧(Kabat)의 EU 인덱스(EU index)에 따른 번호)를 포함하거나, 또는 Fc-영역이 인간 서브클래스 IgG4에 속하는 경우 상기 Fc-영역은 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G(카밧의 EU 인덱스에 따른 번호)를 포함한다.
도 1은 hCMEC/D3 기반 분석 도식을 나타낸다.
I. 정의
본원의 경우 "수용체(acceptor) 인간 프레임워크"는, 하기에 정의된 바와 같은 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유도된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유도된" 수용체 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 태양에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하이다. 일부 태양에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
"친화도"는 분자(예, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 상대(예, 항원) 사이의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 말한다. 달리 언급하지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들면, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 말한다. 분자 X의 그 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것을 포함하여 당해 분야에 공지된 통상적인 방법들에 의해 측정할 수 있다. 친화도를 측정하기 위한 특정한 예시적이고 대표적인 태양들이 하기에 기술되어 있다.
"친화도 증진된" 항체는, 항원에 대한 항체의 친화도에 개선을 야기하는 변형을 갖지 않는 모 항체에 비해, 하나 이상의 초가변 영역(HVR)에 하나 이상의 변형을 갖는 항체를 말한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 광의로 사용되며, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이성 항체(예를 들면, 이중특이성 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 경우의 항체 단편을 포함하여(이로 한정되지는 않는다), 다양한 항체 구조물을 포함한다.
"항체 단편"은 온전한(intact) 항체가 결합하는 항원과 결합하는 온전한 항체의 일부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 다른 분자를 말한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디(diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자(예, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체가 포함되나 이로 한정되지는 않는다.
용어 "키메라" 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분은 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 말한다.
항체의 "클래스"는 그 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 항체의 5개 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 여러개가 서브클래스(이소타입(isotype)), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
"작동인자 기능"은 항체 클래스에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물 활성을 말한다. 항체 작동인자 기능의 예로는 다음이 포함된다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화.
약제, 예를 들면, 약학 제형의 "효과량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량으로 및 필요한 시간동안 효과적인 양을 말한다.
용어 "Fc-영역"은 본원에서 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc-영역 및 변이체 Fc-영역을 포함한다. 한 태양에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단까지 이어진다. 그러나, Fc-영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, Fc-영역 또는 불변 영역중 아미노산 잔기의 번호는, 문헌 [Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]에 기술된 바와 같이, EU 인덱스로도 불리는 EU 번호 체계에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 말한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 다음의 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체(full length antibody)", "온전한 항체(intact antibody)" 및 "전항체(whole antibody)"는 본원에서 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 가지거나 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc-영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 상기 세포들의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 말한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환 세포"를 포함하며, 이들은 1차 형질전환된 세포, 및 계대 수에 관계없이 그로부터 유도된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에 있어서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 발명에 포함된다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 흔히 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 아군(subgroup)으로부터 이루어진다. 일반적으로, 서열의 상기 아군은 문헌 [Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3]에서와 같은 아군이다. 한 태양에서, VL의 경우, 상기 아군은 상기 카밧 등의 문헌에서와 같은 아군 카파 I이다. 한 태양에서, VH의 경우, 상기 아군은 상기 카밧 등의 문헌에서와 같은 아군 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 말한다. 특정 태양에서, 인간화 항체는 하나 이상, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 여기서 HVR(예를 들면, CDR)의 전부 또는 거의 전부가 비-인간 항체에 상응하고, FR의 전부 또는 거의 전부가 인간 항체에 상응한다. 인간화 항체는 임의적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화가 일어난 항체를 말한다.
용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 서열에 있어서 초가변성이고("상보성 결정 영역" 또는 "CDR") 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하고/하거나 항원-접촉 잔기("항원 접촉부")을 함유하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 말한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR: VH에 3개(H1, H2, H3) 및 VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다.
HVR은 본 발명에서 다음을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)에 존재하는 초가변 루프(문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917]);
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)에 존재하는 CDR(문헌 [Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]);
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2) 및 93-101(H3)에 존재하는 항원 접촉부(문헌 [MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)]); 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3) 및 94-102(H3)를 포함한, (a), (b) 및/또는 (c)의 조합.
달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인내 다른 잔기들(예를 들면, FR 잔기)은 본원에서 카밧 등의 상기 문헌에 따라 번호가 부여된다.
"개체" 또는 "대상"은 포유동물이다. 포유동물로는 가축(예, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼 및 설치류(예, 마우스 및 래트)가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특정 태양에서, 개체 또는 대상은 인간이다.
"단리된" 항체는 그 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 태양에서, 항체는, 예를 들면, 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전 초점(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정시, 95% 또는 99%보다 더 큰 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 검토를 위해서는, 예를 들면, 문헌 [Flatman, S. et al, J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87]을 참조하시오.
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 말한다. 단리된 핵산은, 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 말한다, 즉, 상기 집단을 이루는 개개 항체들은, 예를 들면, 천연 돌연변이를 함유하거나 또는 단클론성 항체 제제의 제조시 발생하는 가능한 변이체 항체(상기 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고/하거나, 동일 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(determinant)(에피토프)에 대한 상이한 항체들을 포함하는 다클론성 항체 제제와 대조적으로, 단클론성 항체 제제의 각각의 단클론성 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 따라서, 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 이해되지 않아야 한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용될 단클론성 항체는, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌 전체 또는 일부를 함유하는 유전자전이 동물을 이용하는 방법을 포함하여(이로 한정되지는 않는다) 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 단클론성 항체를 제조하기 위한 상기 방법 및 다른 대표적인 방법들이 본원에 기술되어 있다.
"천연(native) 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 말한다. 예를 들면, 천연 IgG 항체는 다이설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 헤테로사량체성 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VH)에 이어, 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VL)에 이어, 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는, 그 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
용어 "패키지 삽입물"은 치료 제품의 적응증, 사용법, 투여량, 투여법, 병용 치료, 금기 및/또는 사용에 관한 경고에 대한 정보를 포함하는, 치료 제품의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 말하기 위해 사용된다.
기준 폴리펩티드 서열과 관련하여 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않고, 기준 폴리펩티드 서열중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 대중적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여, 당해 분야의 기술에 속하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당해 분야에 숙련된 자라면, 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 경우, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 산출한다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 제작되었으며, 소스 코드는 워싱턴 D.C., 20559의 미국 저작권청(U.S. Copyright Office)에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 여기에 미국 저작권 등록 번호(U.S. Copyright Registration No.) TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아 사우스 샌프란시스코의 제넨테크 인코포레이티드로부터 대중적으로 이용가능하거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여, UNIX 작업 시스템 상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 그와 비교해 또는 그에 대비해, 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(양자택일적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 그와 비교해 또는 그에 대비해 특정 % 아미노산 서열 동일성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)은 다음과 같이 산출된다:
100 x 분수 X/Y
상기에서, X는 A와 B의 상기 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 평가된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 같지 않을 것임을 인지할 것이다. 특별히 달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에서 기술한 바와 같이 수득된다.
용어 "약학 제형"은 그에 함유된 활성 성분의 생물 활성이 효과적이 되게 하기 위한 형태이면서, 제형이 투여될 대상에게 허용될 수 없을 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 대상에게 무독성인, 활성 성분 이외의 다른, 약학 제형중의 성분을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료"(및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)은 치료되는 개체의 자연적 과정을 변화시키기 위한 시도의 임상적 개입을 말하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적 병리학적 결과의 경감, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 태양에서, 본 발명의 항체는 질환의 진전을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는데 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들면, 문헌 [Kindt, T.J. et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., (2007), page 91] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인이면 항원-결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는, 상보성 VL 또는 VH 도메인 각각의 라이브리러를 검색하기 위해, 상기 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628] 참조).
용어 "벡터"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 연결되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조물로서의 벡터 뿐 아니라 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈내에 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 작용가능하게 연결되는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
"혈액-뇌 장벽"(BBB)은, 뇌 모세혈관 내피 원형질막 내에 밀착 연접에 의해 형성되어 뇌안으로 분자, 심지어 우레아(60 달톤)와 같은 매우 소분자의 운반을 제한하는 단단한 장벽을 구축하는, 말초순환과 뇌 및 척수 사이의 생리학적 장벽을 말한다. 뇌 안의 BBB, 척수 내의 혈액-척수 장벽, 및 망막 내의 혈액-망막 장벽은 CNS 내의 인접 모세혈관 장벽들이며, 본원에서는 총괄하여 혈액-뇌 장벽 또는 BBB로 지칭된다. BBB는 또한 혈액-CSF 장벽(맥락총)을 포함하며, 여기서는 장벽이 모세혈관 내피 세포가 아니라 상의 세포로 이루어진다.
"중추 신경계"(CNS)는 신체 기능을 조절하는 신경 조직의 복합체를 말하며, 뇌 및 척수를 포함한다.
용어 "혈액-뇌 장벽 수용체"(BBBR)는 BBB를 횡단하여 분자를 운반할 수 있거나 또는 외래 투여된 분자를 운반하기 위해 사용될 수 있는 뇌 내피 세포 상에서 발현되는 세포외 막-결합 수용체 단백질을 의미한다. BBBR의 예로는 다음이 포함되나 이로 한정되지 않는다: 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGF-R), 제한하지 않고 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1(LRP1) 및 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(LRP8)을 포함한 저밀도 지단백질 수용체, 및 헤파린-결합 상피 성장 인자-유사 성장 인자(HB-EGF). 대표적인 BBBR은 트랜스페린 수용체(TfR)이다.
용어 "뇌 작동인자 물질"은 BBB를 횡단하여 뇌로 운반될 분자를 의미한다. 작동인자 물질은 전형적으로 뇌로 전달되기에 바람직한 특징적인 치료 활성을 갖는다. 작동인자 물질로는 신경 질환 약물 및 세포독성 약제, 예를 들면, 폴리펩티드 및 항체, 특히 뇌 표적에 대한 단클론성 항체 또는 그의 단편이 포함된다.
용어 "1가 결합 물질"은 BBBR에 특이적으로 및 1가 결합 방식으로 결합할 수 있는 분자를 의미한다. 본원에 보고된 바와 같은 혈액 뇌 셔틀 모듈 및/또는 접합체는 단일 단위의 1가 결합 물질의 존재를 특징으로 한다, 즉, 본 발명의 혈액 뇌 셔틀 모듈 및/또는 접합체는 정확하게 한 단위의 1가 결합 물질을 포함한다. 1가 결합 물질로는 폴리펩티드, 전장 항체, Fab, Fab', Fv 단편을 포함한 항체 단편, 단일쇄 항체 분자, 예를 들면, 단일쇄 Fab, scFv가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 1가 결합 물질은, 예를 들면, 파지 디스플레이 또는 면역접종과 같은 당해 분야의 기술을 사용하여 조작된 스캐폴드(scaffold) 단백질일 수 있다. 1가 결합 물질은 또한 폴리펩티드일 수 있다. 특정 태양에서, 1가 결합 물질은 혈액 뇌 장벽 수용체에 대한 CH2-CH3 Ig 도메인 및 단일쇄 Fab(scFab)를 포함한다. scFab는 링커에 의해 CH2-CH3 Ig 도메인의 C-말단에 커플링된다. 특정 태양에서, scFab는 트랜스페린 수용체에 대해 유도된다.
용어 "1가 결합 방식"은 1가 결합 물질과 BBBR 사이의 상호작용이 1개의 단일 에피토프를 통해 일어나는, BBBR에 대한 특이적 결합을 의미한다. 1가 결합 방식은 단일 에피토프 상호작용점으로 인해 BBBR의 임의의 이량체화/다량체화를 방지한다. 1가 결합 방식은 BBBR의 세포내 정렬이 변화되는 것을 방지한다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정인자를 의미한다. 특정 태양에서, 에피토프 결정인자로는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자들의 화학적 활성 표면 집단이 포함되며, 특정 태양에서, 특이적 3차원 구조 특징 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 한 영역이다.
"트랜스페린 수용체"("TfR")는 2개의 다이설파이드-결합된 서브유니트(각각 약 90,000 Da의 겉보기 분자량 가짐)로 이루어지고 척추동물에서 철 흡수에 수반되는 막횡단 당단백질(약 180,000 Da의 분자량 가짐)이다. 한 태양에서, TfR은 본원에서, 예를 들면, 문헌 [Schneider et al. Nature 311 (1984) 675 - 678]에 보고된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 인간 TfR이다.
용어 "신경 질환"은 CNS에 발병하고/하거나 CNS에 병인을 갖는 질환 또는 질병을 말한다. 대표적인 CNS 질환 또는 질병으로는 신경병증, 아밀로이드증, 암, 안 질환 또는 질병, 바이러스 또는 미생물 감염, 염증, 허혈, 신경퇴행성 질환, 발작, 행동 장애 및 리소좀 축적 질환이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 본 출원에 있어서, CNS는 정상적으로 혈액-망막 장벽에 의해 신체의 나머지 부위로부터 격리되는 눈을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 신경 질환의 구체적인 예로는 다음이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: 신경퇴행성 질환[루이소체병(Lewy body disease), 척수신경마비성회백수염 증후군(postpoliomyelitis syndrome), 샤이-드레거 증후군(Shy-Draeger syndrome), 올리브교소뇌위축(olivopontocerebellar atrophy), 파킨슨병(Parkinson's disease), 다계통 위축, 선상체흑질 변성증을 포함하나 이로 한정되지 않는다], 타우병증(tauopathies)[알츠하이머병 및 핵상마비를 포함하나 이로 한정되지 않는다], 프리온 질환[소해면상뇌병증, 스크래피(scrapie), 크로이츠펠트-야콥 증후군(Creutzfeldt-Jakob syndrome), 쿠루병(kuru), 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease), 만성 소모성 질환 및 치명적 가족성 불면증을 포함하나 이로 한정되지 않는다], 구마비(bulbar palsy), 운동 뉴런 질환 및 신경계 이형퇴행성 질환[카나반병(Canavan disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 신경 세로이드-지질갈색소증, 알렉산더병(Alexander's disease), 투렛 증후군(Tourette's syndrome), 멘케스 킨키 헤어 증후군(Menkes kinky hair syndrome), 코케인 증후군(Cockayne syndrome), 할러포르덴-스파츠 증후군(Halervorden-Spatz syndrome), 라포라병(lafora disease), 레트 증후군(Rett syndrome), 간렌즈핵변성증, 레쉬-니한 증후군(Lesch-Nyhan syndrome), 및 운베리히트-룬드보그 증후군(Unverricht-Lundborg syndrome)을 포함하나 이로 한정되지 않는다], 치매[픽병(Pick's disease) 및 척수소뇌성 실조증을 포함하나 이로 한정되지 않는다], 암(예를 들면, 신체 다른 부위의 암으로부터 비롯된 뇌 전이를 포함하여, CNS 및/또는 뇌의 암).
용어 "신경 질환 약물"은 하나 이상의 신경 질환을 치료하는 약물 또는 치료제를 의미한다. 신경 질환 약물로는 소분자 화합물, 항체, 펩티드, 단백질, 하나 이상의 CNS 표적의 천연 리간드, 하나 이상의 CNS 표적의 천연 리간드의 변형체, 압타머(aptamer), 억제 핵산(즉, 소형 억제 RNA(siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA)), 리보자임 및 소분자, 또는 상기 언급한 것들중 임의 물질의 활성 단편이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 대표적인 신경 질환 약물은 본원에 기술되어 있으며, 다음이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: 항체, 압타머, 단백질, 펩티드, 억제 핵산 및 소분자, 및 그것들 자체이거나 또는 CNS 항원 또는 표적 분자, 예를 들면, 아밀로이드 전구체 단백질 또는 그의 일부, 아밀로이드 베타, 베타-세크레타제, 감마-세크레타제, 타우, 알파-시누클레인, 파킨, 헌팅틴, DR6, 프레세닐린, 아포E(ApoE), 신경교종 또는 다른 CNS 암 마커, 및 뉴로트로핀(이들로 한정되지는 않는다)을 특이적으로 인식하고/하거나 그에 작용(즉, 억제, 활성화 또는 검출)하는 전술한 것들 중 임의 물질의 활성 단편. 신경 질환 약물 및 그를 사용하여 치료될 수 있는 상응하는 질환의 비-제한 예는 다음이다: 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF): 만성 뇌손상(신경발생), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF-2): 항-상피 성장 인자 수용체 뇌암, (EGFR)-항체: 교질 세포주 유래 신경 인자 파킨슨병(GDNF), 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF): 근위축성 측삭 경화증, 우울증, 리소좀 효소: 뇌의 리소좀 축적 질환, 섬모 신경영양 인자(CNTF): 근위축성 측삭 경화증, 뉴레귤린-1(Neuregulin-1): 조현병, 항-HER2 항체(예를 들면, 트라스투주맙): HER2-양성 암으로부터의 뇌 전이.
용어 "조영제(imaging agent)"는 그의 존재 및/또는 위치가 직접 또는 간접적으로 검출되게 하는 하나 이상의 성질을 갖는 화합물을 의미한다. 상기 조영제의 예로는 검출을 가능하게 하는 표지된 물질을 포함하는 단백질 및 소분자 화합물이 포함된다.
용어 "CNS 항원" 또는 "뇌 표적"은 항체 또는 소분자에 의해 표적화될 수 있는, 뇌를 포함한 CNS에서 발현되는 항원 및/또는 분자를 의미한다. 상기 항원 및/또는 분자의 예로는, 제한하지 않고, 다음이 포함된다: 베타-세크레타제 1(BACEl), 아밀로이드 베타(Abeta), 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2), 타우, 아포지단백질 E4(ApoE4), 알파-시누클레인, CD20, 헌팅틴, 프리온 단백질(PrP), 류신 풍부 반복 키나제 2(LRRK2), 파킨, 프레세닐린 1, 프레세닐린 2, 감마 세크레타제, 사멸 수용체 6(DR6), 아밀로이드 전구체 단백질(APP), p75 뉴트로핀 수용체(p75NTR), 및 카스파제 6. 한 태양에서, 항원은 BACEl이다.
용어 "특이적으로 결합하다"는 항원에 선택적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체를 의미한다. 결합 친화도는 일반적으로 표준 분석법, 예를 들면, 스캐차드(Scatchard) 분석 또는 표면 플라즈몬 공명 기술(예를 들면, 비아코어(BIACORE, 등록상표) 사용)을 이용하여 측정된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "CH2-CH3 Ig 물질"은 면역글로불린 CH2 또는 CH3 도메인으로부터 유래된 단백질 물질을 말한다. "CH2-CH3 Ig 물질"은 이량체를 형성하는 2개의 "CH2-CH3" 폴리펩티드를 포함한다. 면역글로불린은 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM일 수 있다. 한 태양에서, CH2-CH3 Ig 물질은 IgG 면역글로불린으로부터 유래되며 본원에서 "CH2-CH3 IgG 물질"로도 지칭된다. 상기 용어는 CH2-CH3 도메인의 천연 서열 및 변이체 CH2-CH3 도메인을 포함한다. 한 태양에서, "CH2-CH3 Ig 물질"은 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단까지 이어지는 인간 중쇄 CH2-CH3 IgG 도메인으로부터 유래한다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, CH2-CH3 도메인 영역 또는 불변 영역중 아미노산 잔기의 번호는 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기술된 바와 같이, EU 인덱스로도 불리는 EU 번호 체계에 따른다.
"접합체"는 표지, 신경 질환 약물 또는 세포독성 약제를 포함하나 이로 한정되지는 않는 하나 이상의 이종 분자에 접합된 본 발명의 융합 단백질이다.
용어 "링커"는 본원에 보고된 바와 같은 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈 및/또는 융합 단백질 및/또는 접합체의 상이한 물질들을 공유적으로 연결시키는 화학적 링커 또는 단일쇄 펩티드 링커를 의미한다. 링커는, 예를 들면, 뇌 작동인자 물질을 1가 결합 물질에 연결시킨다. 예를 들면, 1가 결합 물질이 CH2-CH3 Ig 물질 및 혈액 뇌 장벽 수용체에 대한 scFab를 포함하는 경우, 링커는 scFab를 CH3-CH2 Ig 물질의 C-말단에 접합시킨다. 뇌 작동인자 물질을 1가 결합 물질에 접합시키는 링커(제 1 링커) 및 scFab를 CH2-CH3 Ig 도메인의 C-말단에 연결시키는 링커(제 2 링커)는 같거나 다를 수 있다.
펩티드 결합에 의해 연결된 1 내지 20개 아미노산으로 이루어진 단일쇄 펩티드 링커를 사용할 수 있다. 특정 태양에서, 아미노산은 20개 천연 아미노산으로부터 선택된다. 특정한 다른 태양에서, 아미노산 중 하나 이상은 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및 라이신으로부터 선택된다. 다른 태양에서, 링커는 화학적 링커이다. 특정 태양에서, 상기 링커는 25개 이상 아미노산 잔기, 한 바람직한 태양에서는 32 내지 50개 아미노산 잔기의 길이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 단일쇄 펩티드 링커이다. 한 태양에서, 상기 펩티드 링커는 (GxS)n 링커로, 이때 G는 글리신, S는 세린이고, (x는 3, n은 8, 9 또는 10이거나) 또는 (x는 4이고 n은 6, 7 또는 8이고), 한 태양에서, x는 4이고 n은 6 또는 7이고, 한 바람직한 태양에서, x는 4이고 n은 7이다. 한 태양에서, 상기 링커는 (G4S)4(서열번호 8)이다. 한 태양에서, 링커는 (G4S)6G2(서열번호 7)이다.
접합은 다양한 화학 링커를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 1가 결합 물질 또는 융합 단백질 및 뇌 작동인자 물질은, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오) 프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예를 들면, 다이메틸 아디피미데이트 HC1), 활성 에스터(예를 들면, 다이숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들면, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들면, 비스(p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들면, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이이소시아네이트(예를 들면, 톨루엔 2,6-다이이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오르 화합물(예를 들면, 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠)과 같은 다양한 이작용성 단백질 커플링제를 사용하여 접합될 수 있다. 링커는 뇌로 전달시 작동인자 물질의 방출을 촉진하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(문헌 [Chari et al, Cancer Res. 52 (1992) 127-131]; US 5,208,020 호)를 사용할 수 있다.
공유성 접합은 직접적이거나 링커를 통할 수 있다. 특정 태양에서, 직접적 접합은 단백질 융합물의 제조에 의해(즉, BBBR 및 작동인자 물질에 대한 1가 결합 물질을 암호화하고 단일 폴리펩티드(쇄)로 발현되는 2개 유전자의 유전자 융합에 의해) 이루어진다. 특정 태양에서, 직접적 접합은 BBBR에 대한 1가 결합 물질의 두 부분중 하나상의 반응기와 뇌 작동인자 물질상의 상응하는 기 또는 수용체(acceptor) 사이에 공유 결합의 형성에 의해 이루어진다. 특정 태양에서, 직접적 접합은, 적절한 조건하에서 접합될 다른 분자에 대해 공유 결합을 형성하는 반응기(비-제한 예로서, 설프하이드릴기 또는 카복실기)를 포함시키기 위한 접합될 2개 분자중 하나의 변형(즉, 유전자 변형)에 의해 이루어진다. 하나의 비-제한 예로서, 바람직한 반응기(즉, 시스테인 잔기)를 갖는 분자(즉, 아미노산)는, 예를 들면, BBBR 항체에 대한 1가 결합 물질내에 도입될 수 있고, 신경 약물과 다이설파이드 결합이 형성될 수 있다. 단백질에 대한 핵산의 공유성 접합을 위한 방법은 또한 당해 분야에 공지되어 있다(즉, 광가교결합, 예를 들면, 문헌 [Zatsepin et al. Russ. Chem. Rev. 74 (2005) 77-95] 참조). 접합은 또한 다양한 링커를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 1가 결합 물질 및 작동인자 물질은, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오) 프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예를 들면, 다이메틸 아디피미데이트 HC1), 활성 에스터(예를 들면, 다이숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들면, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들면, 비스(p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들면, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이이소시아네이트(예를 들면, 톨루엔 2,6-다이이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오르 화합물(예를 들면, 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠)과 같은 다양한 이작용성 단백질 커플링제를 사용하여 접합될 수 있다. 펩티드 결합에 의해 연결된 1 내지 20개 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 링커도 또한 사용할 수 있다. 특정한 상기 태양에서, 아미노산 잔기는 20개의 천연 아미노산으로부터 선택된다. 특정한 다른 상기 태양에서, 아미노산 잔기들중 하나 이상이 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및 라이신으로부터 선택된다. 링커는 뇌로 전달시 작동인자 물질의 방출을 촉진하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(문헌 [Chari et al, Cancer Res. 52 (1992) 127-131]; 및 US 5,208,020 호)를 사용할 수 있다.
II. 조성물 및 방법
한 양태에서, 본 발명은, 부분적으로, 본원에 보고된 바와 같은 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈을 사용하여 뇌 작동인자 물질을 혈액 뇌 장벽을 횡단하여 뇌로 전달할 수 있다는 발견에 기초한다. 특정 태양에서, 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈은 혈액 뇌 장벽 수용체, 예를 들면, 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 1가 결합 물질을 포함한다. 본원에 보고된 바와 같은 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈은, 예를 들면, 신경 질환, 예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 및 파킨슨병과 알츠하이머병 공존질환의 진단 또는 치료에 유용하다.
A. 대표적인 항-혈액 뇌 장벽 수용체 항체
혈액 뇌 장벽 수용체에 특이적으로 결합하는 1가 결합 물질은 그의 결합 및 트랜스시토시스 성질과 관련하여 특성화될 수 있다:
- 1가 결합 물질로서 BBBR 발현 세포의 효과적인 세포 결합,
- 1가 결합 물질로서 효과적인 시험관내 트랜스시토시스,
- 인간 - 사이노몰거스 교차-반응성(예를 들면, 비아코어 및 FACS 실험에서).
트랜스시토시스 스크리닝은 hCMEC/D3 기반 분석에서 수행하였다. 상기 분석은 펄스-추적 방식으로 수행하였다. hCMEC/D3 뇌 내피 세포를 1가 결합 물질과 함께 1 시간동안 배양하고, 세척한 후, 하기의 파라미터를 세척후 0 및 4 시간 후에 측정하였다:
i) 부하 단계동안 세포내에 흡수된 1가 결합 물질의 양;
ii) 부하 및 세척 4 시간 후 1가 결합 물질의 기저부 양;
iii) 부하 및 세척 4 시간 후 1가 결합 물질의 정단부 양;
iv) 부하 및 세척후 0 및 4 시간 후 세포내(세포 용해에 의해) 1가 결합 물질의의 양;
v) 부하 및 세척후 0 및 4 시간 후 1가 결합 물질의 총량.
본원에 보고된 바와 같은 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈내 1가 결합 물질로서 적합하기 위해, 1가 결합 물질은 i) hCMEC/D3 세포에 의해 흡수되고(엔도시토시스(endocytosis)), ii) hCMEC/D3 세포 밖으로 운반되고(엑소시토시스), iii) hCMEC/D3 세포 내부에서 안정(분해를 위한 엔도솜으로의 운반이 없거나 낮음)해야 한다.
따라서, 한 태양에서, 1가 결합 물질은, hCMEC/D3 기반 분석에서 i) 1시간의 부하 기간동안 hCMEC/D3 세포 내로의 (실질적인) 흡수, ii) 부하 기간 및 세척 단계후 세척후 4 시간 이내에 정단부 및/또는 기저부 구획 내로의 방출, 및 iii) 낮은 (세포내) 분해율을 특징으로 한다.
한 태양에서, 부하는 1 시간동안 약 2.67 ㎍/mL 1가 결합 물질의 농도에서 이루어진다.
본원에 보고된 바와 같은 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 1가 결합 물질로서 적합하기 위해 1가 결합 물질은 전술한 hCMEC/D3 기반 분석에서 하기의 임계값을 나타내어야 하는 것으로 밝혀졌다:
i) 400 pg 이상의, 부하 단계동안 세포내에 흡수된 1가 결합 물질의 양,
ii) 100 pg 이상의, 부하 및 세척 4 시간 후 1가 결합 물질의 기저부 양, 및
iii) 150 pg 이상의, 부하 및 세척 4 시간후 1가 결합 물질의 정단부 양.
마우스 항-인간 트랜스페린-수용체 항체 128.1(가변 영역 서열에 대해서는 WO 93/10819 호 및 서열번호 11 및 12 참조)을 기준으로 취할 수 있다. 이 경우, 본원에 보고된 바와 같은 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈의 1가 결합 물질로서 적합하기 위해 1가 결합 물질은 전술한 hCMEC/D3 기반 분석에서 하기의 임계값을 나타내어야 한다:
i) 항체 128.1의 부하량의 20% 이상의, 부하 단계동안 세포내에 흡수된 1가 결합 물질의 양,
ii) 항체 128.1의 기저부 양의 15% 이상의, 부하 및 세척 4 시간후 1가 결합 물질의 기저부 양, 및
iii) 항체 128.1의 정단부 양의 15% 이상의, 부하 및 세척 4 시간후 1가 결합 물질의 정단부 양
hCMEC/D3 기반 분석을 다음과 같이 수행하였다(이것은 본원에 보고된 바와 같은 모든 양태들의 한 태양이다):
hCMEC/D3(WO 2006/056879 호 및 문헌 [Weksler, B.B., et al., FASEB J. 19 (2005) 1872-1874] 참조)을 위한 배지 및 보충제는 론자(Lonza)로부터 수득할 수 있다. hCMEC/D3 세포(계대수 26 내지 29)는 2.5% FBS, 공급된 성장 인자의 1/4을 함유하고 공급된 하이드로코르티손, 겐타마이신 및 아스콜브산으로 완전 보충된 EBM2 배지에서 콜라겐-코팅된 커버슬립(현미경관찰) 또는 플라스크에서 밀집상태(confluence)까지 배양된다/될 수 있다.
모든 트랜스시토시스 분석에 있어서, 고밀도 기공(1x108 기공/cm2) PET 막 필터 삽입물(0.4 ㎛ 기공 크기, 12 mm 직경)을 12-웰 세포 배양 플레이트에 사용한다/할 수 있다. 배지 부피는 정단부 및 기저부 챔버 각각에 대해 400 ㎕ 및 1600 ㎕로 산출된다. 필터 삽입물의 정단부 챔버는 래트 꼬리 콜라겐 I(7.5 ㎍/cm2)에 이어 피브로넥틴(5 ㎍/mL)으로 코팅되고/될 수 있고, 각각 실온(RT)에서 1 시간동안 배양을 지속한다. hCMEC/D3 세포는 EBM2 배지에서 10 내지 12 일동안 밀집된 단층(약 2x105 세포/cm2)으로 성장한다/할 수 있다. 빈 필터는 분석 전에 1 시간동안 또는 밤새(o/n) 1% BSA를 함유하는 PBS에서 차단된 다음 분석전에 EBM2에서 적어도 1 시간동안 교정된다/될 수 있다.
분석(분석 도식에 대해서는 도 1 참조)은 달리 본원에 기술된 바와 같이 재구성된 무혈청 EBM2 배지에서 수행하였다. 분석일에, 세포를 60분동안 혈청-결핍시켜 문제의 혈액 뇌 장벽 수용체의 천연 리간드를 고갈시킨다. 세포를 함유하거나 함유하지 않는(그러나 완전 배지 중에서 밤새 차단된) 필터 삽입물을 37 ℃에서 1 시간동안 문제의 단클론성 항체(1가 결합 물질)와 함께 정단부에서 배양하였다. 단층들을 RT에서 무혈청 배지중에서 정단부에서(400 ㎕) 및 기저부에서(1600 ㎕) 각각 3 내지 5 분동안 3회 세척하였다. 예열시킨 배지를 정단부 챔버에 첨가하고, 1600 ㎕의 예열된 배지를 함유하는 새로운 12 웰 플레이트(1% BSA를 함유하는 PBS로 밤새 차단됨)로 필터를 옮겼다. 이 시점에서, 특이성 항체(1가 결합 물질) 흡수를 측정하기 위해, 세포를 함유하거나 함유하지 않는 필터를 500 ㎕ RIPA 완충액에서 용해시켰다. 나머지 필터들은 37 ℃ 또는 4 ℃에서 배양하고, 샘플을 다양한 시점에서 수거하여 항체(1가 결합 물질)의 정단부 및/또는 기저부 방출을 측정하였다. 샘플내 항체의 함량은 고 민감성 IgG ELISA를 사용하여 정량화할 수 있다(실시예 10 참조). 각각의 시점에서, 데이터는 2개의 빈 필터 및 3개의 필터 세포 배양물로부터 작성되어야 한다.
69개 항-트랜스페린 수용체 항체에 대한 결과를 하기 표에 나타내었다. 항체 128.1을 기준으로 사용하였다.
Figure 112021095157442-pat00001
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항체 299는 705 pg의 트랜스시토시스 부하량을 나타내고, 4 시간 후에 170 pg(= 부하량의 24%)를 기저부 구획에서 확인할 수 있고 294 pg(= 부하량의 42%)를 정단부 구획에서 확인할 수 있다.
항체 494는 3510 pg의 트랜스시토시스 부하량을 나타내고, 4 시간 후에 748 pg(= 부하량의 21%)를 기저부 구획에서 확인할 수 있고 1503 pg(= 부하량의 43%)를 정단부 구획에서 확인할 수 있다.
상기에 개략된 바와 같은 기준을 충족시키는 항체들은 본 발명의 태양들이다.
따라서, 본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 다음을 포함하는 항-트랜스페린 수용체 항체 또는 그의 트랜스페린 수용체 결합 단편이다:
(1) 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(2) 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(3) 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(4) 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(5) 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(6) 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(7) 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(8) 서열번호 27의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(9) 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(10) 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(11) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(12) 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(13) 서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(14) 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(15) 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(16) 서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(17) 서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(18) 서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(19) 서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 50의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(20) 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(21) 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(22) 서열번호 55의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(23) 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(24) 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(25) 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(26) 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(27) 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(28) 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(29) 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(30) 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(31) 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(32) 서열번호 75의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(33) 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(34) 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(35) 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(36) 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 84의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(37) 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(38) 서열번호 87의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(39) 서열번호 89의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 90의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(40) 서열번호 91의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(41) 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(42) 서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 96의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
(43) 서열번호 97의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 98의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인.
본원에 보고된 바와 같은 한 바람직한 양태는 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-트랜스페린 수용체 항체 또는 그의 트랜스페린 수용체 결합 단편이다.
본원에 보고된 바와 같은 한 바람직한 양태는 서열번호 91의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-트랜스페린 수용체 항체 또는 그의 트랜스페린 수용체 결합 단편이다.
각각의 아미노산 서열들은 하기 표에 나타나 있다.
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Figure 112021095157442-pat00006
Figure 112021095157442-pat00007
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Figure 112021095157442-pat00011
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 다음을 포함하는 인간화 항-트랜스페린 수용체 항체 또는 그의 트랜스페린 수용체 결합 단편이다:
(1) 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(2) 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(3) 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(4) 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(5) 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(6) 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(7) 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(8) 서열번호 27의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(9) 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(10) 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(11) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(12) 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(13) 서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(14) 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(15) 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(16) 서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(17) 서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(18) 서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(19) 서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 50의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(20) 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(21) 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(22) 서열번호 55의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(23) 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(24) 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(25) 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(26) 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(27) 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(28) 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(29) 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(30) 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(31) 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(32) 서열번호 75의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(33) 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(34) 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(35) 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(36) 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 84의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(37) 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(38) 서열번호 87의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(39) 서열번호 89의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 90의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(40) 서열번호 91의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(41) 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(42) 서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 96의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인, 또는
(43) 서열번호 97의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 98의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인.
본원에 보고된 바와 같은 한 바람직한 양태는 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간화 항-트랜스페린 수용체 항체 또는 그의 트랜스페린 수용체 결합 단편이다.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 (a) 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 인간화 항-인간 트랜스페린 수용체 항체이다. 한 태양에서, 상기 항체는 (d) 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함한다.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 (a) 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 인간화 항-인간 트랜스페린 수용체 항체이다. 한 태양에서, 상기 항체는 (d) 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-트랜스페린 수용체 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 VH HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 한 태양에서, 상기 항체는 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 태양에서, 항체는 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 또 다른 태양에서, 항체는 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 또 다른 태양에서, 항체는 (a) 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 한 태양에서, 항체는 (a) 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (ii) 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (iii) 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 115로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
본원에 보고된 바와 같은 한 바람직한 양태는 서열번호 91의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 유도된 인간화 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간화 항-트랜스페린 수용체 항체 또는 그의 트랜스페린 수용체 결합 단편이다.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 인간화 항-인간 트랜스페린 수용체 항체이다. 한 태양에서, 상기 항체는 (d) 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함한다.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 인간화 항-인간 트랜스페린 수용체 항체이다. 한 태양에서, 상기 항체는 (d) 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-트랜스페린 수용체 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 VH HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 한 태양에서, 상기 항체는 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 태양에서, 항체는 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 또 다른 태양에서, 항체는 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 또 다른 태양에서, 항체는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 한 태양에서, 항체는 (a) 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (ii) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (iii) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 뇌 작동인자 물질로서 전장 IgG 항체, 링커, 및 트랜스페린 수용체에 결합하는 1가 결합 물질로서 1개의 scFab를 포함하는 트랜스페린 셔틀 모듈로서, 이때 상기 scFab는 링커에 의해 IgG 항체의 중쇄들 중 하나의 Fc-영역의 C-말단에 접합된다.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 뇌 작동인자 물질로서 전장 IgG 항체, 링커, 및 트랜스페린 수용체에 결합하는 1가 결합 물질로서 1개의 scFv를 포함하는 트랜스페린 셔틀 모듈로서, 이때 상기 scFv는 링커에 의해 IgG 항체의 중쇄들 중 하나의 Fc-영역의 C-말단에 접합된다.
한 바람직한 태양에서, 1가 결합 물질은 서열번호 109, 110, 112, 113, 114 및 115, 또는 서열번호 116, 117, 119, 120, 121 및 122의 HVR을 포함한다.
또 다른 양태에서, 상기 태양들 중 어느 하나에 따른 항-트랜스페린 수용체 항체는 하기 섹션 1 내지 6에 기술된 바와 같은 임의의 특징들을 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다.
1. 항체 친화도
한 태양에서, Kd는 방사성표지된 항원 결합 분석법(RIA)에 의해 측정한다. 한 태양에서, RIA는 해당 항체의 Fab 변형체 및 그의 항원을 사용하여 수행한다. 예를 들면, 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는, 비표지 항원의 연속 적정물의 존재하에서 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시킨 후, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정한다(예를 들면, 문헌 [Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881] 참조). 분석을 위한 조건을 설정하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER, 등록상표) 다중-웰 플레이트(터모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨(pH 9.6) 중의 5 ㎍/mL의 포획 항-Fab 항체(카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅하고, 이어서 실온(약 23 ℃)에서 PBS 중의 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5 시간동안 차단시켰다. 비-흡착 플레이트(눈크(Nunc) #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM의 [125I]-항원을 해당 Fab의 연속 희석물과 혼합한다(예를 들면, 문헌 [Presta, L.G. et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599]에서의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치하게). 이어서, 해당 Fab를 밤새 배양한다; 그러나, 배양은 평형이 확실하게 도달되게 하기 위해 더 오랫동안(예를 들면, 약 65 시간) 지속될 수도 있다. 그 후에, 혼합물을 실온에서 배양을 위해(예를 들면, 약 1 시간동안) 포획 플레이트로 옮긴다. 이어서, 용액을 제거하고 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리솔베이트 20(트윈(TWEEN)-20(등록상표))으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조되면, 150 ㎕/웰의 섬광제(scintillant)(마이크로신트(MICROSCINT)-20™; 패커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 10 분동안 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 카운터(패커드) 상에서 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도를 경쟁 결합 분석법에 사용하기 위해 선택한다.
또 다른 태양에 따라서, Kd는 비아코어(등록상표) 표면 플라즈몬 공명 분석법을 이용하여 측정한다. 예를 들면, 비아코어(등록상표)-2000 또는 비아코어(등록상표)-3000(비아코어 인코포레이티드(BIAcore Inc.), 뉴저지 피스카타웨이)을 이용한 분석을 25 ℃에서 약 10 반응 단위(response unit, RU)에서 고정화 항원 CM5 칩을 사용하여 수행한다. 한 태양에서, 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 비아코어 인코포레이티드)을 공급자의 지시에 따라서 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 4.8)로 5 ㎍/mL(약 0.2 μM)로 희석한 후 5 ㎕/분의 유량으로 주입하여 약 10 반응 단위(RU)의 커플링된 단백질을 달성한다. 항원 주입 후에, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단한다. 동적 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물(0.78 nM 내지 500 nM)을 25 ℃에서 약 25 ㎕/분의 유량으로 0.05% 폴리솔베이트 20(트윈-20™) 계면활성제를 갖는 PBS(PBST) 중에 주입한다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는 결합 및 해리 샌서그램을 동시에 적합화시켜 단순한 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(비아코어(등록상표) 평가 소프트웨어(Evaluation Software) 버전 3.2)을 이용하여 산출한다. 평형 해리 상수(Kd)는 비 koff/kon로서 산출한다(예를 들면, 문헌 [Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881] 참조). 상기의 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 결합 속도(on-rate)가 106 M-1s-1를 초과하는 경우, 결합 속도는, 분광계, 예를 들면, 정류기(stop-flow) 장착 분광광도계(아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-AMINCO™ 분광광도계(터모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정시 증가하는 농도의 항원의 존재하에 PBS(pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의, 25 ℃에서의 형광 발광 강도(여기 = 295 nm; 발광 = 340 nm, 16 nm 통과대역(band-pass))에서의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기술을 이용하여 측정할 수 있다.
2. 항체 단편
특정 태양에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편으로는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기에 기술되는 다른 단편들이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특정 항체 단편에 대한 검토를 위해서는, 문헌 [Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]을 참조하시오. scFv 단편에 대한 검토를 위해서는, 예를 들면, 문헌 [Plueckthun, A., In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994) pp. 269-315]; 또한 WO 93/16185 호; 및 US 5,571,894 호 및 US 5,587,458 호를 참조하시오. 재생 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 고찰을 위해서는, US 5,869,046 호를 참조하시오.
디아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다(예를 들면, EP 0 404 097 호; WO 1993/01161 호; 문헌 [Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]; 및 문헌 [Hollinger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448] 참조). 트리아바디 및 테트라바디도 또한 문헌 [Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]에 기술되어 있다.
단일-도메인 항체는 중쇄 가변 도메인 전체 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전체 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 태양에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 매사추세츠 월탐); 예를 들면, US 6,248,516 호 참조).
항체 단편은, 본원에 기술된 바와 같이, 온전한 항체의 단백질분해성 절단, 및 재조합 숙주 세포(예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 생성을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정 태양에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정한 키메라 항체가, 예를 들면, US 4,816,567 호; 및 문헌 [Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]에 기술되어 있다. 한 예로, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 원숭이와 같은 비-인간 영장류로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 다른 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 모 항체로부터 변화된 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 태양에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는, 비-인간 모 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들면, CDR(또는 그의 일부)가 비-인간 항체로부터 유도되고 FR(또는 그의 일부)가 인간 항체 서열로부터 유도된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 임의적으로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 일부 태양에서, 인간화 항체중 일부 FR 잔기는, 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화도를 회복시키거나 개선하기 위해 비-인간 항체(예를 들면, 그로부터 HVR 잔기가 유도되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은, 예를 들면, 문헌 [Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633]에 개관되어 있고, 예를 들면, 문헌 [Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329]; 문헌 [Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]; US 5, 821,337 호, US 7,527,791 호, US 6,982,321 호 및 US 7,087,409 호; 문헌 [Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34](특이성 결정 영역(SDR) 그라프팅을 기술하고 있음); 문헌 [Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498]("재표면화"를 기술하고 있음); 문헌 [Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60]("FR 셔플링"을 기술하고 있음); 및 문헌 [Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68 and Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260](FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근방법을 기술하고 있음)에 더 기술되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역으로는 다음이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: "최적합(best-fit)" 방법을 이용하여 선택된 프레임워크 영역(예를 들면, 문헌 [Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308] 참조); 특정한 아군의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역들의 인간 항체들의 공통 서열로부터 유도된 프레임워크 영역(예를 들면, 문헌 [Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289]; 및 문헌 [Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632] 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식선 프레임워크 영역(예를 들면, 문헌 [Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633] 참조); 및 FR 라이브러리 검색으로부터 유도된 프레임워크 영역(예를 들면, 문헌 [Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684] 및 문헌 [Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618] 참조).
4. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 검색함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리를 제작하고 목적하는 결합 특성을 갖는 항체에 대해 상기 라이브러리를 검색하기 위한 다양한 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 방법은, 예를 들면, 문헌 [Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37]에 개관되어 있으며, 예를 들면, 문헌 [McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628]; 문헌 [Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597]; 문헌 [Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175]; 문헌 [Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310]; 문헌 [Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093]; 문헌 [Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472]; 및 문헌 [Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132]에 더 기술되어 있다.
특정한 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 별개로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되고, 상기 라이브러리는 이어서 문헌 [Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455]에 기술된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 검색될 수 있다. 파지는 전형적으로, 단일-쇄 Fv(scFv) 단편으로서든지 또는 Fab 단편으로서든지 항체 단편을 디스플레이한다. 면역접종된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구성할 필요없이 면역원에 대한 고-친화성 항체를 제공한다. 또는, 문헌 [Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734]에 기술된 바와 같이, 나이브(naive) 레퍼토리를 클로닝하여(예를 들면, 인간으로부터) 광범위한 비-자가 및 또한 자가-항원에 대한 항체들의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는 또한, 문헌 [Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388]에 기술된 바와 같이, 줄기 세포로부터 비-재배열된 V-유전자 절편을 클로닝하고, 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변성인 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내에서 재배열을 달성함으로써 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기술하고 있는 특허 공개공보로는, 예를 들면, US 5,750,373 호 및 US 2005/0079574 호, US 2005/0119455 호, US 2005/0266000 호, US 2007/0117126 호, US 2007/0160598 호, US 2007/0237764 호, US 2007/0292936 호 및 US 2009/0002360 호가 포함된다.
5. 다중특이성 항체
특정 태양에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이성 항체, 예를 들면, 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단클론성 항체이다. 특정 태양에서, 결합 특이성 중 하나는 트랜스페린 수용체에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 이중특이성 항체는 또한 세포독성 약제를 트랜스페린 수용체를 발현하는 세포로 편재화시키기 위해 사용될 수 있다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로 제조될 수 있다.
다중특이성 항체를 제조하기 위한 기술로는 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현(문헌 [Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540]; WO 93/08829 호; 및 문헌 [Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659] 참조), 및 "놉-인-홀(knob-in-hole)" 조작(예를 들면, US 5,731,168 호 참조)가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 다중특이성 항체는 또한, 항체 Fc-헤테로이량체 분자를 제조하기 위한 정전 스티어링(steering) 효과를 조작함으로써(WO 2009/089004 호); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합시킴으로써(예를 들면, US 4,676,980 호; 및 문헌 [Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83] 참조); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이성 항체를 생성함으로써(예를 들면, 문헌 [Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553] 참조); 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위해 "디아바디" 기술을 사용함으로써(예를 들면, 문헌 [Hollinger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448] 참조); 단일쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용함으로써(예를 들면, 문헌 [Gruber, M. et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374] 참조); 및, 예를 들면, 문헌 [Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69]에 기술된 바와 같이 삼중특이성 항체를 제조함으로써 제조될 수 있다.
"옥토퍼스(Octopus) 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체도 또한 본원에 포함된다(예를 들면, US 2006/0025576 호 참조).
본원에서 상기 항체 또는 단편은 트랜스페린 수용체 뿐 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용(Dual Acting) Fab" 또는 "DAF"를 또한 포함한다(예를 들면, US 2008/0069820 호 참조).
본원에서 항체 또는 단편은 또한 WO　2009/080251, WO　2009/080252, WO　2009/080253, WO　2009/080254, WO　2010/112193, WO　2010/115589, WO　2010/136172, WO　2010/145792 및 WO 2010/145793 호에 기술된 다중특이성 항체들을 포함한다.
본원에 보고된 바와 같은 모든 양태들의 한 태양에서, 항-트랜스페린 수용체 항체는 이중특이성 항체이다.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는
a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제 1 경쇄 및 제 1 중쇄, 및
b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제 2 경쇄 및 제 2 중쇄(이때, 제 2 경쇄 및 제 2 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 치환된다)를 포함하는 2가의 이중특이성 항체로서, 이때 제 1 항원 또는 제 2 항원은 인간 트랜스페린 수용체이다.
a)의 항체는 b)에 언급된 바와 같은 변형을 함유하지 않으며, a)의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄이다.
b)의 항체에 있어서,
경쇄 내에서, 가변 경쇄 도메인 VL은 상기 항체의 가변 중쇄 도메인 VH로 치환되고,
중쇄 내에서, 가변 중쇄 도메인 VH는 상기 항체의 가변 경쇄 도메인 VL로 치환된다.
한 태양에서,
i) a)의 제 1 경쇄의 불변 도메인 CL에서, 위치 124(카밧에 따른 번호)의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산에 의해 치환되고, a)의 제 1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산 또는 위치 213(카밧 EU 인덱스에 따른 번호)의 아미노산은 음으로 하전된 아미노산에 의해 치환되거나, 또는
ii) b)의 제 2 경쇄의 불변 도메인 CL에서, 위치 124(카밧에 따른 번호)의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산에 의해 치환되고, b)의 제 2 중쇄의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산 또는 위치 213(카밧 EU 인덱스에 따른 번호)의 아미노산은 음으로 하전된 아미노산에 의해 치환된다.
한 바람직한 태양에서,
i) a)의 제 1 경쇄의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 라이신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 번호)(한 바람직한 태양에서는 라이신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로 치환된다), a)의 제 1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환되거나(카밧 EU 인덱스에 따른 번호), 또는
ii) b)의 제 2 경쇄의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 라이신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 번호)(한 바람직한 태양에서는 라이신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로 치환), b)의 제 2 중쇄의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호).
한 태양에서, 제 2 중쇄의 불변 도메인 CL에서, 위치 124 및 123의 아미노산은 K로 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호).
한 태양에서, 제 2 경쇄의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147 및 213의 아미노산은 E로 치환된다(카밧의 EU 인덱스에 따른 번호).
한 바람직한 태양에서, 제 1 경쇄의 불변 도메인 CL에서, 위치 124 및 123의 아미노산은 K로 치환되고, 제 1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147 및 213의 아미노산은 E로 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호).
한 태양에서, 제 2 중쇄의 불변 도메인 CL에서 위치 124 및 123의 아미노산은 K로 치환되고, 제 2 경쇄의 불변 도메인 CH1에서 위치 147 및 213의 아미노산은 E로 치환되고, 제 1 경쇄의 가변 도메인 VL에서 위치 38의 아미노산은 K로 치환되고, 제 1 중쇄의 가변 도메인 VH에서 위치 39의 아미노산은 E로 치환되고, 제 2 중쇄의 가변 도메인 VL에서 위치 38의 아미노산은 K로 치환되고, 제 2 경쇄의 가변 도메인 VH에서 위치 39의 아미노산은 E로 치환된다(카밧 EU 인덱스에 다른 번호).
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는
a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제 1 경쇄 및 제 1 중쇄, 및
b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제 2 경쇄 및 제 2 중쇄(이때, 상기 제 2 경쇄 및 제 2 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 치환되고, 제 2 경쇄 및 제 2 중쇄의 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 치환된다)를 포함하는 2가의 이중특이성 항체로서, 이때 제 1 항원 또는 제 2 항원은 인간 트랜스페린 수용체이다.
a)의 항체는 b)에 언급된 바와 같은 변형을 함유하지 않으며, a)의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄이다.
b)의 항체에 있어서,
경쇄 내에서, 가변 경쇄 도메인 VL은 상기 항체의 가변 중쇄 도메인 VH로 치환되고, 불변 경쇄 도메인 CL은 상기 항체의 불변 중쇄 도메인 CH1로 치환되며,
중쇄 내에서, 가변 중쇄 도메인 VH는 상기 항체의 가변 경쇄 도메인 VL로 치환되고, 불변 중쇄 도메인 CH1은 상기 항체의 불변 경쇄 도메인 CL로 치환된다.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는
a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제 1 경쇄 및 제 1 중쇄, 및
b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제 2 경쇄 및 제 2 중쇄(이때, 상기 제 2 경쇄 및 제 2 중쇄의 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 치환된다)를 포함하는 2가의 이중특이성 항체로서, 이때 제 1 항원 또는 제 2 항원은 인간 트랜스페린 수용체이다.
a)의 항체는 b)에 언급된 바와 같은 변형을 함유하지 않으며, a)의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄이다.
b)의 항체에 있어서,
경쇄 내에서, 불변 경쇄 도메인 CL은 상기 항체의 불변 중쇄 도메인 CH1로 치환되고,
중쇄 내에서, 불변 중쇄 도메인 CH1은 상기 항체의 불변 경쇄 도메인 CL로 치환된다.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는
a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체, 및
b) 1 내지 4개의 추가 항원(즉, 바람직하게는 1개의 다른 항원, 즉, 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 및/또는 제 3 및/또는 제 4 및/또는 제 5 항원)에 특이적으로 결합하는 1, 2, 3 또는 4개의 단일쇄 Fab를 포함하는 다중특이성 항체로서,
이때 b)의 상기 단일쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C- 또는 N-말단에서 펩티드 링커에 의해 a)의 상기 전장 항체에 융합되고, 상기 제 1 항원 또는 추가 항원들중 하나는 인간 트랜스페린 수용체이다.
한 태양에서, 제 2 항원에 결합하는 1 또는 2개의 동일한 단일쇄 Fab 단편들은 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에서 펩티드 링커에 의해 상기 전장 항체에 융합된다.
한 태양에서, 제 2 항원에 결합하는 1 또는 2개의 동일한 단일쇄 Fab 단편들은 상기 전장 항체의 중쇄의 C-말단에서 펩티드 링커에 의해 상기 전장 항체에 융합된다.
한 태양에서, 제 2 항원에 결합하는 1 또는 2개의 동일한 단일쇄 Fab 단편들은 상기 전장 항체의 경쇄의 C-말단에서 펩티드 링커에 의해 상기 전장 항체에 융합된다.
한 태양에서, 제 2 항원에 결합하는 2개의 동일한 단일쇄 Fab 단편들은 상기 전장 항체의 각각의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에서 펩티드 링커에 의해 상기 전장 항체에 융합된다.
한 태양에서, 제 2 항원에 결합하는 2개의 동일한 단일쇄 Fab 단편들은 상기 전장 항체의 각각의 중쇄의 C-말단에서 펩티드 링커에 의해 상기 전장 항체에 융합된다.
한 태양에서, 제 2 항원에 결합하는 2개의 동일한 단일쇄 Fab 단편들은 상기 전장 항체의 각각의 경쇄의 C-말단에서 펩티드 링커에 의해 상기 전장 항체에 융합된다.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 다음을 포함하는 3가의 이중특이성 항체이다:
a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체,
b) ba) 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 또는 bb) 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 불변 도메인 1(CH1)로 이루어지는 제 1 폴리펩티드(이때 상기 제 1 폴리펩티드는 그의 VH 도메인의 N-말단하에서 펩티드 링커에 의해 상기 전장 항체의 2개 중쇄중 1개의 C-말단에 융합된다),
c) ca) 항체 경쇄 가변 도메인(CL) 또는 cb) 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)으로 이루어지는 제 2 폴리펩티드(이때 상기 제 2 폴리펩티드는 VL 도메인의 N-말단하에서 펩티드 링커에 의해 상기 전장 항체의 2개 중쇄중 1개의 C-말단에 융합된다)
(이때, 상기 제 1 폴리펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 제 2 폴리펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인(VL)은 함께 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 형성하고, 제 1 항원 또는 제 2 항원은 인간 트랜스페린 수용체이다).
한 태양에서, b)의 폴리펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 c)의 폴리펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인(VL)은 하기 위치들 사이에 다이설파이드 결합의 도입에 의해 쇄간 다이설파이드 가교를 통해 결합되고 안정화된다:
i) 중쇄 가변 도메인 위치 44 대 경쇄 가변 도메인 위치 100, 또는
ii) 중쇄 가변 도메인 위치 105 대 경쇄 가변 도메인 위치 43, 또는
iii) 중쇄 가변 도메인 위치 101 대 경쇄 가변 도메인 위치 100(항상 카밧 EU 인덱스에 따른 번호).
안정화를 위해 비천연 다이설파이드 가교를 도입하기 위한 기술은, 예를 들면, WO　94/029350 호, 문헌 [Rajagopal, V., et al., Prot. Eng. (1997) 1453-59]; 문헌 [Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25, (1998) 387-393]; 또는 문헌 [Schmidt, M., et al., Oncogene (1999) 18 1711-1721]에 기술되어 있다. 한 태양에서, b) 및 c)의 폴리펩티드들의 가변 도메인들 사이의 선택적인 다이설파이드 결합은 중쇄 가변 도메인 위치 44와 경쇄 가변 도메인 위치 100 사이에 존재한다. 한 태양에서, b) 및 c)의 폴리펩티드들의 가변 도메인들 사이의 선택적인 다이설파이드 결합은 중쇄 가변 도메인 위치 105와 경쇄 가변 도메인 위치 43 사이에 존재한다(항상 카밧의 EU 인덱스에 따른 번호). 한 태양에서, 단일쇄 Fab 단편의 가변 도메인 VH와 VL 사이에 상기 선택적인 다이설파이드 안정화를 갖지 않는 3가의 이중특이성 항체가 바람직하다.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는
a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 제 1 경쇄 및 제 1 중쇄, 및
b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 제 2 (변형된) 경쇄 및 제 2 (변형된) 중쇄(이때, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 치환되고/되거나, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 치환된다)를 포함하는 3중특이성 또는 4중특이성 항체이며,
c) 여기서, 1 또는 2개의 추가 항원들(즉, 제 3 및/또는 제 4 항원)에 특이적으로 결합하는 1 내지 4개의 항원 결합 펩티드들은 펩티드 링커에 의해 a) 및/또는 b)의 경쇄 또는 중쇄의 C- 또는 N-말단에 융합되고,
이때, 제 1 항원 또는 제 2 항원 또는 추가 항원들 중 1개는 인간 트랜스페린 수용체이다.
a)의 항체는 b)에 언급된 바와 같은 변형을 함유하지 않으며, a)의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄이다.
한 태양에서, 3중특이성 또는 4중특이성 항체는 c)에 1 또는 2개의 추가 항원에 특이적으로 결합하는 1 또는 2개의 항원 결합 펩티드를 포함한다.
한 태양에서, 항원 결합 펩티드는 scFv 단편 및 scFab 단편의 군에서 선택된다.
한 태양에서, 항원 결합 펩티드는 scFv 단편이다.
한 태양에서, 항원 결합 펩티드는 scFab 단편이다.
한 태양에서, 항원 결합 펩티드는 a) 및/또는 b)의 중쇄의 C-말단에 융합된다.
한 태양에서, 3중특이성 또는 4중특이성 항체는 c)에 1개의 추가 항원에 특이적으로 결합하는 1 또는 2개의 항원 결합 펩티드를 포함한다.
한 태양에서, 3중특이성 또는 4중특이성 항체는 c)에 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 동일한 항원 결합 펩티드를 포함한다. 한 바람직한 태양에서, 상기 2개의 동일한 항원 결합 펩티드는 둘 다 동일한 펩티드 링커에 의해 a) 및 b)의 중쇄의 C-말단에 융합된다. 한 바람직한 태양에서, 2개의 동일한 항원 결합 펩티드는 scFv 단편이거나 또는 scFab 단편이다.
한 태양에서, 3중특이성 또는 4중특이성 항체는 c)에 제 3 및 제 4 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 항원 결합 펩티드를 포함한다. 한 태양에서, 상기 2개의 항원 결합 펩티드는 둘 다 동일한 펩티드 커넥터에 의해 a) 및 b)의 중쇄의 C-말단에 융합된다. 한 바람직한 태양에서, 상기 2개의 항원 결합 펩티드는 scFv 단편이거나 또는 scFab 단편이다.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는
a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는(및 2개의 Fab 단편을 포함하는) 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄,
b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 2개의 추가의 Fab 단편(이때 상기 추가의 Fab 단편은 둘 다 펩티드 링커에 의해 a)의 중쇄의 C- 또는 N-말단에 융합된다)을 포함하는 2중특이성 4가 항체로서,
이때, Fab 단편들에서는 하기의 변형이 수행되었다:
i) a)의 Fab 단편 둘 다에서, 또는 b)의 Fab 단편 둘 다에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 치환되고/되거나, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 치환되거나,
또는
ii) a)의 Fab 단편 둘 다에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 치환되고, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 치환되고,
b)의 Fab 단편 둘 다에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 치환되거나, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 치환되거나,
또는
iii) a)의 Fab 단편 둘 다에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 치환되거나, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 치환되고,
b)의 Fab 단편 둘 다에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 치환되고, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 치환되거나,
또는
iv) a)의 Fab 단편 둘 다에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 치환되고, b)의 Fab 단편 둘 다에서, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 치환되거나,
또는
v) a)의 Fab 단편 둘 다에서, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 치환되고, b)의 Fab 단편 둘 다에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 치환되며,
이때, 제 1 항원 또는 제 2 항원은 인간 트랜스페린 수용체이다.
한 태양에서, 상기 추가의 Fab 단편은 둘 다 펩티드 링커에 의해 a)의 중쇄의 C-말단에 또는 a)의 중쇄의 N-말단에 융합된다.
한 태양에서, 상기 추가의 Fab 단편은 둘 다 펩티드 링커에 의해 a)의 중쇄의 C-말단에 융합된다.
한 태양에서, 상기 추가의 Fab 단편은 둘 다 펩티드 커넥터에 의해 a)의 중쇄의 N-말단에 융합된다.
한 태양에서, Fab 단편들에서 하기의 변형이 수행된다:
i) a)의 Fab 단편 둘 다에서, 또는 b)의 Fab 단편 둘 다에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 치환되고/되거나, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 치환된다.
한 태양에서, Fab 단편들에서 하기의 변형이 수행된다:
i) a)의 Fab 단편 둘 다에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 치환되고/되거나, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 치환된다.
한 태양에서, Fab 단편들에서 하기의 변형이 수행된다:
i) a)의 Fab 단편 둘 다에서, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 치환된다.
한 태양에서, Fab 단편들에서 하기의 변형이 수행된다:
i) b)의 Fab 단편 둘 다에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 치환되고/되거나, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 치환된다.
한 태양에서, Fab 단편들에서 하기의 변형이 수행된다:
i) b)의 Fab 단편 둘 다에서, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 치환된다.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 다음을 포함하는 이중특이성 4가 항체이다:
a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하고 제 1 VH-CH1 도메인 쌍을 포함하는 제 1 항체의 (변형된) 중쇄(이때, 상기 중쇄의 C-말단에 상기 제 1 항체의 제 2 VH-CH1 도메인 쌍의 N-말단이 펩티드 링커를 통해 융합된다),
b) a)의 상기 제 1 항체의 2개의 경쇄,
c) 제 2 항원에 특이적으로 결합하고 제 1 VH-CL 도메인 쌍을 포함하는 제 2 항체의 (변형된) 중쇄(이때, 상기 중쇄의 C-말단에 상기 제 2 항체의 제 2 VH-CL 도메인 쌍의 N-말단이 펩티드 링커를 통해 융합된다), 및
d) 각각 CL-CH1 도메인 쌍을 포함하는, c)의 상기 제 2 항체의 2개의 (변형된) 경쇄
(이때, 상기 제 1 항원 또는 제 2 항원은 인간 트랜스페린 수용체이다).
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는
a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 전장 항체의 중쇄 및 경쇄, 및
b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 전장 항체의 중쇄 및 경쇄(이때, 중쇄의 N-말단은 펩티드 링커를 통해 경쇄의 C-말단에 연결된다)를 포함하는 이중특이성 항체로서, 이때 상기 제 1 항원 또는 제 2 항원은 인간 트랜스페린 수용체이다.
a)의 항체는 b)에 언급된 바와 같은 변형을 함유하지 않고, 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄이다.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는
a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체, 및
b) VH2 도메인 및 VL2 도메인을 포함하는 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 단편(이때, 상기 도메인들은 둘 다 다이설파이드 가교에 의해 서로에 연결된다)을 포함하는 이중특이성 항체로서, 이때 VH2 도메인 또는 VL2 도메인중 어느 하나만이 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄에 펩티드 링커를 통해 융합되며, 상기 제 1 항원 또는 제 2 항원은 인간 트랜스페린 수용체이다.
상기 이중특이성 항체에서, a)의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄이다.
한 태양에서, VH2 도메인 또는 VL2 도메인의 다른 하나는 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄에 펩티드 링커를 통해 융합되지 않는다.
본원에 보고된 바와 같은 모든 양태에서, 제 1 경쇄는 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하고, 제 1 중쇄는 VH 도메인, CH1 도메인, 힌지(hinge) 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
모든 양태들의 한 태양에서, 본원에 보고된 바와 같은 항체는 2개 이상의 중쇄 폴리펩티드의 헤테로이량체화를 필요로 하는 다중특이성 항체이며, 이때 상기 항체는 인간 트랜스페린 수용체 및 제 2의 비-인간 트랜스페린 수용체 항원에 특이적으로 결합한다.
헤테로이량체화를 촉진하기 위한 CH3-변형을 위한 여러가지 접근방법들이, 예를 들면, 본원에 참고로 인용된 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291 호에 기술되었다. 전형적으로, 당해 분야에 공지된 접근방법들에서, 제 1 중쇄의 CH3 도메인 및 제 2 중쇄의 CH3 도메인은 둘다 상보적인 방식으로 조작되어, 1개의 조작된 CH3 도메인을 포함하는 중쇄는 더 이상 동일 구조의 또 다른 중쇄와 호모이량체화될 수 없다(예를 들면, CH3-조작된 제 1 중쇄는 또 다른 CH3-조작된 제 1 중쇄와 더 이상 호모이량체화될 수 없고; CH3-조작된 제 2 중쇄는 또 다른 CH3-조작된 제 2 중쇄와 더 이상 호모이량체화될 수 없다). 이에 의해, 1개의 조작된 CH3 도메인을 포함하는 중쇄는, 상보적인 방식으로 조작되는 CH3 도메인을 포함하는 또 다른 중쇄와 강제적으로 헤테로이량체화된다. 본 발명의 상기 태양의 경우, 제 1 중쇄의 CH3 도메인 및 제 2 중쇄의 CH3 도메인은 아미노산 치환에 의해 상보적인 방식으로 조작되어, 제 1 중쇄 및 제 2 중쇄는 강제적으로 헤테로이량체화되는 반면, 제 1 중쇄 및 제 2 중쇄는 더 이상 호모이량체화될 수 없다(예를 들면, 입체적 이유로).
상기에 참조되고 인용된, 당해 분야에 공지된 중쇄 헤테로이량체화를 촉진하기 위한 상이한 접근방법들은, 본 발명에 대해 전술한 특정 아미노산 치환과 함께, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 항체로부터 유도된 "비-가교된 Fab 영역" 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 항체로부터 유도된 "가교된 Fab 영역"을 포함하는 본 발명에 따른 다중특이성 항체에 사용되는 상이한 대안들로서 고려된다.
본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체의 CH3 도메인은, 예를 들면, WO　96/027011 호, 문헌 [Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621]; 및 문헌 [Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681]에 여러 예들과 함께 상세하게 기술되어 있는 "놉-인투-홀(knob-into-holes)" 기술에 의해 변이될 수 있다. 상기 방법에서는, 2개의 CH3 도메인의 상호작용 표면들이 상기 2개의 CH3 도메인들을 함유하는 두 중쇄 모두의 헤테로이량체화를 증가시키도록 변이된다. (두 중쇄의) 2개의 CH3 도메인 각각은 "놉(knob)"일 수 있는 반면, 다른 하나는 "홀(hole)"이다. 다이설파이드 가교의 도입은 헤테로이량체를 더 안정화시키고(문헌 [Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681]; 및 문헌 [Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35]), 수율을 증가시킨다.
한 바람직한 태양에서, 본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체는 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 T366W 돌연변이, 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인에 T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호). 예를 들면, "놉 쇄"의 CH3 도메인 내에 Y349C 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내에 E356C 돌연변이 또는 S354C 돌연변이를 도입함으로써, CH3 도메인들 사이에 추가의 쇄간 다이설파이드 가교가 또한 사용될 수 있다(문헌 [Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681)]). 따라서, 또 다른 바람직한 태양에서, 본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체는 2개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C 및 T366W 돌연변이 및 2개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 E356C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하거나, 또는 본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체는 2개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C 및 T366W 돌연변이 및 2개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함한다(1개의 CH3 도메인에 추가의 Y349C 돌연변이, 및 다른 CH3 도메인에 추가의 E356C 또는 S354C 돌연변이는 쇄간 다이설파이드 가교를 형성한다)(카밧 EU 인덱스에 따른 번호).
그러나, EP　1　870　459A1 호에 기술된 바와 같은 다른 놉-인-홀 기술도 또한 대안적으로 또는 추가로 사용될 수 있다. 한 태양에서, 본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체는 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 R409D 및 K370E 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인에 D399K 및 E357K 돌연변이를 포함한다(카밧 UE 인덱스에 따른 번호).
한 태양에서, 본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체는 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 T366W 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인에 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이, 및 추가로 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 R409D 및 K370E 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인에 D399K 및 E357K 돌연변이를 포함한다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호).
한 태양에서, 본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체는 2개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C 및 T366W 돌연변이 및 2개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하거나, 또는 본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체는 2개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C 및 T366W 돌연변이 및 2개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이, 및 추가로 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 R409D 및 K370E 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인에 D399K 및 E357K 돌연변이를 포함한다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호).
"놉-인투-홀 기술"과 별개로, 헤테로이량체화를 수행하기 위해 다중특이성 항체의 중쇄의 CH3 도메인을 변형시키기 위한 다른 기술이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 기술들, 특히 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 및 WO 2013/096291 호에 기술되어 있는 기술들은 본원에서 본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체와 함께 "놉-인투-홀 기술"에 대한 대안으로서 고려된다.
본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체의 한 태양에서는, 다중특이성 항체의 제 1 중쇄 및 제 2 중쇄의 헤테로이량체화를 촉진하기 위해 EP 1870459 호에 기술된 접근방법을 이용한다. 상기 접근방법은 제 1 및 제 2 중쇄 둘 다의 사이의 CH3/CH3-도메인-계면에서 특정 아미노산 위치에 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 도입을 기초로 한다.
따라서, 상기 태양은, 항체의 3차 구조에서 제 1 중쇄의 CH3 도메인 및 제 2 중쇄의 CH3 도메인이 각각의 항체 CH3 도메인 사이에 위치하는 계면을 형성하고, 제 1 중쇄의 CH3 도메인 및 제 2 중쇄의 CH3 도메인의 각각의 아미노산 서열들이 각각 항체의 3차 구조에서 상기 계면내에 위치하는 아미노산들의 세트를 포함하고, 한 중쇄의 CH3 도메인에서 계면에 위치한 아미노산의 세트로부터 첫번째 아미노산이 양으로 하전된 아미노산에 의해 치환되고 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 계면에 위치한 아미노산의 세트로부터 두번째 아미노산이 음으로 하전된 아미노산에 의해 치환되는, 본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체에 관한 것이다. 상기 태양에 따른 다중특이성 항체는, 본원에서 "CH3(+/-)-조작된 다중특이성 항체"(여기서, 약자 "+/-"는 각각의 CH3 도메인에 도입된 반대로 하전된 아미노산을 나타낸다)로도 지칭된다.
본원에 보고된 바와 같은 상기 CH3(+/-)-조작된 다중특이성 항체의 한 태양에서, 양으로 하전된 아미노산은 K, R 및 H로부터 선택되고, 음으로 하전된 아미노산은 E 또는 D로부터 선택된다.
본원에 보고된 바와 같은 상기 CH3(+/-)-조작된 다중특이성 항체의 한 태양에서, 양으로 하전된 아미노산은 K 및 R로부터 선택되고, 음으로 하전된 아미노산은 E 또는 D로부터 선택된다.
본원에 보고된 바와 같은 상기 CH3(+/-)-조작된 다중특이성 항체의 한 태양에서, 양으로 하전된 아미노산은 K이고, 음으로 하전된 아미노산은 E이다.
본원에 보고된 바와 같은 상기 CH3(+/-)-조작된 다중특이성 항체의 한 태양에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 409의 아미노산 R은 D로 치환되고, 위치에서의 아미노산 K는 E로 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 399의 아미노산 D는 K로 치환되고, 위치 357의 아미노산 E는 K로 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호).
본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체의 한 태양에서는, 다중특이성 항체의 제 1 중쇄와 제 2 중쇄의 헤테로이량체화를 촉진하기 위해 WO 2013/157953 호에 기술된 접근방법을 이용한다. 본원에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 한 태양에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 366의 아미노산 T는 K로 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 351의 아미노산 L은 D로 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호). 본원에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 또 다른 태양에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 366의 아미노산 T는 K로 치환되고, 위치 351의 아미노산 L은 K로 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 351의 아미노산 L은 D로 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호).
본원에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 또 다른 태양에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 366의 아미노산 T는 K로 치환되고, 위치 351의 아미노산 L은 K로 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 351의 아미노산 L은 D로 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호). 또한, 하기 치환들 중 하나 이상이 다른 중쇄의 CH3 도메인에 포함된다: 위치 349의 아미노산 Y는 E로 치환되고, 위치 349의 아미노산 Y는 D로 치환되고, 위치 368의 아미노산 L은 E로 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호). 한 태양에서, 위치 368의 아미노산 L은 E로 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호).
본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체의 한 태양에서는, 다중특이성 항체의 제 1 중쇄와 제 2 중쇄의 헤테로이량체화를 촉진하기 위해 WO 2012/058768 호에 기술된 접근방법을 이용한다. 본원에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 한 태양에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 351의 아미노산 L은 Y로 치환되고 위치 407의 아미노산 Y는 A로 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 366의 아미노산 T는 A로 치환되고 위치 409의 아미노산 K는 F로 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호). 또 다른 태양에서, 전술한 치환 이외에, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 411(원래 T), 399(원래 D), 400(원래 S), 405(원래 F), 390(원래 N) 및 392(원래 K)의 아미노산들 중 1개 이상이 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호). 바람직한 치환은 다음이다:
- N, R, Q, K, D, E 및 W로부터 선택된 아미노산에 의한 위치 411의 아미노산 T의 치환(카밧 EU 인덱스에 따른 번호),
- R, W, Y 및 K로부터 선택된 아미노산에 의한 위치 399의 아미노산 D의 치환(카밧 EU 인덱스에 따른 번호),
- E, D, R 및 K로부터 선택된 아미노산에 의한 위치 400의 아미노산 S의 치환(카밧 EU 인덱스에 따른 번호),
- I, M, T, S, V 및 W로부터 선택된 아미노산에 의한 위치 405의 아미노산 F의 치환(카밧 EU 인덱스에 따른 번호);
- R, K 및 D로부터 선택된 아미노산에 의한 위치 390의 아미노산 N의 치환(카밧 EU 인덱스에 따른 번호); 및
- V, M, R, L, F 및 E로부터 선택된 아미노산에 의한 위치 392의 아미노산 K의 치환(카밧 EU 인덱스에 따른 번호).
(WO 2012/058768 호에 따라 조작된) 본원에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 또 다른 태양에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 351의 아미노산 L은 Y로 치환되고 위치 407의 아미노산 Y는 A로 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 366의 아미노산 T는 V로 치환되고 위치 409의 아미노산 K는 F로 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호). 본원에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 또 다른 태양에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 407의 아미노산 Y는 A로 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 366의 아미노산 T는 A로 치환되고 위치 409의 아미노산 K는 F로 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호). 상기 마지막 전술한 태양에서, 상기 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 392의 아미노산 K는 E로 치환되고, 위치 411의 아미노산 T는 E로 치환되고, 위치 399의 아미노산 D는 R로 치환되고, 위치 400의 아미노산 S는 R로 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호).
본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체의 한 태양에서는, 다중특이성 항체의 제 1 중쇄와 제 2 중쇄의 헤테로이량체화를 촉진하기 위해 WO 2011/143545 호에 기술된 접근방법을 이용한다. 본원에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 한 태양에서, 두 중쇄 모두의 CH3 도메인에서의 아미노산 변형은 위치 368 및/또는 409에 도입된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호).
본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체의 한 태양에서는, 다중특이성 항체의 제 1 중쇄와 제 2 중쇄의 헤테로이량체화를 촉진하기 위해 WO 2011/090762 호에 기술된 접근방법을 이용한다. WO 2011/090762 호는 "놉-인투-홀" 기술에 따른 아미노산 변형에 관한 것이다. 본원에 보고된 바와 같은 상기 CH3(KiH)-조작된 다중특이성 항체의 한 태양에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 366의 아미노산 T는 W로 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 407의 아미노산 Y는 A로 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호). 본원에 보고된 바와 같은 상기 CH3(KiH)-조작된 다중특이성 항체의 또 다른 태양에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 366의 아미노산 T는 Y로 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 407의 아미노산 Y는 T로 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호).
IgG2 이소타입을 갖는 본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체의 한 태양에서는, 다중특이성 항체의 제 1 중쇄와 제 2 중쇄의 헤테로이량체화를 촉진하기 위해 WO 2011/090762 호에 기술된 접근방법을 이용한다.
본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체의 한 태양에서는, 다중특이성 항체의 제 1 중쇄와 제 2 중쇄의 헤테로이량체화를 촉진하기 위해 WO 2009/089004 호에 기술된 접근방법을 이용한다. 본원에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 한 태양에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 392의 아미노산 K 또는 N은 음으로 하전된 아미노산에 의해(한 바람직한 태양에서 E 또는 D로, 한 바람직한 태양에서는 D로) 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 399의 아미노산 D, 위치 356의 아미노산 E 또는 D, 또는 위치 357의 아미노산 E는 양으로 하전된 아미노산에 의해(한 바람직한 태양에서 K 또는 R로, 한 바람직한 태양에서는 K로, 한 바람직한 태양에서는 위치 399 또는 356의 아미노산이 K로 치환된다) 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호). 또 다른 한 태양에서, 전술한 치환 이외에, 한 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 409의 아미노산 K 또는 R은 음으로 하전된 아미노산에 의해(한 바람직한 태양에서 E 또는 D로, 한 바람직한 태양에서는 D로) 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호). 또 다른 한 태양에서, 전술한 치환들에 더해 또는 그에 대안적으로, 한 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 439의 아미노산 K 및/또는 위치 370의 아미노산 K는 서로 독립적으로, 음으로 하전된 아미노산에 의해(한 바람직한 태양에서 E 또는 D로, 한 바람직한 태양에서는 D로) 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호).
본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체의 한 태양에서는, 다중특이성 항체의 제 1 중쇄와 제 2 중쇄의 헤테로이량체화를 촉진하기 위해 WO 2007/147901 호에 기술된 접근방법을 이용한다. 본원에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 한 태양에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 253의 아미노산 K는 E로 치환되고, 위치 282의 아미노산 D는 K로 치환되고, 위치 322의 아미노산 K는 D로 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 239의 아미노산 D는 K로 치환되고, 위치 240의 아미노산 E는 K로 치환되고, 위치 292의 아미노산 K는 D로 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호).
본원에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체의 한 태양에서는, 다중특이성 항체의 제 1 중쇄와 제 2 중쇄의 헤테로이량체화를 촉진하기 위해 WO 2007/110205 호에 기술된 접근방법을 이용한다.
본원에 보고된 바와 같은 모든 양태 및 태양들 중 한 태양에서, 다중특이성 항체는 이중특이성 항체 또는 삼중특이성 항체이다. 본 발명의 한 바람직한 태양에서, 다중특이성 항체는 이중특이성 항체이다.
본원에 보고된 바와 같은 모든 양태들의 한 태양에서, 항체는 2가 또는 3가 항체이다. 한 태양에서, 항체는 2가 항체이다.
본원에 보고된 바와 같은 모든 양태들의 한 태양에서, 다중특이성 항체는 IgG 타입 항체의 불변 도메인 구조를 갖는다. 본원에 보고된 바와 같은 모든 양태들의 한 태양에서, 다중특이성 항체는, 상기 다중특이성 항체가 인간 서브클래스 IgG1의 항체이거나 또는 돌연변이 L234A 및 L235A를 갖는 인간 서브클래스 IgG1의 항체인 것을 특징으로 한다. 본원에 보고된 바와 같은 모든 양태들의 또 다른 한 태양에서, 다중특이성 항체는, 상기 다중특이성 항체가 인간 서브클래스 IgG2의 항체인 것을 특징으로 한다. 본원에 보고된 바와 같은 모든 양태들의 또 다른 한 태양에서, 다중특이성 항체는, 상기 다중특이성 항체가 인간 서브클래스 IgG3의 항체인 것을 특징으로 한다. 본원에 보고된 바와 같은 모든 양태들의 또 다른 한 태양에서, 다중특이성 항체는, 상기 다중특이성 항체가 인간 서브클래스 IgG4의 항체, 또는 추가의 돌연변이 S228P를 갖는 인간 서브클래스 IgG4의 항체인 것을 특징으로 한다. 본원에 보고된 바와 같은 모든 양태들의 또 다른 한 태양에서, 다중특이성 항체는, 상기 다중특이성 항체가 인간 서브클래스 IgG1 또는 인간 서브클래스 IgG4의 항체인 것을 특징으로 한다. 본원에 보고된 바와 같은 모든 양태들의 또 다른 한 태양에서, 다중특이성 항체는, 상기 다중특이성 항체가 돌연변이 L234A 및 L235A를 갖는 인간 서브클래스 IgG1의 항체인 것을 특징으로 한다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호). 본원에 보고된 바와 같은 모든 양태들의 또 다른 한 태양에서, 다중특이성 항체는, 상기 다중특이성 항체가 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 인간 서브클래스 IgG1의 항체인 것을 특징으로 한다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호). 본원에 보고된 바와 같은 모든 양태들의 또 다른 한 태양에서, 다중특이성 항체는, 상기 다중특이성 항체가 돌연변이 S228P 및 L235E를 갖는 인간 서브클래스 IgG4의 항체인 것을 특징으로 한다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호). 본원에 보고된 바와 같은 모든 양태들의 또 다른 한 태양에서, 다중특이성 항체는, 상기 다중특이성 항체가 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 갖는 인간 서브클래스 IgG4의 항체인 것을 특징으로 한다(카밧 EU 인덱스에 따른 번호).
본원에 보고된 바와 같은 모든 양태들의 한 태양에서, 본원에 명시된 바와 같은 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 추가의 C-말단 글리신-라이신 다이펩티드(G446 및 K447, 카밧 EU 인덱스에 따른 번호)를 포함한다. 본원에 보고된 바와 같은 모든 양태들의 한 태양에서, 본원에 명시된 바와 같은 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 추가의 C-말단 글리신 잔기(G446, 카밧 EU 인덱스에 따른 번호)를 포함한다.
6. 항체 변이체
특정 태양에서, 본원에 제공된 항체들의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는, 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 내에 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 변형은, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 잔기의 삽입 및/또는 상기 서열내에서의 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 구조물을 수득할 수 있으나, 단, 최종 구조물은 목적하는 특성, 예를 들면, 항원-결합 특성을 소유해야 한다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 태양에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이유발을 위한 해당 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환을 "보존적 치환"이란 제목하에 표 1에 나타내었다. 표 1에 "예시적 치환"이란 제목하에, 및 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 하기에서 더 기술하는 바와 같이 보다 실질적인 변화들이 제공되어 있다. 아미노산 치환은 해당 항체 내에 도입될 수 있으며, 생성물들은 목적하는 활성, 예를 들면, 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별될 수 있다.
원래 잔기 예시적 치환 보존적 치환
Ala(A) Val; Leu; Ile Val
Arg(R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn(N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp(D) Glu; Asn Glu
Cys(C) Ser; Ala Ser
Gln(Q) Asn; Glu Asn
Glu(E) Asp; Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile(I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu(L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys(K) Arg; Gln; Asn Arg
Met(M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe(F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val; Ser Ser
Trp(W) Tyr; Phe Tyr
Try(Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val(V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
아미노산은 통상적인 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Gln;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 상기 부류중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 포함한다.
치환 변이체의 한 유형은 모 항체(예를 들면, 인간화 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 생성된 변이체는 모 항체에 비해 특정 생물학적 성질(예를 들면, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에서 변화(예를 들면, 개선)를 가질 것이고/이거나 모 항체의 특정 생물학적 성질을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는, 편리하게, 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 증진 기술을 이용하여 생성될 수 있는 친화도 증진된 항체이다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체는 파지 상에 디스플레이되고 특정 생물 활성(예를 들면, 결합 친화도)에 대해 선별된다.
예를 들면, 항체 친화도를 개선하기 위해, 변이(예를 들면, 치환)가 HVR에 수행될 수 있다. 상기 변이는 HVR "핫스팟(hotspot)", 즉, 체세포 성숙 과정동안 높은 빈도로 돌연변이가 일어나는 코돈에 의해 암호화되는 잔기(예를 들면, 문헌 [Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196] 참조), 및/또는 항원과 접촉하는 잔기에서 이루어질 수 있으며, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리를 제작하고 그로부터 재선별하는 것에 의한 친화도 증진은, 예를 들면, 문헌 [Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37]에 기술되었다. 친화도 증진의 일부 태양에서, 다양한 방법들 중 임의 방법(예를 들면, 실수유발(error-prone) PCR, 쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드-지향 돌연변이유발)에 의해 증진을 위해 선택된 가변 유전자 내에 변화가 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리가 구축된다. 상기 라이브러리는 이어서 목적하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 검색된다. 변화를 도입하는 또 다른 방법은, 여러 HVR 잔기(예를 들면, 한번에 4 내지 6개 잔기)가 무작위선정되는 HVR-지향 접근방법을 포함한다. 항원 결합에 수반되는 HVR 잔기는, 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 확인될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 종종 표적화된다.
특정 태양에서, 변이가 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 치환, 삽입 또는 결실이 일어날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변이(예를 들면, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)가 HVR에서 이루어질 수 있다. 상기 변이는, 예를 들면, HVR 중 항원 접촉 잔기의 외부에서 일어날 수 있다. 상기에 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 태양에서, 각각의 HVR은 변이되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085]에 기술된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 상기 방법에서는, 항체의 항원과의 상호작용이 영향을 받는지를 측정하기 위해 표적 잔기들(예를 들면, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu와 같은 하전된 잔기들)의 잔기 또는 기를 확인하고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들면, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환시킨다. 초기 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 추가의 치환이 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 상기 접촉 잔기 및 인접 잔기들은 치환 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 선별하여 그들이 목적하는 성질을 보유하는지를 결정하기 위해 변이체들을 선별할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개 잔기로부터 백개 이상 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 및 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체가 포함된다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체로는 효소(예를 들면, ADEPT) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단으로의 융합이 포함된다.
b) 글리코실화 변이체
특정 태양에서, 본원에 제공된 항체는, 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키기 위해 변이된다. 항체에 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변이시킴으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 그에 결합된 탄수화물이 변이될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로, 일반적으로 Fc-영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 결합된, 분지된 바이안테너리(biantennary) 올리고사카라이드를 포함한다(예를 들면, 문헌 [Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32] 참조). 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐 아니라, 바이안테너리 올리고사카라이드 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 결합된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 특정한 개선된 성질을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 본 발명의 항체에서 올리고사카라이드의 변형이 수행될 수 있다.
한 태양에서, Fc-영역에 결합된(직접 또는 간접적으로) 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들면, 상기 항체내 푸코스의 양은 1 내지 80%, 1 내지 65%, 5 내지 65%, 또는 20 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들면, WO 2008/077546 호에 기술된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정할 때 Asn297에 결합된 모든 당구조물(glycostructure)(예를 들면, 복합체, 하이브리드 및 만노스 고함량 구조물)의 합에 대한, Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균량을 산출함으로써 측정된다. Asn297은 Fc-영역에서 대략 위치 297에 위치한 아스파라긴 잔기를 말한다(Fc-영역 잔기의 EU 번호체계); 그러나, Asn297은 또한, 항체내 미미한 서열 변화로 인해, 위치 297의 약 ㅁ3개 아미노산의 상류 또는 하류에, 즉, 위치 294와 300 사이에 위치할 수도 있다. 상기 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다(예를 들면, US 2003/0157108 호; US 2004/0093621 호 참조). "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 관한 공개공보의 예로는 다음이 포함된다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; 문헌 [Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249]; 및 문헌 [Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614]. 탈푸코실화 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예로는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포주(문헌 [Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545]; US 2003/0157108 호; 및 WO　2004/056312 호, 특히 실시예 11), 및 녹아웃(knockout) 세포주, 예를 들면, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들면, 문헌 [Yamane-Ohnuki, N, et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614]; 문헌 [Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688]; 및 WO 2003/085107 호 참조)가 포함된다.
예를 들면, 항체의 Fc-영역에 결합된 바이안테너리 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 이등분 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 상기 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체들의 예는, 예를 들면, WO 2003/011878 호; US 6,602,684 호; 및 US 2005/0123546 호에 기술되어 있다. Fc-영역에 결합된 올리고사카라이드에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체도 또한 제공된다. 상기 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체는, 예를 들면, WO 1997/30087 호; WO 1998/58964 호; 및 WO 1999/22764 호에 기술되어 있다.
c) Fc-영역 변이체
특정 태양에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc-영역내에 도입됨으로써 Fc-영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc-영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예를 들면, 치환)을 포함하는, 인간 Fc-영역 서열(예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc-영역)을 포함할 수 있다.
특정 태양에서, 본 발명은, 생체내 항체의 반감기가 중요하지만 특정한 작동인자 기능(예를 들면, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 유해한 용도에 바람직한 후보가 되게하는, 전부는 아니지만 일부의 작동인자 기능을 갖는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 수행할 수 있다. 예를 들면, 항체가 FcγR 결합이 결여되지만(따라서 ADCC 활성이 결여되기 쉬운), FcRn 결합 능력은 보유하는 것을 보장하기 위해 Fc 수용체(FcR) 결합 분석을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하기 위한 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현시키는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현시킨다. 조혈 세포상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492]의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 해당 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석법의 비-제한 예는 US 5,500,362 호(예를 들면, 문헌 [Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063]; 및 문헌 [Hellstrom, I. et al., Porc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502] 참조); US 5,821,337 호(문헌 [Brueggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361] 참조)에 기술되어 있다. 또는, 비-방사성 분석 방법을 이용할 수 있다(예를 들면, 유세포분석을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아 마운틴뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 위스콘신 매디슨) 참조). 상기 분석법들에 유용한 작동인자 세포로는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(Natural Killer, NK) 세포가 포함된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 해당 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 문헌 [Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항체가 C1q와 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 결여되는지를 확인하기 위해 C1q 결합 분석을 또한 수행할 수 있다(예를 들면, WO 2006/029879 호 및 WO 2005/100402 호에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조). 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171]; 문헌 [Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; 및 문헌 [Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743] 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정도 또한 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Petkova, S.B., et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769] 참조).
감소된 작동인자 기능을 갖는 항체는 Fc-영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 항체를 포함한다(US 6,737,056 호). 상기 Fc 돌연변이체로는, 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체가 포함된다(US 7,332,581 호).
FcR에 대해 개선되거나 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기술되어 있다(예를 들면, US 6,737,056 호; WO 2004/056312 호; 및 문헌 [Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604] 참조).
특정 태양에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선하는 1개 이상의 아미노산 치환, 예를 들면, Fc-영역의 위치 298, 333 및/또는 334에 치환을 갖는 Fc-영역을 포함한다(잔기들의 EU 번호체계).
일부 태양에서, 예를 들면, US 6,194,551 호, WO 99/51642 호 및 문헌 [Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184]에 기술된 바와 같이, 변이된(즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 야기하는 변이가 Fc-영역에서 이루어진다.
증가된 반감기, 및 태아에게 모체 IgG의 전달을 담당하는 신생아 Fc 수용체(FcRn)(문헌 [Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593]; 및 문헌 [Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434])에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 US 2005/0014934 호에 기술되어 있다. 상기 항체들은 그 중에 FcRn에 대한 Fc-영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc-영역을 포함한다. 상기 Fc 변이체로는 Fc-영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에 치환, 예를 들면, Fc-영역 잔기 434의 치환을 갖는 변이체들이 포함된다(US 7,371,826 호).
Fc-영역 변이체의 다른 예에 관하여, 또한 문헌 [Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 332 (1988) 738-740]; US 5,648,260 호; US 5,624,821 호; 및 WO 94/29351 호를 참조하시오.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 태양에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항체, 예를 들면, "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 태양에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기들을 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 항체의 접근가능한 부위에 위치하고, 항체를 다른 잔기, 예를 들면, 약물 잔기 또는 링커-약물 잔기에 접합시켜 본원에서 추가로 기술하는 바와 같은 면역접합체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 특정 태양에서, 하기 잔기들 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카밧 번호체계); 중쇄의 A118(EU 번호체계); 및 중쇄 Fc-영역의 S400(EU 번호체계). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들면, US 7,521,541 호에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 태양에서, 본원에 제공된 항체는 당해 분야에 공지되어 있고 용이하게 이용가능한 추가의 비단백성 잔기를 함유하도록 더 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 잔기는 수용성 중합체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 수용성 중합체의 비-제한 예로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예, 글리세롤), 폴리비닐 알콜 및 그의 혼합물이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 그의 수중 안정성으로 인해 제조시 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며, 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 항체에 결합되는 중합체의 수는 달라질 수 있으며, 하나보다 많은 중합체가 결합되는 경우, 이들은 같거나 다른 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은, 개선될 항체의 특정한 성질 또는 기능, 항체 유도체가 정의된 조건하에서 치료에 사용될 것인지 여부 등을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 고려사항들에 근거하여 결정될 수 있다.
또 다른 태양에서, 방사선에 노출됨으로써 선택적으로 가열될 수 있는 항체와 비단백성 잔기의 접합체가 제공된다. 한 태양에서, 비단백성 잔기는 탄소 나노튜브(nanotube)이다(문헌 [Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605]). 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 정상 세포에 유해하지 않지만 항체-비단백성 잔기에 근접한 세포가 사멸되는 온도까지 비단백성 잔기를 가열시키는 파장을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는, 예를 들면, US 4,816,567 호에 기술된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 제조할 수 있다. 한 태양에서, 본원에 기술된 항-트랜스페린 수용체 항체를 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 핵산은 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들면, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 암호화할 수 있다. 다른 태양에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들면, 발현 벡터)가 제공된다. 또 다른 태양에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 상기 태양에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터를 포함한다. 한 태양에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포 또는 림프계 세포(예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 태양에서, 상기 제공된 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건하에서 배양하고, 임의적으로 항체를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 것을 포함하는, 항-트랜스페린 수용체 항체의 제조 방법이 제공된다.
항-트랜스페린 수용체 항체의 재조합 생성을 위해, 예를 들어, 전술한 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고, 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터내에 삽입시킨다. 상기 핵산은 통상적인 절차를 이용하여(예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열화할 수 있다.
항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포로는 본원에 기술된 원핵 또는 진핵 세포가 포함된다. 예를 들면, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 작동인자 기능이 필요하지 않은 경우, 세균에서 생성될 수 있다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들면, US 5,648,237 호, US 5,789,199 호 및 US 5,840,523 호를 참조하시오(또한 이. 콜라이에서 항체 단편의 발현을 기술하고 있는 문헌 [Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.(ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254] 참조). 발현 후에, 항체는 가용성 분획중 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있으며 더 정제될 수 있다.
원핵세포 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생성을 야기하는 진균 및 효모 균주를 포함하여, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물도 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다(문헌 [Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414]; 및 문헌 [Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215] 참조).
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 많은 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양물도 또한 숙주로 사용될 수 있다(예를 들면, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 및 US 6,417,429 호(유전자전이 식물에서 항체를 생성하기 위한 플랜티바디즈(PLANTIBODIES™) 기술 설명) 참조).
척추동물 세포도 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서 성장하기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 태아 신장 세포주(예를 들면, 문헌 [Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74]에 기술된 바와 같은 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(예를 들면, 문헌 [Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252]에 기술된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부암 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간세포(Hep G2); 마우스 유방암 세포(MMT 060562); 예를 들면, 문헌 [Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68]에 기술된 바와 같은 TRI 세포; MRC5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 DHFR- CHO 세포(문헌 [Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220])를 포함하여 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예를 들면, Y0, NS0 및 Sp2/0가 포함된다. 항체 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들면, 문헌 [Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.(ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268]을 참조하시오.
C. 분석법
본원에 제공된 항-트랜스페린 수용체 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 분석법들에 의해 그의 물리/화학 성질 및/또는 생물 활성을 확인하고, 그에 대해 선별하거나 또는 특성화할 수 있다.
결합 분석법
한 양태에서, 본 발명의 항체는, 예를 들면, ELISA, 알파LISA, 웨스턴 블롯, 항체 또는 역상 어레이 등과 같은 공지된 방법에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 검사된다.
대표적인 ELISA 또는 알파LISA 분석법에서, 용액(세포 상등액, 세포 또는 조직 용해액, 체액 등) 중 트랜스페린 수용체는, 트랜스페린 수용체 또는 특정 입체구조의 트랜스페린 수용체 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체, 및 트랜스페린 수용체의 제 2 에피토프 또는 입체구조에 특이적으로 결합하는, 검출 물질에 커플링된 검출 항체에 의해 결합된다. 판독은 검출 물질(화학발광, 형광, 에너지 전달 유도성 발광 등)에 근거한다.
항체 어레이의 경우에는, 항체들을 유리 또는 니트로셀룰로스 칩 상에 스포팅(spotting)한다. 슬라이드를 차단하고 트랜스페린 수용체 함유 용액과 함께 배양하고, 세척하여 미결합 항체들을 제거하고, 결합된 항체들을 형광 표지된 상응하는 2차 항체를 사용하여 검출한다. 형광 신호는 형광 슬라이드 스캐너로 측정한다. 유사하게, 역상 어레이의 경우, 재조합 트랜스페린 수용체, 세포 상등액, 세포 또는 조직 용해액, 체액 등을 유리 또는 니트로셀룰로스 칩 상에 스포팅한다. 슬라이드를 차단하고, 개개 어레이들을 트랜스페린 수용체 상의 특정 에피토프에 대한 항체와 함께 배양한다. 미결합 항체들은 세척하고, 결합된 항체들은 형광 표지된 상응하는 2차 항체를 사용하여 검출한다. 형광 신호는 형광 슬라이드 스캐너에 의해 측정한다(문헌 [Dernick, G., et al., J. Lipid Res. 52 (2011) 2323-2331]).
D. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 태양에서, 본원에 제공된 임의의 항-트랜스페린 수용체 항체는 생물 샘플에서 인간 트랜스페린 수용체의 존재를 검출하기에 유용하다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 태양에서, 생물 샘플은 세포 또는 조직, 예를 들면, 뇌 조직을 포함한다.
한 태양에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-트랜스페린 수용체 항체가 제공된다. 다른 양태에서, 생물 샘플중 트랜스페린 수용체의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 태양에서, 상기 방법은 생물 샘플을 트랜스페린 수용체에 대한 항-트랜스페린 수용체 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 본원에 기술된 바와 같은 항-트랜스페린 수용체 항체와 접촉시키고, 항-트랜스페린 수용체 항체와 트랜스페린 수용체 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 태양에서, 예를 들면, 트랜스페린 수용체가 환자 선별을 위한 바이오마커인 경우, 항-트랜스페린 수용체 항체를 사용하여 항-트랜스페린 수용체 항체를 사용한 치료에 해당되는 대상을 선별한다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 대표적인 질병으로는 1형 뇌 철 축적(NBIA1)을 갖는 신경퇴행, 순수 자율신경 실조, 다운 증후군, 괌(Guam) 콤플렉스, 및 여러 루이체(Lewy body)병, 예를 들어, 확산성 루이체병(DLBD), 알츠하이머병의 루이체 변이(LBVAD), 특정 형태의 고셰병(Gaucher's disease) 및 파킨슨병(Parkinson's disease) 치매(PDD)가 포함된다.
특정 태양에서, 표지된 항-트랜스페린 수용체 항체가 제공된다. 표지로는 직접 검출되는 표지 또는 잔기(예를 들면, 형광, 발색, 전자-고밀도, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐 아니라, 예를 들면, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 잔기, 예를 들어, 효소 또는 리간드가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 대표적인 표지로는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I. 3H 및 131I, 형광단, 예를 들면, 희토류 킬레이트화물 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시퍼라제, 예를 들면, 반딧불이 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제(US 4,737,456 호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들면, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, HRP, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제와 같은 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소와 커플링된 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들면, 우리카제 및 잔틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
E. 약학 제형
본원에 기술된 바와 같은 항-트랜스페린 수용체 항체의 약학 제형은 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기 항체를 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써(문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, A.(ed.) (1980)]), 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로, 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 다음을 포함하나 이로 한정되지는 않는다: 완충제, 예를 들면, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스콜브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 방부제(예를 들면, 옥타데실 다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-생성 상대-이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착체(예를 들면, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 본원에서 대표적인 약학적으로 허용되는 담체로는 또한 간질성(intersitial) 약물 분산제, 예를 들면, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들면, rhuPH20(하일레넥스(HYLENEX, 등록상표), 박스터 인터내셔날 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))이 포함된다. rhuPH20을 포함하여, 특정한 대표적 sHASEGP 및 사용 방법은 US 2005/0260186 호 및 US 2006/0104968 호에 기술되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제와 혼합된다.
대표적인 동결건조 항체 제형이 US 6,267,958 호에 기술되어 있다. 수성 항체 제형으로는 US 6,171,586 호 및 WO 2006/044908 호에 기술된 것들이 포함되며, 상기 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본 발명의 제형은 또한 치료되는 특정한 적응증에 필요한 대로 하나보다 많은 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 성분들을 함유할 수 있다. 상기 활성 성분들은 의도한 목적에 효과적인 양으로 함께 적절히 존재한다.
활성 성분은, 예를 들면, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐에, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리(메틸 메타크릴레이트) 미세캡슐 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 미세구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐)에, 또는 마크로유화액에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)]에 개시되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적절한 예로는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예를 들면, 필름 또는 미세캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은, 예를 들면, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
III. 제품
본 발명의 또 다른 양태에서, 전술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기, 및 용기 상에 또는 용기에 부착된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 용기는 조성물을 단독으로 또는 질병을 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 또 다른 조성물과 함께 함유하며, 멸균 진입구를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물중 하나 이상의 활성 약제는 본 발명의 항체이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 질병을 치료하기 위해 사용되는 것을 나타낸다. 또한, 제품은 (a) 본 발명의 항체를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성 약제 또는 그렇지 않으면 치료제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 태양에서의 제품은 또한 조성물이 특정 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면, 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거액(Ringer's solution) 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2(또는 제 3)의 용기를 또한 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질을 또한 포함할 수 있다.
임의의 상기 제품은 항-트랜스페린 수용체 항체 대신에 또는 그에 더해 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
IV. 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기에 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 태양들이 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
재료 및 방법
재조합 DNA 기술
표준 방법을 이용하여 문헌 [Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual]; 및 문헌 [Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기술된 바와 같이 DNA를 조작하였다. 분자 생물 시약은 제조사의 지시에 따라 사용하였다.
유전자 및 올리고뉴클레오티드 합성
목적하는 유전자 절편을 제네아트 게엠베하(Geneart GmbH)(독일 레겐스부르크)에서 화학적 합성에 의해 제조하였다. 합성된 유전자 단편들을 증식/증폭을 위해 이. 콜라이 플라스미드 내에 클로닝시켰다. 서브클로닝된 유전자 단편들의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 또는, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드들을 어닐링시킴으로써 또는 PCR에 의해 짧은 합성 DNA 단편들을 조립하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드들은 메타비온 게엠베하(Metabion GmbH)(독일 플라네그-마르틴스리트)에 의해 제조하였다.
시약
모든 상업적 화학물질, 항체 및 키트들은 달리 언급되지 않는 경우 제조사의 프로토콜에 따라 제공된 바와 같이 사용하였다.
실시예 1
토끼 및 마우스의 면역접종
마우스의 면역접종
100 ㎍의 벡터 DNA를 피내 적용한 후 전기천공(1000 V/cm의 2 제곱 펄스, 기간 0.1 ms, 간격 0.125 s에 이어서; 287.5 V/cm의 4 제곱 펄스, 기간 10 ms, 간격 0.125 s)에 의해, 전장 인간 또는 사이노몰거스 TfR을 암호화하는 플라스미드 발현 벡터를 이용하여 NMRI 마우스를 유전자적으로 면역접종시켰다. 마우스는 제 0, 14, 28, 42, 56, 70 및 84 일에 6 또는 7번의 연속 면역접종을 받았다. 4번째 및 6번째 면역접종은 사이노몰거스 TfR을 암호화하는 벡터를 사용하여 수행하였으며; 인간 TfR을 암호화하는 벡터를 모든 다른 면역접종에 사용하였다. 제 36, 78 및 92 일에 혈액을 채취하고 혈청을 제조하여, 이것을 ELISA(하기 참조)에 의한 역가 측정에 사용하였다. 106 인간 TF-1 세포, 또는 인간 Fc-영역에 대한 N-말단 융합물로서 HEK293F 세포에서 발현되고 단백질 A 친화 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제된, 나선 도메인(Leu122에서 시작되고 Asn608에서 종료되는 인간 TfR의 세포외 도메인)이 결여된 재조합 인간 가용성 TfR 50 ㎍의 정맥내 주사에 의한, 제 96 일에 추가접종을 위해, 최고 역가를 갖는 동물들을 선택하고, 안정하게 형질감염된 CHO-K1 세포(실시예 4 참조)의 표면에서 발현된 인간 및 사이노몰거스 트랜스페린 수용체에 결합하는 그의 능력에 근거하여 하이브리도마 기술에 의해 단클론성 항체를 단리하였다.
토끼의 면역접종
400 ㎍의 벡터 DNA를 피내 적용한 후 전기천공(750 V/cm의 2 제곱 펄스, 기간 10 ms, 간격 1 s)에 의해, 전장 인간 또는 사이노몰거스 TfR을 암호화하는 플라스미드 발현 벡터를 이용하여, 인간화 항체 레퍼토리를 발현하는 뉴질랜드 화이트(New Zealand White) 토끼 또는 유전자전이 토끼를 유전자적으로 면역접종시켰다. 토끼는 제 0, 14, 28, 56, 84 및 112 일에 6번의 연속 면역접종을 받았다. 4번째 및 6번째 면역접종은 사이노몰거스 TfR을 암호화하는 벡터를 사용하여 수행하였으며; 인간 TfR을 암호화하는 벡터를 모든 다른 면역접종에 사용하였다. 제 35, 63, 91 및 119 일에 혈액(평가된 전체 혈액 부피의 10%)을 채취하였다. 혈청을 제조하여, 이것을 ELISA(하기 참조)에 의한 역가 측정에 사용하고, 말초혈 단핵 세포를 단리하여, 이것을 B 세포 클로닝 과정(실시예 2 참조)에서 항원-특이적 B 세포의 공급원으로서 사용하였다.
혈청 역가 측정(ELISA)
인간 재조합 가용성 TfR(R&D 시스템즈 목록 번호 2472-TR)을 PBS 중에서 3 ㎍/mL, 100 ㎕/웰로 96-웰 눈크(NUNC) 맥시솔브(Maxisorb) 플레이트 상에 고정화시킨 후: PBS중 2% 크로테인C(CroteinC) 200 ㎕/웰로 플레이트를 차단하고; PBS중 0.5% 크로테인C 100 ㎕/웰 중에 항혈청의 연속 희석물을 2중으로 적용하고; (1) 모든 마우스 혈청에 대해 HRP-접합된 염소 항-마우스 항체(잭슨 임뮤노리서치(Jackson Immunoresearch)/디아노바(Dianova) 115-036-071; 1/16 000), (2) 모든 토끼 혈청에 대해 HRP-접합된 당나귀 항-토끼 IgG 항체(잭슨 임뮤노리서치/디아노바 711-036-152; 1/16 000), (3) 유전자전이 토끼로부터의 혈청에 대해서만 토끼 항-인간 IgG 항체(피어스(Pierce)/터모 사이언티픽(Thermo Scientific) 31432; 1/5000), (4) 유전자전이 토기로부터의 혈청에 대해서만 비오티닐화 염소 항-인간 카파 항체(서던 바이오테크(Southern Biotech)/비오졸(Biozol) 2063-08, 1/5 000) 및 스트렙타비딘-HRP로 검출하고; PBS중 0.5% 크로테인C 100 ㎕/웰에 희석시켰다. 모든 단계에 있어서, 플레이트를 37 ℃에서 1 시간동안 배양하였다. 모든 단계들 사이에, 플레이트를 PBS중 0.05% 트윈 20으로 3회 세척하였다. BM 블루 POD 가용성 기질(로슈) 100 ㎕/웰을 첨가하여 신호를 발생시키고; 1 M HCl 100 ㎕/웰을 첨가하여 중단시켰다. 흡광도를 기준으로서 690 nm에 대해 450 nm에서 판독하였다. 역가는 반-최대 신호를 야기하는 항혈청의 희석률로서 정의되었다.
실시예 2
토끼로부터의 B-세포 클로닝
토끼 말초혈 단핵 세포(PBMC)의 단리
요약하여 6마리 동물(2마리 야생형(wt) 토끼 및 4마리 유전자전이(tg) 토끼)에서 혈액 샘플을 채취하였다. 상기 토끼들은 2가지 상이한 면역접종 캠페인으로부터 유도되었다: 2 wt 및 2 tg 토끼를 사용한 1차 캠페인 및 2마리 tg 토끼를 사용한 2차 캠페인(실시예 "토끼의 면역접종" 또한 참조). 전혈을 함유하는 EDTA를 1x PBS(PAA, 오스트리아 파슁(Pasching))로 2배 희석한 후, 포유동물 림포라이트(lympholyte)(시더레인 래버러토리즈(Cedarlane Laboratories), 캐나다 온타리오 벌링턴)를 제조사의 설명에 따라 사용하여 밀도 원심분리를 행하였다. PBMC는 1x PBS로 2회 세척하였다.
EL-4 B5 배지
10% FCS(하이클론(Hyclone), 미국 유타 로간), 2 mM 글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(PAA, 오스트리아 파슁), 2 mM 나트륨 피루베이트, 10 mM HEPES(팬 바이오테크(PAN Biotech), 독일 아이덴바흐) 및 0.05 mM β-머캅토에탄올(깁코(Gibco), 스코틀랜드 페이즐리)로 보충된 RPMI 1640(팬 바이오테크, 독일 아이덴바흐).
세포의 고갈
1차 면역접종 캠페인: CHO 세포의 밀집상태 단층으로 덮인 멸균 6-웰 플레이트(세포 배양 등급)를 사용하여 비특이적 부착을 통해 대식세포/단핵구뿐 아니라 비-특이적으로 결합하는 림프구를 고갈시켰다.
2차 면역접종 캠페인: 햄스터 트랜스페린 수용체 항체에 교차-반응성인 항체를 생성하는 B-세포가 고갈될 것임을 배제할 수 없었으므로 CHO 세포로 덮인 웰을 사용한 고갈 단계는 생략하였다. 그러므로, 블랭크 멸균 6-웰 플레이트(세포 배양 등급)를 사용하여 비특이적 부착을 통해 대식세포 및 단핵구를 고갈시켜, 잠재적인 B-림프구 생성 햄스터 교차-반응성(및 가능한 마우스 교차-반응성) 표면 항체가 작업흐름에서 다음 단계에 도달할 수 있게 하였다.
각각의 면역접종 캠페인에서: 최대 4 mL 배지 및 면역접종된 토끼로부터의 6x106 이하의 PBMC로 각 웰을 충전시키고, 37 ℃에서 배양기에서 1 시간동안 결합시켰다. 상등액 중의 세포(말초혈 림프구(PBL))를 항원 패닝(panning) 단계에 사용하였다.
인간 트랜스페린 수용체 상에서 B-세포의 증폭
인간 트랜스페린 수용체-양성 CHO 세포의 단층으로 덮인 6-웰 조직 배양 플레이트에 4 mL 배지 당 6x106 이하의 PBL을 접종하고 37 ℃에서 배양기에서 1 시간동안 결합시켰다. 웰을 1x PBS로 1 내지 2회 조심스럽게 세척하여 비-부착 세포를 제거하였다. 남은 점착성 세포는 37 ℃에서 배양기에서 10분동안 트립신으로 분리시켰다. EL-4 B5 배지로 트립신화를 중단시켰다. 면역 형광 염색까지 세포를 얼음위에서 유지시켰다.
면역 형광 염색 및 유세포분석
항-토끼 IgG FITC(AbD 세로텍, 독일 뒤셀도르프)를 단일 세포 분류에 사용하였다. 표면 염색을 위해, 고갈 및 증폭 단계로부터 수득된 세포를 PBS 중에서 항-토끼 IgG FITC 항체와 함께 배양하고 4 ℃에서 어두운 상태에서 45분간 배양하였다. 염색 후에, PBMC를 빙냉 PBS로 2배 세척하였다. 최종적으로, PBMC를 빙냉 PBS에 재현탁하고, 즉시 FACS 분석에 적용하였다. 5 ㎍/mL 농도의 프로피듐 요오다이드(BD 파밍겐(BD Pharmingen), 미국 캘리포니아 샌디에이고)를 FACS 분석 전에 첨가하여 사멸 세포와 생 세포를 구별하였다.
컴퓨터 및 FACSDiva 소프트웨어가 장착된 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) FACSAria(BD 바이오사이언시즈, USA)를 단일 세포 분류에 사용하였다.
B-세포 배양
토끼 B-세포의 배양은 주블러 등(Zubler et al. (1985))에 의해 기술된 바와 유사한 방법에 의해 준비하였다. 간략하게, 단일 분류된 토끼 B-세포를, 96-웰 플레이트에서, 판소르빈(Pansorbin) 세포(1:200000)(칼바이오켐(Calbiochem)(메르크(Merck)), 독일 다름스타트), 5% 토끼 흉선세포 상등액(차지 TSN-M13(10242), 마이크로코트(MicroCoat), 독일 베른리트) 및 감마-조사된 뮤린 EL-4-B5 흉선종 세포(2.5x104/웰)를 함유하는 200 ㎕/웰 EL-4 B5 배지와 함께 37 ℃에서 5% CO2의 대기하에 배양기에서 7 일동안 배양하였다. B-세포 배양 상등액을 스크리닝을 위해 제거하고, 잔류 세포를 즉시 수거하고 -80 ℃에서 100 ㎕ RLT 완충액(키아겐, 독일 힐덴) 중에 냉동시켰다.
실시예 3
1가 항-TfR IgG의 선별 및 생성을 위한 파지 디스플레이
파지 디스플레이에 의한 선별
인간 및 사이노몰거스 TfR에 결합하는 항체 제조를 표준 프로토콜을 사용하여 파지 디스플레이에 의해 수행하였다(문헌 [Silacci et al, Proteomics, 5 (2005) 2340-2350]). C-말단 Avi-태그(서열번호 99)를 함유한 인간 홀 Fc-영역의 N-말단 힌지에 hTfR ECD를 연결시키고 포유동물 발현 벡터내에 접합시켜, hTfR-Fc(KiH)-Avi (KiH = 놉-인투-홀, Avi = Avi 태그) 항원에 대해 합성된 유전자를 클로닝시켰다. 본 실시예의 모든 포유동물 발현 벡터는 전사 및 번역 개시를 위한 MPSV 프로모터를 가지며, 이때 전사는 ORF의 하류에 위치한 합성 폴리A 신호 서열에 의해 종료된다. 또한, 상기 벡터는 EBV-EBNA 발현 세포주에서의 자율 복제를 위한 EBV oriP 서열을 함유한다. 정확한 ORF는 서열분석에 의해 확인하였다. 상기 벡터는, 빈 놉-Fc-영역 및 BirA 단백질과의 공-발현 및 배양 배지에 1 mM의 비오틴 첨가에 의해, HEK293 EBNA 현탁 세포에서의 발현에 사용되었다. 생성된 비오티닐화 단백질은 단백질 A 친화 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. cyTfR-Fc(KiH)-Avi 항원이 각각 생성되었다(서열번호 100).
사용된 라이브러리는 VH1, 3, 4 및 5 계열, 및 V-카파1, -2 및 -3, 및 V-람다3의 인간 프레임워크를 사용하는 완전 합성 라이브러리이었다. 무작위선정된 아미노산들은 CDR-H3 및 CDR-L3에 존재하였다. 모든 상이한 경쇄 라이브러리들과 함께 각각의 중쇄 VH를 사용하여 라이브러리 풀을 제작하였다. 선별은 하기 절차에 따라서 용액중에서 수행하였다: 1. 1 mL의 총 부피로 0.5 시간동안 100　nM 비오티닐화 TfR-avi-his에 대한 각 라이브러리의 약 1012 파지미드(phagemid) 입자의 결합, 2. 10 분동안 5.4 x 107 스트렙타비딘-코팅된 자석 비드의 첨가에 의한 비오티닐화 TfR-avi-his 및 특이적으로 결합된 파지 입자의 포획, 3. 5-10x 1 mL PBS/트윈 20 및 5-10x 1 mL PBS를 사용한 비드의 세척, 4. 10 분동안 1 mL 100　mM TEA(트라이에틸아민)의 첨가에 의한 파지 입자의 용출 및 500 ㎕ 1　M 트리스/HCl(pH 7.4)의 첨가에 의한 중화, 및 5. 지수적으로 성장하는 이. 콜라이 TG1 세균의 재감염, 헬퍼 파지 VCSM13으로의 감염, 및 후속 선별 단계에 사용될 파지미드 입자의 후속 PEG/NaCl 침전. 선별은 일정하거나 감소하는(10-7　M로부터 2x10-9　M까지) 항원 농도를 사용하여 3 내지 5 단계에 걸쳐 수행하였다. 2 단계에서, 항원/파지 복합체의 포획은 스트렙타비딘 비드 대신에 뉴트라비딘 플레이트를 사용하여 수행하였다. 재조합 가용성 항원에 대해 제조된 결합제는 종종 세포 상에서 약한 결합만을 나타내었기 때문에, 재조합 항원상에서의 증폭의 2번째 또는 3번째 단계 후에 천연 항원을 나타내는 세포를 사용하여 2회의 추가 선별 단계를 도입하였다. 여기서, 2개의 세포주 TF-1 및 NCI-H460을 사용하였다(둘 다 ATCC에서 이용가능). 간략하게, 1x106 세포를, 수용체 매개된 내재화를 배제하기 위해 얼음위에서 1 시간동안 약 1012 파지 입자와 함께 배양하였다. PBST 완충액(1% 트윈-20을 함유하는 PBS)을 사용하여 5 내지 10회 원심분리 단계에 의해 세척을 수행하였다. 전체 세포를 사용하여 파지 구제를 위해 TG1 세균을 감염시켰다.
특이적 결합제는 다음과 같이 ELISA에 의해 확인하였다: 웰 당 100 ㎕의 10　nM 비오티닐화 TfR-avi-his를 뉴트라비딘 플레이트 상에 코팅하였다. Fab-함유 세균 상등액을 첨가하고, 항-FLAG/HRP 2차 항체를 사용하여 그의 FLAG-태그에 의해 결합 Fab를 검출하였다. ELISA-양성 클론들을 96-웰 포맷으로 가용성 Fab 단편으로서 세균적으로 발현시키고, 상등액을 프로테온(ProteOn) XPR36(바이오래드(BioRad))을 사용하여 SPR-분석에 의해 동적 스크리닝 실험에 적용하였다. 최고 친화도 상수를 갖는 Fab를 발현하는 클론들을 확인하고 상응하는 파지미드를 서열분석하였다.
Fab 항체의 정제
Top10 세포를 모든 세포 ELISA 양성 클론의 파지미드 플라스미드로 개별적으로 형질감염시켰다. 세포들을 배지에서 성장시키고 Fab 항체의 생성을 유도하였다. Fab 항체들을 주변세포질 제조에 의해 단리하고 IMAC를 사용하여 정제하였다.
FACS 분석
정제된 Fab 항체들을 다양한 농도로 TF-1 세포에 적용하였다. 세포 결합된 Fab 항체들을 형광 표지된 항-Fab 항체 및 FACS에 의한 측정을 이용하여 검출하였다. EC50 값을 산출하였다.
선별된 클론의 생성 및 특성화
IgG 포맷으로의 전환
FACS 또는 세포 ELISA 상에서 뚜렷한 세포 결합 신호 및 hTfR-Fc(KiH)-Avi 및 cyTfR-Fc(KiH)-Avi 항원 둘 다에 대한 교차-반응성 결합 하에, 6 내지 20 분의 복합체 반감기(t1/2) 또는 10 nM 내지 500 nM의 세포상 EC50을 갖는 선별된 클론들을 IgG 포맷으로 전환시키기 위해 선택하였다.
그러므로, VL 도메인을 PCR에 의해 증폭시키고 전술한 바와 같은 포유동물 발현 벡터내에 CL 도메인의 바로 상류에 클로닝시켰다. 또한, VH 도메인을 PCR에 의해 증폭시키고 CH-Fc 도메인의 바로 상류에 클로닝시켰다. 두 발현 벡터 둘 다의 서열을 결정하였다.
IgG 항체의 생성
HEK293 EBNA 현탁 세포를 LC 및 HC 암호화 플라스미드 둘 다로 형질감염시키고 7 일동안 배양하였다. 멸균 여과에 의해 상등액을 청정화시켰다. 단백질 A 크로마토그래피에 의해 IgG 농도를 측정하였다.
태그라이트(TagLite) 기술을 이용한 EC50의 측정
막관통 도메인을 포함하는 hTfR 또는 cyTfR 각각의 ECD의 유전자를 포유동물 발현 벡터내에 SNAP-태그 하류에 접합시켰다. 상기 벡터를 사용하여 HEK293 EBNA 현탁 세포를 형질감염시켜, C-말단 SNAP 태그 융합물(서열번호 101, 서열번호 102)을 갖는 TfR의 디스플레이를 수득하였다. SNAP 태그는 SNAP-Lumi4Tb(시스바이오(Cisbio))로 특이적으로 표지화하였다. 표지화 효율은 615 nm에서 테르븀(Terbium)의 방출을 측정함으로써 결정하였다. 표지된 세포는 -80 ℃에서 저장하였다.
항-인간Fc-d2 IgG 항체의 존재하에서, 표지된 세포들을 다양한 희석률로 IgG 상등액과 함께 배양하고, FRET 신호(공여체 염료 Lumi4Tb의 방출: 615　nM 및 수용체 염료 d2의 방출: 665　nM)를 4 시간후에 측정하였다. EC50 값을 산출하여 25 IgG를 수득하였으며, 이것은 hTfR 및 cyTfR 둘 다에 결합되었다.
FACS에 의한 세포 결합 측정
전장 hTfR 또는 cyTfR 각각의 유전자를 포유동물 발현 벡터내에 클로닝시켰다. 상기 벡터를 CHO EBNA 현탁 세포의 형질감염에 사용하였다. IgG 상등액을 TfR 디스플레이 세포에 직접 적용하였다. PBST로 세척한 후, 항-huFc IgG-HRP 항체 접합체를 사용하여 항원-항체 복합체를 검출한 후 3,3'-5,5'-테트라메틸벤지딘으로 발색시켰다. 기능성 디스플레이는 상업적으로 시판하는 항-TfR 항체를 사용하여 확인하였다. 25개 태그라이트 양성 클론 모두가 강한 결합 신호를 나타내었다.
1가 IgG 유사 분자의 생성 및 정제
L234A, L235A 및 P329G 돌연변이를 함유하는, 인간 놉 IgG1 HC를 암호화하는 포유동물 발현 벡터내에 VH 도메인을 클로닝시켰다. 상기 벡터를, LC(전술한 벡터) 및 L234A, L235A, P329G, H435R 및 Y436F 돌연변이를 갖는 빈 홀-Fc 도메인을 공-발현하는 HEK293 EBNA 현탁 세포에서의 발현에 사용하였다. 생성된 단백질은 단백질 A 친화 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정하여 단량체성 단백질이 >95%인 경우, 단백질을 크기 배제 크로마토그래피로 더 정제하였다.
실시예 4
세포 ELISA에 의한 인간 및 사이노몰거스 TfR-결합 항체의 동정
인간 및 사이노몰거스 TfR을 인식하는 항체에 대해 토끼 B-세포 또는 마우스 하이브리도마 상등액을 스크리닝하기 위해, 안정하게 형질감염된 CHO-K1 세포를 사용한 세포 ELISA를 이용하였다. 인간 또는 사이노몰거스 TfR에 대해서 뿐 아니라 네오마이신-포스포트랜스퍼라제에 대한 발현 카세트를 함유하는 발현 플라스미드로 CHO-K1 세포를 형질감염시켜 안정한 형질감염체를 수득하였다. 형질감염 후에, 500 ㎍/mL G418(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))을 함유하는 성장 배지에 세포를 희석시켰다. 성장 클론의 출현 후에, 세포를 분리하고, MEM-75(Abcam) 또는 13E4(라이프 테크놀로지스), 및 인간 또는 사이노몰거스 TfR에 대한 PE-표지된 2차 항체로 염색시키고, 고 형광성 세포를 단일 세포로서 96-웰-플레이트 웰(FACS 아리아) 내에 분류시켰다. 7일간 성장시킨 후, 클론을 TfR 발현에 대해 다시 점검하고 가장 우수하게 발현시키는 클론을 세포 ELISA 실험을 위해 선택하였다.
간략하게, 384-웰 플레이트의 웰 당 15,000 세포를 접종하고, 37 ℃, 5% CO2에서 18 시간동안 배양하였다. 상등액을 자동 세척기(바이오테크(BIOTEK))를 사용하여 제거하고, 30 ㎕의 항체-함유 상등액을 각 웰에 가한 후, 24 ㎕의 성장 배지를 첨가하였다. 2 시간동안 배양한 후, 웰을 비우고, PSB중 0.05% 글루타르알데하이드 30 ㎕를 RT에서 45 분동안 첨가하였다. PBS/0.025% 트윈20(PBST)으로 3회 세척한 후, 차단 완충액에 1:5000으로 희석시킨 항-토끼-HRP 또는 항-마우스-HRP(서던 바이오테크(Southern Biotech)) 30 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 RT에서 1 시간동안 배양하였다. 웰을 PBST로 6회 세척하고, 웰당 30 ㎕의 TMB를 사용하여 신호를 발생시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 5
항-TfR 항체의 클로닝 및 발현
재조합 DNA 기술
표준 방법을 이용하여 문헌 [Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual]; 및 문헌 [Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기술된 바와 같이 DNA를 조작하였다. 분자 생물 시약은 제조사의 지시에 따라 사용하였다.
유전자 및 올리고뉴클레오티드 합성
목적하는 유전자 절편을 제네아트 게엠베하(독일 레겐스부르크)에서 화학적 합성에 의해 제조하였다. 합성된 유전자 단편들을 증식/증폭을 위해 이. 콜라이 플라스미드 내에 클로닝시켰다. 서브클로닝된 유전자 단편들의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 또는, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드들을 어닐링시킴으로써 또는 PCR에 의해 짧은 합성 DNA 단편들을 조립하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드들은 메타비온 게엠베하(독일 플라네그-마르틴스리트)에 의해 제조하였다.
V-도메인의 PCR 증폭
뉴클레오스핀(NucleoSpin) 8/96 RNA 키트(마슈레이-나겔(Macherey & Nagel); 740709.4, 740698)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 B-세포 용해액(RLT 완충액에 재현탁됨 - 키아겐 - 목록 번호 79216)으로부터 전체 RNA를 제조하였다. RNA를 60 ㎕ RNAse 비함유 물로 용출시켰다. 슈퍼스크립트 III 퍼스트-스트랜드 신테시스 슈퍼믹스(Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix)(인비트로겐 18080-400) 및 올리고 dT-프라이머를 제조사의 설명에 따라서 사용하여 역전사효소 반응에 의해 cDNA를 생성하기 위해 6 ㎕의 RNA를 사용하였다. 모든 단계는 해밀튼 ML 스타 시스템(Hamilton ML Star System) 상에서 수행하였다. 중쇄의 경우 프라이머 rbHCfinal.up 및 rbHCfinal.do, 야생형 토끼 B 세포의 경쇄의 경우 rbLC.up 및 rbLC.do, 및 유전자전이 토끼 B-세포의 경쇄의 경우 BcPCR_FHLC_leader.fw 및 BcPCR_huCkappa.rev를 사용하여(하기 표 참조) 50 ㎕의 최종 부피의 어큐프라임 슈퍼믹스(AccuPrime SuperMix)(인비트로겐 12344-040)를 사용하여 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역(VH 및 VL)을 증폭시키기 위해 4 ㎕의 cDNA를 사용하였다. 모든 정방향 프라이머들은 (VH 및 VL 각각의) 신호 펩티드에 특이적인 반면, 역방향 프라이머들은 (VH 및 VL 각각의) 불변 영역에 특이적이었다. RbVH+RbVL에 대한 PCR 조건은 다음과 같았다: 94 ℃에서 5 분동안 고온 출발; 94 ℃에서 20초, 70 ℃에서 20초, 68 ℃에서 45초의 35 주기, 및 68 ℃에서 7 분동안 최종 연장. HuVL에 대한 PCR 조건은 다음과 같았다: 94 ℃에서 5 분동안 고온 출발; 94 ℃에서 20초, 52 ℃에서 20초, 68 ℃에서 45초의 40 주기, 및 68 ℃에서 7 분동안 최종 연장.
Figure 112021095157442-pat00012
50 ㎕ PCR 용액 중 8 ㎕를 48 E-겔 2%(인비트로겐 G8008-02) 상에 부하하였다. 양성 PCR 반응물을 뉴클레오스핀 추출물 II 키트(마슈레이-나겔; 740609250)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 제거하고 50 ㎕ 용출 완충액에 용출시켰다. 모든 제거 단계는 해밀튼 ML 스탈렛 시스템 상에서 수행하였다.
토끼 단클론성 2가 항체의 재조합체 발현
토끼 단클론성 2가 항체의 재조합체 발현을 위해, VH 또는 VL을 암호화하는 PCR-생성물을 오버행(overhang) 클로닝 방법에 의해 발현 벡터내에 cDNA로서 클로닝하였다(문헌 [RS Haun et al., BioTechniques (1992) 13, 515-518]; 및 문헌 [MZ Li et al., Nature Methods (2007) 4, 251-256]). 발현 벡터는 인트론 A를 포함하는 5' CMV 프로모터, 및 3' BGH 폴리아데닐화 서열로 이루어진 발현 카세트를 함유하였다. 발현 카세트 이외에, 상기 플라스미드는 pUC18-유래 복제 기점, 및 이. 콜라이에서의 플라스미드 증폭을 위해 암피실린 내성을 제공하는 베타-락타마제 유전자를 함유하였다. 기본 플라스미드의 3개 변이체를 사용하였다: VH 영역을 수용하도록 설계된 토끼 IgG 불변 영역을 함유하는 1개의 플라스미드에 반해, 2개의 또 다른 플라스미드는 VL 영역을 수용하도록 토끼 또는 인간 카파 LC 불변 영역을 함유한다.
카파 또는 감마 불변 영역을 암호화하는 선형화된 발현 플라스미드 및 VL 또는 VH 삽입물을 중복 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다.
정제된 PCR 생성물을 T4 DNA-폴리머라제와 함께 배양하여 단일-가닥 오버행을 생성하였다. dCTP 첨가에 의해 반응을 중단시켰다.
다음 단계로, 플라스미드 및 삽입물을 결합시키고 recA와 함께 배양하여 부위 특이적 재조합을 유도하였다. 재조합된 플라스미드를 이. 콜라이에 형질전환시켰다. 다음날, 성장된 콜로니들을 골라내고, 플라스미드 제조, 제한효소 분석 및 DNA-서열분석에 의해 정확한 재조합 플라스미드에 대해 검사하였다.
항체 발현을 위해, 단리된 HC 및 LC 플라스미드를 HEK293 세포내에 일시적으로 동시-형질감염시키고, 상등액을 1 주일후에 수거하였다.
토끼 단클론성 1가 항체의 발현을 위한 벡터의 제조
단클론성 1가 항체로서 선택된 후보의 재조합체 발현을 위해, 모든 VH 쇄의 토끼 불변 영역들을 CH3 절편중 놉-돌연변이를 둘러싸는 인간 불변 영역으로 전환시켰다. 토끼 야생형 B-세포로부터 유도된 VL 쇄의 경우, 토끼 C 카파 불변 영역을 인간으로 전환시켰다. 신호 펩티드에 특이적인 정방향 프라이머, 및 (VH 및 VL 각각의) 인간 불변 영역에 상동성인 중복 서열(20 bp)을 (3' 말단에) 갖는 CDR3-J 영역에 특이적인 역방향 프라이머를 사용하여, 50 ㎕의 최종 부피의 어큐프라임 슈퍼믹스(인비트로겐 12344-040)를 사용하여 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 증폭시키기 위해, 선택된 후보의 cDNA 4 ㎕를 사용하였다. VH 및 VL 쇄 증폭을 위한 PCR 조건은 다음과 같았다: 94 ℃에서 5 분동안 고온 출발; 94 ℃에서 20초, 68 ℃에서 20초, 68 ℃에서 45초의 35 주기, 및 68 ℃에서 7 분동안 최종 연장.
VH 또는 VL을 암호화하는 PCR-생성물을 오버행 클로닝 방법에 의해 발현 벡터내에 cDNA로서 클로닝하였다(문헌 [RS Haun et al., BioTechniques (1992) 13, 515-518]; 및 문헌 [MZ Li et al., Nature Methods (2007) 4, 251-256]). 발현 벡터는 인트론 A를 포함하는 5' CMV 프로모터, 및 3' BGH 폴리아데닐화 서열로 이루어진 발현 카세트를 함유하였다. 발현 카세트 이외에, 상기 플라스미드는 pUC18-유래 복제 기점, 및 이. 콜라이에서의 플라스미드 증폭을 위해 암피실린 내성을 제공하는 베타-락타마제 유전자를 함유하였다. 기본 플라스미드의 2개 변이체를 사용하였다: 새로운 증폭된 VH 쇄를 수용하도록 설계된 인간 IgG 불변 영역을 함유하는 1개의 플라스미드, 및 VL 쇄를 수용하도록 인간 카파 LC 불변 영역을 함유하는 두번째 플라스미드.
카파 또는 감마 불변 영역을 암호화하는 선형화된 발현 플라스미드 및 VL/VH 삽입물을 중복 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다.
정제된 PCR 생성물을 T4 DNA-폴리머라제와 함께 배양하여 단일-가닥 오버행을 생성하였다. dCTP 첨가에 의해 반응을 중단시켰다.
다음 단계로, 플라스미드 및 삽입물을 결합시키고 recA와 함께 배양하여 부위 특이적 재조합을 유도하였다. 재조합된 플라스미드를 이. 콜라이에 형질전환시켰다. 다음날, 성장된 콜로니들을 골라내고, 플라스미드 제조, 제한효소 분석 및 DNA-서열분석에 의해 정확한 재조합 플라스미드에 대해 검사하였다.
실시예 6
1가 항-TfR 항체의 일시적 발현
F17 배지(인비트로겐 코포레이션)에서 배양된 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포(인간 태아 신장 세포주 293-유래)에서 생체내에서 항체를 제조하였다. 형질감염을 위해, "293-프리" 형질감염 시약(노바겐(Novagen))을 사용하였다. 항체들 및 전술한 바와 같은 항체-기반 변형된 분자들을 개개 발현 플라스미드들로부터 발현시켰다. 형질감염은 제조사의 설명에 명시된 바와 같이 수행하였다. 재조합 단백질-함유 세포 배양 상등액을 형질감염 3 내지 7 일후에 수거하였다. 상등액은 정제까지 감온(예를 들면, -80 ℃)에서 저장하였다.
예를 들면, HEK293 세포에서 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반적인 정보는 문헌 [Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203]에 제공되어 있다.
실시예 7
고처리율에서 한-팔 트랜스페린 수용체 항체의 정제
96 딥-웰(deep-well) 플레이트에 한 팔(one armed) 항체를 함유하는 50 mL의 청정화된 상등액을 200 ㎕ MabSelectSuRe 컬럼 상에 부하시켰다. pH 7.4에서 PBS를 사용한 세척 단계 후에, 단백질을 테칸/어톨(Tecan/Atoll)-시스템을 사용하여 2.5 mM HCl로 용출시켜 0.5 mL 용출액을 수득하였다. 용출액을 2　M 트리스(pH 8)로 중화시켰다. 정제된 단백질을 나노드롭(Nanodrop) 분광광도계를 사용하여 정량화하고, 변성 및 환원 조건하에서 CE-SDS 및 분석용 SBC에 의해 분석하였다. 고순도(>95　%)를 갖는 단백질을 수득하기 위해, 항체의 대부분이 크기 배제 크로마토그래피 상에서 더 정제되어 절반 항체로부터 놉-놉 항체 및 더 많은 응집물을 분리하여야 한다. 다음으로, 디오넥스 얼티메이트(Dionex UltiMate) 3000을 사용하여 140 mM NaCl(pH 6.0)을 함유하는 20 mM 히스티딘 중의 슈퍼덱스200 10/300GL 상에 500 ㎕의 샘플을 주입하였다. 상기 방법은 25 내지 30개 샘플/일을 분별시키므로, 한-팔 포맷에서 다수의 스크리닝 히트를 폴리싱(polishing)하게 한다. 분획들을 취합하고 전술한 바와 같이 다시 분석하였다.
실시예 8
트랜스시토시스 분석을 위한 hCMEC/D3 세포 배양
hCMEC/D3(문헌 [Weksler, B. B. et al., FASEB J. 19 (2005), 1872-1874])을 위한 배지 및 보충제들은 론자로부터 입수하였다. hCMEC/D3 세포(계대수 26-29)는, 2.5% FBS, 공급된 성장 인자의 1/4을 함유하고 공급된 하이드로코르티손, 겐타마이신 및 아스콜브산으로 완전 보충된 EBM2 배지에서 콜라겐-코팅된 커버슬립(현미경관찰) 또는 플라스크에서 밀집상태까지 배양하였다.
모든 트랜스시토시스 분석에 있어서, 고밀도 기공(1x108 기공/cm2) PET 막 필터 삽입물(0.4 ㎛, 12 mm 직경)을 12-웰 세포 배양 플레이트에 사용하였다. 최적 배지 부피는 정단부 및 기저부 챔버 각각에 대해 400 ㎕ 및 1600 ㎕로 산출되었다. 필터 삽입물의 정단부 챔버는 래트 꼬리 콜라겐 I(7.5 ㎍/cm2)에 이어 피브로넥틴(5 ㎍/mL)으로 코팅되었으며, 각각 RT에서 1 시간동안 배양을 지속하였다. hCMEC/D3 세포는 EBM2 배지에서 10 내지 12일동안 밀집된 단층(약 2x105 세포/cm2)으로 성장하였다.
실시예 9
1가 항체의 트랜스시토시스 분석
전체 분석은 달리 실시예 1에 기술된 바와 같이 재구성된 무혈청 EBM2 배지에서 수행하였다. 세포를 함유하는 필터 삽입물을 37 ℃에서 1 시간동안 1가 항체(농도: 2.67 ㎍/mL)와 함께 정단부에서 배양한 후, 전체 정단부 및 기저부 배지를 수거하였다. 상기 값들로부터 세포간극 플럭스(paracellular flux)를 산출하였다. 단층들을 RT에서 무혈청 배지중에서 정단부에서(400 ㎕) 및 기저부에서(1600 ㎕) 각각 3 내지 5 분동안 3회 세척하였다. 세척물을 모두 수거하여 결합 항체의 제거 효율을 모니터링하였다. 예열된 배지를 정단부 챔버에 첨가하고, 1600 ㎕의 예열된 배지를 함유하는 새로운 12 웰 플레이트(1% BSA를 함유하는 PBS로 밤새 차단됨)로 필터를 옮겼다. 이 시점에서, 특이성 항체 흡수를 측정하기 위해, 필터상의 세포를 500 ㎕ RIPA 완충액에서 용해시켰다. 나머지 필터들은 37 ℃에서 배양하고, 샘플을 다양한 시점에서 수거하여 항체의 정단부 및/또는 기저부 방출을 측정하였다. 샘플내 항체의 함량은 고 민감성 IgG ELISA를 사용하여 정량화하였다(실시예 3 참조). 각각의 시점에서, 데이터는 3개의 필터 세포 배양물로부터 작성되었다.
실시예 10
트랜스시토시스 분석후 민감성 IgG ELISA
전체 절차는 세척 단계에 자동 세척기를 사용하여 RT에서 수행하였다. 384-웰 플레이트를 PBS 중에서 Fcγ-특이적인, 1 ㎍/mL 항-인간/마우스 IgG 30 ㎕/웰로 2 시간동안 코팅시킨 후, 인간 및 마우스 IgG 분석 각각을 위해 1% BSA 또는 1% 크로테인C를 함유하는 차단 완충액 PBS 중에서 1 시간동안 배양하였다. 트랜스시토시스 분석으로부터의 순차 희석된 샘플, 및 트랜스시토시스 분석에 사용된 항체의 표준 농축물을 플레이트에 첨가하고 2 시간동안 배양하였다. 4회 세척한 후, 차단 완충액 중의 30 ㎕/웰의 50 ng/mL 항-인간/마우스-F(ab)2-비오틴을 첨가하고 2 시간동안 더 배양하였다. 6회 세척한 후에, 30 ㎕/웰의 50 ng/mL(huIgG 분석) 또는 100　ng/mL(mIgG 분석) 폴리-HRP40-스트렙타비딘(피츠제랄드(Fitzgerald); 1% BSA 및 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS 중)을 첨가하고 30 분동안 배양하였다. 4회 세척한 후, 30 ㎕/웰의 BM 화학발광 기질(로슈)을 첨가하여 면역 복합체를 검출하였다. 발광 플레이트 판독기를 사용하여 발광 신호를 측정하고 적합 표준 곡선을 이용하여 농도를 산출하였다. 분석의 민감도는 10 pg/mL 내지 10 ng/mL의 범위였다.
실시예 11
hTfR 돌연변이체로 형질감염된 CHO 세포의 세포 ELISA에 의한 에피토프 지도작성
인간 트랜스페린 수용체(hTfR) 상의 에피토프 영역을 측정할 수 있도록 하기 위해, 인간과 마우스 TfR 사이의 상당한 상동성(77% 동일성)에도 불구하고 두 이종상동성 사이에 우수한 교차-반응성을 나타내는, 세포외 부분에 대한 항체는 알려진 바가 없다는 근거에 따라서, 한 무리의 표면-노출된 아미노산들이 정렬된 마우스 TfR 서열(하기 표 참조)에서 상이한 아미노산들을 갖는 위치에서 hTfR 서열내에 돌연변이를 도입하였다. 상응하는 돌연변이를 갖는 플라스미드의 클로닝은 전술하였다. 상기 에피토프들에 대한 인간 TfR 결합제들의 결합을 지도화하기 위해, CHO-K1 세포를 기술된 플라스미드로 일시적으로 형질감염시키고 항체 결합을 세포 ELISA로 측정하였다. 간략하게, 실험 전날 정상 성장 배지(RPMI/10% FCS) 중에서 96-웰 플레이트의 웰 당 104 세포를 플레이팅하였다. 다른 날, 배지를 옵티멤 혈청 감소 배지(OPTI-MEM Serum-Reduced Medium)(깁코)로 교체하고, 1200 ㎕의 옵티멤, 12 ㎍의 플라스미드 DNA 및 12 ㎕의 엑스트림진(XtremeGENE) 형질감염 시약(로슈)의 혼합물 10 ㎕를 예비-배양 30 분후에 웰에 첨가하였다. 세포를 37　℃/7.5%　CO2에서 배양한 다음, 배지를 제거하고, TfR 항체를 성장 배지중 1 nM 내지 100 nM의 농도로 첨가한 후, 4 ℃에서 2 시간동안 배양하였다. 그 후에, 항체 용액을 PBS중 0.05% 글루타르알데하이드로 대체하고, 세포를 RT에서 15분동안 고정시킨 다음, PBS로 2회 세척하고 HRP-접합된 항-인간-Fc 2차 항체(바이오래드; ELISA 차단 시약(로슈)중 1:2000)과 함께 RT에서 1.5 시간동안 배양하였다. 웰 당 50 ㎕의 TMB를 사용하여 PBS로 3회 세척후 신호를 발생시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Figure 112021095157442-pat00013
실시예 12
인간 TfR-항체 상호작용에 대한 표면 플라즈몬 공명-기반 결합 분석
항-인간 Fab 항체(GE 헬쓰케어, 목록 번호 28-9583-25)로 전처리된 C1 센서칩(GE 헬쓰케어, 목록 번호 BR1005-35)이 장착된 비아코어 B 4000(GE 헬쓰케어) 상에서 판매회사의 매뉴얼에 따라 표준 아민 커플링 화학 절차를 이용하여 결합 실험을 수행하였다.
동적 측정을 위해, 60 초의 접촉 시간 및 포스페이트 완충 식염수(pH 7.4), 0.05% 트윈 20 중 10 ㎕/분의 유량을 적용하여 25 ℃에서 샘플 항체를 고정화시켰다. 재조합 His6-표지된 인간 트랜스페린 수용체(R&D 시스템즈, 목록 번호 2474-TR-050)를 증가하는 농도로 적용하고 시간 경과에 따라 신호를 모니터링하였다. 30 ㎕/분의 유량에서 150 초의 결합 시간 및 600 초의 해리 시간의 평균 시간 기간이 기록되었다. 데이터는 1:1 결합 모델(랭뮤어 등온선)을 이용하여 적합화시켰다.
SEQUENCE LISTING <110> F. 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Claims (4)

  1. (i) (a) 서열번호 109의 아미노산 서열로 이루어진 HVR-H1; (b) 서열번호 110의 아미노산 서열로 이루어진 HVR-H2; (c) 서열번호 112의 아미노산 서열로 이루어진 HVR-H3; (d) 서열번호 113의 아미노산 서열로 이루어진 HVR-L1; (e) 서열번호 114의 아미노산 서열로 이루어진 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 115의 아미노산 서열로 이루어진 HVR-L3, 또는
    (ii) (a) 서열번호 116의 아미노산 서열로 이루어진 HVR-H1; (b) 서열번호 117의 아미노산 서열로 이루어진 HVR-H2; (c) 서열번호 119의 아미노산 서열로 이루어진 HVR-H3; (d) 서열번호 120의 아미노산 서열로 이루어진 HVR-L1; (e) 서열번호 121의 아미노산 서열로 이루어진 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 122의 아미노산 서열로 이루어진 HVR-L3
    을 포함하는 인간화된 항 트랜스페린 수용체 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    인간 트랜스페린 수용체 및 사이노몰거스 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 인간화된 항 트랜스페린 수용체 항체.
  3. 신경 질환의 치료를 위한 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 인간화된 항 트랜스페린 수용체 항체를 포함하는 약학 제형으로서,
    상기 항체가 신경 질환의 치료를 위한 약학적으로 활성인 화합물과 접합되고,
    상기 신경 질환이 신경퇴행성 질환, 루이소체병, 척수신경마비성회백수염 증후군, 샤이-드레거 증후군, 올리브교소뇌위축, 파킨슨병, 다계통 위축, 선상체흑질 변성증, 타우병증, 알츠하이머병, 핵상마비, 프리온 질환, 소해면상뇌병증, 스크래피, 크로이츠펠트-야콥 증후군, 쿠루병, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병, 만성 소모성 질환, 치명적 가족성 불면증, 구마비, 운동 뉴런 질환, 신경계 이형퇴행성 질환, 카나반병, 헌팅톤병, 신경 세로이드-지질갈색소증, 알렉산더병, 투렛 증후군, 멘케스 킨키 헤어 증후군, 코케인 증후군, 할러포르덴-스파츠 증후군, 라포라병, 레트 증후군, 간렌즈핵변성증, 레쉬-니한 증후군, 운베리히트-룬드보그 증후군, 치매, 픽병, 척수소뇌성 실조증, CNS 암 및 뇌의 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는,
    약학 제형.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    혈액 뇌 장벽을 횡단하여 뇌 작동인자 물질을 운반하는데 사용하기 위한 인간화된 항 트랜스페린 수용체 항체.
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