ES2347144T3 - Proteinas de fusion de la transferrina modificada que comprenden dominos aino o carboxilo de transferrina duplicados. - Google Patents

Proteinas de fusion de la transferrina modificada que comprenden dominos aino o carboxilo de transferrina duplicados. Download PDF

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Abstract

Una proteína de fusión de la transferrina que comprende un resto de transferrina (Tf) y al menos una proteína o péptido terapéutico, en la que dicho resto de transferrina se selecciona del grupo constituido por (i) un resto de transferrina que comprende dos o más dominios N de transferrina; (ii) un resto de transferrina que comprende un dominio N de transferrina y un dominio C de transferrina que ha sido modificado por sustitución de aminoácidos de las regiones del dominio C o aminoácidos para las regiones correspondientes o aminoácidos del dominio N según se muestra en ID. SEC. Nº 2 ó 3, para presentar patrones de glicosilación y propiedades de unión del hierro de un dominio N de la transferrina nativa o de tipo natural según se muestra en ID. SEC. Nº 2 ó 3; (iii) un resto de transferrina que comprende dos o más dominios C de transferrina que están modificados para inhibir o prevenir la glicosilación y la unión al receptor de Tf; y (iv) un resto de transferrina constituido por dos dominios N de transferrina; en la que dicho resto de transferrina prolonga la estabilidad en el suero, la semivida en circulación in vivo y la biodisponibilidad de dicha proteína terapéutica.

Description

Proteínas de fusión de la transferrina modificada que comprenden dominios aino o carboxilo de transferrina duplicados.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a proteínas o péptidos terapéuticos con estabilidad en el suero, semivida en circulación in vivo y biodisponibilidad ampliadas, particularmente a proteínas o péptidos terapéuticos fusionados a, o insertados en, una molécula de transferrina modificada para reducir o inhibir la glicosilación, la unión del hierro y/o la unión al receptor de transferrina.
Antecedentes de la invención
Las proteínas o péptidos terapéuticos en su estado nativo o cuando se producen de forma recombinante son moléculas típicamente lábiles que presentan cortos períodos de estabilidad en suero o cortas semividas en circulación in vivo. Además, estas moléculas son a menudo extremadamente lábiles cuando se encuentran en una formulación, en particular cuando se formulan en disoluciones acuosas con fines de diagnóstico y fines terapéuticos.
Existen pocas soluciones prácticas para prolongar o potenciar la estabilidad in vivo o in vitro de las moléculas proteicas terapéuticas. El polietilenglicol (PEG) es una sustancia que se puede unir a una proteína, dando como resultado una actividad sostenida, de mayor duración, de la proteína. Si la actividad de la proteína se prolonga mediante la unión a PEG, se puede disminuir la frecuencia con la que se necesita administrar la proteína. La unión a PEG, sin embargo, a menudo disminuye o destruye la actividad terapéutica de la proteína. Aunque en algún caso la unión a PEG puede reducir la inmunogenicidad de la proteína, en otros casos puede aumentar la inmunogenicidad.
Las proteínas o péptidos terapéuticos se han estabilizado también mediante fusión a una proteína capaz de prolongar la semivida en circulación in vivo de la proteína terapéutica. Por ejemplo, las proteínas terapéuticas fusionadas a albúmina o a fragmentos de anticuerpos pueden presentar semivida en circulación extendida in vivo en comparación con la proteína terapéutica en el estado no fusionado. Véase Patentes de EEUU Nº 5.876.969 y 5.766.883.
Otra proteína sérica, la transferrina humana glicosilada (Tf), se ha usado también para realizar fusiones con proteínas terapéuticas para dirigir la administración hacia el interior de las células o para trasportar agentes a través de la barrera hematoencefálica. Estas proteínas de fusión que comprenden la Tf humana glicosilada se han usado para dirigir el factor de crecimiento nervioso (NGF) o el factor neurotrófico ciliar (CNTF) a través de la barrera hematoencefálica fusionando la Tf de longitud completa con el agente. Véase Patentes de EEUU Nº 5.672.683 y 5.977.307. En estas proteínas de fusión, la porción Tf de la molécula está glicosilada y se une a dos átomos de hierro, que son necesarios para la unión de la Tf a su receptor en una célula y, según los autores de estas patentes, para dirigir la administración del resto NGF o el CNTF a través de la barrera hematoencefálica. Se han producido también proteínas de fusión de la transferrina insertando una secuencia diana de la proteasa de VIH-1 en los bucles expuestos de la superficie de la transferrina glicosilada para investigar la capacidad para producir otra forma de la Tf de fusión para dirigir la administración al interior de una célula mediante el receptor de Tf (Ali y col. (1999) J. Biol. Chem. 274(34): 24066-24073).
La transferrina sérica (Tf) es una glicoproteína monomérica con un peso molecular de 80.000 dalton que se une al hierro en la circulación y lo trasporta a diversos tejidos a través del receptor de la transferrina (TfR) (Aisen y col. (1980) Ann. Rev. Biochem. 49: 357-393; MacGillivray y col. (1981) J. Biol. Chem. 258: 3543-3553, Patente de EEUU Nº 5.026.651). La Tf es una de las moléculas séricas más comunes, que comprende hasta aproximadamente un 5-10% de las proteínas séricas totales. Se produce transferrina deficiente en carbohidratos en grandes cantidades en la sangre de individuos alcohólicos y presenta una semivida más larga (aproximadamente 14-17 días) que la de la transferrina glicosilada) (aproximadamente 7-10 días) Véase van Eijk y col. (1983) Clin. Chim. Acta 132: 167-171, Stibler (1991) Clin. Chem. 37: 2029-2037 (1991), Arndt (2001) Clin. Chem. 47(1): 13-27 y Stibler y col. en "Carbohydrate-deficient consumption", Advances in the Biosciences, (Ed Nordmann y col.), Pergamon, 1988, Vol. 71, páginas 353-357).
Se ha caracterizado bien la estructura de la Tf y el mecanismo de unión al receptor, la unión y liberación de hierro y se ha dilucidado la unión al ión carbonato (Patentes de EEUU Nº 5.026.651, 5.986.067 y MacGillivray y col. (1983) J. Biol. Chem. 258(6): 3543-3546).
Se han usado también la transferrina y los anticuerpos que se unen al receptor de la transferrina para administrar o trasportar agentes tóxicos a células tumorales como terapia para el cáncer (Baselga y Mendelsohn, 1994), y se ha usado la transferrina como un vector no viral de terapia génica para administrar ADN a las células (Frank y col, 1994; Wagner y col, 1992). La capacidad de liberar proteínas en el sistema nervioso central (SNC) se ha demostrado usando el receptor de la transferrina como punto de entrada con diversas proteínas y péptidos, incluidos CD4 (Walus y col, 1996), el factor neurotrófico derivado de cerebro (Pardridge y col, 1994), el factor neurotrófico derivado de la glia (Albeck y col), un análogo de péptido vasointestinal (Bickel y col, 1993), un péptido beta-amiloide (Saito y col, 1995) y un oligonucleótido antisentido (Pardridge y col, 1995).
\newpage
Sin embargo, las proteínas de fusión de la transferrina no se han modificado o construido mediante ingeniería genética para prolongar la semivida en circulación in vivo de una proteína ni de un péptido terapéutico o para aumentar la biodisponibilidad reduciendo o inhibiendo la glicosilación del resto de Tf ni para reducir o evitar la unión al hierro y/o al receptor de Tf.
Resumen de la invención
Como se describe más detalladamente a continuación, la presente invención incluye las proteínas de fusión de la Tf modificada que comprenden al menos una proteína, un polipéptido o un péptido terapéutico, en los que la porción o el resto de Tf se construye por ingeniería genética para que comprenda al menos dos dominios N de la transferrina nativa o de tipo natural, al menos dos dominios C modificados que están modificados para inhibir o para evitar la glicosilación y la unión al receptor de Tf o un dominio N y un dominio C, en el que el dominio C se ha modificado por sustitución de aminoácidos de las regiones del domino C o aminoácidos para las regiones correspondientes o aminoácidos del dominio N como se muestra en ID. SEC. Nº 2 ó 3, para presentar patrones de glicosilación y propiedades de unión de hierro de un dominio N de la transferrina nativa o de tipo natural como se muestra en ID. SEC. Nº 2 ó 3. La invención también incluye formulaciones farmacéuticas y composiciones que comprenden las proteínas de fusión, los procedimientos para ampliar la estabilidad en el suero, la semivida en circulación in vivo y la biodisponibilidad de una proteína terapéutica por medio de la fusión a la transferrina modificada, las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de Tf modificada y similares. Otro aspecto de la presente invención se refiere a una proteína de fusión de Tf modificada para uso en el tratamiento de una enfermedad o los síntomas de una enfermedad en un paciente.
Descripción detallada Descripción general
Se ha descubierto que se puede estabilizar una proteína terapéutica (por ejemplo, un polipéptido, un anticuerpo, o un péptido, o sus fragmentos y variantes) para prolongar la semivida en circulación in vivo y/o para retener la actividad de la proteína terapéutica durante periodos de tiempo prolongados in vivo fusionando genéticamente o conjugando químicamente la proteína, el polipéptido o péptido terapéutico a una transferrina modificada que comprende al menos dos dominios N de la transferrina nativa o de tipo natural, al menos dos dominios C modificados y un domino N y un dominio C, según se describió anteriormente. Las proteínas de fusión de la transferrina modificada incluyen una proteína o un dominio de la transferrina unido covalentemente a una proteína o péptido terapéutico, en la que la porción de la transferrina se ha modificada para contener una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en comparación con una secuencia de transferrina natural. Las proteínas de fusión de Tf se pueden construir mediante ingeniería genética para reducir o evitar la glicosilación dentro de la Tf o un dominio de Tf. En ciertas formas de realización, la proteína Tf o el(los) dominio(s) Tf se modifican para presentar una unión reducida o ninguna unión al ión hierro o carbonato, o para tener una afinidad reducida o ninguna unión al receptor de Tf (TfR).
La presente invención incluye por consiguiente proteínas de fusión de la transferrina, composiciones terapéuticas que comprenden las proteínas de fusión, y las proteínas de fusión para uso en el tratamiento de una enfermedad o de los síntomas de una enfermedad en un paciente. Una proteína de fusión de la transferrina incluye al menos un fragmento o variante de una proteína terapéutica y al menos un fragmento o variante de la transferrina modificada, que están asociadas entre sí, de preferencia mediante fusión genética (es decir, la proteína de fusión de la transferrina está generada por la traducción de un ácido nucleico en el que un polinucleótido que codifica toda o una porción de una proteína terapéutica se une en marco con un polinucleótido que codifica toda o una porción de la transferrina modificada) o por conjugación química entre sí. La proteína terapéutica y la proteína transferrina, una vez que forman parte de la proteína de fusión de la transferrina, pueden denominarse una "porción", "región" o "resto" de la proteína de fusión de la transferrina (por ejemplo, una "porción de proteína terapéutica" o una "porción de la proteína transferrina").
En una forma de realización, la invención proporciona una proteína de fusión de la transferrina que comprende, o como alternativa está constituida por, una proteína terapéutica y una proteína transferrina sérica modificada. En otras formas de realización, la invención proporciona una proteína de fusión de la transferrina que comprende, o como alternativa está constituida por, un fragmento biológicamente activo y/o terapéuticamente activo de una proteína terapéutica y una proteína transferrina modificada. En otras formas de realización, la invención proporciona una proteína de fusión de la transferrina que comprende, o como alternativa está constituida por, una variante biológicamente activa y/o terapéuticamente activa de una proteína terapéutica y la proteína transferrina modificada. En otras formas de realización, la invención proporciona una proteína de fusión de la transferrina que comprende una proteína terapéutica y un fragmento biológicamente activo y/o terapéuticamente activo de la transferrina modificada. En otra forma de realización, la porción de la proteína terapéutica de la proteína de fusión de la transferrina es la forma activa de la proteína terapéutica.
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o ensayo de la presente invención puede usarse cualquier procedimiento y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, se describen los procedimientos y materiales preferidos.
Definiciones
Según se usa en el presente documento, el término "actividad biológica" se refiere a una función o conjunto de actividades llevadas a cabo por una molécula, proteína o péptido terapéutico en un contexto biológico (es decir, en un organismo o una de sus reproducciones perfectas in vitro). Las actividades biológicas pueden incluir, pero no se limitan a, las funciones de la porción de molécula terapéutica de las proteínas de fusión reivindicadas, tales como, pero no limitadas a, la inducción de la secreción de la matriz extracelular procedente de líneas celulares sensibles, la inducción de la secreción de hormonas, la inducción de la quimiotaxis, la inducción de la mitogénesis, la inducción de la diferenciación, o la inhibición de la división celular de las células sensibles. Se considera que una proteína o péptido de fusión de la invención es biológicamente activo si presenta una o más actividades biológicas de su equivalente natural de la proteína terapéutica.
Según se usa en el presente documento "un aminoácido que corresponde a" o un "aminoácido equivalente" en una secuencia de la transferrina se identifica mediante alineación para maximizar la identidad o similitud entre una primera secuencia de la transferrina y al menos una segunda secuencia de la transferrina. El número usado para identificar un aminoácido equivalente en una segunda secuencia de la transferrina se basa en el número usado para identificar el aminoácido correspondiente en la primera secuencia de la transferrina. En algunos casos, pueden usarse estas frases para describir los residuos de aminoácidos en la transferrina humana en comparación con algunos residuos en la transferrina del suero de conejo.
Según se usa en el presente documento, las frases "fragmento de una proteína Tf" o "proteína Tf", o "porción de una proteína Tf" se refieren a una secuencia de aminoácidos que comprende al menos aproximadamente un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de una proteína Tf que se presenta naturalmente o su mutante.
Según se usa en el presente documento, el término "gen" se refiere a cualquier segmento de ADN asociado con una función biológica. Por consiguiente, los genes incluyen, pero no están limitados a, las secuencias codificadoras y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Los genes pueden incluir también segmentos de ADN no expresados que, por ejemplo, forman las secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Pueden obtenerse genes de una diversidad de fuentes, incluida la clonación de una fuente de interés o pueden sintetizarse a partir de la información de una secuencia predicha o conocida y pueden incluir secuencias diseñadas para que tengan los parámetros deseados.
Según se usa en el presente documento, un "polinucleótido heterólogo" o un "ácido nucleico heterólogo" o un "gen heterólogo" o una "secuencia heteróloga" o un "segmento de ADN exógeno" se refiere a un polinucleótido, ácido nucleico o segmento de ADN que se origina a partir de una fuente extraña a la célula huésped concreta, o, si procede de la misma fuente, está modificada a partir de su forma original. Un gen heterólogo en una célula huésped incluye un gen que es endógeno para la célula huésped concreta, pero que se ha modificado. Por consiguiente, los términos se refieren a un segmento de ADN que es extraño o heterólogo a la célula, u homólogo a la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula huésped en la que el elemento no se encuentra normalmente. Como ejemplo, una secuencia señal nativa en una célula de levadura pero unida a una secuencia de Tf humana, es heteróloga.
Según se usa en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico "aislado" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que está esencialmente libre de otras secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, al menos aproximadamente un 20% pura, preferiblemente al menos aproximadamente un 40% pura, de más preferencia aproximadamente un 60% pura, incluso de más preferencia aproximadamente un 80% pura, de mayor preferencia aproximadamente un 90% pura, e incluso lo más preferible aproximadamente un 95% pura, según se determina mediante electroforesis en gel de agarosa. Por ejemplo, puede obtenerse, mediante procedimientos de clonación convencionales una secuencia de ácido nucleico aislado, usada en ingeniería genética para reubicar la secuencia de ácido nucleico desde su localización natural a un sitio diferente en el que se reproducirá. Los procedimientos de clonación pueden implicar la escisión y el aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido, la inserción del fragmento en la molécula vector, y la incorporación del vector recombinante a una célula huésped en la que se replicarán múltiples copias o clones de la secuencia del ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico puede ser genómica, ADNc, ARN, semisintética, de origen sintético, o cualquiera de sus combinaciones.
Según se usa en el presente documento, se dice que dos o más secuencias codificadoras de ADN están "unidas" o "fusionadas" cuando, como resultado de fusiones en marco entre las secuencias codificadoras de ADN, las secuencias codificadoras del ADN se traducen en un polipéptido de fusión.
Según se usa en el presente documento, el término "fusión" en referencia a las fusiones de Tf incluye, pero no está limitado a, la unión de al menos una proteína, polipéptido o péptido terapéutico, de preferencia la región variable de un anticuerpo, al extremo N terminal de Tf, la unión al extremo C terminal de Tf, la inserción entre dos aminoácidos cualquiera en el interior de Tf, y/o la sustitución de una porción de la secuencia de Tf tal como el bucle de Tf.
"Transferrina modificada", según se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de transferrina que presenta al menos una modificación de su secuencia de aminoácidos, en comparación con la transferrina natural para producir una molécula de transferrina que comprende al menos dos dominios N, al menos dos dominios C que están modificados para inhibir o para evitar la glicosilación y la unión al receptor de Tf o un dominio N y un dominio C, en el que el dominio C se ha modificado por sustitución de aminoácidos de las regiones del domino C o aminoácidos para las regiones correspondientes o aminoácidos del dominio N como se muestra en ID. SEC. Nº 2 ó 3, para presentar patrones de glicosilación y propiedades de unión de hierro de un dominio N de la transferrina nativa o de tipo natural como se muestra en ID. SEC. Nº 2 ó 3.
"Proteína de fusión de la transferrina modificada", según se usa en el presente documento, se refiere a una proteína formada por la fusión de al menos una molécula de transferrina modificada (o uno de sus fragmentos o variantes) a al menos una molécula de una proteína terapéutica (o uno de sus fragmentos o variantes).
Según se usa en el presente documento, los términos "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refieren a dexosirribonucleótidos o ribonucleótidos y sus polímeros tanto en forma de cadena única como en doble cadena. A menos que se limite de manera específica, los términos abarcan los ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares como el ácido nucleico de referencia y se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos que se producen naturalmente. A menos que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico concreto abarca también implícitamente sus variantes modificadas de manera conservativa (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y las secuencias complementarias así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, pueden conseguirse sustituciones de codones degenerados generando secuencias en las que está sustituida la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) con restos de base mixta y/o dexosiinosina (Batzer y col. (1991) Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsuka y col. (1985) J. Biol. Chem. 260: 2605-2608; Cassol y col. (1992); Rossolini y col. (1994) Mol. Cell. Probes 8: 91-98). El término ácido nucleico se usa de manera intercambiable con gen, ADNc y ARNm codificado por un gen.
Según se usa en el presente documento, se hace referencia a un segmento de ADN como "unido de manera operativa" cuando se sitúa en una relación funcional con otro segmento de ADN. Por ejemplo, el ADN de una secuencia señal se une de manera operativa al ADN que codifica una proteína de fusión de la invención si se expresa como una preproteína que participa en la secreción de la proteína de fusión; un promotor o un potenciador se une de manera operativa a una secuencia de codificación si estimula la transcripción de la secuencia. Generalmente, las secuencias de ADN que se unen de manera operativa son contiguas, y en el caso de una secuencia señal o de la proteína de fusión, ambas son contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no necesitan ser contiguos con las secuencias de codificación cuya transcripción controlan. La unión, en este contexto, se lleva a cabo mediante ligadura en sitios de restricción convenientes o en adaptadores o conectores insertados en su lugar.
Según se usa en el presente documento, el término "promotor" se refiere a una región de ADN implicada en la unión de la ARN polimerasa para iniciar la transcripción.
Según se usa en el presente documento, el término "recombinante" se refiere a una célula, tejido u organismo que ha experimentado transformación con una nueva combinación de genes o ADN.
Según se usa en el presente documento, una entidad, proteína, polipéptido o péptido diana se refiere a una molécula que se une específicamente a un tipo de célula concreto [normal (por ejemplo, linfocitos) o anormal (por ejemplo, célula cancerosa)] y por consiguiente se puede usar para dirigir una proteína o compuesto de fusión de Tf (fármaco, o agente citotóxico) específicamente hacia ese tipo celular.
Según se usa en el presente documento "proteína terapéutica" se refiere a proteínas, polipéptidos, péptidos o sus variantes, que tienen una o más actividades terapéutica(s) y/o biológica(s). Las proteínas terapéuticas abarcadas por la invención incluyen, pero no están limitadas a proteínas, polipéptidos, péptidos, anticuerpos y compuestos biológicos. Los términos péptidos, proteínas y polipéptidos se usan de manera intercambiable en el presente documento. Además, el término "proteína terapéutica" puede referirse a la correlación que se produce de manera endógena o natural de una proteína terapéutica. Por un polipéptido que muestra una "actividad terapéutica" o una proteína que es "terapéuticamente activa" se entiende un polipéptido que posee una o más actividades biológicas y/o terapéuticas asociadas con una proteína terapéutica tal como una o más de las proteínas terapéuticas descritas en el presente documento o conocidas de otra manera en la técnica. Como ejemplo no limitante, una "proteína terapéutica" es una proteína que es útil para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad, afección o trastorno, Tal enfermedad, afección o trastorno puede ser en seres humanos o en animales no humanos, por ejemplo, de uso veterinario.
Según se usa en el presente documento, el término "transformación" se refiere a la transferencia de ácido nucleico (es decir, un polímero de nucleótidos) al interior de una célula. Según se usa en el presente documento, el término "transformación genética" se refiere a la transferencia y a la incorporación de ADN, especialmente ADN recombinante, en el interior de una célula.
Según se usa en el presente documento, el término "transformante" se refiere a una célula, tejido u organismo que ha experimentado transformación.
Según se usa en el presente documento, el término "transgén" se refiere a un ácido nucleico que se inserta en un organismo, célula huésped o vector de manera que asegura su función.
Según se usa en el presente documento, el término "transgénico" se refiere a células, cultivos celulares, organismos, bacterias, hongos, animales, plantas, y la progenie de cualquiera de los anteriores, que ha recibido un gen extraño o modificado y en concreto un gen que codifica una proteína de fusión de Tf modificada mediante uno de los diversos procedimientos de transformación, en el que el gen extraño o modificado es de la misma o de diferentes especies que las especies del organismo que recibe el gen extraño o modificado.
"Variantes o variante" se refiere a un polinucleótido o ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico o polipéptido de referencia, pero que retiene sus propiedades esenciales. Generalmente, las variantes son globalmente muy similares, y, en muchas regiones, idénticas al ácido nucleico o polipéptido de referencia. Según se usa en el presente documento, "variante" se refiere a una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de la transferrina de la invención, que difiere en la secuencia de una proteína terapéutica natural pero que retiene al menos una de sus propiedades funcional y/o terapéutica según se describe en otra parte en el presente documento o se conoce de otra manera en la técnica.
Según se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere en sentido amplio a cualquier plásmido, fagémido o virus que codifica un ácido nucleico exógeno. El término se construye también para incluir compuestos no plásmidos, no fagémidos y no virales que facilitan la transferencia del ácido nucleico en viriones o células, tales como, por ejemplo, compuestos de polilisina y similares. El vector puede ser un vector viral que sea adecuado como vehículo de administración para la administración del ácido nucleico, o uno de sus mutantes, a una célula, o el vector puede ser un vector no viral que sea adecuado para el mismo objetivo. Se conocen bien en la técnica los ejemplos de vectores virales y no virales para la administración de ADN a las células y tejidos y se describen, por ejemplo en Ma y col. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 12744-12746). Los ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a, un virus vacunal recombinante, un adenovirus recombinante, un virus adenoasociado recombinante, un virus de la viruela aviar recombinante, y similares (Cranage y col., 1986, EMBO J. 5: 3057-3063; Solicitud de Patente Internacional Nº WO94/17810, publicada el 18 de agosto de 1994; Solicitud de Patente Internacional Nº WO94/23744, publicada el 27 de octubre de 1994). Los ejemplos de vectores no virales incluyen, pero no se limitan a, liposomas, poliaminas derivadas de ADN, y similares.
Según se usa en el presente documento, el término de "tipo natural" se refiere a una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos que se presenta naturalmente.
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Transferrina y modificaciones de la transferrina
Puede usarse cualquier transferrina para producir las proteínas de fusión de la Tf modificada de la invención. Como ejemplo, la Tf humana natural (Tf) es una proteína de 679 aminoácidos, de aproximadamente 75 KDa (sin tener en cuenta la glicosilación), con dos dominios principales, N (aproximadamente 330 aminoácidos) y C (aproximadamente 340 aminoácidos), que parecen originarse a partir de la duplicación de un gen. Véase números de acceso de GenBank NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 y S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov/), así como las ID. SEC. Nº 1, 2 y 3. Los dos dominios han divergido en el tiempo pero retienen un elevado grado de identidad/similitud.
Cada uno de los dominios N y C se divide además en dos subdominios, N1 y N2, C1 y C2, La función de Tf es trasportar hierro a las células del cuerpo. Este proceso está mediado por el receptor de Tf (TfR), que se expresa en todas las células, de manera particularmente en las células en crecimiento activo. TfR reconoce la forma unida al hierro de Tf (se unen dos moléculas de cada por receptor), a continuación se produce la endocitosis, de esta manera, el complejo TfR/Tf se trasporta al endosoma, en ese momento la disminución localizada del pH da como resultado la liberación del hierro unido y la recirculación del complejo TfR/Tf a la superficie celular y la liberación de Tf (conocida como apoTf en su forma no unida al hierro). La unión al receptor se produce a través del dominio C de Tf. Los dos sitios de glicosilación en el dominio C no parecen estar implicados en la unión al receptor, ya que la Tf no glicosilada unida al hierro se une al receptor.
Cada molécula de Tf puede trasportar dos iones hierro (Fe^{3+}). Estos se complejan en el espacio entre los subdominios N1 y N2, C1 y C2 dando como resultado un cambio conformacional en la molécula. Tf cruza la barrera hematoencefálica (BBB) mediante el receptor de Tf.
En la transferrina humana, los sitios de unión al hierro comprenden al menos los aminoácidos Asp 63 (Asp 82 de la ID. SEC. Nº 2 que incluye la secuencia señal de la Tf natural), Asp 392 (Asp 411 de la ID. SEC. Nº 2), Tyr 95 (Tyr 114 de la ID. SEC. Nº 2), Tyr 426 (Tyr 445 de la ID. SEC. Nº 2), Tyr 188 (Tyr 207 de la ID. SEC. Nº 2), Tyr 514 o 517 (Tyr 533 o Tyr 536 de la SEC DE ID Nº:2), His 249 (His 268 de la ID. SEC. Nº 2), e His 585 (His 604 de la ID. SEC. Nº 2) de la ID. SEC. Nº 3. Las regiones bisagra comprenden al menos los residuos de aminoácidos 94-96, 245-247 y/o 316-318 del dominio N así como los residuos de aminoácidos 425-427, 581-582 y/o 652-658 del dominio C de la ID. SEC. Nº 3. Los sitios de unión al carbonato comprenden al menos los aminoácidos Thr 120 (Thr 139 de la ID. SEC. Nº 2), Thr 452 (Thr 471 de la ID. SEC. Nº 2), Arg 124 (Arg 143 de la ID. SEC. Nº 2), Arg 456 (Arg 475 de la ID. SEC. Nº 2), Ala 126 (Ala 145 de la ID. SEC. Nº 2), Ala 458 (Ala 477 de la ID. SEC. Nº 2), Gly 127 (Gly 146 de la ID. SEC. Nº 2) y Gly 459 (Gly 478 de la ID. SEC. Nº 2) de la ID. SEC. Nº 3.
En una forma de realización de la invención, la proteína de fusión de la transferrina modificada incluye una transferrina humana modificada, aunque se puede usar cualquier molécula de Tf animal para producir las proteínas de fusión de la invención, incluidas las variantes de la Tf humana, de vaca, cerdo, oveja, perro, conejo, rata, ratón, hámster, echnida, platypus, pollo, rana, gusano del tabaco, mono, así como otras especies de bovinos, caninos y aves. Todas estas secuencias de la Tf están fácilmente disponibles en el GenBank y otras bases de datos públicas. Las secuencia de nucleótidos de la Tf humana está disponible (véase ID. SEC. Nº 1, 2 y 3 y los números de acceso descritos anteriormente y disponibles en www.ncbi.nlm.nih.gov) y puede usarse para llevar a cabo fusiones genéticas entre Tf o un dominio de Tf y la molécula terapéutica de elección. También pueden llevarse a cabo también fusiones a partir de moléculas relacionadas tales como lacto transferrina (lactoferrina) Nº de acceso de GenBank: NM_002343) o melanotransferrina (Nº de acceso de GenBank NM_013900, melanotransferrina de murino).
La melanotransferrina es una proteína glicosilada que se encuentra en grandes cantidades en las células de melanoma maligno y que se denominó originalmente antígeno p97 de melanoma humano (Brown y col., 1982, Nature, 296: 171-173). Posee una elevada homología de secuencia con la transferrina sérica humana, la lactoferrina humana y la transferrina de pollo (Brown y col., 1982, Nature, 296: 171-173; Rose y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83: 1261-1265). Sin embargo, a diferencia de estos receptores, no se ha identificado ningún receptor celular para la melanotransferrina. La melanotransferrina se une de manera reversible al hierro y existe en dos formas, una de las cuales se une a las membranas celulares mediante un anclaje de glicosil fosfatidilinositol mientras que la otra forma es soluble y se secreta activamente (Baker y col., 1992, FEBS Lett, 298: 215-218; Alemany y col., 1993, J. Cell Sci., 104: 1155-1162; Food y col., 1994, J. Biol. Chem. 274: 7011-7017).
La lactoferrina (Lf), una proteína de defensa natural de unión al hierro, se ha encontrado que posee actividad antibacteriana, antimicótica, antivírica, antineoplásica y antiinflamatoria. La proteína está presente en secreciones exocrinas que están expuestas comúnmente a la flora normal: leche, lágrimas, exudado nasal, saliva, moco bronquial, fluidos gastrointestinales, moco cervicovaginal y fluido seminal. Además, Lf es un constituyente principal de los gránulos secundarios específicos de los neutrófilos polimorfonucleares (PMN) circulantes. La apoproteína se libera en la desgranulación de los PMN en áreas sépticas. Una función principal de la Lf es secuestrar el hierro libre en fluidos y zonas inflamadas de tal manera que suprime el daño mediado por radicales libres y disminuye la disponibilidad del metal para invadir las células microbianas y neoplásicas. En un estudio que examinó la velocidad de recambio de Lf marcada con ^{125}I en adultos, se demostró que Lf era captada rápidamente por el hígado y el bazo, y la radioactividad persistió durante varias semanas en el hígado y el bazo (Bennett y col. (1979), Clin. Sci. (Lond.) 57: 453-460).
En una forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina de la invención incluye una variante de corte y empalme de la transferrina. En un ejemplo, una variante de corte y empalme de la transferrina puede ser una variante de corte y empalme de la transferrina humana. En una forma de realización específica, la variante de corte y empalme de la transferrina humana puede ser la del Nº de acceso de Genbank AAA61140.
En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina de la invención incluye una variante de corte y empalme de la lactoferrina. En un ejemplo, una variante de corte y empalme de la lactoferrina sérica humana puede ser una novedosa variante de corte y empalme de una lactoferrina de los neutrófilos. En una forma de realización específica, la variante de corte y empalme de la lactoferrina de neutrófilos puede ser la del Nº de acceso de Genbank AAA59479. En otra forma realización específica, la variante de corte y empalme de la lactoferrina de neutrófilos puede comprender la siguiente secuencia de aminoácidos EDCIALKGEADA (ID. SEC. Nº 8), que incluye la novedosa región de variante de corte y empalme.
En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina de la invención incluye una variante de la melanotransferrina.
Pueden realizarse fusiones de la Tf modificada con dominios N o C de cualquier proteína, fragmento, dominio, o dominio construido mediante ingeniería genética de la Tf. Por ejemplo, pueden producirse proteínas de fusión usando la secuencia de la Tf de longitud completa, con o sin la secuencia señal de la Tf natural. También pueden prepararse las proteínas de fusión de la Tf usando un dominio de Tf único por duplicado, tal como un dominio N o C individual. En algunas formas de realización, el uso de un dominio N doble es ventajoso ya que los sitios de glicosilación de Tf residen en el dominio C y el dominio N, por sí mismo, no se une al hierro ni al receptor de Tf. En otras formas de realización, pueden producirse fusiones de una proteína terapéutica a un dominio C doble, en el que el dominio C se modifica para inhibir o evitar la glicosilación y la unión del receptor de Tf.
En una forma de realización de preferencia, el dominio o lóbulo C está modificado de tal manera que no esté glicosilado y no se una al hierro mediante la sustitución de las regiones o aminoácidos relevantes del dominio C por las presentes en las correspondientes regiones o sitios de un dominio N nativo o natural.
El análisis de dos dominios mediante la superposición de la estructura tridimensional de los dos dominios (Swiss PDB Viewer 3.7b2, Iterative Magic Fit) y mediante la alineación directa de los aminoácidos (alineación múltiple ClustalW) revela que los dos dominios han divergido con el tiempo. La alineación de los aminoácidos muestra una identidad del 42% y una similitud del 59% entre los dos dominios. Sin embargo, aproximadamente el 80% del dominio N tiene una equivalencia estructural correspondiente con la del dominio C. El dominio C tiene también algunos enlaces disulfuro adicionales en comparación con el dominio N.
La alineación de los modelos moleculares de los dominios N y C revela los siguientes equivalentes estructurales:
1 
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Los enlaces disulfuro de las dos regiones se alinean como sigue:
2
En una forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye al menos dos lóbulos N terminales de la transferrina. En otras formas de realización, la porción de la transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye al menos dos lóbulos N terminales de la transferrina derivados de la transferrina sérica humana.
En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye, comprende, o está constituida por al menos dos lóbulos N terminales de transferrina que tienen una mutación en al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo constituido por Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188 e His249 de la ID. SEC. Nº 3.
En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de transferrina modificada incluye un lóbulo N terminal de la transferrina sérica humana recombinante que tiene una mutación en Lys206 o His207 de la ID. SEC. Nº 3.
En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye, comprende o está constituida por dos lóbulos C terminales de transferrina modificados para inhibir o evitar la glicosilación y la unión al receptor de Tf. En otras formas de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye al menos dos de tales lóbulos C terminales de transferrina derivados de la transferrina sérica humana.
En otra forma de realización, el lóbulo C terminal mutante incluye además una mutación de al menos uno de Asn413 y Asn611 de la ID. SEC. Nº 3, a un aminoácido que no permite la glicosilación.
En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye al menos dos lóbulos C terminales de transferrina que tienen una mutación en al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo constituido por Asp392, Tyr426, Tyr514, Tyr517 e His585 de la ID. SEC. Nº 3, en la que el mutante retiene la capacidad de unirse a iones metálicos. En una forma de realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye al menos dos lóbulos C terminales de transferrina que tienen una mutación en al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo constituido por Tyr426, Tyr514, Tyr517 e His585 de la ID. SEC. Nº 3, en la que el mutante tiene una capacidad reducida de unirse a iones metálicos. En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye al menos dos lóbulos C terminales de transferrina que tienen una mutación en al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo constituido por Asp392, Tyr426, Tyr517 e His585 de la ID. SEC. Nº 3, en la que el mutante no retiene la capacidad de unirse a iones metálicos y funciona de manera sustancialmente similar a un dominio N.
En algunas formas de realización, la Tf o la porción de Tf tendrán longitud suficiente para aumentar la semivida en circulación in vivo, la estabilidad en disolución in vitro, la estabilidad en suero o la biodisponibilidad de la proteína terapéutica en comparación con la semivida en circulación in vivo, la estabilidad en disolución in vitro, la estabilidad in vitro, la estabilidad en suero, o la biodisponibilidad de proteína terapéutica en un estado no fusionado. Tal aumento de la semivida en circulación in vivo, la estabilidad en disolución in vitro, la estabilidad en suero o la biodisponibilidad puede ser de aproximadamente un 30%, 50%, 70%, 80%, 90% o mayor aumento respecto de la proteína terapéutica no fusionada. En algunos casos, las proteínas de fusión de la transferrina modificada presentan una semivida en suero de aproximadamente 10-20 o más días, aproximadamente 12-18 días o aproximadamente 14-17 días.
Cuando el dominio C de Tf es parte de la proteína de fusión, los dos sitios de glicosilación unidos a N, residuos de aminoácidos que corresponden a N413 y N611 de la ID. SEC. Nº 3, pueden mutarse para expresión en un sistema de levaduras para evitar la glicosilación o hipermanosilación y prolongar la semivida en circulación in vivo de la proteína de fusión y/o de la proteína terapéutica (para producir asialo-, o en algunos ejemplos monosialo-Tf o disialo-Tf). Además de los aminoácidos de Tf que corresponden a N413 y N611, las mutaciones pueden ser residuos adyacentes dentro del sitio de glicosilación N-X-S/T para evitar o reducir sustancialmente la glicosilación. Véase Patente de EEUU Nº 5.986.067 de Funk y col. Se ha informado también de que el dominio N de la Tf expresada en Pichia pastoris pasa a estar glicosilado unido a O con una única hexosa en S32 que se puede mutar o modificar también para evitar dicha glicosilación. Es más, se puede reducir o eliminar la glicosilación unida a O en una célula huésped de levadura con mutaciones en los genes PMT.
Por consiguiente, en una forma de realización de la invención, la proteína de fusión de la transferrina incluye una molécula de transferrina modificada en la que la transferrina presenta glicosilación reducida, incluyendo pero estar limitado a formas asialo, monosialo y disialo de Tf. En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que está mutado para evitar la glicosilación. En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina sérica recombinante humana que está mutado para evitar la glicosilación, en el que al menos uno de Asn413 y Asn611 de la ID. SEC. Nº 3 están mutados a un aminoácido que no permite la glicosilación. En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina sérica humana recombinante que está mutado para evitar o reducir sustancialmente la glicosilación, en el que las mutaciones pueden ser en los residuos adyacentes dentro del sitio de glicosilación N-X-S/T. Además, se puede reducir o evitar la glicosilación mutando el residuo de serina o treonina. Además, se sabe que el cambio de X por prolina inhibe la glicosilación.
Tal como se analiza a continuación con más detalle, también se construyen mediante ingeniería genética las proteínas de fusión de la Tf modificada que comprenden un dominio C de la invención para inhibir o evitar la unión al hierro y/o al receptor de Tf, o para presentar propiedades de unión al hierro de una transferrina nativa o de tipo natural como se muestra en ID. SEC. Nº 2 ó 3. El dominio N solo no se unirá al TfR cuando se cargue con el hierro, y el dominio C unido al hierro se unirá al TfR pero no con la misma afinidad que la molécula completa.
En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante no retiene la capacidad de unirse a iones metálicos. En una forma de realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una avidez de unión más débil por los iones metálicos que la de la transferrina sérica natural. En una forma de realización alternativa, la porción de transferrina da la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una avidez de unión más fuerte por los iones metálicos que la de la transferrina sérica natural.
En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante no retiene la capacidad de unirse al receptor de la transferrina. En una forma de realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una avidez de unión más débil por el receptor de la transferrina que la de la transferrina sérica natural. En una forma de realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una avidez de unión más fuerte por el receptor de la transferrina que la de la transferrina sérica natural.
En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante no retiene la capacidad de unirse a iones carbonato. En una forma de realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una avidez de unión más débil por los iones carbonato que la de la transferrina sérica natural. En una forma de realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una avidez de unión más fuerte por los iones carbonato que la de la transferrina sérica natural.
En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina sérica recombinante humana que tiene una mutación en al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo constituido por Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, His249, Asp392, Tyr426, Tyr514, Tyr517 y His585 de la ID. SEC. Nº 3, en la que el mutante retiene la capacidad de unirse a iones metálicos. En una forma de realización alternativa, un mutante de transferrina sérica humana recombinante que tiene una mutación en al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo constituido por Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, His249, Asp392, Tyr426, Tyr514, Tyr517 y His585 de la ID. SEC. Nº 3, en la que el mutante tiene una capacidad reducida de unirse a iones metálicos. En otra forma de realización, un mutante de transferrina sérica humana recombinante que tiene una mutación en al menos un residuo de aminoácido seleccionados entre el grupo constituido por Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, His249, Asp392, Tyr426, Tyr517 y His585 de la ID. SEC. Nº 3, en la que el mutante no retiene la capacidad de unirse a iones metálicos.
En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina sérica recombinante humana que tiene una mutación en Lys206 o His207 de la ID. SEC. Nº 3, en la que el mutante tiene una mayor avidez de unión para los iones metálicos que la transferrina sérica humana de tipo natural (véase Patente de EEUU Nº 5.986.067, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad). En una forma de realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina sérica recombinante humana que tiene una mutación en Lys206 o His207 de la ID. SEC. Nº 3, en la que el mutante tiene una avidez de unión más débil para los iones metálicos que la transferrina sérica humana de tipo natural. En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina sérica recombinante humana que tiene una mutación en Lys206 o His207 de la ID. SEC. Nº 3, en la que el mutante no se une a iones metálicos.
Puede usarse cualquier técnica disponible para preparar las proteínas de fusión de la invención, incluidas, pero sin limitarse a las técnicas moleculares comúnmente disponibles, por ejemplo, las dadas a conocer en Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Cuando se llevan a cabo sustituciones de nucleótidos usando técnicas para realizar mutagénesis específica del sitio que se conocen bien en la técnica, los cambios en los aminoácidos modificados son preferiblemente de naturaleza menor, es decir, sustituciones conservadoras de aminoácidos, aunque se contemplan también otras sustituciones no conservadoras, particularmente cuando producen una porción de transferrina modificada de una proteína de fusión de la Tf, por ejemplo, una proteína de fusión de la Tf modificada que presenta glicosilación reducida, unión al hierro reducida y similares. Se contemplan específicamente sustituciones de aminoácidos, pequeñas deleciones o inserciones, normalmente de uno hasta aproximadamente 30 aminoácidos, inserciones entre los dominios de la transferrina; pequeñas extensiones amino o carboxilo terminales, tales como un residuo de metionina amino terminal, o pequeños péptidos conectores de menos de 50, 40, 30, 20 ó 10 residuos entre los dominios de la transferrina o en la unión de una proteína transferrina y una proteína o péptido terapéutico; o una pequeña extensión que facilita la purificación, tal como un tramo de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.
Los ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos son sustituciones realizadas dentro del mismo grupo tales como dentro del grupo de aminoácidos básicos (tales como arginina, lisina, histidina), aminoácidos ácidos (tales como ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (tales como glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (tales como leucina, isoleucina, valina), aminoácidos aromáticos (tales como fenilalanina, triptófano, tirosina) y aminoácidos pequeños (tales como glicina, alanina, serina, treonina, metionina).
Las sustituciones no conservadoras abarcan las sustituciones de aminoácidos en un grupo por aminoácidos de otro grupo. Por ejemplo, una sustitución no conservadora incluiría la sustitución de un aminoácido hidrófobo por un aminoácido polar. Para una descripción general de la sustitución de nucleótidos, véase, por ejemplo, Ford y col. (1991), Prot. Exp. Pur. 2: 95-107. Las sustituciones, deleciones e inserciones no conservadoras son particularmente útiles para producir las proteínas de fusión de Tf de la invención que no presentan o presentan reducida unión del hierro y/o que no presentan o presentan reducida unión de la proteína de fusión al receptor de Tf.
En el polipéptido y las proteínas de la invención, se sigue el siguiente sistema para designar los aminoácidos según la siguiente lista convencional.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA DE AMINOÁCIDOS
3
Puede reducirse o interrumpirse la unión al hierro y/o la unión al receptor mediante mutación, que incluye deleción, sustitución o inserción en, los residuos de aminoácidos que corresponden a uno o más de los residuos Asp63, Tyr95, Tyr188, His249 del dominio N de Tf y/o los residuos Asp 392, Tyr 426, Tyr 514 y/o His 585 del dominio C de la SEC DE ID Nº: 3. También puede verse afectada la unión al hierro mediante mutación en los aminoácidos Lys206, His207 o Arg632 de la SEC DE ID Nº: 3. Puede reducirse o interrumpirse la unión al carbonato mediante mutación, que incluye deleción, sustitución o inserción en, los residuos de aminoácidos que corresponden a uno o más de los residuos Thr120, Arg124, Ala126, Gly127 del dominio N de Tf y/o los residuos Thr452, Arg456, Ala458 y/o Gly459 del dominio C de la ID. SEC. Nº 3. Una reducción o interrupción de la unión al carbonato puede afectar adversamente la unión al hierro y/o al receptor.
La unión al receptor de Tf puede reducirse o interrumpirse mediante mutación, que incluye deleción, sustitución o inserción en, los residuos de aminoácidos que corresponden a uno o más de los residuos del dominio N de Tf descritos anteriormente para la unión al hierro.
Tal como se analizó anteriormente, puede reducirse o evitarse la glicosilación mediante mutación, que incluye deleción, sustitución o inserción en, los residuos de aminoácidos que corresponden a uno o más de los residuos del dominio C de Tf alrededor de los sitios N-X-S/T que corresponden a los residuos N413 y/o N611 del dominio C (Véase Patente de EEUU Nº 5.986.067). Por ejemplo, puede realizarse la mutación de N413 y/o N611 en residuos de Glu.
En ejemplos en los que las proteínas de fusión de Tf de la invención no están modificadas para evitar la unión al hierro y/o la unión al carbonato, los iones de hierro y/o carbonato pueden estar eliminados o escindidos de la proteína de fusión.
Pueden realizarse mutaciones adicionales con la Tf para alterar la estructura tridimensional de la Tf, tales como modificaciones en la región bisagra para evitar el cambio conformacional necesario para la unión al hierro y el reconocimiento del receptor de Tf. Por ejemplo, pueden realizarse mutaciones en o alrededor de los residuos de los aminoácidos 94-96, 245-247 y/o 316-318 del dominio N así como los residuos de los aminoácidos 425-427, 581-582 y/o 652-658 del dominio C. Además, pueden realizarse mutaciones en o alrededor de las regiones que flanquean estos sitios para alterar la estructura y la función de la Tf.
En un aspecto de la invención, la proteína de fusión de la transferrina puede funcionar como una proteína vehículo para prolongar la semivida o la biodisponibilidad de la proteína terapéutica.
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Proteínas de fusión de la transferrina modificada
Las proteínas de fusión de la invención pueden contener una o más copias de la proteína o polipéptido terapéutico unido al extremo N terminal y/o al extremo C terminal del resto Tf. En algunas formas de realización, la proteína o el polipéptido terapéutico se unen a los extremos N y C terminales del resto de Tf y la proteína de fusión puede contener uno o más equivalentes de la proteína o polipéptido terapéutico en cualquiera de ambos extremos de Tf. En otras formas de realización, la proteína o el polipéptido terapéutico se inserta en dominios conocidos de la proteína Tf, por ejemplo, en uno o más de los bucles de Tf (véase Ali y col. (1999) J. Biol. Chem. 274(34): 24066-24073). En otras formas de realización, la proteína terapéutica o el péptido terapéutico se insertan entre los dominios N y C de Tf.
Generalmente, la proteína de fusión de la transferrina de la invención puede tener una región derivada de la transferrina modificada y una región derivada de la proteína terapéutica. Pueden usarse, sin embargo, múltiples dominios de cada proteína para preparar una proteína de fusión de la transferrina de la invención. De manera similar, puede usarse más de una proteína terapéutica para preparar una proteína de fusión de la transferrina de la invención produciendo de esta manera una proteína de fusión de la Tf modificada multifuncional.
La presente invención proporciona una proteína de fusión de la transferrina que contiene una proteína o polipéptido o porción terapéutica del mismo fusionada a una molécula de transferrina o porción de la misma. En una forma de realización, la proteína de fusión de la invención contiene una proteína o polipéptido terapéutico fusionado al extremo N terminal de una molécula de transferrina. En una forma de realización alternativa, la proteína de fusión de la transferrina de la invención contiene una proteína terapéutica fusionada al extremo C terminal de una molécula de transferrina. La presente invención también proporciona una proteína de fusión de la transferrina que contiene una proteína o polipéptido o porción terapéutica del mismo fusionada a una molécula de transferrina modificada o porción de la misma.
En otras formas de realización, la proteína de fusión de la transferrina de la invención contiene una proteína terapéutica fusionada al extremo N terminal y al extremo C terminal de la transferrina modificada. En otra forma de realización, las proteínas terapéuticas fusionadas a los extremos N y C terminales son las mismas proteínas terapéuticas. En una forma de realización alternativa, las proteínas terapéuticas fusionadas a los extremos N y C terminales son proteínas terapéuticas diferentes. En otra forma de realización alternativa, las proteínas terapéuticas fusionadas a los extremos N y C terminales son proteínas terapéuticas diferentes que pueden usarse para tratar o prevenir la misma enfermedad, trastorno, o afección. En otra forma de realización, las proteínas terapéuticas fusionadas a los extremos N y C terminales son proteínas terapéuticas diferentes que pueden usarse para tratar o prevenir enfermedades o trastornos que se sabe en la técnica que se producen comúnmente en pacientes de manera simultánea.
Además, la proteína de fusión de la transferrina de la invención puede también producirse insertando la proteína o el péptido terapéutico de interés (por ejemplo, una proteína o péptido terapéutico como se da a conocer en el presente documento, o, por ejemplo, un anticuerpo de cadena única que se une a una proteína terapéutica o a un fragmento o variante de la misma) en una región interna de la transferrina modificada. Las regiones internas de la transferrina modificada incluyen, pero no se limitan a, los sitios de unión al hierro, las regiones bisagra, los sitios de unión al bicarbonato, o el dominio de unión al receptor. También hay una prolina cerca del extremo N terminal. En un aspecto de la invención, las prolinas en los extremos N y C terminales pueden cambiarse. En otro aspecto de la invención, el enlace disulfuro del extremo C terminal puede eliminarse para liberar el extremo C terminal.
Dentro de la secuencia de la proteína de la molécula de la transferrina modificada, existen numerosos bucles o vueltas, que se estabilizan mediante enlaces disulfuro. Estos bucles son útiles para la inserción, o la fusión interna, de péptidos terapéuticamente activos, particularmente los que requieren una estructura secundaria para ser funcionales, o proteínas terapéuticas para generar una molécula de transferrina modificada con actividad biológica específica.
Cuando se insertan las proteínas o péptidos terapéuticos en o se sustituye al menos un bucle de una molécula de Tf, pueden realizarse inserciones en el interior de cualquiera de las regiones bucle expuestas superficialmente, además de otras áreas de la Tf. Por ejemplo, pueden realizarse inserciones en el interior de los bucles que comprenden los aminoácidos 32-33, 74-75, 256-257, 279-280 y 288-289 de Tf (Ali y col,, supra). Según se ha descrito anteriormente, pueden realizarse también inserciones en el interior de otras regiones de Tf tales como los sitios para la unión del hierro y el bicarbonato, las regiones bisagra, y el dominio de unión al receptor según se describe con más detalle a continuación. Pueden usarse también los bucles en la secuencia de la proteína Tf que son adecuados para la modificación/sustitución para la inserción de proteínas o péptidos para el desarrollo de una biblioteca cribable de insertos de péptidos aleatorios. Puede usarse cualquier procedimiento para producir insertos de ácido nucleico para la generación de bibliotecas de péptidos, incluyendo los sistemas de presentación de fagos y bacterias disponibles, antes de la clonación en un dominio de Tf y/o la fusión con los extremos de Tf.
El extremo N terminal de Tf está libre y apunta hacia fuera del cuerpo de la molécula. Las fusiones de las proteínas o los péptidos en el extremo N terminal pueden ser por consiguiente una forma de realización de preferencia. Tales fusiones pueden incluir una región conectora, tal como, pero sin limitarse a una extensión de poliglicina, para separar la proteína o el péptido terapéutico de Tf. Debe prestarse atención a la unión entre la secuencia líder, la elección de la secuencia líder, y la estructura del ARNm mediante la manipulación/optimización del codón (sin bucles en los tallos principales para inhibir el progreso del ribosoma) aumentarán la secreción y pueden llevarse a cabo fácilmente usando técnicas convencionales de proteínas recombinantes.
El extremo C terminal de Tf parece estar más hundido y asegurado mediante un enlace disulfuro en 6 aminoácidos del extremo C terminal. En la Tf humana, el aminoácido C terminal es una prolina que, dependiendo de la manera en que está orientada, apuntará una fusión hacia afuera como hacia el interior del cuerpo de la molécula. Puede usarse un resto conector o separador en el extremo C terminal en algunas formas de realización de la invención. Existe también una prolina próxima al extremo N terminal. En un aspecto de la invención, puede cambiarse la prolina en los extremos N y/o C terminales. En otro aspecto de la invención, puede eliminarse el enlace disulfuro C terminal para liberar el extremo C terminal.
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Ácidos nucleicos
La presente invención también proporciona moléculas de ácidos nucleicos. Estas codifican una proteína de fusión de la Tf modificada que comprende una proteína transferrina o una porción de una proteína transferrina unida o ligada de manera covalente a una proteína terapéutica. Tal como se analiza con más detalle a continuación, puede usarse cualquier proteína terapéutica. La proteína de fusión puede comprender además una región conectora, por ejemplo, un conector con una longitud menor de aproximadamente 50, 40, 30, 20 ó 10 residuos de aminoácidos. El conector puede estar unido de manera covalente a y entre la proteína transferrina o porción de la misma y la proteína terapéutica. Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden estar purificadas o no.
Se proporcionan también las células huésped y vectores para la replicación de las moléculas de ácido nucleico y para expresar las proteínas de fusión codificadas. Puede usarse cualquier vector o célula huésped, tanto procariota como eucariota, pero pueden resultar de preferencia los sistemas de expresión eucariotas, en concreto, los sistemas de expresión de levaduras. Se conocen en la técnica muchos vectores y células huésped para tales objetivos. Está dentro del conocimiento del experto en la técnica la selección de un conjunto apropiado para la aplicación deseada.
Pueden clonarse las secuencias de ADN que codifican la transferrina, porciones de la transferrina y las proteínas terapéuticas de interés a partir de una diversidad de bibliotecas genómicas o de ADNc conocidas en la técnica. Las técnicas para aislar tales secuencias de ADN usando procedimientos basados en sondas son técnicas convencionales y muy conocidas por los expertos en la técnica. Las sondas para aislar tales secuencias de ADN pueden basarse en secuencias de ADN o proteínas publicadas (véase, por ejemplo, Baldwin, G.S. (1993) Comparison of Transferrin Sequences from Different Species. Comp. Biochem. Physiol. 106B/1: 203-218). Como alternativa, puede usarse el procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), dado a conocer por Mullis y col. (Patente de EEUU Nº 4.683.195) y Mullis (Patente de EEUU Nº 4.683.202). La elección de la biblioteca y la selección de las sondas para el aislamiento de tales secuencias de ADN están dentro del nivel de conocimiento de un experto en la técnica.
Según se conoce en la técnica, la "similitud" entre dos polinucleótidos o polipéptidos se determina comparando la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos y sus sustitutos de nucleótidos o de aminoácidos conservados de un polinucleótido o polipéptido con la secuencia de un segundo polinucleótido o polipéptido. Se conoce también en la técnica la "identidad", que significa el grado de relación de la secuencia entre dos secuencias de polipéptidos o dos polinucleótidos según se determina mediante la identidad de la secuencia entre dos cadenas de tales secuencias. Pueden calcularse fácilmente la identidad y la similitud (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991).
Aunque existen numerosos procedimientos para medir la identidad y la similitud entre dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos, los términos "identidad" y "similitud" son bien conocidos por los técnicos expertos (Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)). Los procedimientos comúnmente empleados para determinar la identidad o la similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a los que se dan a conocer en la Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (1988).
Los procedimientos de preferencia para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mayor correspondencia entre las dos secuencias probadas. Los procedimientos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas informáticos. Los procedimientos de programas informáticos de preferencia para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan al paquete del programa GCG (Devereux, y col., Nucl. Acid Res. 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, y col., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)). El grado de similitud o de identidad referidos a lo anterior se determina como el grado de identidad entre las dos secuencias, que a menudo indica una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. Puede determinarse el grado de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos por medio de un programa informático conocido en la técnica como GAP proporcionado en el paquete del programa GCG (Needleman and Wunsch (1970) J. of Mol. Biol. 48: 443-453). Con el objeto de determinar el grado de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos para la presente invención, se usa GAP con las siguientes configuraciones: penalización por creación de huecos de 5,0 y penalización por extensión de huecos de 0,3.
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Optimización del codón
La degeneración del código genético permite variaciones en la secuencia de nucleótidos de una proteína transferrina y/o la proteína terapéutica de interés, produciendo a la vez un polipéptido que tiene idéntica secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por la secuencia de ADN nativa. El procedimiento, conocido como "optimización del codón" (descrito en la Patente de EEUU Nº 5.547.871 que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad) proporciona un medio para diseñar tal secuencia de ADN alterada. El diseño de los genes de codón optimizado debería tener en cuenta una diversidad de factores, incluyendo la frecuencia de uso del codón en un organismo, las frecuencias semejantes más próximas, la estabilidad del ARN, el potencial de formación de la estructura secundaria, la ruta de síntesis y las manipulaciones futuras previstas del ADN de ese gen. En concreto, pueden usarse los procedimientos disponibles para alterar los codones que codifican una proteína de fusión dada con los más fácilmente reconocidos por la levadura cuando se usan sistemas de expresión de levaduras.
La degeneración del código genético permite codificar y traducir la misma secuencia de aminoácidos de muchas maneras diferentes. Por ejemplo, leucina, serina y arginina están codificadas cada una por seis codones diferentes, mientras que valina, prolina, treonina, alanina y glicina están codificadas cada una por cuatro codones diferentes. Sin embargo, la frecuencia de uso de tales codones sinónimos varía de genoma a genoma entre eucariotas y procariotas. Por ejemplo, los patrones de elección de codones sinónimos entre mamíferos son muy similares, mientras que organismos evolutivamente distantes tales como levaduras (tal como S. cerevisiae), bacterias (tal como E. coli) e insectos (tal como D. melanogaster) revelan un patrón claramente diferente de frecuencias de uso del codón genómico (Grantham, R, y col., Nucl. Acid Res., 8, 49-62 (1980); Grantham, R., y col., Nucl. Acid Res., 9, 43-74 (1981); Maroyama, T., y col., Nucl. Acid Res., 14, 151-197 (1986); Aota, S., y col., Nucl. Acid Res., 16, 315-402 (1988); Wada, K., y col., Nucl. Acid Res., 19 Supp., 1981-1985 (1991); Kurland, C. G., FEBS Lett., 285, 165-169 (1991)). Estas diferencias en los patrones de elección del codón parecen contribuir a los niveles de expresión global de los genes individuales modulando las velocidades de elongación de los péptidos (Kurland, C. G., FEBS Lett., 285, 165-169 (1991); Pedersen, S., EMBO J., 3, 2895-2898 (1984); Sorensen, M. A., J. Mol. Biol., 207, 365-377 (1989); Randall, L. L., y col., Eur. J. Biochem., 107, 375-379 (1980); Curran, J. F., and Yarus, M., J. Mol. Biol., 209, 65-77 (1989); Varenne, S., y col., J. Mol. Biol., 180, 549-576 (1984), Varenne, S., y col., J. Mol, Biol., 180, 549-576 (1984); Garel, J.-P., J. Theor. Biol., 43, 211-225 (1974); Ikemura, T., J. Mol. Biol., 146, 1-21 (1981); Ikemura, T., J. Mol. Biol., 151, 389-409 (1981)).
Las frecuencias de preferencia de uso del codón de un gen sintético deberían reflejar los usos del codón de los genes nucleares derivados del genoma exacto (o tan estrechamente relacionado como sea posible) de la célula/organismo que se prevé que se va a usar para la expresión de la proteína recombinante, particularmente de las especies de levaduras. Según se ha analizado anteriormente, en una forma de realización de preferencia de la secuencia de la Tf humana se optimiza el codón, antes o después de la modificación como se describe en el presente documento para la expresión de levadura como puede ser la(s) secuencia(s) del(os) nucleótido(s) de la proteína terapéutica.
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Vectores
Las unidades de expresión para uso en la presente invención comprenderán generalmente los siguientes elementos, unidos de manera operativa en una orientación 5' a 3': un promotor transcripcional, una secuencia señal secretora, una secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión de la Tf modificada que comprende la proteína transferrina o una porción de una proteína transferrina unida a una secuencia de ADN que codifica una proteína o péptido terapéutico de interés y un terminador transcripcional. Según se ha analizado anteriormente, puede usarse cualquier disposición de la proteína o péptido terapéutico fusionado a o en el interior de la porción de Tf en los vectores de la invención. La célula huésped seleccionada determinará la selección de los promotores adecuados, las secuencias señal y los terminadores y resultará evidente para un experto en la técnica y se analiza más específicamente a continuación.
Los vectores de levaduras adecuados para uso en la presente invención se describen en la Patente de EEUU Nº 6.291.212 e incluyen YRp7 (Struhl y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035-1039, 1978), YEp13 (Broach y col., Gene 8: 121-133, 1979), pJDB249 y pJDB219 (Beggs, Nature 275: 104-108, 1978), pPPC0005, pSeCHSA, pScNHSA, pC4 y sus derivados. Los vectores de plásmidos de levaduras útiles incluyen también pRS403-406, pRS413-416 y los vectores de Pichia disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EEUU. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos Integrantes de Levaduras (YIps) e incorporan los marcadores seleccionables de levaduras HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-41.6 son plásmidos Centrómeros de Levaduras (YCps).
Tales vectores incluirán generalmente un marcador seleccionable, que puede ser uno de cualquier número de genes que presente un fenotipo dominante para el cual exista un ensayo fenotípico que permita seleccionar los transformantes. Los marcadores seleccionables de preferencia son los que complementan la auxotrofia de la célula huésped, proporcionan resistencia a antibióticos o permiten a una célula utilizar fuentes específicas de carbono, e incluyen LEU2 (Broach y col. ibid.), URA3 (Botstein y col., Gene 8: 17, 1979), HIS3 (Struhl y col., ibid.) o POT1 (Kawasaki y Bell, documento EP 171.142). Otros marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen CAT, que confiere resistencia al cloranfenicol en células de levaduras. Los promotores de preferencia para uso en levaduras incluyen los promotores de los genes glicolíticos de las levaduras (Hitzeman y col., J Biol. Chem. 225: 12073-12080, 1980; Alber y Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434, 1982; Kawasaki, Patente de EEUU Nº 4.599.311) o los genes de la alcohol deshidrogenasa (Young y col., en Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender y col., (eds.), pág. 355, Plenum, N.Y., 1982; Ammerer, Meth. Enzymol. 101: 192-201, 1983) al respecto, los promotores particularmente de preferencia son el promotor TPI1 (Kawasaki, Patente de EEUU Nº 4.599.311) y el promotor ADH_{2-4}C [véase Patente de EEUU Nº 6.291.212] (Russell y col., Nature 304: 652-654, 1983). Las unidades de expresión pueden incluir también un terminador transcripcional. Un terminador transcripcional de preferencia es el terminador TPI1 (Alber and Kawasaki, ibid.) otros vectores de preferencia y componentes de preferencia tales como los promotores y terminadores de un sistema de expresión de levadura se dan a conocer en las Patentes Europeas EP 0258067, EP 0286424, EP0317254, EP 0387319, EP 0386222, EP 0424117, EP 0431880, y EP 1002095; Publicaciones de Patentes Europeas EP 0828759, EP 0764209, EP 0749478, y EP 0889949; publicación PCT WO 00/44772 y WO 94/04687; y las Patentes de EEUU Nº 5.739.007; 5.637.504; 5.302.697; 5.260.202; 5.667.986; 5.728.553; 5.783.423; 5.965.386; 6.150.133; 6.379.924; y 5.714.377.
Además de las levaduras, pueden expresarse las proteínas de fusión modificadas de la presente invención en hongos filamentosos, por ejemplo, cepas de los hongos Aspergillus. Los ejemplos de promotores útiles incluyen los derivados de los genes glicolíticos de Aspergillus nidulans, tales como el promotor adh3 (McKnight y col., EMBO J. 4: 2093-2099, 1985) y el promotor tpiA. Un ejemplo de un terminador adecuado es el terminador adh3 (McKnight y col., ibid.). Las unidades de expresión que utilizan tales componentes pueden clonarse en el interior de vectores que sean capaces de la inserción en el ADN cromosómico de Aspergillus, por ejemplo.
Los vectores de expresión en mamíferos para uso en la realización de la presente invención incluirán un promotor capaz de dirigir la transcripción de la proteína de fusión de la Tf modificada. Los promotores de preferencia incluyen promotores virales y promotores celulares, los promotores virales de preferencia incluyen el promotor tardío mayor de adenovirus 2 (Kaufman y Sharp, Mol. Cell. Biol. 2: 1304-13199, 1982) y el promotor de SV40 (Subramani y col., Mol. Cell. Biol. 1: 854-864, 1981). Los promotores celulares de preferencia incluyen el promotor de la metalotioneína 1 de ratón (Palmiter y col., Science 222: 809-814, 1983) y el promotor V_{kappa} de ratón [véase Patente de EEUU Nº 6.291.212] (Grant y col., Nucl. Acids Res. 15: 5496, 1987). Un promotor particularmente de preferencia es un promotor V_{H} de ratón [la Patente de EEUU Nº 6.291.212] (Loh y col, ibid). Tales vectores de expresión pueden contener también un conjunto de sitios de corte y empalme del ARN localizados en la dirección 3' (o secuencia abajo) del promotor y en la dirección 5' (o secuencia arriba) de la secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión de la transferrina. Los sitios de corte y empalme del ARN de preferencia pueden obtenerse de los genes de adenovirus y/o de inmunoglobulinas.
Contenida también en los vectores de expresión está una señal de poliadenilación localizada en la dirección 3' de la secuencia de codificación de interés. Las señales de poliadenilación incluyen las señales de poliadenilación temprana o tardía de SV40 (Kaufman y Sharp, ibid.), la señal de poliadenilación procedente de la región E1B de adenovirus 5 y el terminador del gen de la hormona de crecimiento humana (DeNoto y col., Nucl. Acid Res. 9: 3719-3730, 1981). Una señal de poliadenilación particularmente de preferencia es el terminador del gen V_{H} [véase Patente de EEUU Nº 6.291.212] (Loh y col, ibid.). Los vectores de expresión pueden incluir una secuencia líder vírica no codificadora, tal como la líder tripartita de adenovirus 2, localizada entre el promotor y los sitios de corte y empalme del ARN. Los vectores de preferencia pueden incluir también secuencias potenciadoras, tales como el potenciador de SV40 y el potenciador \mu de ratón [véase Patente de EEUU Nº 6.291.212] (Gillies, Cell 33: 717-728, 1983). Los vectores de expresión pueden incluir también secuencias que codifican los ARN de adenovirus VA.
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Transformación
Son bien conocidas en la bibliografía las técnicas para transformar hongos, y se han sido descritas, por ejemplo, por Beggs (ibid.), Hinnen y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933, 1978), Yelton y col., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1740-1747, 1984), y Russell (Nature 301: 167-169, 1983). Pueden usarse otras técnicas para introducir secuencias de ADN clonado en células fúngicas, tales como la electroporación (Becker and Guarente, Methods in Enzymol. 194: 182-187, 1991). El genotipo de la célula huésped contendrá generalmente un defecto genético que está complementado por el marcador seleccionable presente en el vector de expresión. La elección de un huésped y el marcador seleccionable particulares está dentro del nivel de conocimiento de un experto en la técnica.
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Pueden introducirse las secuencias de ADN clonado que comprenden las proteínas de fusión de la Tf modificada de la invención en células de mamífero cultivadas mediante, por ejemplo, transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler y col., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52: 456, 1973). Pueden usarse también otras técnicas para introducir secuencias de ADN clonado en células de mamíferos, tales como la electroporación (Neumann y col., EMBO J. 1: 841-845, 1982), o la lipofección. Con el fin de identificar las células que tienen integrado el ADN clonado, se introduce generalmente un marcador seleccionable en las células junto con el gen o el ADNc de interés. Los marcadores seleccionables de preferencia para uso en células de mamífero cultivadas incluyen los genes que confieren resistencia a fármacos, tales como neomicina, higromicina y metotrexato. El marcador seleccionable puede ser un marcador seleccionable amplificable. Un marcador seleccionable amplificable de preferencia es el gen DHFR. Un marcador amplificable particularmente de preferencia es el ADNc de DHFR^{r} [véase Patente de EEUU Nº 6.291.212] (Simonsen and Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495-2499, 1983). Thilly revisó los marcadores seleccionables (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass.) y la elección de los marcadores seleccionables está dentro del nivel de conocimiento de un experto
en la técnica.
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Células huésped
La presente invención incluye también una célula, de preferencia una célula de levadura transformada para expresar una proteína de fusión de la transferrina modificada de la invención. Además de las propias células huésped transformadas, la presente invención también incluye un cultivo de tales células, de preferencia un cultivo monoclonal (clonalmente homogéneo), o un cultivo derivado de un cultivo monoclonal, en un medio nutritivo. Si se secreta el polipéptido, el medio contendrá el polipéptido, con las células, o sin las células si se han separado por filtración o centrifugación.
Las células huésped para uso en la práctica de la presente invención incluyen células eucariotas, y en algunos casos células procariotas, capaces de transformarse o transfectarse con ADN exógeno y crecer en cultivo, tal como células de mamífero, insecto, hongo, planta y bacteria.
Las células fúngicas, incluyendo las especies de levaduras (por ejemplo, Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces spp., Pichia spp.) pueden usarse como células huésped dentro de la presente invención. Los ejemplos de hongos que incluyen levaduras como huéspedes contemplados como útiles en la práctica de la presente invención para expresar la proteína de fusión de la transferrina de las invenciones son Pichia (algunas especies de las cuales se clasificaban anteriormente como Hansenula), Saccharomyces, Kluyveromyces, Aspergillus, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Zygosaccharomyces, Debaromyces, Trichoderma, Cephalosporium, Humicola, Mucor, Neurospora, Yarrowia, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis, y similares. Los ejemplos de Saccharomyces spp. son S. cerevisiae, S. italicus y S. rouxii. Los ejemplos de Kluyveromyces spp. son K. fragilis, K. lactis y K. marxianus. Una especie de Torulaspora adecuada es T. delbrueckii. Los ejemplos de Pichia spp. son P. angusta (anteriormente H. polymorpha), P. anomala (anteriormente H. anomala) y P. pastoris.
Las células huésped particularmente útiles para producir las proteínas de fusión de la Tf de la invención son la Pichia pastoris metilotrófica (Steinlein y col. (1995) Protein Express. Purif. 6: 619-624). Se ha desarrollado Pichia pastoris para que sea un huésped destacado para la producción de proteínas extrañas puesto que su promotor de la alcohol oxidasa ha sido aislado y clonado; se informó por primera vez su transformación en 1985. P. pastoris puede utilizar el metanol como fuente de carbono en ausencia de glucosa. El sistema de expresión de P. pastoris puede usar el promotor de la alcohol oxidasa inducida por metanol (AOX1), que controla el gen que codifica la expresión de la alcohol oxidasa, la enzima que cataliza la primera etapa en el metabolismo del metanol. Este promotor se ha caracterizado e incorporado a una serie de vectores de expresión de P. pastoris. Debido a que las proteínas producidas en P. pastoris se pliegan normalmente de manera correcta y se secretan en el medio, la fermentación de P. pastoris construida mediante ingeniería genética proporciona una excelente alternativa a los sistemas de expresión en E. coli. Se han producido numerosas proteínas usando este sistema, incluyendo el fragmento de la toxina del tétanos, la pertactina de Bordetella pertussis, la albúmina del suero humano y la lisozima.
Las cepas de la levadura Saccharomyces cerevisiae son otro huésped de preferencia. En una forma de realización de preferencia, se usa una célula de levadura, o más específicamente, una célula huésped de Saccharomyces cerevisiae que contiene una deficiencia genética en un gen requerido para la glicosilación ligada a asparagina de las glicoproteínas. Pueden prepararse las células huésped de S. cerevisiae que tienen tales defectos usando técnicas convencionales de mutación y selección, aunque se han modificado muchas cepas de levadura disponibles para evitar o reducir la glicosilación o la hipermanosilación. Ballou y col. (J. Biol. Chem. 255: 5986-5991, 1980) han descrito el aislamiento de los mutantes de la biosíntesis de la mannoproteína que carecen de los genes que afectan a la glicosilación ligada a asparagina. Gentzsch y Tanner (Glycobiology 7: 481-486, 1997) han descrito una familia de al menos seis genes (PMT1-6) que codifican las enzimas responsables de la primera etapa en la O-glicosilación de las proteínas en levadura. Los mutantes que carecen de uno o más de estos genes muestran una reducida glicosilación ligada a O y/o una alteración en la especificidad de la O-glicosilación.
Para optimizar la producción de las proteínas heterólogas, se prefiere también que la cepa huésped trasporte una mutación, tal como la mutación pep4 en S. cerevisiae (Jones, Genetics 85: 23-33, 1977), que da como resultado una actividad proteolítica reducida. Las cepas huésped que contienen mutaciones en otras regiones que codifican proteasas son particularmente útiles para producir grandes cantidades de proteínas de fusión de la Tf de la invención.
Las células huésped que contienen construcciones de ADN de la presente invención se hacen crecer en un medio de crecimiento adecuado. Según se usa en el presente documento, el término "medio de crecimiento adecuado" significa un medio que contiene los nutrientes requeridos para el crecimiento de las células. Los nutrientes requeridos para el crecimiento celular pueden incluir una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, los aminoácidos esenciales, vitaminas, minerales y factores de crecimiento. El medio de crecimiento será generalmente selectivo para las células que contienen la construcción de ADN mediante, por ejemplo, selección mediante fármaco o deficiencia en un nutriente esencial que se complementará por el marcador seleccionable en la construcción de ADN o transfectarse simultáneamente con la construcción de ADN. Las células de levadura, por ejemplo, se hacen crecer de preferencia en un medio definido químicamente, que comprende una fuente de carbono, por ejemplo, sacarosa, una fuente de nitrógeno no de aminoácidos, sales inorgánicas, vitaminas y suplementos de aminoácidos esenciales. El pH del medio se mantiene de preferencia a un pH mayor de 2 y menor de 8, de preferencia a pH 5,5-6,5. Los procedimientos para mantener un pH estable incluyen controlar el tamponamiento y el pH constante. Los agentes tamponadores de preferencia incluyen citrato-fosfato o ácido succínico y Bis-Tris (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). Las células de levadura que tienen un defecto en un gen requerido para la glicosilación ligada a asparagina se hacen crecer de preferencia en un medio que contiene un estabilizante osmótico. Un estabilizante osmótico de preferencia es sorbitol suplementado en el medio a una concentración de entre 0,1 M y 1,5 M, de preferencia a 0,5 M ó 1,0 M.
Se hacen crecer las células de mamífero cultivadas en medios libres de suero o que contienen suero comercialmente disponible. La selección de un medio apropiado para la línea celular concreta usada está dentro del nivel de conocimiento de un experto en la técnica. Se dejaron crecer las células de mamífero transfectadas durante un periodo de tiempo, normalmente 1-2 días, hasta el comienzo de la expresión de la(s) secuencia(s) de ADN de interés. A continuación se aplicó la selección mediante fármaco para seleccionar el crecimiento de las células que expresaban el marcador seleccionable de una manera estable. Para las células que se han transfectado con un marcador seleccionable amplificable, se puede aumentar la concentración del fármaco por etapas para seleccionar el aumento del número de copias de las secuencias clonadas, aumentando por tanto los niveles de expresión.
También pueden usarse sistemas de expresión de baculovirus/células de insecto para producir las proteínas de fusión de Tf modificada de la invención. El Sistema de Expresión de Baculovirus BacPAK^{TM} (BD Biosciences (Clontech)) expresa las proteínas recombinantes en grandes cantidades en células huésped de insectos. Se insertó el gen diana en un vector de transferencia, que se transfectó simultáneamente en células huésped de insectos con el ADN viral de BacPAK6 linealizado. El ADN de BacPAK6 carece de una porción esencial del genoma de baculovirus. Cuando el ADN se recombina con el vector, se restaura el elemento esencial y el gen diana se transfiere al genoma de baculovirus. Tras la recombinación, se repican y purifican unas pocas placas víricas, y se verifica el fenotipo recombinante. A continuación se pueden amplificar los virus recombinantes aislados recientemente y usarse para infectar cultivos de células de insectos para producir grandes cantidades de la proteína deseada.
Pueden producirse también las proteínas de fusión de la Tf usando plantas y animales transgénicos. Por ejemplo, ovejas y cabras pueden fabricar la proteína terapéutica en su leche. O las plantas de tabaco pueden incluir la proteína en sus hojas. La producción de proteínas en plantas y animales transgénicos comprende añadir un nuevo gen que codifica la proteína de fusión en el genoma del organismo. No sólo puede el organismo transgénico producir una nueva proteína, sino que también puede pasar esta capacidad en su progenie.
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Secuencias señal secretoras
Las frases "secuencia señal secretora" o "secuencia señal" o "secuencia líder de secreción" se usan de manera intercambiable y se describen, por ejemplo, en la Patente de EEUU Nº 6.291.212 y la Patente de EEUU Nº 5.547.871, que se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad. Las secuencias señal secretoras o secuencias señal o secuencias líder de secreción codifican péptidos secretores. Un péptido secretor es una secuencia de aminoácidos que actúa para dirigir la secreción de un polipéptido o proteína madura procedente de una célula. Los péptidos secretores se caracterizan generalmente por un núcleo de aminoácidos hidrófobos y se encuentran normalmente (pero no exclusivamente) en los extremos amino terminales de las proteínas recientemente sintetizadas. Muy a menudo los péptidos secretores se escinden de la proteína madura durante la secreción. Los péptidos secretores pueden contener sitios de procesamiento que permiten escindir el péptido señal de la proteína madura a medida que ésta pasa a través de la ruta secretora. Los sitios de procesamiento pueden estar codificados en el interior del péptido señal o pueden añadirse al péptido señal mediante, por ejemplo, mutagénesis in vitro.
Pueden usarse péptidos secretores para dirigir la secreción de las proteínas de fusión de la Tf modificada de la invención. Uno de tales péptidos secretores que puede usarse en combinación con otros péptidos secretores es la secuencia líder del factor de apareamiento alfa. Se requieren secuencias señal secretoras o secuencias señal o secuencias líder de secreción para una serie compleja de etapas de procesamiento post-traduccionales que dan como resultado la secreción de una proteína. Si está presente una secuencia señal intacta, la proteína que se está expresando entra en la luz del retículo endoplásmico rugoso y a continuación se trasporta a través del aparato de Golgi hasta las vesículas secretoras y finalmente se trasporta fuera de la célula. Generalmente, la secuencia señal sigue inmediatamente al codón de inicio y codifica un péptido señal en el extremo amino terminal de la proteína que se va a secretar. En la mayor parte de los casos, la secuencia señal se escinde mediante una proteasa específica, denominada peptidasa señal. Las secuencias señal de preferencia mejoran el procesamiento y exportan la eficacia de la expresión de la proteína recombinante mediante vectores de expresión virales, de mamíferos o de levaduras. En algunos casos, puede usarse la secuencia señal de la Tf natural para expresar y secretar las proteínas de fusión de la invención.
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Conectores
El resto de Tf y el(los) resto(s) de la proteína terapéutica de las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención pueden fusionarse directamente o usando un péptido conector de diversas longitudes para proporcionar mayor separación física y permitir más movilidad espacial entre las proteínas fusionadas y de esta manera, maximizar la accesibilidad de la porción de proteína terapéutica, por ejemplo, para la unión de su receptor análogo. El péptido conector puede estar constituido por aminoácidos que sean flexibles o más rígidos. Por ejemplo, un conector tal como pero sin limitarse a una extensión de poliglicina. El conector puede ser menor de aproximadamente 50, 40, 30, 20 ó 10 residuos de aminoácidos. El conector puede unirse covalentemente a y entre la proteína transferrina o su porción y la proteína terapéutica.
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Detección de las proteínas de fusión de la Tf
Los ensayos para la detección de proteínas de fusión terapéuticas de la transferrina modificada biológicamente activas pueden incluir la transferencia Western, la transferencia de proteínas o el filtro de colonias así como ensayos basados en la actividad que detectan la proteína terapéutica fusionada. Puede prepararse un filtro de transferencia Western usando el procedimiento descrito por Towbin y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354, 1979). Brevemente, las muestras se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio.
Las proteínas en el gel se transfirieron electroforéticamente a papel de nitrocelulosa. Se pueden preparar filtros de transferencia de proteínas filtrando las muestras o concentrados de sobrenadante a través de filtros de nitrocelulosa usando, por ejemplo, un Minifold (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.). Pueden prepararse filtros de colonias haciendo crecer las colonias sobre un filtro de nitrocelulosa que se ha extendido a través de un medio de crecimiento apropiado.
En este procedimiento, se prefiere un medio sólido. Se dejan crecer las células sobre los filtros durante al menos 12 horas. Las células se retiran de los filtros lavándolos con un tampón apropiado que no elimina las proteínas unidas a los filtros. Un tampón de preferencia comprende Tris-base 25 mM, glicina 19 mM, pH 8,3, metanol al 20%.
Las proteínas de fusión de la invención pueden detectarse también evaluando la actividad del resto de proteína terapéutica. Tales ensayos están fácilmente disponibles incluyendo, pero sin limitarse a, los ensayos descritos en la Tabla 1. Específicamente, pueden evaluarse las proteínas de fusión de la invención para la actividad funcional (por ejemplo, la actividad biológica o la actividad terapéutica) usando el ensayo al que se hace referencia en la columna "Ensayo de Actividad de Ejemplo" de la Tabla 1. Además, un experto en la técnica puede evaluar de manera rutinaria los fragmentos de una proteína terapéutica que corresponde a una porción de la proteína terapéutica de una proteína de fusión de la invención, usando para la actividad los ensayos a los que se hace referencia en su correspondiente fila de la Tabla 1. Además, un experto en la técnica puede evaluar de manera rutinaria los fragmentos de una proteína de la transferrina modificada para la actividad usando los ensayos conocidos en la técnica.
Por ejemplo, en una forma de realización en la que se está evaluando la capacidad de una proteína de fusión de la transferrina de la invención para unirse o competir con una proteína terapéutica para la unión a un anticuerpo anti polipéptido terapéutico y/o el anticuerpo antitransferrina, pueden usarse diversos ensayos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, sistemas de ensayos competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como los radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorción unido a enzima), inmunoensayos de tipo sándwich, ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitación mediante difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (usando oro coloidal, marcas de enzimas o radioisótopos, por ejemplo), transferencias western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel), ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A, y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En una forma de realización, se detecta la unión con el anticuerpo detectando una marca en el anticuerpo primario. En otra forma de realización, se detecta el anticuerpo primario detectando la unión de un anticuerpo o reactivo secundario con el anticuerpo primario. En una forma de realización adicional, se marca el anticuerpo secundario. Se conocen muchos medios en la técnica para detectar la unión en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente invención.
En otra forma de realización, en la que se identificó un compañero de unión (por ejemplo, un receptor o un ligando) de una proteína terapéutica, puede evaluarse la unión a este compañero de unión mediante una proteína de fusión de la transferrina que contiene la proteína terapéutica como la porción de la proteína terapéutica de la fusión, por ejemplo, por medios bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, cromatografía en gel reductor y no reductor, cromatografía de afinidad de proteínas, y transferencia por afinidad. El técnico experto conocerá otros procedimientos y están dentro del alcance de la presente invención.
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Aislamiento y purificación de las proteínas de fusión de la transferrina modificada
Las proteínas de fusión de la transferrina modificada secretadas biológicamente activas pueden aislarse a partir del medio de crecimiento de las células huésped en condiciones que permitan la secreción de las proteínas de fusión biológicamente activas. El material celular se retira del medio de cultivo, y las proteínas de fusión biológicamente activas se aíslan usando las técnicas de aislamiento conocidas en la técnica. Las técnicas de aislamiento adecuadas incluyen la precipitación y el fraccionamiento mediante una diversidad de procedimientos cromatográficos, que incluyen la filtración en gel, la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de afinidad.
Un procedimiento de purificación particularmente de preferencia es la cromatografía de afinidad en una columna enlazante de hierro o quelante de metales o una cromatografía de inmunoafinidad usando un anticuerpo dirigido contra la transferrina o proteína terapéutica o la porción del péptido del polipéptido de fusión. El anticuerpo se inmoviliza o se une de preferencia a un soporte o sustrato sólido. Un sustrato particularmente de preferencia es Sepharose activada por CNBr (Pharmacia LKB Technologies, Inc., Piscataway, N.J.). Mediante este procedimiento, el medio se combina con el anticuerpo/sustrato en condiciones que permitan que se produzca la unión. Puede lavarse el complejo para eliminar el material no unido, y la proteína de fusión de la transferrina se libera o eluye mediante el uso de condiciones desfavorables para la formación del complejo. Los procedimientos de elución particularmente útiles incluyen cambios en el pH, en el que el anticuerpo inmovilizado tiene una elevada afinidad por el ligando a un primer pH y una afinidad reducida a un segundo pH (mayor o menor); cambios en la concentración de algunos agentes caótropos; o mediante el uso de detergentes.
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Proteínas de fusión de la transferrina modificada marcadas
Las proteínas de fusión de la transferrina de la presente invención también pueden marcarse con un radioisótopo u otro agente de formación de imagen y usarse con objetivos diagnósticos in vivo. Los agentes radioisótopos para formación de imágenes de preferencia incluyen yodo-125 y tecnecio-99, siendo particularmente de preferencia tecnecio-99. Se conocen bien en la técnica los procedimientos para producir conjugados de proteína-isótopo, y están descritos por, por ejemplo, Eckelman y col. (Patente de EEUU Nº 4.652.440), Parker y col. (documento WO 87/05030) y Wilber y col. (documento EP 203.764). Como alternativa, las proteínas de fusión de la transferrina pueden unirse a potenciadores de marca de espín y usarse para formación de imagen mediante resonancia magnética (RM). Los potenciadores de marca de espin adecuados incluyen compuestos de radicales libres, estables, estéricamente impedidos, tales como nitróxidos.
Los procedimientos para marcar ligandos para la formación de imágenes mediante RM se dan a conocer por, por ejemplo, Coffman y col. (Patente de EEUU Nº 4.656.026). Para la administración, las proteínas de fusión de la transferrina marcada se combinan con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como disolución salina estéril o agua estéril. La administración es de preferencia mediante inyección de bolo, de preferencia por vía intravenosa.
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Producción de proteínas de fusión
La presente invención proporciona además procedimientos para producir una proteína de fusión modificada de la invención usando las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento. En términos generales, la producción de una forma recombinante de una proteína implica normalmente las siguientes etapas.
Se obtiene en primer lugar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de la transferrina de la invención. A continuación la molécula de ácido nucleico se coloca de preferencia de manera operativa con las secuencias de control adecuadas, según se ha descrito anteriormente, para formar una unidad de expresión que contenga el marco de lectura abierto de la proteína, las unidades de expresión se usan para transformar un huésped adecuado y el huésped transformado se cultiva en condiciones que permitan la producción de la proteína
recombinante.
La proteína recombinante se aísla opcionalmente a partir del medio o a partir de las células; puede no ser necesaria la recuperación y la purificación de la proteína en algunos casos en los que se pueden tolerar algunas impurezas.
Puede llevarse a cabo cada una de las anteriores etapas en una diversidad de maneras. Por ejemplo, la construcción de vectores de expresión que son operativos en una variedad de huéspedes se lleva a cabo usando replicones y secuencias de control apropiados, como se mostró anteriormente. Las secuencias de control, los vectores de expresión y los procedimientos de transformación son dependientes del tipo de células huésped usado para expresar el gen y se han discutido en detalle anteriormente y son conocidos por los expertos en la técnica. Los sitios de restricción adecuados pueden, si no están normalmente disponibles, añadirse a los extremos de la secuencia de codificación de tal manera que proporcionen un gen escindible para insertar en estos vectores. Un técnico experto puede adaptar fácilmente cualquier sistema de huésped/expresión conocido en la técnica para uso con las moléculas de ácido nucleico de la invención para producir una proteína recombinante deseada.
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Según se analizó anteriormente, puede usarse cualquier sistema de expresión, incluyendo sistemas de levaduras, bacterias, animales, plantas eucariotas y procariotas. En algunas formas de realización, se prefieren los sistemas de levaduras, cultivo de células de mamíferos, y producción de animales o plantas transgénicos. En otras formas de realización, pueden usarse sistemas de levaduras que se han modificado para reducir la glicosilación, la hiperglicosilación o la actividad proteolítica de las levaduras naturales.
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Moléculas terapéuticas
Puede usarse cualquier molécula terapéutica como compañero de fusión de Tf según los procedimientos y las composiciones de la presente invención. Según se usa en el presente documento, una molécula terapéutica es normalmente una proteína o péptido capaz de ejercer un efecto biológico beneficioso in vitro o in vivo e incluye las proteínas o los péptidos que ejercen un efecto beneficioso en relación con la homeostasis normal, la fisiología o un estado de enfermedad. Las moléculas terapéuticas no incluyen los compañeros de fusión comúnmente usados como marcadores o auxiliares de la purificación de proteínas, tales como las galactosidasas bacterianas (véase por ejemplo, Patente de EEUU Nº 5.986.067 y Aldred y col. (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 122: 960-965). Por ejemplo, un efecto beneficioso que se relaciona con un estado de enfermedad incluye cualquier efecto que sea ventajoso para el sujeto tratado, incluyendo la prevención de la enfermedad, la estabilización de la enfermedad, la disminución o el alivio de los síntomas de la enfermedad o una modulación, alivio o cura del defecto subyacente que produce un efecto beneficioso en el sujeto tratado.
Una proteína de fusión de la transferrina modificada de la invención incluye al menos un fragmento o variante de una proteína terapéutica y al menos un fragmento o variante de la transferrina sérica modificada, que se asocian entre sí, de preferencia mediante fusión genética.
En una forma de realización, la proteína de fusión de la transferrina incluye una molécula de transferrina modificada unida a un agente neurofarmacéutico. En otra forma de realización, la proteína de fusión de la transferrina modificada incluye transferrina en el extremo carboxilo terminal unida a un agente neurofarmacéutico en el extremo amino terminal. En una forma de realización alternativa, la proteína de fusión de la transferrina modificada incluye transferrina en el extremo amino terminal unida a un agente neurofarmacéutico en el extremo carboxilo terminal. En formas de realización específicas el agente neurofarmacéutico es tanto el factor de crecimiento nervioso como el factor neurotrófico ciliar.
En otras formas de realización, una proteína de fusión de la transferrina modificada de la invención puede contener al menos un fragmento o variante de una proteína terapéutica, y/o al menos un fragmento o variante de un anticuerpo. En una forma de realización adicional, las proteínas de fusión de la transferrina pueden contener fragmentos de péptidos o variantes de péptidos de proteínas o anticuerpos en los que la variante o fragmento retiene al menos una actividad biológica o terapéutica. Las proteínas de fusión de la transferrina pueden contener proteínas terapéuticas que pueden ser fragmentos de péptido o variantes de péptidos de al menos aproximadamente 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, o al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 55, al menos aproximadamente 60, o al menos aproximadamente 70 o más aminoácidos de longitud fusionados a los extremos N y/o C terminales, insertados en el interior, o insertados en un bucle de una transferrina modificada.
En otra forma de realización, las moléculas de fusión de la transferrina modificada contienen una porción de proteína terapéutica que pueden ser fragmentos de una proteína terapéutica que incluyen la proteína de longitud completa así como los polipéptidos que tienen uno o más restos delecionados del extremo amino terminal de la secuencia de aminoácidos.
En otra forma de realización, las moléculas de fusión de la transferrina modificada contienen una porción de proteína terapéutica que puede ser fragmentos de una proteína terapéutica que incluyen la proteína de longitud total así como polipéptidos que tienen uno o más restos delecionados del extremo amino terminal de la secuencia de aminoácidos.
En otra forma de realización, las moléculas de fusión de la transferrina modificada contienen una porción de proteína terapéutica que puede tener uno o más aminoácidos delecionados de los términos amino y carboxilo.
En otra forma de realización, las moléculas de fusión de la transferrina modificada contienen una porción de proteína terapéutica que es al menos aproximadamente un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la proteína terapéutica de referencia que se muestra en el presente documento, o sus fragmentos. En formas de realización adicionales, las moléculas de fusión de la transferrina contienen una porción de proteína terapéutica que es al menos aproximadamente un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a los polipéptidos de referencia que tienen la secuencia de aminoácidos de las deleciones de los extremos N y C terminales según se describió anteriormente.
En otra forma de realización, las moléculas de la transferrina modificada contienen la porción de la proteína terapéutica que es al menos aproximadamente un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100%, idéntica a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos nativa o natural de una proteína terapéutica. Se proporcionan también fragmentos de estos polipéptidos.
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Las proteínas terapéuticas que corresponden a una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de la transferrina modificada de la invención, tal como proteínas superficiales celulares y secretoras, pueden modificarse mediante la unión de uno o más grupos de oligosacáridos. La modificación denominada como glicosilación puede afectar significativamente las propiedades físicas de las proteínas y puede ser importante en la estabilidad, secreción y localización de la proteína. La glicosilación se produce en localizaciones específicas a lo largo de la estructura central del polipéptido. Existen normalmente dos tipos principales de glicosilación: la glicosilación caracterizada por oligosacáridos unidos a O, que se unen a residuos de serina o treonina; y la glicosilación caracterizada por oligosacáridos unidos a N, que se unen a residuos de asparagina en una secuencia Asn-X-Ser/Thr, en la que X puede ser un aminoácido excepto prolina. Variables tales como la estructura de la proteína y el tipo celular influyen en el número y la naturaleza de las unidades de carbohidrato en el interior de las cadenas en diferentes sitios de glicosilación. Son comunes también las glicosilaciones de los isómeros en el mismo sitio dentro de un tipo de célula dado. Por ejemplo, varios tipos de interferón humano están glicosilados.
Pueden modificarse las proteínas terapéuticas que corresponden a una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de la transferrina de la invención, así como sus análogos y variantes, de tal manera que se altere la glicosilación en uno o más sitios como resultado de la(s) manipulación(es) de su secuencia de ácido nucleico por la célula huésped en la que se expresan, o debido a otras condiciones de su expresión. Por ejemplo, puede producirse la glicosilación de los isómeros eliminando o introduciendo los sitios de glicosilación, por ejemplo, mediante sustitución o deleción de residuos de aminoácidos, tales como la sustitución de glutamina por asparagina, o pueden producirse proteínas recombinantes no glicosiladas expresando las proteínas en células huésped que no las glicosilarán, por ejemplo, en levaduras deficientes en glicosilación. Estos enfoques son conocidos en la técnica.
Se conocen bien en la técnica las proteínas terapéuticas y su ácido nucleico y están disponibles en bases de datos públicas tales como las Chemical Abstracts Services Databases (por ejemplo, el Registro CAS), GenBank, y GenSeq.
En otras formas de realización, las proteínas de fusión de la transferrina de la invención son capaces de una actividad terapéutica y/o actividad biológica, que corresponde a la actividad terapéutica y/o la actividad biológica de la proteína terapéutica presentada en la correspondiente fila de la Tabla y en otra parte en esta solicitud (Véanse, por ejemplo, las columnas de la Tabla 1 "Actividad biológica" y "Proteína terapéutica X"). En otras formas de realización, las porciones de proteína terapéuticamente activa de las proteínas de fusión de la transferrina de la invención son fragmentos o variantes de las secuencias de referencia citadas en el presente documento.
La presente invención está también dirigida a proteínas de fusión de Tf modificada que comprenden fragmentos de las proteínas terapéuticas descritas en el presente documento. Incluso si la deleción de uno o más aminoácidos del extremo N terminal de una proteína da como resultado la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la porción de proteína terapéutica, pueden retenerse otras actividades terapéuticas y/o actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas, capacidad de multimerizar, capacidad de unirse a un ligando). Por ejemplo, la capacidad de los polipéptidos con deleciones N terminales de inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen las formas completa o madura de los polipéptidos se retendrán generalmente con menos de la mayoría de los residuos del polipéptido completo eliminado del extremo N terminal. Si un polipéptido concreto que carece de los residuos N terminales de un polipéptido completo retiene tales actividades inmunológicas, puede evaluarse mediante los procedimientos de rutina descritos en el presente documento y conocidos de otra manera en la técnica. No es improbable que un mutante con un gran número de residuos de aminoácido N terminales delecionados pueda retener alguna actividad biológica o inmunogénica. De hecho, péptidos compuestos por tan pocos como seis residuos de aminoácidos pueden provocar a menudo una respuesta inmune.
Como se ha mencionado también anteriormente, incluso si la deleción de uno o más aminoácidos de los extremos N terminal o C terminal de una proteína terapéutica da como resultado la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, pueden retenerse aún otras actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas, capacidad de multimerizar, capacidad de unirse a un ligando) y/o actividades terapéuticas. Por ejemplo, se retendrá generalmente la capacidad de los polipéptidos con deleciones C terminales para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen las formas completa o madura del polipéptido, cuando menos de la mayoría de los restos del polipéptido completo o maduro se eliminan del extremo C terminal. Si un polipéptido concreto que carece de los residuos N terminales y/o C terminales de un polipéptido de referencia retiene la actividad terapéutica, puede determinarse fácilmente mediante los procedimientos rutinarios que se describen en el presente documento y/o de otra manera conocida en la técnica.
Los fragmentos de péptidos de las proteínas terapéuticas pueden ser fragmentos que comprendan, o como alternativa, estén constituidos por, una secuencia de aminoácidos que muestra una actividad terapéutica y/o una actividad funcional (por ejemplo, actividad biológica) de la secuencia de polipéptidos de la proteína terapéutica de la cual la secuencia de aminoácidos es un fragmento.
Los fragmentos de péptidos de la proteína terapéutica pueden comprender sólo los extremos N y C terminales de la proteína, es decir, la porción central de la proteína terapéutica se ha delecionado. Como alternativa, los fragmentos de péptidos pueden comprender porciones no adyacentes y/o adyacentes de la parte central de la proteína terapéutica.
Otros fragmentos de polipéptido son fragmentos biológicamente activos. Fragmentos biológicamente activos son los que presentan actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de una proteína terapéutica usada en la presente invención. La actividad biológica de los fragmentos puede incluir una mejora de la actividad deseada, o una disminución de la actividad indeseada.
Generalmente, las variantes de las proteínas son globalmente muy similares, y, en muchas regiones, idénticas a la secuencia de aminoácidos de la proteína terapéutica que corresponde a una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de la transferrina de la invención. Los ácidos nucleicos que codifican estas variantes están también abarcados por la invención.
Otros polipéptidos terapéuticos que pueden usarse en la invención son polipéptidos codificados por polinucleótidos que se hibridan con el complemento de un molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de una proteína terapéutica en condiciones de hibridación rigurosas que son conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. y col., eds., 1989 Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons Inc., Nueva York). Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos están también abarcados por la invención.
Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, un 95% "idéntica" a la secuencia de aminoácidos problema de la presente invención, se entiende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sujeto es idéntica a la secuencia problema excepto en que la secuencia de polipéptidos sujeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos problema. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos problema, se puede insertar, delecionar, o sustituir por otros aminoácidos hasta un 5% de los residuos de aminoácidos en la secuencia sujeto. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino o carboxilo terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre las posiciones terminales, intercaladas tanto individualmente entre los restos en la secuencia de referencia, como en uno o más grupos contiguos en el interior de la secuencia de referencia.
En la práctica, puede determinarse convencionalmente si cualquier polipéptido particular es al menos aproximadamente un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntico a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión de la transferrina de la invención o uno de sus fragmentos (tal como una porción de la proteína terapéutica de la proteína de fusión de la transferrina o la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina) usando programas informáticos conocidos. Un procedimiento de preferencia para determinar la mejor correspondencia global entre una secuencia problema (una secuencia de la presente invención) y una secuencia sujeto, denominada también como alineación global de la secuencia, puede determinarse usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brufiag y col. (Comp. App. Biosci 245 (1990)).
Las variantes de polinucleótidos pueden contener alteraciones en las regiones de codificación, las regiones no codificadoras, o ambas. Pueden usarse las variantes de polinucleótidos que contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones, o deleciones silenciosas, pero que no alteran las propiedades o las actividades del polipéptido codificado para producir proteínas de fusión de la Tf modificada. Pueden utilizarse variantes de nucleótidos producidas mediante sustituciones silenciosas debidas a la degeneración del código genético. Más aún, pueden utilizarse también variantes de polipéptidos en las que están sustituidos, delecionados, o añadidos menos de aproximadamente 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20, menos de 10, ó 5-50, 5-25, 5-10, 1-5 ó 1-2 aminoácidos. Pueden producirse variantes de polinucleótidos por diferentes razones, por ejemplo, para optimizar la expresión del codón de un huésped concreto (cambio de los codones en el ARNm humano por los preferidos por un huésped, tal como, una levadura o E. coli según se describió anteriormente).
En otras formas de realización, el resto de proteína terapéutica tiene sustituciones conservadoras en comparación con la secuencia de tipo natural. Por "sustituciones conservadoras" se entiende intercambios dentro de los grupos tales como la sustitución de los aminoácidos alifáticos o hidrófobos Ala, Val, Leu e Ile; la sustitución de los residuos hidroxilo Ser y Thr; la sustitución de los residuos ácidos Asp y Glu; la sustitución de los residuos amida Asn y Gln, la sustitución de los residuos básicos Lys, Arg e His; la sustitución de los residuos aromáticos Phe, Tyr y Trp, y la sustitución de los aminoácidos de pequeño tamaño Ala, Ser, Thr, Met y Gly. Se proporcionan las directrices con respecto a cómo realizar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas, por ejemplo, en Bowie y col., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247: 1306-1310 (1990). En formas de realización específicas, los polipéptidos de la invención comprenden, o como alternativa, están constituidos por, fragmentos o variantes de la secuencia de aminoácidos de una proteína terapéutica descrita en el presente documento y/o la proteína transferrina sérica, y/o la transferrina modificada de la invención, en la que los fragmentos o variantes tienen 1-5, 5-10, 5-25, 5-50, 10-50 ó 50-150 adiciones, sustituciones, y/o deleciones de residuos de aminoácidos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras formas de realización, las sustituciones de aminoácidos son conservadoras. Se describen también en el presente documento los ácido nucleicos que codifican estos polipéptidos.
Las proteínas de fusión modificadas de la presente invención pueden estar compuestas por aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados y pueden contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos codificados por genes. Los polipéptidos pueden modificarse tanto por procesos naturales, tales como el procesamiento post-traduccional, como por técnicas de modificación químicas que se conocen bien en la técnica. Tales modificaciones están bien descritas en los textos básicos y en monografías más detalladas, así como en la voluminosa bibliografía de investigación.
Se pueden producir modificaciones en cualquier parte en un polipéptido, incluyendo la estructura central peptídica, las cadenas secundarias de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo terminales. Se apreciará que puede estar presente el mismo tipo de modificación en el mismo grado o en grados variables en varios sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden ser ramificados, por ejemplo, como resultado de ubiquitinación y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y ramificados cíclicos pueden ser el resultado de procesos naturales posteriores a la traducción o pueden prepararse mediante procedimientos sintéticos. Las modificaciones incluyen la acetilación, acilación, ADP ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlace disulfuro, desmetilación, formación de reticulado covalente, formación de cisteína, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tales como arginilación y ubiquitinación (Véanse, por ejemplo PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2a Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, páginas 1-12 (1983); Seifter y col. (1990) Meth. Enzymol. 182: 626-646; Rattan y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62.
Las moléculas terapéuticas que pueden fusionarse a o insertarse en Tf incluyen, pero no se limitan a, hormonas, proteínas de la matriz, inmunosupresores, broncodilatadores, agentes cardiovasculares, enzimas, agentes del SNC, neurotransmisores, proteínas o péptidos receptores, hormonas del crecimiento, factores de crecimiento, péptidos antivriales, péptidos inhibidores fusogénicos, citocinas, linfocinas, monocinas, interleucinas, factores estimulantes de colonias, factores de diferenciación, factores angiogénicos, ligandos del receptor, proteínas asociadas a cáncer, antineoplásicos, péptidos virales, péptidos antibióticos, proteínas de la sangre, proteínas antagonistas, factores de transcripción, factores antiangiogénicos, proteínas o péptidos antagonistas, antagonistas del receptor, anticuerpos, anticuerpos de cadena única y moléculas de adhesión celular. Pueden combinarse diferentes moléculas terapéuticas en una proteína de fusión única para producir una molécula terapéutica bi o multifuncional. Pueden usarse también diferentes moléculas en combinación para producir una proteína de fusión con una entidad terapéutica y una entidad directora.
Las citocinas son proteínas solubles liberadas por las células del sistema inmune, que actúan no enzimáticamente a través de receptores específicos para regular las respuestas inmunes. Las citocinas semejan hormonas en las que actúan a bajas concentraciones de unión con elevada afinidad hacia un receptor específico. El término "citocina" se usa en el presente documento para describir proteínas recombinantes o que se producen naturalmente, sus análogos, y sus fragmentos, que provocan una respuesta biológica específica en una célula que tiene un receptor para esa citocina. Las citocinas incluyen de preferencia interleucinas tales como interleucina-2 (IL-2) (Nº de Acceso de GenBank S77834), IL-3 (Nº de Acceso de GenBank M14743), IL-4 (Nº de Acceso de GenBank M23442), IL-5 (Nº de Acceso de GenBank J03478), IL-6 (Nº de Acceso de GenBank M14584), IL-7 (Nº de Acceso de GenBank NM_000880), IL-10 (Nº de Acceso de GenBank NM_000572), IL-12 (Nº de Acceso de GenBank AF180562 y Nº de Acceso al Gen-Bank AF180563), IL-13 (Nº de Acceso de GenBank U10307), IL-14 (Nº de Acceso de GenBank XM_170924), IL-15 (Nº de Acceso de GenBank X91233), IL-16 (Nº de Acceso de GenBank M_004513), IL-17 (Nº de Acceso al Gen-Bank NM_002190) e IL-18 (Nº de Acceso de GenBank M_001562), factores hematopoyéticos tales como factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) (Nº de Acceso de GenBank X03021), factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) (Nº de Acceso de GenBank X03656), factor de activación de plaquetas (Nº de Acceso de GenBank NM_000437) y eritropoyetina (Nº de Acceso de GenBank X02158), factores de necrosis tumoral (TNF) tal como TNF\alpha (Nº de Acceso de GenBank X02910), linfocinas tales como linfotoxina-\alpha (Nº de Acceso de GenBank X02911), linfotoxina-\beta (Nº de Acceso de GenBank L11016), leucorregulina, factor inhibidor de la migración de macrófagos (Nº de Acceso de GenBank M25639) y neuroleucina (Nº de Acceso de GenBank K03515), reguladores de los procesos metabólicos tales como leptina (Nº de Acceso de GenBank U43415), interferones tales como interferón \alpha (IFN\alpha) (Nº de Acceso de GenBank M54886), IFN\beta (Nº de Acceso de GenBank V00534), IFN\gamma (Nº de Acceso de GenBank J00219), IFNo (Nº de Acceso de GenBank NM_002177), trombospondina 1 (THBS1) (Nº de Acceso de GenBank NM_003246), THBS2 (Nº de Acceso de GenBank L12350), THBS3 (Nº de Acceso de GenBank L38969), THBS4 (Nº de Acceso de GenBank NM_003248) y quimiocinas. De preferencia, la proteína de fusión de transferrina modificada-citocina de la presente invención muestra actividad biológica de la citocina.
El término "hormona" se usa en el presente documento para describir una cualquiera de las numerosas sustancias biológicamente activas que están producidas por algunas células o tejidos y que producen cambios o actividades biológicas específicas que se producen en otra célula o tejido localizados en cualquier parte del cuerpo. Las hormonas incluyen de preferencia GLP-1 de preproteína de glucagón (Nº de Acceso de GenBank NM_002045), proinsulina (Nº de Acceso de GenBank V00565), insulina (Nº de Acceso al Gen-Bank NM_000207), hormona 1 del crecimiento (Nº de Acceso de GenBank V00520), hormona 2 del crecimiento (Nº de Acceso de GenBank F006060), factor de liberación de la hormona del crecimiento (Nº de Acceso de GenBank NM_021081), factor I de crecimiento análogo a insulina (Nº de Acceso de GenBank M27544), factor II de crecimiento análogo a insulina (Nº de Acceso de GenBank NM_000612), proteína 1 de unión al factor de crecimiento análogo a insulina (IGFBP-1) (Nº de Acceso de GenBank M59316), IGFBP-2 (Nº de Acceso de GenBank X16302), IGFBP-3 (Nº de Acceso de GenBank NM_000598), IGFBP-4 (Nº de Acceso de GenBank Y12508), IGFBP-5 (Nº de Acceso de GenBank M65062), IGFBP-6 (Nº de Acceso de GenBank NM_002178), IGFBP-7 (Nº de Acceso de GenBank NM_001553), cadena \beta de la gonadotropina coriónica (Nº de Acceso de GenBank NM_033142), cadena \alpha de la gonadotropina coriónica (Nº de Acceso de GenBank NM_000735), hormona \beta luteneizante (Nº de Acceso de GenBank X00264), hormona \beta estimuladora del folículo (Nº de Acceso de GenBank NM_000510), hormona \beta estimuladora de la tiroides (Nº de Acceso de GenBank NM_000549), prolactina (Nº de Acceso de GenBank NM_000948), pro-opiomelanocortina (Nº de Acceso de GenBank V01510), corticotropina (ACTH), \beta-lipotropina, hormona estimuladora de \alpha-melanocitos (\alpha-MSH), \gamma-lipotropina, \beta-MSH, \beta-endorfina, y péptido del lóbulo intermedio análogo a corticotropina (CLIP).
El término "factor de crecimiento" se usa en el presente documento para describir cualquier proteína o péptido que se une a un receptor para estimular la proliferación celular. Los factores de crecimiento incluyen de preferencia el factor-\alpha de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-\alpha) (Nº de Acceso de GenBank X03795), PDGF-\beta (Nº de Acceso de GenBank X02811), hormonas, factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Nº de Acceso de GenBank NM_001963), factores de crecimiento de los fibroblastos tales como factor 1 de crecimiento de los fibroblastos (FGF1) (Nº de Acceso de GenBank NM_000800), FGF2 (Nº de Acceso de GenBank NM_002006), FGF3 (Nº de Acceso de GenBank NM_005247), FGF4 (Nº de Acceso de GenBank NM_002007), FGF5 (Nº de Acceso de GenBank M37825), FGF6 (Nº de Acceso de GenBank X57075), FGF7 (Nº de Acceso de GenBank NM_002009), FGF8 (Nº de Acceso al Gen-Bank AH006649), FGF9 (Nº de Acceso de GenBank NM_002010), FGF10 (Nº de Acceso de GenBank AB002097), FGF11 (Nº de Acceso de GenBank NM_004112), FGF12 (Nº de Acceso de GenBank NM_021032), FGF13 (Nº de Acceso de GenBank NM_004114), FGF14 (Nº de Acceso de GenBank NM_004115), FGF16 (Nº de Acceso al Gen-Bank AB009391), FGF17 (Nº de Acceso de GenBank M_003867), FGF18 (Nº de Acceso de GenBank AF075292), FGF19 (Nº de Acceso de GenBank NM_005117), FGF20 (Nº de Acceso de GenBank NM_019851), FGF21 (Nº de Acceso de GenBank NM_019113), FGF22 (Nº de Acceso de GenBank NM_020637) y FGF23 (Nº de Acceso al Gen-Bank NM_020638), angiogenina (Nº de Acceso de GenBank M11567), factor neurotrófico derivado de cerebro (Nº de Acceso de GenBank M61176), factor de crecimiento neurotrófico ciliar (Nº de Acceso de GenBank X60542), factor-\alpha de crecimiento transformante (TGF-\alpha) (Nº de Acceso de GenBank X70340), TGF\beta (Nº de Acceso de GenBank X02812), factor-\alpha de crecimiento nervioso (NGF-\alpha) (Nº de Acceso de GenBank NM_010915), NGF-\beta (Nº de Acceso de GenBank X52599), inhibidor tisular de metaloproteinasa 1 (TIMP1) (Nº de Acceso de GenBank NM_003254), TIMP2 (Nº de Acceso de GenBank NM_003255), TIMP3 (Nº de Acceso de GenBank U02571), TIMP4 (Nº de Acceso de GenBank U76456) y estimulador 1 de macrófagos (Nº de Acceso de GenBank L11924).
El término "proteína de la matriz" se usa en el presente documento para describir las proteínas o péptidos que se encuentran normalmente en la matriz extracelular. Estas proteínas pueden ser funcionalmente importantes para la resistencia, la filtración, o la adhesión. Las proteínas de la matriz incluyen de preferencia colágenos tales como colágeno I (Nº de Acceso de GenBank Z74615), colágeno II (Nº de Acceso de GenBank X16711), colágeno III (Nº de Acceso de GenBank X14420), colágeno IV (Nº de Acceso de GenBank NM_001845), colágeno V (Nº de Acceso de GenBank NM_000393), colágeno VI (Nº de Acceso de GenBank NM_058175), colágeno VII (Nº de Acceso de GenBank L02870), colágeno VIII (Nº de Acceso de GenBank NM_001850), colágeno IX (Nº de Acceso de GenBank X54412), colágeno X (Nº de Acceso de GenBank X60382), colágeno XI (Nº de Acceso de GenBank J04177), y colágeno XII (Nº de Acceso de GenBank U73778), proteínas laminina tales como LAMA2 (Nº de Acceso de GenBank NM_000426), LAMA3 (Nº de Acceso de GenBank L34155), LAMA4 (Nº de Acceso de GenBank NM_002290), LAMB1 (Nº de Acceso de GenBank NM_002291), LAMB3 (Nº de Acceso de GenBank L25541), LAMC1 (Nº de Acceso de GenBank NM_002293), nidógeno (Nº de Acceso de GenBank NM_002508), \alpha-tectorina (Nº de Acceso de GenBank NM_005422), \beta-tectorina (Nº de Acceso de GenBank NM_058222) y fibronectina (Nº de Acceso de GenBank X02761).
El término "proteínas de la sangre" se define tradicionalmente como aquellas que se originan en el plasma, producidas muchas ahora comúnmente por medios recombinantes, e incluyen, pero no se limitan a proteínas séricas naturales, derivados, fragmentos y mutantes o sus variantes, factores de coagulación de la sangre, derivados, mutantes, variantes y fragmentos (que incluyen los factores VII, VIII, IX, X), inhibidores de proteasas (antitrombina III, alfa-1antitripsina), activador del plasminógeno de tipo urocinasa, inmunoglobulinas, factor de von Willebrand y mutantes de von Willebrand, fibronectina, fibrinógeno, trombina y hemoglobina.
El término "enzima" se usa en el presente documento para describir cualquier proteína o sustancia proteínica que cataliza una reacción específica sin que se produzca su alteración o destrucción permanente. Las enzimas incluyen de preferencia factores de coagulación tales como F2 (Nº de Acceso de GenBank XM_170688), F7 (Nº de Acceso de GenBank XM_027508), F8 (Nº de Acceso de GenBank XM_013124), F9 (Nº de Acceso de GenBank NM_000133), F10 (Nº de Acceso de GenBank AF503510) y otros, metaloproteinasas de la matriz tales como la metaloproteinasa I de la matriz (Nº de Acceso de GenBank MMP1) (Nº de Acceso de GenBank NM_002421), MMP2 (Nº de Acceso de GenBank NM_004530), MMP3 (Nº de Acceso de GenBank NM_002422), MMP7 (Nº de Acceso de GenBank NM_002423), MMP8 (Nº de Acceso de GenBank NM_002424), MMP9 (Nº de Acceso de GenBank NM_004994), MMP10 (Nº de Acceso de GenBank NM_002425), MMP12 (Nº de Acceso de GenBank NM_002426), MMP13 (Nº de Acceso de GenBank X75308), MMP20 (Nº de Acceso de GenBank M_004771), adenosina desaminasa (Nº de Acceso de GenBank NM_000022), proteína cinasas activadas por mitógeno tales como MAPK3 (Nº de Acceso de GenBank XM_055766), MAP2K2 (Nº de Acceso de GenBank NM_030662), MAP2K1 (Nº de Acceso de GenBank NM_002755), MAP2K4 (Nº de Acceso de GenBank NM_003010), MAP2K7 (AF013588), y MAPK12 (NM_002969), cinasas tales como JNKK1 (Nº de Acceso de GenBank U17743), JNKK2 (Nº de Acceso de GenBank AF014401), JAK1 (M64174), JAK2 (NM_004972), y JAK3 (NM_000215), y fosfatasas tales como PPM1A (Nº de Acceso de GenBank NM_021003) y PPM1D (Nº de Acceso de GenBank NM_003620).
La frase "factores de transcripción" se usa en el presente documento para describir cualquier proteína o péptido implicado en la transcripción de los genes que codifican la proteína. Los factores de transcripción pueden incluir Sp1, Sp2 (Nº de Acceso de GenBank NM_003110), Sp3 (Nº de Acceso de GenBank AY070137), Sp4 (Nº de Acceso de GenBank NM_003112) NFYB (Nº de Acceso de GenBank NM_006166), Hap2 (Nº de Acceso de GenBank M59079), GATA-1 (Nº de Acceso de GenBank NM_002049), GATA-2 (Nº de Acceso de GenBank NM_002050), GATA-3 (Nº de Acceso de GenBank X55122), GATA-4 (Nº de Acceso de GenBank L34357), GATA-5, GATA-6 (Nº de Acceso de GenBank NM_005257), FOG2 (NM_012082), Eryfl (Nº de Acceso de GenBank X17254), TRPS1 (Nº de Acceso de GenBank NM_014112), NF-E2 (Nº de Acceso de GenBank NM_006163), NF-E3, NF-E4, TFCP2 (Nº de Acceso de GenBank NM_005653), Oct-1 (Nº de Acceso de GenBank X13403), proteínas homeobox tales como HOXB2 (Nº de Acceso de GenBank NM_002145), HOX2H (Nº de Acceso de GenBank X16665), homólogo del gen hairless (Nº de Acceso de GenBank NM_005144), proteínas madre frente a decapentaplégicas tales como MADH1 (Nº de Acceso de GenBank NM_005900), MADH2 (Nº de Acceso de GenBank NM_005901), MADH3 (Nº de Acceso de GenBank NM_005902), MADH4 (Nº de Acceso de GenBank NM_005359), MADH5 (Nº de Acceso de GenBank AF009678), MADH6 (Nº de Acceso de GenBank NM_005585), MADH7 (Nº de Acceso de GenBank NM_005904), MADH9 (Nº de Acceso de GenBank NM_005905), y transductor de la señal y activador de las proteínas de transcripción tales como STAT1 (Nº de Acceso de GenBank XM_010893), STAT2 (Nº de Acceso de GenBank NM_005419), STAT3 (Nº de Acceso de GenBank AJ012463), STAT4 (Nº de Acceso de GenBank M_003151), STAT5 (Nº de Acceso de GenBank L41142), y STAT6 (Nº de Acceso de GenBank NM_003153).
En otra forma de realización adicional de la invención, la molécula terapéutica es una proteína no humana o no de mamífero. Por ejemplo, gp120 de VIH, Tat de VIH, resultan de preferencia las proteínas superficiales de otros virus tales como hepatitis, herpes, gripe, adenovirus y RSV, otros componentes de VIH, proteínas superficiales de parásitos tales como antígenos de la malaria y proteínas superficiales bacterianas. Pueden usarse estas proteínas no humanas, por ejemplo, como antígenos, o porque tienen actividades útiles. Por ejemplo, la molécula terapéutica puede ser estreptocinasa, estafilocinasa, asparaginasa, u otras proteínas con actividades enzimáticas útiles.
En una forma de realización alternativa, la molécula terapéutica es una proteína de unión a ligando con actividad biológica. Tales proteínas de unión a ligando pueden, por ejemplo, (1) bloquear las interacciones receptor-ligando en la superficie celular; o (2) neutralizar la actividad biológica de una molécula en la fase líquida de la sangre, evitando por consiguiente que ésta no alcance a su diana celular. En algunas formas de realización, las proteínas de fusión de la transferrina modificada incluyen una molécula de transferrina modificada fusionada a un dominio de unión a ligando de un receptor seleccionado del grupo constituido por, pero sin limitarse a, el receptor de una lipoproteína de baja densidad (LDL), un receptor de LDL acetilado, un receptor del factor \alpha de necrosis tumoral, un receptor del factor \beta de crecimiento transformante, un receptor de citocina, un receptor de Fc de inmunoglobulina, un receptor de hormona, un receptor de glucosa, un receptor de glicolípido y un receptor de glicosaminoglicano. En otras formas de realización, las proteínas de unión a ligando incluyen CD2 (M14362), CD3G (NM_000073), CD3D (NM_000732), CD3E (NM_000733), CD3Z (J04132), CD28 (NM_006139), CD4 (Nº de Acceso de GenBank NM_000616), CD1A (Nº de Acceso de GenBank M28825), CD1B (Nº de Acceso de GenBank NM_001764), CD1C (Nº de Acceso de GenBank NM_001765), CD1D (Nº de Acceso al Gen-Bank NM_001766), CD80 (Nº de Acceso de GenBank NM_005191), GNB3 (Nº de Acceso de GenBank AF501884), CTLA-4 (Nº de Acceso de GenBank NM_005214), moléculas de adhesión intercelular tales como ICAM-1 (NM_000201), ICAM-2 (NM_000873) e ICAM-3 (NM_002162), receptores del factor de necrosis tumoral tales como TNFRSF1A (Nº de Acceso de GenBank X55313), TNFR1SFB (Nº de Acceso de GenBank NM_001066), TNFRSF9 (Nº de Acceso de GenBank NM_001561), TNFRSF10B (Nº de Acceso de GenBank NM_003842), TNFRSF11B (Nº de Acceso de GenBank NM_002546) y TNFRSF13B (Nº de Acceso de GenBank NM_006573), y receptores de interleucina tales como IL2RA (Nº de Acceso de GenBank NM_000417), IL2RG (Nº de Acceso de GenBank NM_000206), IL4R (Nº de Acceso de GenBank AF421855), IL7R (Nº de Acceso de GenBank NM_002185), IL9R (Nº de Acceso al Gen-Bank XM_015989), e IL13R (Nº de Acceso de GenBank X95302). De preferencia la proteína de fusión de unión al ligando de la Tf de la presente invención muestra la actividad biológica de la proteína de unión al ligando.
La frase "proteínas asociadas a cáncer" se usa en el presente documento para describir proteínas o polipéptidos cuya expresión está asociada con cáncer o el mantenimiento de crecimiento celular controlado, tales como las proteínas codificadas por genes supresores de tumores u oncogenes. Las proteínas asociadas a cáncer puede incluir p16 (Nº de Acceso de GenBank AH005371), p53 (Nº de Acceso de GenBank NM_000546), p63 (Nº de Acceso de GenBank NM_003722), p73 (Nº de Acceso de GenBank NM_005427), BRCA1 (Nº de Acceso de GenBank U14680), BRCA2 (Nº de Acceso de GenBank NM_000059), proteína de interacción con CTBP (Nº de Acceso de GenBank U72066), DMBT1 (Nº de Acceso de GenBank NM_004406), HRAS (Nº de Acceso de GenBank NM_005343), NCYM (Nº de Acceso de GenBank NM_006316), FGR (Nº de Acceso de GenBank NM_005248), myb (Nº de Acceso de GenBank AF104863), rafl (Nº de Acceso de GenBank NM_002880), erbB2 (Nº de Acceso de GenBank NM_004448), VAV (Nº de Acceso de GenBank X16316), c-fos (V Nº de Acceso de GenBank 01512), c-fes (Nº de Acceso de GenBank X52192), c-jun (Nº de Acceso de GenBank NM_002228), MAS1 (Nº de Acceso de GenBank M13150), pim-1 (Nº de Acceso de GenBank M16750), TIF1 (Nº de Acceso de GenBank NM_003852), c-fms (Nº de Acceso de GenBank X03663), EGFR (Nº de Acceso de GenBank NM_005228), erbA (Nº de Acceso de GenBank X04707), tirosina cinasa c-src (Nº de Acceso de GenBank XM_044659), c-abl (Nº de Acceso de GenBank M14752), N-ras (Nº de Acceso de GenBank X02751), K-ras (Nº de Acceso de GenBank M54968), jun-B (Nº de Acceso de GenBank M29039), c-myc (Nº de Acceso de GenBank AH001511), RB1 (Nº de Acceso de GenBank M28419), DCC (Nº de Acceso de GenBank X76132), APC (Nº de Acceso de GenBank NM_000038), NF1 (Nº de Acceso de GenBank M89914), NF2 (Nº de Acceso de GenBank Y18000) y bcl-2 (Nº de Acceso de GenBank M13994).
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"Péptidos inhibidores fusogénicos" se usa en el presente documento para describir los péptidos que muestran actividad antiviral, competencia de función antimembrana, y/o una capacidad para modular los procesos intracelulares, por ejemplo, los que implican estructuras superenrolladas de péptidos. La actividad antiviral incluye, pero no se limita a, la inhibición de VIH-1, VIH-2, VSR, SIV, VEB, virus del sarampión, virus de la gripe, o la transmisión del CMV a células no infectadas. Además, la capacidad antifusogénica, la actividad antiviral o la actividad moduladora intracelular de los péptidos requiere meramente la presencia de los péptidos y no requiere específicamente la estimulación de una respuesta inmune del huésped dirigida contra dichos péptidos. Antifusogénico se refiere a la capacidad del péptido para inhibir o reducir el nivel de los episodios de fusión de la membrana entre dos o más restos en relación con el nivel de fusión de la membrana que se produce entre dichos restos en ausencia del péptido. Los restos pueden ser, por ejemplo, membranas celulares o estructuras virales, tales como envolturas o pili virales. El término "péptido antiviral", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad del péptido para inhibir la infección viral de células o alguna actividad viral requerida para una infección viral productiva y/o la patogénesis viral mediante, por ejemplo, fusión célula-célula o infección de virus libre. Dicha infección puede implicar la fusión de la membrana, como se produce en el caso de los virus con envoltura, o algún otro episodio de fusión que implique una estructura viral y una estructura celular. Los péptidos inhibidores fusogénicos y los péptidos antivirales tienen a menudo secuencias de aminoácidos que proceden de más de una proteína viral (por ejemplo, un polipéptido derivado de VIH-1, VIH-2, VSR y SIV).
Pueden encontrarse ejemplos de péptidos inhibidores fusogénicos y péptidos antivirales en los documentos WO 94/2820, WO 96/19495, WO 96/40191, WO 01/64013 y en las patentes de EEUU Nº 6.333.395, 6.258.782, 6.228.983, 6.133.418, 6.093.794, 6.068.973, 6.060.065, 6.054.265, 6.020.459, 6.017.536, 6.013.263, 5.464.933, 5.346.989,
5.603.933, 5.656.480, 5.759.517, 6.245.737; 6.326.004 y 6.348.568; que se incorporan en el presente documento por referencia. En una forma de realización de preferencia, los péptidos antifusogénicos se seleccionan del grupo constituido por T-20 de VIH (FWNWLSAWKDLELLEQENKEQQNQSEEILSHILSTY, ID. SEC. Nº 4), T-1249 de VIH, T786 de VSR (VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV, ID. SEC. Nº 5), T1584 de VSR (AVSKVLH
LEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQL, ID. SEC. Nº 6) y T112 de VSR (VFPSDEF
DASISQVNEKINQSLAFIRESDELLHNV, ID. SEC. Nº 7).
Los ejemplos de otros tipos de péptidos incluyen fragmentos de proteínas terapéuticas como se describe en el presente documento, en particular, los fragmentos de proteínas humanas que retienen al menos una actividad de la molécula original. Los péptidos que pueden usarse para producir las proteínas de fusión de la Tf modificada de la invención, incluye también péptidos miméticos y péptidos que presentan una actividad biológica de una proteína terapéutica pero difieren en la secuencia o en la estructura tridimensional de una proteína terapéutica de longitud completa. Como un ejemplo no limitante, los péptidos incluyen los péptidos miméticos de eritropoyetina dados a conocer por Johnson y col. (2000) Nephrol. Dial. Transplant 15(9): 1274-1277, Kuai y col. (2000) J. Pept. Res. 56(2): 59-62, Barbone y col. (1999) Nephrol. Dial. Transplant. 14 Supp. 2: 80-4, Middleton y col. (1999) J. Biol. Chem. 274(20): 14163-14169, Johnson y col. (1998) Biochemistry 37(11): 3699-3710, Johnson y col. (1997) Chem. Biol. 12: 939-950, Wrighton y col. (1997) Nat. Biotechnol. 15(12): 1261-1665, Livnah y col. (1996) Science 273: 464-471, y Wrighton y col., (1996) Science 273: 458-464.
Las moléculas terapéuticas incluyen también proteínas alérgenas y sus fragmentos digeridos. Éstas incluyen alérgenos del polen de ambrosía, centeno, koeleria, dáctilo, cerrillo, agróstide blanca, festuca roja, fleo, romaza, trigo, maíz, artemisa, pasto azul, hierba anual de California, bledo, hierba Bermuda, cardo ruso, cedro de montaña, encina, arce americano, sicómoro, arce, olmo, etc., ácaros del polvo, veneno de abeja, alérgenos alimentarios, ácaros del pelo de los animales y otros venenos de insectos.
Otras moléculas terapéuticas incluyen vacunas microbianas que incluyen vacunas virales, bacterianas y protozoarias y sus diversos componentes tales como los antígenos superficiales. Estos incluyen vacunas que contienen glicoproteínas, proteínas o péptidos derivados de estas proteínas. Tales vacunas se preparan a partir de Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus neumoniae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Vibrio cholera, Campylobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Legionella neumophila, Tieponema pallidum, clamidia, toxoide del tétanos, toxoide de la difteria, virus de la gripe, adenovirus, paramixovirus (paperas, sarampión), virus de la rubeola, virus de la poliomielitis, virus de la hepatitis, virus del herpes, virus de la rabia, VIH-1, VIH-2, VSR y virus del papiloma.
Las moléculas de fusión de preferencia pueden contener péptidos anti-VIH, péptidos anti-VSR, hormona del crecimiento humana, interferones \alpha y/o \beta, eritropoyetina (EPO), péptidos análogos a EPO, factor de estimulación de las colonias de granulocitos (GCSF), factor de estimulación de las colonias de granulocitos-macrófagos (GMCSF), insulina, factor de crecimiento análogo a insulina (IGF), trombopoyetina, péptidos que corresponden a la CDR de un anticuerpo, Proteína Asociada a la Neogénesis de los Islotes (INGAP), calcitonina, angiostatina, endostatina, interleucina-2, factor de liberación de la hormona del crecimiento, hormona paratiroidea humana, péptidos anti factor de necrosis tumoral (TNF), receptor de la interleucina-1 (IL-1) y/o anticuerpos de cadena única.
También pueden prepararse proteínas de fusión de la invención para incluir péptidos o polipéptidos derivados de las bibliotecas de péptidos para cribar moléculas con funciones nuevas o novedosas. Tales bibliotecas de péptidos pueden incluir los disponibles comercialmente o públicamente, por ejemplo, American Peptide Co. Inc., Cell Sciences Inc., Invitrogen Corporation, Phoenix Pharmaceuticals Inc., United States Biological, así como los producidos mediante las tecnologías disponibles, por ejemplo, bibliotecas de presentación de bacteriófagos y bacterias preparadas usando los procedimientos convencionales.
En otras formas de realización adicionales de la invención, pueden prepararse proteínas de fusión de la Tf usando restos de proteínas terapéuticas conocidos en la técnica y ejemplificados mediante los péptidos y proteínas actualmente aprobados por la Dirección Federal de Fármacos y Alimentos (Food and Drug Administration) (www.fda.gov/cber/
efoi/approve.htm) así como las Publicaciones de Patente PCT Nº WO 01/79258, WO 01/77137, WO 01/79442, WO 01/79443, WO 01/79444 y WO 01/79480.
La Tabla 1 (adaptada de la Publicación Internacional PCT Nº WO 01/79444) proporciona una lista no exhaustiva de las proteínas terapéuticas que corresponden a una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de la transferrina modificada de la invención. La columna "Proteína terapéutica X" da a conocer las moléculas de proteínas terapéuticas seguidas por paréntesis que contienen los nombres científicos y comerciales que comprenden o están constituidos como alternativa por esta molécula de proteína terapéutica o uno de sus fragmentos o variantes. "Proteína terapéutica X" como se usa en el presente documento puede referirse tanto a una molécula de proteína terapéutica individual (como se define mediante la secuencia de aminoácidos que puede obtenerse de los números de acceso del CAS y el GenBank), o al grupo completo de proteínas terapéuticas asociadas con una molécula de proteína terapéutica dada que se da a conocer en esta columna. La columna del "Identificador de ejemplo" proporciona los números del registro del Chemical Abstracts Services (CAS) (publicados por la American Chemical Society) y/o los Números de Acceso de Genbank (por ejemplo, ID del Locus, NP-XXXXX (Secuencia de Referencia de la Proteína), y los identificadores XP-XXXXX (Proteína Modelo) disponibles de la página web del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov), que corresponde a las entradas en el Registro CAS o la base de datos del Genbank que contienen una secuencia de aminoácidos de la molécula de proteína o un fragmento o variante de la molécula de la proteína terapéutica. Además, se proporcionan los números de Acceso del GenSeq y/o el índice de citas bibliográficas de publicaciones para identificar la secuencia de aminoácidos a modo de ejemplo de algunos polipéptidos.
Las páginas resumen asociadas con cada uno de estos Números de Acceso a CAS y a Genbank y a GenSeq así como el índice de citas bibliográficas de publicaciones están disponibles (por ejemplo, número de ID de PubMed (PMID)). La columna PCT/Referencia de Patente proporciona los números de Patente de EEUU o los Números de las Publicaciones Internacionales PCT que corresponden a las patentes y/o las solicitudes de patente publicadas que describen la molécula de proteína terapéutica. La columna de Actividad biológica describe las actividades biológicas asociadas con la molécula de proteína terapéutica. La columna de Ensayo de actividad de ejemplo proporciona las referencias que describen los ensayos que pueden usarse para probar la actividad terapéutica y/o biológica de una proteína terapéutica o una proteína de fusión de la transferrina de la invención que comprende una porción X de la proteína terapéutica. Estas referencias se incorporan también por referencia en el presente documento en su totalidad. La columna "Indicación de preferencia Y" describe las enfermedades, trastornos, y/o afecciones que se pueden tratar, prevenir, diagnosticar, o mejorar mediante la proteína terapéutica X o una proteína de fusión de la transferrina de la invención que comprende una porción de la proteína X terapéutica.
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Formulaciones farmacéuticas y procedimientos de tratamiento
Las proteínas de fusión modificadas pueden administrarse a un paciente que las necesite usando protocolos de administración convencionales. Por ejemplo, las proteínas de fusión de la Tf modificada pueden proporcionarse solas, o en combinación, o en combinación secuencial con otros agentes que modulan un proceso patológico particular. Según se usa en el presente documento, se dice que dos agentes se administran en combinación cuando los dos agentes se administran simultáneamente o se administran independientemente de una manera tal que los agentes actuarán al mismo o casi al mismo tiempo.
Los agentes de la presente invención pueden administrarse por vía parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica y bucal. Por ejemplo, puede administrarse un agente localmente en un lugar de la lesión mediante microinfusión. Como alternativa, o concurrentemente, la administración puede ser no invasiva mediante vía oral, por inhalación, nasal, o pulmonar. La dosificación administrada dependerá de la edad, salud, y peso del receptor, tipo de tratamiento concurrente, si acaso, frecuencia de tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado.
La presente invención proporciona además composiciones que contienen uno o más transcuerpos de la invención. Aunque las necesidades varían, la determinación de los intervalos óptimos de las cantidades eficaces de cada componente está comprendida dentro del conocimiento del experto en la técnica. Las dosificaciones usuales comprenden aproximadamente 1 pg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Las dosificaciones de preferencia para la administración sistémica comprenden aproximadamente 100 ng/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Las dosificaciones de preferencia para la administración directa a un sitio diana mediante microinfusión comprenden aproximadamente 1 g/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal. Cuando se administran mediante inyección directa o microinfusión, las proteínas de fusión modificadas pueden construirse mediante ingeniería genética para no presentar o presentar unión reducida del hierro para evitar, en parte, la toxicidad localizada del hierro.
Además a la proteína de fusión farmacológicamente activa, las composiciones de la presente invención pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente para administrar en el lugar de acción. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Además, pueden administrarse suspensiones de los compuestos activos como inyecciones de suspensiones oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos grasos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las inyecciones de suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión e incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes. Pueden usarse también liposomas para encapsular el agente para la liberación en la célula.
La formulación farmacéutica para administración sistémica según la invención puede formularse para administración entérica, parenteral o tópica. De hecho, pueden usarse los tres tipos de formulaciones simultáneamente para conseguir la administración sistémica del ingrediente activo. Las formulaciones adecuadas para administración oral incluyen cápsulas de gelatina dura o blanda, píldoras, comprimidos, que incluyen comprimidos recubiertos, elixires, suspensiones, jarabes o inhalaciones y sus formas de liberación controlada.
En la práctica de los procedimientos de la presente invención, los agentes de la presente invención pueden usarse solos o en combinación, o en combinación con otros agentes terapéuticos o de diagnóstico. En algunas formas de realización de preferencia, pueden administrarse simultáneamente los compuestos de la presente invención junto con otros compuestos normalmente prescritos para estas afecciones según la práctica médica generalmente aceptada. Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse in vivo, ordinariamente en mamíferos, tales como seres humanos, ovejas, caballos, ganado, cerdos, perros, gatos, ratas y ratones, ex vivo o in vitro.
Las proteínas de fusión modificadas de la presente invención pueden usarse en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de las enfermedades y/o trastornos relacionados con las enfermedades y trastornos del sistema endocrino, el sistema nervioso, el sistema inmune, el sistema respiratorio, el sistema cardiovascular, el sistema reproductor, el sistema digestivo, las enfermedades y/o trastornos relacionados con la proliferación celular, y/o las enfermedades o trastornos relacionados con la sangre.
En otras formas de realización de la invención, pueden usarse las proteínas de fusión de la Tf modificada en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de las enfermedades y/o trastornos relacionados con las enfermedades y trastornos conocidos por estar asociados o poder tratarse con restos de la proteína terapéutica como se sabe en la técnica y se ejemplifica en las Publicaciones de Patentes PCT Nº WO 01/79258, WO 01/77137, WO 01/79442, WO 01/79443, WO 01/79444 y WO 01/79480. Por consiguiente, la presente invención abarca un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno presentado en la columna "Indicación de preferencia Y" de la Tabla 1 que comprende la administración a un paciente en el que se desea dicho tratamiento, prevención o mejora mediante una proteína de fusión de la transferrina modificada de la invención que comprende una porción de proteína terapéutica que corresponde a una proteína terapéutica que se da a conocer en la columna "Proteína terapéutica X" de la Tabla 1 en una cantidad eficaz para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad o el trastorno.
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En algunas formas de realización, puede usarse una proteína de fusión de la transferrina de la presente invención para diagnosticar y/o pronosticar las enfermedades y/o trastornos.
Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, diagnóstico y/o pronóstico de las enfermedades, trastornos y/o afecciones del sistema inmune. Además, pueden usarse las proteínas de fusión de la presente invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la presente invención como un marcador o detector de una enfermedad o trastorno concreto del sistema inmune.
En una forma de realización de preferencia, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de la transferrina modificada de la invención podrían usarse como un agente para estimular la inmunosensibilidad entre individuos inmunodeficientes. En formas de realización específicas, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención podrían usarse como un agente para estimular la inmunosensibilidad entre las células B y/o las células T de individuos inmunodeficientes.
Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, diagnóstico y/o pronóstico de las enfermedades autoinmunes. Muchos trastornos autoinmunes son el resultado de un reconocimiento inadecuado del material propio como extraño por las células inmunes. Este reconocimiento inadecuado da como resultado una respuesta inmune que conduce a la destrucción del tejido del huésped. Por consiguiente, la administración de proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención, que pueden inhibir una respuesta inmune, particularmente la proliferación, diferenciación, o quimiotaxis de las células T, puede ser una terapia eficaz en la prevención de los trastornos autoinmunes.
Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, pronóstico y/o diagnóstico de las enfermedades, trastornos y/o afecciones de las células hematopoyéticas. Las proteínas de fusión de la transferrina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención podrían usarse para aumentar la diferenciación y la proliferación de las células hematopoyéticas, que incluyen las células madre pluripotentes, en un esfuerzo para tratar o prevenir las enfermedades, trastornos y/o afecciones asociadas con una disminución en algunos (o muchos) tipos de células hematopoyéticas, incluyendo, pero sin limitarse a, leucopenia, neutropenia, anemia y trombocitopenia.
Como alternativa, las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención podrían usarse para aumentar la diferenciación y la proliferación de las células hematopoyéticas, incluyendo las células madre pluripotentes, en un esfuerzo para tratar o prevenir las enfermedades, trastornos y/o afecciones asociadas con un aumento en algunos (o muchos) tipos de células hematopoyéticas, incluyendo, pero sin limitarse a, histiocitosis.
Se pueden tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar también las reacciones y afecciones alérgicas, tales como asma (concretamente asma alérgico) u otros problemas respiratorios y usar las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención. Además, pueden usarse estas moléculas para tratar, prevenir, pronosticar y/o diagnosticar la anafilaxis, hipersensibilidad a una molécula antigénica, o la incompatibilidad del grupo sanguíneo.
Además, pueden usarse las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención, para tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar las reacciones alérgicas mediadas por IgE. Tales reacciones alérgicas incluyen, pero no se limitan a, asma, rinitis y eczema. En formas de realización específicas, pueden usarse las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención para modular las concentraciones de IgE in vitro o in vivo.
Además, las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención tienen usos en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de las afecciones inflamatorias. Por ejemplo, debido a que las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden inhibir la activación, proliferación y/o la diferenciación de las células implicadas en una respuesta inflamatoria, pueden usarse estas moléculas para prevenir y/o tratar las afecciones inflamatorias crónicas y agudas. Tales afecciones inflamatorias incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, la inflamación asociada con infección (por ejemplo, choque séptico, sepsis o síndrome sistémico de respuesta inflamatoria), lesión por reperfusión tras isquemia, letalidad de endotoxinas, rechazo hiperagudo mediado por el complemento, nefritis, lesión de pulmón inducida por citocinas o quimiocinas, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, sobreproducción de citocinas (por ejemplo, TNF o IL-1), trastornos respiratorios (por ejemplo, asma y alergia); trastornos gastrointestinales (por ejemplo, enfermedad intestinal inflamatoria); cánceres (por ejemplo, gástrico, de ovario, de pulmón, de vejiga, de hígado y de mama); trastornos del SNC (por ejemplo, esclerosis múltiple, lesión isquémica de cerebro y/o ictus, lesión traumática de cerebro); trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer); demencia relacionada con SIDA y enfermedad priónica; trastornos cardiovasculares (por ejemplo, aterosclerosis, miocarditis, enfermedad cardiovascular y complicaciones por derivación cardiopulmonar); así como muchas enfermedades, afecciones y trastornos adicionales que se caracterizan por inflamación (por ejemplo, hepatitis, artritis reumatoide, gota, trauma, pancreatitis, sarcoidosis, dermatitis, lesión de reperfusión tras isquemia renal, enfermedad de Grave, lupus eritematoso sistémico, diabetes mellitus y rechazo alogénico al trasplante).
Debido a que la inflamación es un mecanismo de defensa fundamental, los trastornos inflamatorios pueden afectar virtualmente cualquier tejido del cuerpo. Por consiguiente, las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención tienen usos en el tratamiento de trastornos inflamatorios específicos de tejido, que incluyen, pero no se limitan a, adrenalitis, alveolitis, angiocolecistitis, apendicitis, balanitis, blefaritis, bronquitis, bursitis, carditis, celulitis, cervicitis, colecistitis, corditis, colitis, conjuntivitis, cistitis, dermatitis, diverticulitis, encefalitis, endocarditis, esofagitis, eustaquitis, fibrositis, foliculitis, gastritis, gastroenteritis, gingivitis, glositis, hepatoesplenitis, queratitis, laberintitis, laringitis, linfangitis, mastitis, otitis media, meningitis, metritis, mucitis, miocarditis, miositis, miringitis, nefritis, neuritis, orquitis, osteocondritis, otitis, pericarditis, peritendonitis, peritonitis, faringitis, flebitis, poliomielitis, prostatitis, pulpitis, retinitis, rinitis, salpingitis, escleritis, esclerocoroiditis, escrotitis, sinusitis, espondilitis, esteatitis, estomatitis, sinovitis, siringitis, tendonitis, tonsilitis, uretritis y vaginitis.
En formas de realización específicas, las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención son útiles para diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar los rechazos al trasplante de órganos y la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD). Se produce el rechazo del órgano por la destrucción de las células inmunes del huésped del tejido trasplantado a través de una respuesta inmune. De manera similar, está también implicada una respuesta inmune en GVHD pero, en este caso, las células inmunes trasplantadas extrañas destruyen los tejidos del huésped. Los polipéptidos, anticuerpos, o polinucleótidos de la invención y/o sus agonistas o antagonistas, que inhiben una respuesta inmune, particularmente la activación, proliferación, diferenciación o quimiotaxis de las células T, pueden ser una terapia eficaz en la prevención del rechazo al órgano o GVHD.
En otra forma de realización específica, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención se usaron como un adyuvante para potenciar respuestas inmunes antivirales: las respuestas inmunes antivirales que pueden potenciarse usando las composiciones de la invención como un adyuvante, incluyen enfermedades o síntomas virales y asociados a virus descritos en el presente documento o conocidos de otra manera en la técnica. En formas de realización específicas, se usaron las composiciones de la invención como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a un virus, enfermedad o síntoma seleccionado del grupo constituido por SIDA, meningitis, dengue, VEB y hepatitis (por ejemplo, hepatitis B). En otra forma de realización específica, se usaron las composiciones de la invención como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a un virus, enfermedad o síntoma seleccionado del grupo constituido por: VIH/SIDA, virus sincitial respiratorio; dengue, rotavirus, encefalitis japonesa B, gripe A y B, virus paragripal, sarampión, citomegalovirus, rabia, Junin, Chicungunya, Fiebre del Valle del Rift, herpes simple y fiebre
amarilla.
En otra forma de realización específica, se usaron las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención como un adyuvante para potenciar respuestas inmunes antibacterianas o antifúngicas. Las respuestas inmunes antibacterianas o antifúngicas que pueden potenciarse usando las composiciones de la invención como un adyuvante incluyen las enfermedades o síntomas de bacterias u hongos y las asociadas a bacterias u hongos descritas en el presente documento o conocidas de otra manera en la técnica. En formas de realización específicas, se usaron las composiciones de la invención como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a una enfermedad o síntoma por bacteria u hongo seleccionada del grupo constituido por tétanos, difteria, botulismo, meningitis tipo B y candidiasis.
En otra forma de realización específica, se usaron la composiciones de la invención como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a una enfermedad o síntoma por bacteria u hongo seleccionadas del grupo constituido por Vibrio cholerae, Mycobacterium leprae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Neisseria meningitidis, Streptococcus neumoniae, Streptococcus Grupo B, Shigella spp., Escherichia coli enterotoxigénica, E. coli enterohemorrágica, Borrelia burgdorferi y Candida.
En otra forma de realización específica, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención se usaron como un adyuvante para potenciar respuestas inmunes antiparasitarias. Las respuestas inmunes antiparasitarias que pueden potenciarse usando las composiciones de la invención como un adyuvante incluyen las enfermedades o síntomas por parásitos o asociados a parásitos descritos en el presente documento o conocidos de otra manera en la técnica. En formas de realización específicas, pueden usarse las composiciones de la invención como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a un parásito. En otra forma de realización específica se usaron las composiciones de la invención como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a Plasmodium (malaria) o Leishmania.
En otra forma de realización específica, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse también para tratar enfermedades infecciosas que incluyen silicosis, sarcoidosis y fibrosis pulmonar idiopática; por ejemplo, evitando el reclutamiento y activación de los fagocitos mononucleares.
En otra forma de realización específica, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención se usaron como un antígeno para la generación de anticuerpos para inhibir o potenciar respuestas inmunomediadas contra los polipéptidos de la invención.
En una forma de realización, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención se administran a un animal (por ejemplo, ratón, rata, conejo, hámster, cobaya, cerdos, micro cerdos, pollo, camello, cabra, caballo, vaca, oveja, perro, gato, primate no humano y ser humano, de más preferencia ser humano) para estimular el sistema inmune para producir cantidades aumentadas de uno o más anticuerpos (por ejemplo, IgG, IgA, IgM e IgE), para inducir la producción de anticuerpos con mayor afinidad y el cambio del tipo de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG, IgA, IgM e IgE, y/o para aumentar una respuesta inmune.
En otra forma de realización, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención se usaron en una o más de las aplicaciones descritas en el presente documento, ya que pueden aplicarse a la medicina veterinaria.
En otra forma de realización específica, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención se usaron como medio para bloquear algunos aspectos de las respuestas inmunes a agentes extraños o propios. Los ejemplos de enfermedades o afecciones en las que puede desearse el bloqueo de algunos aspectos de las respuestas inmunes incluyen trastornos autoinmunes tales como lupus y artritis, así como inmunosensibilidad a las alergias de la piel, inflamación, enfermedad del intestino, lesión, y enfermedades/trastornos asociados con patógenos.
En otra forma de realización específica, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención se usaron como una terapia para evitar la proliferación de células B y la secreción de Ig asociada con enfermedades autoinmunes tales como púrpura trombocitopénica idiopática, lupus eritematoso sistémico y esclerosis múltiple.
En otra forma de realización específica, las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención se usaron como un inhibidor de la activación de las células B y/o T en las células endoteliales. Esta actividad perturba la arquitectura del tejido o las respuestas análogas y es útil, por ejemplo en la perturbación de las respuestas inmunes y el bloqueo de la sepsis.
En otra forma de realización específica, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención se usaron como una terapia para la hipergammaglobulinemia crónica evidente en dichas enfermedades tales como la gammopatía monoclonal de significancia indeterminada (MGUS), la enfermedad de Waldenstrom, gammopatías monoclonales idiopáticas relacionadas y plasmacitomas.
En otra forma de realización específica, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse por ejemplo para inhibir la quimiotaxis de los polipéptidos y la activación de los macrófagos y sus precursores, y de los neutrófilos, basófilos, linfocitos B, y algunas subseries de células T, por ejemplo, células T activadas y citotóxicas CD8, y los linfocitos citolíticos naturales, en algunas enfermedades autoinmunes e inflamatorias crónicas e infecciosas. Ejemplos de enfermedades autoinmunes se describen en el presente documento e incluyen la esclerosis múltiple y la diabetes dependiente de insulina.
En otra forma de realización específica, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención puede usarse también para tratar la aterosclerosis, por ejemplo, evitando la infiltración de monocitos en la pared arterial.
En otra forma de realización específica, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para tratar el síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto (ARDS).
En otra forma de realización específica, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden ser útiles para estimular la reparación de heridas y tejidos, estimular la angiogénesis y/o estimular la reparación de enfermedades o trastornos vasculares o linfáticos. Además, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para estimular la regeneración de superficies mucosas.
En una forma de realización específica, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención se usan para diagnosticar, pronosticar, tratar y/o prevenir un trastorno caracterizado por inmunodeficiencia primaria o adquirida, producción deficiente de inmunoglobulina en suero, infecciones recurrentes y/o disfunción del sistema inmune. Además, las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para tratar o prevenir infecciones de las articulaciones, huesos, piel y/o glándulas parótidas, infecciones transmitidas por sangre (por ejemplo, sepsis, meningitis, artritis séptica y/u osteomielitis), enfermedades autoinmunes (por ejemplo, las que se dan a conocer en el presente documento), trastornos inflamatorios y neoplasias y/o cualquier enfermedad o trastorno o afección asociadas con estas infecciones, enfermedades, trastornos y/o neoplasias) incluyendo, pero sin limitarse a, Inmunodeficiencia Variable Común (CVID), otras inmunodeficiencias primarias, enfermedad por VIH, Leucemia Linfocítica Crónica (CLL), bronquitis recurrente, sinusitis, otitis media, conjuntivitis, neumonía, hepatitis, meningitis, herpes zóster (por ejemplo, herpes zóster grave) y/o neumocistis carinii. Otras enfermedades y trastornos que se pueden prevenir, diagnosticar, pronosticar y/o tratar con las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a, infección por VIH, infección por HTLV-BLV, linfopenia, anemia por disfunción bactericida de los fagocitos, trombocitopenia y hemoglobinuria.
En una forma de realización específica, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar cánceres o neoplasmas que incluyen cánceres o neoplasmas de células inmunes o relacionados con tejido inmune. Los ejemplos de cánceres o neoplasmas que se pueden prevenir, diagnosticar o tratar mediante las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica, plasmacitomas, mieloma múltiple, linfoma de Burkitt, enfermedades transformadas por VEB y/o las enfermedades y los trastornos descritos en la sección titulada "Trastornos hiperproliferativos" en otra parte en el presente documento.
En otra forma de realización específica, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse como una terapia para disminuir la proliferación celular de los Linfomas de células B grandes.
En formas de realización específicas, las composiciones de la invención se usan como un agente para estimular la inmunosensibilidad entre los individuos inmunodeficientes en células B, tales como, por ejemplo, un individuo que experimenta una esplenectomía parcial o completa.
Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para modular la actividad hemostática (la detención del sangrado) o trombolítica (disolución del coágulo). Por ejemplo, aumentando la actividad hemostática o trombolítica, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención podrían usarse para tratar o prevenir las enfermedades, trastornos y/o afecciones de coagulación de la sangre (por ejemplo, afibrinogenemia, deficiencias de factores, hemofilia), las enfermedades, trastornos y/o afecciones de las plaquetas de la sangre (por ejemplo, trombocitopenia), o las heridas resultantes de trauma, cirugía u otras causas. Como alternativa, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención, que pueden disminuir la actividad hemostática o trombolítica podrían usarse para inhibir o disolver los coágulos. Estas moléculas serían importantes en el tratamiento o prevención de los ataques cardiacos (infartos), los ictus o la formación de escaras.
En formas de realización específicas, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para prevenir, diagnosticar, pronosticar y/o tratar la trombosis, trombosis arterial, trombosis venosa, tromboembolismo, embolismo pulmonar, aterosclerosis, infarto de miocardio, ataque isquémico transitorio, angina inestable. En formas de realización específicas, las proteínas de fusión de la transferrina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para la prevención de la oclusión de los injertos de la safena, para reducir el riesgo de la trombosis periprocedural que puede acompañar a los procedimientos de angioplastia, para reducir el riesgo de ictus en pacientes con fibrilación auricular que incluye fibrilación auricular no reumática, para reducir el riesgo de embolismo asociado a válvulas cardiacas mecánicas y/o enfermedad de las válvulas mitrales. Otros usos para las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención, incluyen, pero no se limitan a, la prevención de oclusiones en dispositivos extracorpóreos (por ejemplo, canales intravasculares, vías de acceso en pacientes de hemodiálisis, equipos de hemodiálisis y equipos de derivación cardiopulmonar).
En otra forma de realización, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para prevenir, diagnosticar, pronosticar y/o tratar las enfermedades y trastornos de la sangre y/o los órganos que forman la sangre asociados con el(los) tejido(s) en los que se expresa el polipéptido de la invención.
Las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para modular la actividad hematopoyética (la formación de células de la sangre). Por ejemplo, las proteínas de fusión de la transferrina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para aumentar la cantidad de todas o de las subseries de células de la sangre, tales como, por ejemplo, los eritrocitos, linfocitos (células B o T), células mieloides (por ejemplo, basófilos, eosinófilos, neutrófilos, células mastocíticas, macrófagos) y las plaquetas. La capacidad de disminuir la cantidad de células de la sangre o de las subseries de células de la sangre puede ser útil en la prevención, detección, diagnóstico y/o tratamiento de las anemias y las leucopenias descritas a continuación. Como alternativa, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para disminuir la cantidad de todas o de las subseries de células de la sangre, tales como, por ejemplo, los eritrocitos, linfocitos (células B o T), células mieloides (por ejemplo, basófilos, eosinófilos, neutrófilos, células mastocíticas, macrófagos) y las plaquetas. La capacidad para disminuir la cantidad de células de la sangre o de las subseries de células de la sangre puede ser útil en la prevención, detección, diagnóstico y/o tratamiento de la leucocitosis, tal como, por ejemplo, la eosinofilia. Las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para prevenir, tratar, o diagnosticar la discrasia sanguínea.
Las anemias son afecciones en las que el número de glóbulos rojos de la sangre o la cantidad de hemoglobina (la proteína que transporta el oxígeno) en la misma está por debajo del nivel normal. La anemia puede estar causada por sangrado excesivo, disminución de la producción de glóbulos rojos de la sangre o aumento en la destrucción de glóbulos rojos de la sangre (hemólisis). Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de las anemias. Las anemias que se pueden tratar, prevenir o diagnosticar mediante las proteínas de fusión de la transferrina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen anemia por deficiencia de hierro, anemia hipocrómica, anemia microcítica, clorosis, anemia sideroblástica hereditaria, anemia sideroblástica idiopática adquirida, aplasia de glóbulos rojos, anemia megaloblástica (por ejemplo, anemia perniciosa, (deficiencia de vitamina B12 y anemia por deficiencia de ácido fólico), anemia aplásica, anemias hemolíticas (por ejemplo, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica microangiopática y hemoglobinuria paroxística nocturna). Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de las anemias asociadas con las enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, anemias asociadas con lupus eritematoso sistémico, cánceres, linfomas, enfermedad renal crónica y bazo aumentado. Las proteínas de fusión de la transferrina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de la anemia que se produce a partir de tratamientos con fármacos tales como las anemias asociadas con metildopa, dapsona y/o sulfamidas. Además, las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de las anemias asociadas con arquitectura anormal de los glóbulos rojos que incluye, pero no se limita a, esferocitosis hereditaria, eliptocitosis hereditaria, deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, anemia de células falciformes.
Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de anormalidades de la hemoglobina (por ejemplo, las asociadas con anemia de células falciformes, enfermedad de la hemoglobina C, enfermedad de la hemoglobina S-C y enfermedad de la hemoglobina E). Además, las proteínas de fusión de la transferrina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, prevención y/o pronóstico en el tratamiento de talasemias, que incluyen, pero no se limitan a, formas mayores y menores de alfa talasemia y beta talasemia.
En otra forma de realización, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de los trastornos de sangrado que incluyen, pero no se limitan a, trombocitopenia (por ejemplo, púrpura trombocitopénica idiopática, y púrpura trombocitopénica trombótica), enfermedad de Von Willebrand, trastornos plaquetarios hereditarios (por ejemplo, las enfermedades de almacenamiento tales como los síndromes de Chediak-Higashi y Hermansky-Pudlak, disfunción del tromboxano A2, tromboastenia y síndrome de Bernard-Soulier), síndrome hemolítico urémico, hemofilias tales como hemofilia A o deficiencia del Factor V-II y enfermedad de Christmas o deficiencia del Factor IX, Telangiectasia Hemorrágica hereditaria, conocida también como Síndrome de Rendu-Osler-Webe, púrpura alérgica (púrpura de Henoch Schonlein) y coagulación intravascular diseminada.
En otra forma de realización, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden ser útiles como un agente para aumentar la producción de citocina.
En algunas formas de realización, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para tratar o detectar trastornos hiperproliferativos, que incluyen neoplasmas. Las proteínas de fusión de la transferrina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden inhibir la proliferación del trastorno a través de interacciones directas o indirectas. Como alternativa, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden producir la proliferación de otras células que pueden inhibir el trastorno hiperproliferativo.
Por ejemplo, pueden tratarse los trastornos hiperproliferativos aumentando una respuesta inmune, particularmente, aumentando las calidades antigénicas del trastorno hiperproliferativo o proliferando, diferenciando, o movilizando las células T. Esta respuesta inmune puede aumentarse, tanto potenciando una respuesta inmune existente, como iniciando una nueva respuesta inmune. Como alternativa, disminuir una respuesta inmune puede ser también un procedimiento para tratar trastornos hiperproliferativos tales como un agente de quimioterapia.
Los ejemplos de trastornos hiperproliferativos que se pueden tratar o detectar mediante las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a neoplasmas localizados en el colon, abdomen, hueso, mama, aparato digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (adrenal, paratiroidea, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejido blando, bazo, tórax y tracto urogenital.
De manera similar, se pueden tratar o detectar otros trastornos hiperproliferativos mediante las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención. Los ejemplos de tales trastornos hiperproliferativos incluyen, pero no se limitan a leucemia linfoblástica aguda infantil; leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical; cáncer hepatocelular en adultos (primario), cáncer de hígado en adultos (primario), leucemia linfocítica aguda en adultos, leucemia mieloide aguda en adultos; enfermedad de Hodgkin en adultos, linfoma de Hodgkin en adultos, leucemia linfocítica en adultos, linfoma no Hodgkin en adultos, cáncer primario de hígado en adultos, sarcoma del tejido blando en adultos, linfoma relacionado con SIDA, neoplasias relacionadas con SIDA, cáncer anal, astrocitoma, cáncer de los conductos biliares, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, glioma de tronco cerebral, tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer de la pelvis renal y el uréter, linfoma del sistema nervioso central, linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral, cáncer cervical, cáncer hepatocelular infantil (primario), cáncer de hígado infantil (primario), leucemia linfoblástica aguda infantil, leucemia mieloide aguda infantil, glioma de tronco cerebral infantil, astrocitoma cerebelar infantil; astrocitoma cerebral infantil, tumores extracraneales de las células germinales infantiles, enfermedad de Hodgkin infantil, linfoma de Hodgkin infantil, glioma hipotalámico y de la ruta visual infantil, leucemia linfoblástico infantil, meduloblastoma infantil; linfoma No Hodgkin infantil, tumores neuroectodérmico primitivo supratentorial y pineal infantiles, cáncer primario de hígado infantil, rabdomiosarcoma infantil, sarcoma del tejido blando infantil, glioma hipotalámico y de la ruta visual, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, carcinoma endocrino de las células de los Islotes del páncreas, cáncer endometrial, ependimoma, cáncer epitelial, cáncer esofágico, sarcoma de Ewing y tumores relacionados, cáncer pancreático exocrino, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer extrahepático de los conductos biliares, cáncer de ojo, cáncer de mama femenino, enfermedad de Gaucher, cáncer de Vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumores gastrointestinales, tumores de células germinales, tumor Trofoblástico gestacional, leucemia de células Vellosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, enfermedad de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, hipergammaglobulinemia, cáncer de hipofaringe, cánceres Intestinales, melanoma Intraocular, carcinoma de las células de los Islotes, cáncer pancreático de la células de los Islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de labios y de la cavidad oral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, trastornos linfoproliferativos, macroglobulinemia, cáncer de pecho masculino, mesotelioma maligno, timoma maligno, meduloblastoma, melanoma, mesotelioma, cáncer escamoso metastásico del cuello con tumor primario oculto, cáncer escamoso metastásico del cuello con tumor primario, cáncer escamoso metastásico del cuello, mieloma múltiple, neoplasma de células Plasmáticas/mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, leucemia mielógena, leucemia mieloide, trastornos mieloproliferativos, cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal, cáncer de nasofaringe, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin durante el embarazo, cáncer de piel sin melanoma, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer escamoso metastásico del cuello con tumor primario oculto, cáncer de orofaringe, osteosarcoma fibroso maligno, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno del hueso, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinales de ovario, tumor de ovario con bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, paraproteinemias, púrpura, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, feocromocitoma, tumor de la pituitaria, neoplasma de células plasmáticas/mieloma múltiple, linfoma primario del sistema nervioso central; cáncer primario de hígado, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de células renales, cáncer de pelvis renal y uréter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivares, sarcomas, sarcoidosis, síndrome de Sezary, cáncer de piel, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de Intestino delgado, sarcoma del tejido blando, cáncer escamoso del cuello, cáncer de estómago, tumores neuroectodérmico primitivo supratentorial y pineal, linfoma de células T, cáncer de testículos, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de pelvis renal y uréter, cáncer de transición de pelvis renal y uréter, tumores trofoblásticos, cáncer de células de uréter y pelvis renal, cáncer de uretra, cáncer de útero, sarcoma de útero, cáncer de vagina, glioma de la ruta visual e hipotalámico; cáncer de vulva; macroglobulinemia de Waldenstrom; tumor de Wilm, y cualquier otra enfermedad hiperproliferativa, además de neoplasia localizada en un sistema de órgano presentado anteriormente.
En otra forma de realización, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención, se usan para diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar afecciones premalignas y para prevenir la progresión a un estado neoplásico o maligno, incluyendo, pero sin limitarse a, los trastornos descritos anteriormente.
Tales usos están indicados en las afecciones conocidas o sospechosas de preceder a la progresión de neoplasia o cáncer, en concreto, cuando el crecimiento de células no neoplásicas está constituido por hiperplasia, metaplasia, o más concretamente, se ha producido displasia (para una revisión de dichas afecciones de crecimiento anormal véase Robbins y Angell, 1976, Basic Pathology, 2a Ed. W. B. Saunders Co., Filadelfia, págs. 68-79).
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Hiperplasia es una forma de proliferación celular controlada, que implica un aumento en el número de células en un tejido u órgano, sin alteración significativa en la estructura o función. Los trastornos hiperplásicos que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a, hiperplasia del nódulo linfático mediastinal angiofolicular, hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia, hiperplasia melanocítica atípica, hiperplasia de células basales, hiperplasia aguda de nódulo linfático gigante, hiperplasia del cemento, hiperplasia adrenal congénita, hiperplasia sebácea congénita, hiperplasia quística, hiperplasia quística de la mama, hiperplasia de la dentadura, hiperplasia ductal, hiperplasia endometrial, hiperplasia fibromuscular, hiperplasia epitelial focal, hiperplasia gingival, hiperplasia fibrosa inflamatoria, hiperplasia papilar inflamatoria, hiperplasia endotelial papilar intravascular, hiperplasia nodular de la próstata, hiperplasia nodular regenerativa, hiperplasia pseudoepiteliomatosa, hiperplasia sebácea senil, e hiperplasia verrucosa.
En otra forma de realización, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención conjugadas con una toxina o un isótopo radioactivo, según se describe en el presente documento, pueden usarse para tratar cánceres y neoplasmas, que incluyen, pero no se limitan a, los descritos en el presente documento. En otra forma de realización de preferencia, las proteínas de fusión de la transferrina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención conjugadas con una toxina o un isótopo radioactivo, según se describe en el presente documento, pueden usarse también para tratar la leucemia mieloide aguda.
Además, las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden afectar la apoptosis, y por consiguiente, serían útiles en el tratamiento de numerosas enfermedades asociadas con un aumento en la supervivencia celular o la inhibición de la apoptosis. Por ejemplo, las enfermedades asociadas con un aumento en la supervivencia celular o la inhibición de la apoptosis que se podrían diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar por los polinucleótidos, polipéptidos y/o agonistas o antagonistas de la invención, incluyen cánceres (tales como linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones p53 y tumores dependientes de hormonas, que incluyen, pero no se limitan a, cáncer de colon, tumores cardiacos, cáncer de páncreas, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer de intestino, cáncer de testículos, cáncer de estómago, neuroblastoma, mixoma, mioma, linfoma, endotelioma, osteoblastoma, osteoclastoma, osteosarcoma, condrosarcoma, adenoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, sarcoma de Kaposi y cáncer de ovario); trastornos autoinmunes tales como, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus eritematoso sistémico y glomerulonefritis inmunorelacionada y artritis reumatoide) e infecciones virales (tales como los virus del herpes, poxvirus y adenovirus), inflamación, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo agudo al injerto, y rechazo crónico al injerto.
En formas de realización de preferencia, las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención se usan para inhibir el crecimiento, la progresión y/o la metástasis de los cánceres, en concreto, los presentados anteriormente.
Otras enfermedades o afecciones asociadas con un aumento de la supervivencia celular que se podrían diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar mediante las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a progresión y/o metástasis de neoplasias y trastornos relacionados tales como leucemia (que incluye leucemia aguda (por ejemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (que incluye mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia)) y leucemia crónica (por ejemplo, leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica)), policitemia vera, linfomas (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin y enfermedad no Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas, y tumores sólidos que incluyen, pero no se limitan a, sarcomas y carcinomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, fiposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, adenocarcinoma quístico, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de los conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, emangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y
retinoblastoma.
Las enfermedades asociadas con un aumento de la apoptosis que se podrían diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar mediante las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención, incluyen SIDA, trastornos neurodegenerativos (tal como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentosa, degeneración cerebral, tumor cerebral o enfermedad asociada a priones); trastornos autoinmunes (tales como, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus eritematoso sistémico, y glomerulonefritis inmunorelacionada y artritis reumatoide), síndromes mielodisplásicos (tales como anemia aplásica), enfermedad de injerto contra huésped Y, lesión isquémica (tal como la producida por infarto de miocardio, ictus y lesión por reperfusión), lesión de hígado (por ejemplo, lesión de hígado relacionada con hepatitis, lesión tras isquemia/reperfusión, colestosis (lesión de los conductos biliares) y cáncer de hígado), enfermedad del hígado inducida por toxina (tal como la producida por alcohol), choque séptico, caquexia y anorexia.
Otra forma de realización de preferencia, utiliza los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención para inhibir la división celular aberrante, mediante terapia génica usando la presente invención y/o las proteínas de fusión o sus fragmentos.
Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar trastornos proliferativos celulares insertando en una célula en proliferación anormal un polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la transferrina de la invención modificada de la presente invención, en el que dicho polinucleótido reprime dicha expresión.
Otra forma de realización de la presente invención proporciona un procedimiento para tratar trastornos proliferativos celulares en individuos que comprende la administración de una o más copias activas del gen de la presente invención a una célula o células en proliferación anormal.
Los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden liberarse directamente en los sitios de la enfermedad proliferativa celular desordenada, en órganos internos, cavidades corporales, y similares mediante el uso de dispositivos de formación de imagen usados para guiar una aguja de inyección directamente al sitio de la enfermedad. Los polinucleótidos de la presente invención pueden administrarse también en el sitio de la enfermedad en el momento de la intervención quirúrgica.
Por enfermedad proliferativa celular se entiende cualquier enfermedad o trastorno humano o animal, que afecta uno cualquiera o cualquier combinación de órganos, cavidades, o partes corporales, que se caracteriza por proliferaciones anormales locales únicas o múltiples de células, grupos de células, o tejidos, tanto benignas como malignas.
Se puede administrar cualquier cantidad de polinucleótidos de la presente invención a condición de que tengan un efecto de inhibir biológicamente la proliferación de las células tratadas.
Además, es posible administrar más de uno de los polinucleótidos de la presente invención simultáneamente en el mismo sitio. Por "inhibir biológicamente" se entiende la inhibición del crecimiento parcial o total así como las disminuciones en la velocidad de proliferación o el crecimiento de las células.
Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención son útiles en la inhibición de la metástasis de las células o los tejidos proliferativos. Puede producirse la inhibición como resultado directo de administrar estas proteínas de fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos, o indirectamente, tal como activando la expresión de las proteínas conocidas por inhibir la metástasis, por ejemplo, las alfa integrinas (véase, por ejemplo, Curr. Top. Mirobiol. Immunol. 1998; 231: 1 41). Pueden conseguirse tales efectos terapéuticos de la presente invención tanto solo, como en combinación con fármacos de molécula pequeña o adyuvantes.
En otra forma de realización, la invención describe también un procedimiento para liberar las composiciones que contienen las proteínas de fusión de la transferrina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención en células diana que expresan un polipéptido unido por, que se une a, o asociado con una proteína de fusión de la transferrina modificada de la invención. Las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden asociarse con polipéptidos heterólogos, ácidos nucleicos heterólogos, toxinas, o profármacos mediante interacciones hidrófobas, hidrófilas, iónicas y/o covalentes.
Las enfermedades del riñón que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con la composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, insuficiencia renal aguda, insuficiencia renal crónica, insuficiencia renal ateroembólica, enfermedad renal terminal, enfermedades inflamatorias del riñón (por ejemplo, glomerulonefritis aguda, glomerulonefritis post infecciosa, glomerulonefritis rápidamente progresiva, síndrome nefrítico, glomerulonefritis membranosa, síndrome nefrítico familiar, glomerulonefritis proliferativa de membrana y glomerulonefritis mesangial proliferativa, glomerulonefritis crónica, nefritis aguda túbulo intersticial, nefritis túbulo intersticial crónica, glomerulonefritis aguda post estreptocócica (PSGN), pielonefritis, nefritis por lupus, nefritis crónica, nefritis intersticial y glomerulonefritis post estreptocócica), trastornos de los vasos sanguíneos de los riñones (por ejemplo, infarto de riñón, enfermedad ateroembólica de riñón, necrosis cortical, nefroesclerosis maligna, trombosis de la vena renal, perfusión renal, retinopatía renal, reperfusión renal tras isquemia, embolismo de la arteria renal y estenosis de la arteria renal), trastornos del riñón como resultado de enfermedad del tracto urinario (por ejemplo, pielonefritis, hidronefrosis, urolitiasis (litiasis renal, nefrolitiasis), nefropatía de reflujo, infecciones del tracto urinario, retención urinaria, y uropatía obstructiva unilateral aguda o crónica). Además, las composiciones de la invención pueden usarse para diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar trastornos metabólicos y congénitos del riñón (por ejemplo, uremia, amiloidosis renal, osteodistrofia renal, acidosis tubular renal, glicosuria renal, diabetes nefrogénica insípida, cistinuria, síndrome de Fanconi, osteosis fibroquística renal (raquitismo renal), enfermedad de Hartnup, síndrome de Bartter, síndrome de Liddle, enfermedad renal poliquística, enfermedad quística medular, riñón medular en esponja, síndrome de Alport, síndrome de nail-patella, síndrome nefrítico congénito, síndrome de aplastamiento, riñón en herradura, nefropatía diabética, diabetes nefrogénica insípida, nefropatía analgésica, cálculos renales y nefropatía membranosa) y enfermedades autoinmunes del riñón (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico (SLE), síndrome de Goodpasture, nefropatía por IgA y glomerulonefritis mesangial proliferativa según la CIPM).
Las composiciones de la invención pueden usarse también para diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar trastornos escleróticos o necróticos del riñón (por ejemplo, glomeruloesclerosis, nefropatía diabética, glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GSFyG), glomerulonefritis narcotizante y necrosis papilar renal), cánceres del riñón (por ejemplo, nefroma, hipernefroma, nefroblastoma, cáncer de células renales, cáncer de células transicionales, adenocarcinoma renal, cáncer de células escamosas y tumor de Wilm) y desequilibrio de electrolitos (por ejemplo, nefrocalcinosis, piuria, edema, hidronefritis, proteinuria, hiponatremia, hipernatremia, hipocalemia, hipercalemia, hipocalcemia, hipercalcemia, hipofosfatemia e hiperfosfatemia).
Las composiciones de la invención pueden administrarse usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, inyección directa de aguja en el sitio de liberación, inyección intravenosa, administración tópica, infusión por catéter, inyectores biolísticos, aceleradores de partículas, depósitos tipo esponja de espuma de gel, otros materiales de depósito comercialmente disponibles, bombas osmóticas, formulaciones farmacéuticas sólidas orales o en forma de supositorio, aplicaciones para decantación o tópicas durante la cirugía, administración en aerosol. Tales procedimientos son conocidos en la técnica. Pueden administrarse las composiciones de la invención como parte de una terapéutica, descrita con más detalle a continuación.
Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención, pueden usarse para tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar trastornos cardiovasculares, incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedad de las arterias periféricas, tales como isquemia de un miembro.
Los trastornos cardiovasculares incluyen, pero no se limitan a, anormalidades cardiovasculares, tales como fístula arterio arterial, fístula arteriovenosa, malformaciones arteriovenosas cerebrales, defectos congénitos del corazón, atresia pulmonar y Síndrome de la Cimitarra.
Los defectos congénitos del corazón incluyen, pero no se limitan a, coartación aórtica, cor triatriatum, anomalías de los vasos coronarios, corazón en criss cross, dextrocardia, ductus arterioso permeable, anomalía de Ebstein, complejo de Eisenmenger, síndrome del corazón izquierdo hipoplástico, levocardia, tetralogía de Fallot, transposición de los grandes vasos, doble salida del ventrículo derecho, atresia tricuspídea, tronco arterioso persistente, defectos septales del corazón, tales como defecto septal aortopulmonar, defectos de almohadillas endocárdicas, síndrome de Lutembacher, trilogía de Fallot, defectos septales ventriculares del corazón.
Los trastornos cardiovasculares incluyen también, pero no se limitan a, cardiopatías, tales como, arritmias, enfermedad carcinoide del corazón, gasto cardiaco elevado, gasto cardiaco bajo, taponamiento cardiaco, endocarditis (que incluye bacterias), aneurisma de corazón, parada cardiaca, insuficiencia cardiaca congestiva, cardiomiopatía congestiva, disnea paroxística, edema cardiaco, hipertrofia cardiaca, cardiomiopatía congestiva, hipertrofia ventricular izquierda, hipertrofia ventricular derecha, ruptura cardiaca después de infarto, ruptura ventricular septal, enfermedades de las válvulas cardiacas, enfermedades miocárdicas, isquemia de miocardio, efusión pericárdica, pericarditis (que incluye constrictiva y tuberculosa), mesotelioma primario del pericardio, síndrome después de pericardiotomía, cardiopatía pulmonar, cardiopatía reumática, disfunción ventricular, hiperemia, complicaciones cardiovasculares del embarazo, Síndrome de la Cimitarra, sífilis cardiovascular y tuberculosis cardiovascular.
Las arritmias incluyen, pero no se limitan a, arritmia sinusal, fibrilación auricular, aleteo auricular, bradicardia, extrasístole, Síndrome de Adams-Stokes, bloqueo de rama, bloqueo senoventricular, síndrome de QT largo, parasístole, Síndrome de Lown-Ganong-Levine, síndrome de preexcitación de tipo Mahaim, síndrome de Wolff-Parkinson-White, síndrome de seno enfermo, taquicardias y fibrilación ventricular. Las taquicardias incluyen taquicardia paroxística, taquicardia supraventricular, ritmo idioventricular acelerado, taquicardia por reentrada nodal atrioventricular, taquicardia auricular ectópica, taquicardia ectópica de la unión, taquicardia por reentrada nodal senoauricular, taquicardia sinusal, taquicardia ventricular en entorchado y taquicardia ventricular.
Las enfermedades de las válvulas cardiacas incluyen, pero no se limitan a, insuficiencia de la válvula aórtica, estenosis de la válvula aórtica, murmullos cardiacos, prolapso de la válvula aórtica, prolapso de la válvula mitral, prolapso de la válvula tricúspide, insuficiencia de la válvula mitral, estenosis de la válvula mitral, atresia pulmonar, insuficiencia de la válvula pulmonar, estenosis de la válvula pulmonar, atresia de tricúspide, insuficiencia de la válvula tricúspide y estenosis de la válvula tricúspide.
Las enfermedades miocárdicas incluyen, pero no se limitan a, cardiomiopatía alcohólica, cardiomiopatía congestiva, cardiomiopatía hipertrófica, estenosis subvalvular aórtica, estenosis subvalvular pulmonar, cardiomiopatía restrictiva, cardiomiopatía de Chagas, fibroelastosis endocárdica, fibrosis endomiocárdica, Síndrome de Kearns, lesión por reperfusión de miocardio y miocarditis.
Las isquemias miocárdicas incluyen, pero no se limitan a, enfermedad coronaria, tal como angina de pecho, aneurisma coronario, arterioesclerosis coronaria, trombosis coronaria, vasoespasmo coronario, infarto de miocardio y miocardio aturdido.
Las enfermedades cardiovasculares incluyen también enfermedades vasculares tales como aneurismas, angiodisplasia, angiomatosis, angiomatosis bacilar, Enfermedad de Hippel-Lindau, Síndrome de Klippel Trenaunay Weber, Síndrome de Sturge Weber, edema angioneurótico, enfermedades aórticas, artritis de Takayasu, aortitis, síndrome de Leriche, enfermedades oclusivas arteriales, artritis, enarteritis, poliarteritis nodosa, trastornos cerebrovasculares, angiopatías diabéticas, retinopatía diabética, embolismos, trombosis, eritromelalgia, hemorroides, enfermedad veno oclusiva hepática, hipertensión, hipotensión, isquemia, enfermedades vasculares periféricas, flebitis, enfermedad veno oclusiva hepática, enfermedad de Raynaud, síndrome de CREST, oclusión de la vena retinal, síndrome de la Cimitarra, síndrome de la vena cava superior, telangiectasia, ataxia telangiectasia, telangiectasia hemorrágica hereditaria, varicocele, venas varicosas, úlcera varicosa, vasculitis e insuficiencia venosa.
Los trastornos cerebrovasculares incluyen, pero no se limitan a, enfermedades cardioarteriales, también incluyen trastornos respiratorios. Las proteínas de fusión de la transferrina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar las enfermedades y/o trastornos del sistema respiratorio.
Las enfermedades y trastornos del sistema respiratorio incluyen, pero no se limitan a, vestibulitis nasal, rinitis no alérgica (por ejemplo, rinitis aguda, rinitis crónica, rinitis atrófica, rinitis vasomotora), pólipos nasales, y sinusitis, angiofibromas juveniles, cáncer de la nariz y papilomas juveniles, pólipos de las cuerdas vocales, nódulos, nódulos del cantante, úlceras de contacto, parálisis de las cuerdas vocales, laringoceles, faringitis (por ejemplo, viral y bacteriana), tonsilitis, celulitis tonsilar, absceso para faríngeo, laringitis, laringoceles, y cánceres de garganta (por ejemplo, cáncer de la nasofaringe, cáncer de amígdala, cáncer de laringe), cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma microcítico (tipo oat cell), carcinoma de células grandes, y adenocarcinoma, trastornos alérgicos (neumonía eosinófila, neumonitis por hipersensibilidad (por ejemplo, alveolitis alérgica extrínseca, neumonitis intersticial alérgica, neumoconiosis orgánica producida por polvo, aspergiliosis broncopulmonar alérgica, asma, granulomatosis de Wegener (vasculitis granulomatosa), síndrome de Goodpasture), neumonía (por ejemplo, neumonía bacteriana (por ejemplo, Streptococcus pneumoniae (neumonía neumocócica), Staphylococcus aureus (neumonía estafilocócica), neumonía por bacterias Gram negativas (producidas por, por ejemplo, Klebsiella y Pseudomonas spp.), neumonía por Mycoplasma pneumoniae, neumonía por Hemophilus influenzae; Legionella pneumophila (enfermedad del Legionario, y Chlamydia psittaci (Psitacosis)), y neumonía viral (por ejemplo, gripe, varicela
(varicela)).
Otras enfermedades y trastornos del sistema respiratorio incluyen, pero no se limitan a bronquiolitis, polio (poliomelitis), croup, infección viral respiratoria sincitial, paperas, eritema infeccioso (la quinta enfermedad), roséola infantil, panencefalitis progresiva por rubeola, sarampión alemán, panencefalitis esclerosante subaguda), neumonía fúngica (por ejemplo, Histoplasmosis, Coccidiomicosis, Blastomicosis, infecciones fúngicas en personas con sistemas inmunes gravemente suprimidos (por ejemplo, criptococosis, producida por Cryptococcus neoformans; aspergiliosis, producida por Aspergillus spp.), candidiasis, producida por Candida; y mucormicosis)), Pneumocystis acrinii (neumonía por neumocistis), neumonías atípicas (por ejemplo, Mycoplasma y Chlamydia spp.), neumonía por infección oportunista, neumonía nosocomial, neumonitis química, y neumonía por aspiración, trastornos pleurales (por ejemplo, pleuresía, derrame pleural, y neumotórax (por ejemplo, neumotórax espontáneo simple, neumotórax espontáneo complicado, neumotórax por tensión)), enfermedades obstructivas de las vías aéreas (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, bronquitis aguda o crónica), enfermedades laborales del pulmón (por ejemplo, silicosis, pulmón negro (neumoconiosis de los mineros del carbón, asbestosis, beriliosis, asma laboral y bisiniosis), enfermedad infiltrativa pulmonar (por ejemplo, fibrosis pulmonar (por ejemplo, neumonía intersticial usual), fibrosis pulmonar idiopática, neumonía intersticial descamativa, neumonía intersticial linfoide, histiocitiosis (por ejemplo, enfermedad de Letterer-Siwe, enfermedad de Hand-Schüller-Christian, granuloma eosinófilo), hemosiderosis pulmonar idiopática, sarcoidosis y proteinosis alveolar pulmonar), síndrome de insuficiencia respiratoria aguda (denominado también, por ejemplo, síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto), edema, embolismo pulmonar, bronquitis (por ejemplo, viral, bacteriana), bronquiectasia, atelectasia, abscesos del pulmón (producidos por, por ejemplo, Staphylococcus aureus o Legionella pneumophila), y fibrosis quística.
Los cánceres que pueden tratarse con las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a tumores sólidos, que incluyen tumores de próstata, pulmón, mama, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, hígado, parótida, tracto biliar, colon, recto, cerviz, útero, endometrio, riñón, vejiga, cáncer de tiroides; tumores primarios y metástasis; melanomas; glioblastoma; sarcoma de Kaposi; leiomiosarcoma; cáncer de pulmón no microcítico; cáncer colorrectal; neoplasias malignas avanzadas; tumores hemáticos tales como leucemia. Por ejemplo, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden administrarse por vía tópica, con el fin de tratar cánceres tales como el cáncer de piel, los tumores de cabeza y cuello, tumores de mama y el sarcoma de Kaposi.
Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden ser útiles, en el tratamiento de otros trastornos, además de cánceres, que implican la angiogénesis. Estos trastornos incluyen, pero no se limitan a: tumores benignos, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas y granulomas piógenos; placas ateroescleróticas; enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo al injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, retinoblastoma, uveítis y crecimiento anormal de los vasos sanguíneos del ojo por Pterigio; artritis reumatoide; soriasis; cicatrización retardada de heridas; endometriosis; vasculogénesis; granulaciones; cicatrices hipertróficas (queloides); fracturas sin unión; escleroderma; tracoma; adhesiones vasculares; angiogénesis miocárdica; coronarias secundarias; cerebrales secundarias; malformaciones arteriovenosas; angiogénesis límbica isquémica; síndrome de Osler-Webber; neovascularización de la placa; telangiectasia, articulaciones en hemofílicos; angiofibroma; displasia fibromuscular; granulación de la herida; enfermedad de Chron; y aterosclerosis.
Por consiguiente, dentro de un aspecto de la presente invención se proporcionan procedimientos para tratar enfermedades neovasculares del ojo.
Además, los trastornos que pueden tratarse con las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a, hemangioma, artritis, soriasis, angiofibroma, placas ateroescleróticas, cicatrización retardada de heridas, granulaciones, articulaciones en hemofílicos, cicatrices hipertróficas, fracturas sin unión, síndrome de Osler-Weber, granuloma piógeno, escleroderma, tracoma; y adhesiones vasculares.
Además, los trastornos y/o estados que se pueden tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar con las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a, tumores sólidos, tumores hemáticos tales como leucemia, metástasis tumorales, sarcoma de Kaposi, tumores benignos, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas y granulomas piógenos, artritis reumatoide, soriasis, enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo al injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, retinoblastoma, y uveítis, cicatrización retardada de heridas, endometriosis, vasculogénesis, granulaciones, cicatrices hipertróficas (queloides), fracturas sin unión, escleroderma, tracoma, adhesiones vasculares, angiogénesis miocárdica, coronarias secundarias, cerebrales secundarias, malformaciones arteriovenosas, angiogénesis límbica isquémica, síndrome de Osler-Webber, neovascularización de placas, telangiectasia, articulaciones en hemofílicos, angiofibroma, displasia fibromuscular, granulación de la herida, enfermedad de Chron, ateroesclerosis, agente que controla el nacimiento evitando la vascularización requerida por el embrión, implante de control de la menstruación, enfermedades que tienen angiogénesis como consecuencia patológica tal como enfermedad por arañazo de gato (Rochele nunalia quintosa), úlceras (Helicobacter pylori), Bartonelosis y angiomatosis bacular.
En un aspecto del procedimiento de control del embarazo, se administra una cantidad del compuesto suficiente para controlar la implantación del embrión antes o después de que se haya producido el coito y la fertilización, proporcionando por consiguiente un procedimiento efectivo de control del embarazo, posiblemente un procedimiento del "día después".
Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse también en el control de la menstruación o administrarse tanto como fluido de lavado peritoneal o como implante peritoneal en el tratamiento de la endometriosis.
Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden utilizarse en una amplia diversidad de procedimientos quirúrgicos.
Las enfermedades asociadas con un aumento de la supervivencia celular o la inhibición de la apoptosis que se podrían tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar usando las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen cánceres (tales como linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones, y tumores dependientes de hormonas, que incluyen, pero no se limitan a, cáncer de colon, tumores cardiacos, cáncer de páncreas, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer de intestino, cáncer de testículos, cáncer de estómago, neuroblastoma, mixoma, mioma, linfoma, endotelioma, osteoblastoma, osteoclastoma, osteosarcoma, condrosarcoma, adenoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, sarcoma de Kaposi y cáncer de ovario); trastornos autoinmunes (tales como, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Chron, polimiositis, lupus eritematoso sistémico y glomerulonefritis inmunorrelacionada y artritis reumatoide) e infecciones virales (tales como virus del herpes, virus de la viruela y adenovirus), inflamación, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo agudo al injerto y rechazo crónico del injerto.
En formas de realización de preferencia, las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención se usan para inhibir el crecimiento, la progresión y/o la metástasis de los cánceres, en particular, los presentados anteriormente.
Otras enfermedades o afecciones asociadas con un aumento de la supervivencia celular que se podrían tratar o detectar mediante las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a la progresión y/o la metástasis de las neoplasias y los trastornos relacionados tales como leucemia (que incluye leucemia aguda (por ejemplo, leucemia aguda linfocítica, leucemia aguda mielocítica (que incluye mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia)) y leucemia crónica (por ejemplo, leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica)), policitemia vera, linfomas (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin y enfermedad no Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas, y tumores sólidos que incluyen, pero no se limitan a, sarcomas y carcinomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfoangiosarcoma, linfoangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumores de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de célula basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, adenocarcinoma quístico, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de los conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de Jung, carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma.
Las enfermedades asociadas con aumento de la apoptosis que se podrían tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar usando las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención, incluyen, pero no se limitan a, SIDA; trastornos neurodegenerativos (tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentosa, degeneración cerebelar y tumor cerebral o enfermedad asociada a priones); trastornos autoinmunes (tales como, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Chron, polimiositis, lupus eritematoso sistémico, y glomerulonefritis inmunorelacionada y artritis reumatoide), síndromes mielodisplásicos (tales como anemia aplásica), enfermedad de injerto contra huésped, lesión isquémica (tal como la producida por infarto de miocardio, ictus y lesión por reperfusión), lesión de hígado (por ejemplo, de hígado relacionada con hepatitis, lesión por isquemia/reperfusión, colestosis/lesión de los conductos biliares) y cáncer de hígado); enfermedad del hígado inducida por toxinas (tal como la producida por alcohol), choque séptico, caquexia y anorexia.
Además, las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención podrían usarse para tratar o prevenir el comienzo de la diabetes mellitus. En pacientes recientemente diagnosticados con los tipos I y II de diabetes, en los que se mantiene alguna función celular de los islotes, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención, podrían usarse para mantener la función de los islotes para por consiguiente, aliviar, retrasar o evitar la manifestación permanente de la enfermedad. También, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención podrían usarse como un auxiliar en el trasplante de las células de islotes para mejorar o promover la función celular de los islotes.
Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para el diagnóstico y/o el tratamiento de las enfermedades, trastornos, daños o lesiones del cerebro y/o el sistema nervioso. Los trastornos del sistema nervioso que pueden tratarse con la composiciones de la invención (por ejemplo, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención), limitados al sistema nervioso incluyen, pero no se limita a, las lesiones y enfermedades o los trastornos que dan como resultado una desconexión de los axones, una disminución o degeneración de las neuronas o la desmielinización. Las lesiones del sistema nervioso que pueden tratarse en un paciente (que incluyen pacientes mamíferos humanos y no humanos), según los procedimientos de la invención incluyen, pero no se limitan a, las siguientes lesiones tanto del sistema nervioso central (incluyendo la médula espinal, el cerebro) como del periférico: (1) lesiones isquémicas, en las que una ausencia de oxígeno en una porción del sistema nervioso da como resultado una lesión o muerte neuronal, incluyendo infarto o isquemia cerebral, o infarto o isquemia de la médula espinal, (2) lesiones traumáticas, que incluyen la lesiones producidas por lesión física o asociada con cirugía, por ejemplo, lesiones que dañan una parte del sistema nervioso, o lesiones por compresión; (3) lesiones malignas, en las que se destruye o lesiona una parte del sistema nervioso por tejido maligno que es tanto un carcinoma asociado al sistema nervioso como un carcinoma derivado del tejido del sistema nervioso, (4) lesiones infecciosas en las que se destruye o lesiona una parte del sistema nervioso, como resultado de la infección, por ejemplo, mediante un absceso o asociado con infección por el virus de la inmunodeficiencia, herpes zóster o el virus del herpes simple, o con la enfermedad de Lyme, tuberculosis o sífilis, (5) lesiones degenerativas, en las que se destruye o lesiona una parte del sistema nervioso como resultado de un proceso degenerativo que incluye, pero no se limita a, degeneración asociada con la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington o esclerosis lateral amiotrófica (ALS); (6) lesiones asociadas con enfermedades o trastornos nutricionales, en las que se destruye o lesiona una parte del sistema nervioso por un trastorno nutricional o trastorno del metabolismo que incluye, pero no se limita a, deficiencia de vitamina B 12, deficiencia de ácido fólico, enfermedad de Wernicke, ambliopía producida por tabaco-alcohol, enfermedad de Marchiafava-Blanami (degeneración primaria del cuerpo calloso), y degeneración cerebral alcohólica; (7) lesiones neurológicas asociadas con enfermedades sistémicas que incluyen, pero no se limitan a diabetes (neuropatía diabética, parálisis de Bell), lupus eritematoso sistémico, carcinoma, o sarcoidoisis; (8) lesiones producidas por sustancias tóxicas que incluyen, alcohol, plomo, o en particular, neurotoxinas; y (9) lesiones desmielinizadas en las que se destruye o lesiona una parte del sistema nervioso por una enfermedad desmielinizante que incluye, pero no se limita a, esclerosis múltiple, mielopatía asociada con virus de la inmunodeficiencia humana, mielopatía transversa o diversas etiologías, leucoencefalopatía multifocal progresiva y mielinosis central pontina.
En una forma de realización, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención se usan para proteger células neurales de los efectos de daños de la hipoxia. En otra forma de realización de preferencia, las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención se usan también para proteger las células neurales de los efectos del daño de la hipoxia cerebral.
En formas de realización específicas, los trastornos de las neuronas motoras que pueden tratarse según la invención incluyen, pero no se limitan a, trastornos tales como infarto, infección, exposición a toxinas, trauma, daño quirúrgico, enfermedad degenerativa o neoplasia que puede afectar a las neuronas motoras así como a otros componentes del sistema nervioso, así como trastornos que afectan selectivamente las neuronas tales como esclerosis lateral amiotrófica, y que incluyen, pero no se limitan a, atrofia muscular espinal progresiva, parálisis bulbar progresiva, esclerosis lateral primaria, atrofia muscular infantil y juvenil, parálisis bulbar progresiva infantil (síndrome de Fazio-Londe), poliomielitis y el síndrome de post polio y neuropatía sensora motora hereditaria (enfermedad de
Charcot-Marie-Tooth).
Además, las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden jugar un papel en la supervivencia neuronal; formación de la sinapsis; conductancia; diferenciación neural, etc. Por consiguiente, las composiciones de la invención (que incluyen las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención) pueden usarse para diagnosticar y/o tratar o prevenir las enfermedades o trastornos asociados con estos papeles, incluyendo, pero sin limitarse a, trastornos del aprendizaje y/o cognitivos. Las composiciones de la invención pueden ser también útiles en el tratamiento o la prevención de los estados de enfermedad neurodegenerativos y/o los trastornos del comportamiento. Tales estados de enfermedad neurodegenerativos y/o los trastornos del comportamiento incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, síndrome de Tourette, esquizofrenia, manía, demencia, paranoia, trastorno obsesivo compulsivo, trastorno de pánico, discapacidades del aprendizaje, ALS, sicosis, autismo, y comportamientos alterados, que incluyen trastornos en la alimentación, modelos de sueño, equilibrio, y percepción.
Los ejemplos de enfermedades neurológicas que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen, enfermedades cerebrales, tales como enfermedades cerebrales metabólicas que incluyen fenilcetonuria, tal como fenilcetonuria materna, deficiencia de piruvato carboxilasa, deficiencia del complejo de la piruvato deshidrogenasa, encefalopatía de Wernicke, edema cerebral, neoplasmas cerebrales tales como neoplasmas cerebelares que incluyen neoplasmas infratentoriales, neoplasmas del ventrículo cerebral tales como neoplasmas del plexo coroide, neoplasmas hipotalámicos, neoplasmas supratentoriales, enfermedad de Canavan, enfermedades cerebelares tales como ataxia cerebelar que incluye degeneración espinocerebelar tal como ataxia telangiectasia, disinergia cerebelar, ataxia de Friederich, enfermedad de Machado-Joseph, atrofia olivopontocerebelar, neoplasmas cerebelares tales como neoplasmas infratentoriales, esclerosis cerebral difusa tal como encefalitis periaxialis, leucodistrofia de células globoides, leucodistrofia metacromática y panencefalitis esclerosante subaguda.
Otras enfermedades neurológicas que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen trastornos cerebrovasculares (tales como enfermedades de la arteria carótida que incluyen trombosis de la arteria carótida, estenosis de la carótida y enfermedad de Moyamoya), angiopatía cerebral amiloide, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arterioesclerosis cerebral, malformaciones arteriovenosas cerebrales, enfermedades de las arterias cerebrales, embolismo cerebral y trombosis tal como trombosis de la arteria carótida, trombosis del seno y síndrome de Wallenger, hemorragia cerebral tal como hematoma epidérmico, hematoma subdural, y hemorragia subaracnoide, infarto cerebral, isquemia cerebral tal como isquemia cerebral transitoria, síndrome de robo de la subclavia e insuficiencia vertebrobasilar, demencia vascular tal como demencia multiinfarto, leucomalacia periventricular, cefalea vascular tal como cefalea en racimo y migraña.
Otras enfermedades neurológicas que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican la proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen demencia tal como demencia compleja por SIDA, demencia presenil, tal como enfermedad de Alzheimer, y síndrome de Creutzfeldt-Jakob, demencia senil tal como enfermedad de Alzheimer y parálisis supranuclear progresiva, demencia vascular tal como demencia multiinfarto, encefalitis que incluye encefalitis periaxial, encefalitis viral, encefalitis epidémica, encefalitis japonesa, encefalitis de San Luis, encefalitis transmitida por garrapatas y fiebre del Nilo occidental, encefalomielitis diseminada aguda, meningoencefalitis tal como síndrome uveomeningoencefalítico, enfermedad de Parkinson postencefálica, y panencefalitis esclerosante subaguda, encefalomalacia tal como leucomalacia periventricular, epilepsia tal como epilepsia generalizada, que incluye espasmos infantiles, epilepsia por ausencia, epilepsia mioclónica que incluye síndrome de MERRF, epilepsia tónica-clónica, epilepsia parcial tal como epilepsia parcial compleja, epilepsia del lóbulo frontal y epilepsia del lóbulo temporal, epilepsia post-traumática, estado epiléptico tal como epilepsia parcial continua, y síndrome de Hallervorden-Spatz.
Otras enfermedades neurológicas que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen hidrocéfalo tal como síndrome de Dandy-Walker e hidrocéfalo con presión normal, enfermedades hipotalámicas tales como neoplasmas hipotalámicos, malaria cerebral, narcolepsia que incluye catalexia, poliomelitis bulbar, seudotumor cerebral, síndrome de Rett, síndrome de Reye, enfermedades talámicas, toxoplasmosis cerebral, tuberculoma intracraneal y síndrome de Zellweger, infecciones del sistema nervioso central tales como SIDA, demencia compleja, absceso cerebral, empiema subdural, encefalomielitis tal como encefalomielitis equina, encefalomielitis equina de Venezuela, encefalomielitis hemorrágica necrotizante, visna y malaria cerebral.
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Otras enfermedades neurológicas que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen meningitis tal como aracnoiditis, meningitis aséptica tal como meningitis viral que incluye meningitis linfocítica crónica, meningitis bacterianas, que incluyen meningitis por Haemophilus, meningitis por Listeria, meningitis meningocócica tal como síndrome de Waterhouse-Friedericlisen, meningitis pneumocócica, y tuberculosis meningeal, meningitis fúngica tal como meningitis criptocócica, derrame subdural, meningoencefalitis, mielitis tal como mielitis transversa, neurosífilis tal como tabes dorsal, poliomelitis que incluye poliomielitis bulbar, y síndrome post poliomielitis, enfermedades priónicas (tales como síndrome de Creutzfeldt-Jakob, encefalitis espongiforme bovina, síndrome de Gertsmann-Straussler, Kuru, scrapie), y toxoplasmosis cerebral.
Otras enfermedades neurológicas que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen neoplasmas del sistema nervioso central tales como neoplasmas cerebrales que incluyen neoplasmas cerebelares tales como neoplasmas infratentoriales, neoplasmas del ventrículo cerebral tales como neoplasmas del plexo coroide, neoplasmas hipotalámicos y neoplasmas supratentoriales, neoplasmas meningeales, neoplasmas de la médula espinal que incluyen neoplasmas epidurales, enfermedades desmielinizantes tales como las enfermedades de Canavan, esclerosis cerebral difusa que incluye adrenoleucodistrofia, encefalitis periaxial, leucodistrofia de células globoides, esclerosis cerebral difusa tal como leucodistrofia metacromática, encefalomielitis alérgica, encefalomielitis hemorrágica necrotizante, leucoencefalopatía multifocal progresiva, en esclerosis múltiple, mielinosis pontina central, mielitis transversa, neuromielitis óptica, scrapie, Swayback, síndrome de fatiga crónica, Visna, síndrome nervioso de presión elevada, meningismo, enfermedades de la médula espinal tales como amiotonía congénita, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal tal como enfermedad de Werdnig-Hoffmann, compresión de la médula espinal, neoplasmas de la médula espinal tales como neoplasmas epidurales, siringomielia, tabes dorsal, síndrome de Stiff-Man, retraso mental tal como síndrome de Angelman, síndrome del Maullido del Gato, síndrome de de Lange, síndrome de Down, gangliosidosis tales como gangliosidosis G (MI), enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Hartnup, homocistunuria, síndrome de Laurence-Moon-Bied, síndrome de Lesch-Nylian, enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce, mucolipidosis tal como fucosidosis, lipofuscinosis ceroide neuronal, síndrome oculocerebrorrenal, fenilcetonuria tal como fenilcetonuria materna, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Rett, síndrome de Rubinstein-Taybi, esclerosis tuberosa, síndrome de WAGR, anormalidades del sistema nervioso tales como holoprosencefalia, defectos del tubo neural tales como anencefalia que incluye hidrangencefalia, deformidad de Arnold-Chairi, encefalocele, meningocele, meningomielocele, disrafismo espinal tal como espina bífida quística y espina bífida oculta.
El sistema endocrino y/o los trastornos y/o las enfermedades por desequilibrio de hormonas abarcan trastornos de la motilidad uterina que incluyen, pero no se limitan a complicaciones con el embarazo y el trabajo de parto (por ejemplo, trabajo pre-término, embarazo pre-término, aborto espontáneo y trabajo lento o parado); y los trastornos y/o enfermedades del ciclo menstrual (por ejemplo, dismenorrea y endometriosis).
El sistema endocrino y/o los trastornos y/o las enfermedades por desequilibrio de hormonas incluyen trastornos y/o enfermedades del páncreas, tales como, por ejemplo, diabetes mellitus, diabetes insípida, agenesis pancreática congénita, feocromocitoma, síndrome tumoral de las células de los islotes; trastornos y/o enfermedades de las glándulas adrenales tales como, por ejemplo, enfermedad de Addison, deficiencia de corticoesteroides, enfermedad virilizante, hirsutismo, síndrome de Cushing, hiperaldosteronismo, feocromocitoma; trastornos y/o enfermedades de las glándulas pituitarias, tales como, por ejemplo, hiperpituitarismo, hipopituitarismo, enanismo pituitario, adenoma de la pituitaria, panhipopituitarismo, acromegalia, gigantismo; trastornos y/o enfermedades del tiroides, que incluyen, pero no se limitan a, hipertiroidismo, hipotiroidismo, enfermedad de Plummer, enfermedad de Graves (bocio tóxico difuso), bocio tóxico nodular, tiroiditis (tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis granulomatosa subaguda y tiroiditis linfocítica silenciosa), síndrome de Pendred, mixedema, cretinismo, tirotoxicosis, defecto de acoplamiento de la hormona tiroidea, aplasia tímica, tumores de células de Hurthle del tiroides, cáncer de tiroides, carcinoma de tiroides, carcinoma medular de tiroides; trastornos y/o enfermedades de la paratiroides, tales como, por ejemplo, hiperparatiroidismo, hipoparatiroidismo; trastornos y/o enfermedades del hipotálamo.
Además, el sistema endocrino y/o los trastornos y/o las enfermedades por desequilibrio de hormonas pueden incluir los trastornos y/o las enfermedades de los testículos o los ovarios, incluyendo cáncer. Otros trastornos y/o enfermedades de los testículos o los ovarios incluyen además, por ejemplo, cáncer de ovario, síndrome de ovario poliquístico, síndrome de Klinefelter, síndrome de testículos evanescentes (anorquia bilateral), ausencia congénita de células de Leydig, criptorquidismo, síndrome de Noonan, distrofia miotónica, hemangioma capilar testicular (benigno), neoplasias testiculares y neotesticulares.
Además, el sistema endocrino y/o los trastornos y/o las enfermedades por desequilibrio de hormonas pueden incluir también trastornos y/o enfermedades tales como, por ejemplo, síndromes por deficiencia poliglandular, feocromocitoma, neuroblastoma, neoplasia endocrina múltiple, y trastornos y/o cánceres de los tejidos endocrinos.
Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para el diagnóstico, tratamiento, o prevención de las enfermedades y/o trastornos del sistema reproductor. Los trastornos del sistema reproductor que pueden tratarse mediante las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, lesiones del sistema reproductor, infecciones, trastornos neoplásicos, defectos congénitos, y las enfermedades o los trastornos que darán como resultado infertilidad, complicaciones con el embarazo, trabajo de parto, o parto, y dificultades después del parto.
Los trastornos y/o las enfermedades del sistema reproductor incluyen enfermedades y/o trastornos de los testículos, que incluyen atrofia testicular, feminización testicular, criptorquismo (unilateral y bilateral), anorquia, testículos ectópicos, epididimitis y orquitis (resultado normalmente de infecciones tales como, por ejemplo, gonorrea, paperas, tuberculosis y sífilis), torsión testicular, vasitis nodosa, tumores de las células germinales (por ejemplo, seminomas, carcinomas de las células embrionarias, teratocarcinomas, coriocarcinomas, tumores del saco vitelino del testículo y teratomas), tumores estromales (por ejemplo, tumores de las células de Leydig), hidrocele, hematocele, varicocele, espermatocele, hernia inguinal y trastornos de la producción espermática (por ejemplo, síndrome de los cilios inmóviles, aspermia, astenozooespermia, azooespermia, oligoespermia y teratozooespermia).
Los trastornos del sistema reproductor incluyen también trastornos de la glándula prostática, tales como prostatitis no bacteriana aguda, prostatitis no bacteriana crónica, prostatitis bacteriana aguda, prostatitis bacteriana crónica, prostatodistonia, prostatosis, prostatitis granulomatosa, malacoplakia, hipertrofia o hiperplasia prostática benigna, y trastornos neoplásicos de la próstata, que incluyen adenocarcinomas, carcinomas de células transicionales, carcinomas ductales y carcinomas de células escamosas.
Además, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, tratamiento y/o prevención de los trastornos o enfermedades del pene y la uretra, que incluyen trastornos inflamatorios, tales como balanopostitis, balanitis xerótica obliterans, fimosis, parafimosis, sífilis, virus herpes simplex, gonorrea, uretritis no gonocócica, clamidia, micoplasma, tricomonas, VIH, SIDA, síndrome de Reiter, condiloma acuminado, condiloma latum, pápulas perladas del pene, anormalidades de la uretra, tales como hipospadias, epispadias, y fimosis, lesiones premalignas, que incluyen Eritroplasia de Queyrat, enfermedad de Bowen, paplosis Bowenoide, condiloma gigante inguinal de Buscke-Lowenstein, y carcinoma verrucoso, cánceres de pene, que incluyen carcinomas de células escamosas, carcinoma in situ, carcinoma verrucoso y carcinoma diseminado del pene; trastornos neoplásicos de la uretra, que incluyen carcinoma de la uretra en el pene, carcinoma urotelial bulbomembranoso y carcinoma prostático uretral; y trastornos eréctiles, tales como priapismo, enfermedad de Peyronie, disfunción eréctil e impotencia.
Además, las enfermedades y/o los trastornos de los vasos deferentes incluyen vasculitis y CBAVD (ausencia bilateral congénita de los vasos deferentes); además, las proteínas de fusión de la transferrina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención, pueden usarse en el diagnóstico, tratamiento y/o prevención de enfermedades y trastornos de las vesículas seminales, que incluyen enfermedad hidatídica, cloridorrea congénita y enfermedad del riñón poliquístico.
Otros trastornos y/o enfermedades del sistema reproductor masculino incluyen, por ejemplo, síndrome de Klinefelter, síndrome de Young, eyaculación prematura, diabetes mellitus, fibrosis quística, síndrome de Kartagener, fiebre elevada, esclerosis múltiple y ginecomastia.
Además, los polinucleótidos, las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse en el diagnóstico, tratamiento y/o prevención de las enfermedades y/o trastornos de la vagina y la vulva, que incluyen vaginosis bacteriana, vaginitis por candida, virus del herpes simple, cancroide, granuloma inguinal, linfogranuloma venéreo, sarna, virus del papiloma humano, trauma vaginal, trauma vulvar, adenosis, vaginitis por clamidia, gonorrea, vaginitis por tricomonas, condiloma acuminado, sífilis, molluscum contagiosum, vaginitis atrófica enfermedad de Paget, líquen escleroso, líquen plano, vulvodinia, síndrome del choque tóxico, vaginismo, vulvovaginitis, vestibulitis vulvar, y trastornos neoplásicos, tales como hiperplasia de células escamosas, carcinoma de células claras, carcinoma de células basales, melanomas, cáncer de la glándula de Bartolino, y neoplasia intraepitelial vulvar.
Los trastornos y/o las enfermedades del útero incluyen dismenorrea, retrodesviación uterina, endometriosis, fibroides, adenomiosis, sangrado anovulatorio, amenorrea, síndrome de Cushiner, molas hidatídicas, síndrome de Asherman, menopausia prematura, pubertad precoz, pólipos uterinos, sangrado uterino disfuncional (por ejemplo, debido a señales hormonales aberrantes), y trastornos neoplásicos, tales como adenocarcinomas, keiomiosarcomas y sarcomas. Además, las proteínas de fusión de la transferrina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden ser útiles como un marcador o detector de, así como, en el diagnóstico, tratamiento y/o prevención de las anormalidades uterinas congénitas, tales como útero bicorne, útero septado, útero unicorne simple, útero unicorne con cuerno rudimentario sin cavidad, útero unicorne con cuerno rudimentario sin cavidad de comunicación, útero unicorne con cuerno con cavidad de comunicación, útero arcuado, útero didelfo y útero con forma de T.
Las enfermedades y/o los trastornos de los ovarios incluyen anovulación, síndrome de ovarios poliquísticos (síndrome de Stein-Leventhal), quistes ováricos, hipofunción de los ovarios, insensibilidad de los ovarios a las gonadotropinas, sobreproducción de andrógenos en los ovarios, síndrome de la vena del ovario derecho, en amenorrea, hirsutismo, y cáncer de ovarios (que incluye, pero no se limita a crecimiento canceroso primario y secundario, tumores de Sertoli-Leydig, carcinoma endometrioide del ovario, adenocarcinoma seroso papilar ovárico, adenocarcinoma mucinoso ovárico, y tumores de Krukenberg de los ovarios.
Las enfermedades y/o los trastornos cervicales incluyen cervicitis, cervicitis crónica, cervicitis mucopurulenta, y displasia cervical, pólipos cervicales, quistes de Nabothian, erosión cervical; incompetencia cervical, y neoplasmas cervicales (que incluyen, por ejemplo, carcinoma cervical, metaplasia escamosa, carcinoma de células escamosas, neoplasia de células adenoescamosas y neoplasia de células columnares).
Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para tratar o detectar agentes infecciosos. Por ejemplo, aumentando la respuesta inmune, concretamente, aumentando la proliferación y la diferenciación de las células B y/o T, pueden tratarse las enfermedades infecciosas. Puede aumentarse la respuesta inmune tanto potenciando una respuesta inmune existente, como mediante las proteínas de fusión de la invención y/o iniciando una nueva respuesta inmune. Como alternativa, los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden inhibir también directamente el agente infeccioso sin estimular necesariamente una respuesta inmune.
Los virus son un ejemplo de un agente infeccioso que puede producir enfermedad o los síntomas que se pueden tratar o detectar mediante las proteínas de fusión de la transferrina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención. Los ejemplos de virus incluyen, pero no se limitan a los siguientes virus y familias virales de ADN y ARN: Arbovirus, Adenoviridae, Arenaviridae, Arterivirus, Bimaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Dengue, VEB, VIH, Flaviviridae, Hepadnaviridae, Hepatitis, Herpesviridae (tal como, Cytomegalovirus, Herpes Simplex; Herpes Zoster), Mononegavirus (por ejemplo, Paramyxoviridae, Morbillivirus, Rhabdoviridae), Orthomyxoviridae (por ejemplo, gripe A, gripe B, y virus paragripal), virus del Papilloma, Papovaviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae (tal como Seudoviruela o Vaccinia), Reoviridae (por ejemplo, Rotavirus), Retroviridae (HTLV-I, HTLV-ll, Lentivirus) y Togaviridae (por ejemplo,
Rubivirus).
De manera similar, los agentes bacterianos y fúngicos que pueden producir enfermedades o los síntomas que se pueden tratar o detectar mediante las proteínas de fusión de la transferrina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a, las siguientes bacterias Gram negativas y Gram positivas, familias bacterianas, y hongos: Actinomyces (por ejemplo, Norcardia), Acinetobacter, Cryptococcus neoformans, Aspergillus, Bacillaceae (por ejemplo, Bacillus anthrasis), Bacteroides (por ejemplo, Bacteroides fragilis), Blastomycosis, Bordetella, Borrelia (por ejemplo, Borrelia burgdorferi), Brucella, Candida, Campylobacter, Chlamydia, Clostridium (por ejemplo, Clostridium botulinum, Clostridium dificile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani), Coccidioides, Corynebacterium (por ejemplo, Corynebacterium diptheriae), Cryptococcus, Dermatomicosis, E. coli (por ejemplo, E. coli Enterotoxigénica y E. coli Enterohemorrágica), Enterobacter (por ejemplo Enterobacter aerogenes), Enterobacteriaceae (Klebsiella, Salmonella (por ejemplo, Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi), Serratia, Yersinia, Shigella), Erysipelothrix, Haemophilus (por ejemplo, Haemophilus influenzae tipo B), Helicobacter, Legionella (por ejemplo, Legionella pneumophila), Leptospira, Listeria (por ejemplo, Listeria monocytogenes), Mycoplasma, Mycobacterium (por ejemplo, Mycobacterium leprae y Mycobacterium tuberculosis), Vibrio (por ejemplo, Vibrio cholerae), Neisseriaceae (por ejemplo, Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis), Pasteurellaceae, Proteus, Pseudomonas (por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa), Rickettsiaceae, espiroquetas (por ejemplo, Treponema. spp., Leptospira spp., Borrelia spp.), Shigella spp., Staphylococcus (por ejemplo, Staphylococcus aureus), Meningococcus, Pneumococcus y Streptococcus (por ejemplo, Streptococcus pneumoniae y los Grupos A, B, y C de Streptococcus), y Ureaplasmas.
Además, los agentes parasíticos que producen enfermedades o que se pueden tratar, prevenir y/o diagnosticar mediante las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a, las siguientes familias o clases: Amebiasis, Babesiosis, Coccidiosis, Criptosporidiosis, Dientamoebiasis, Dourina, Ectoparasíticos, Giardias, Helmintiasis, Leishmaniasis, Esquistisomas, Teileriasis, Toxoplasmosis, Tripanosomiasis, y Tricomonas y Esporozoarios (por ejemplo, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparium, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale).
Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para diferenciar, proliferar, y atraer células que aportan a la regeneración de los tejidos (Véase, Science 276: 59-87 (1997)). Podría usarse la regeneración de los tejidos para reparar, sustituir o proteger del daño en el tejido por defectos congénitos, traumas (heridas, quemaduras, incisiones o úlceras), la edad, las enfermedades (por ejemplo, osteoporosis, osteoartritis, enfermedad periodontal, insuficiencia hepática), cirugía, incluyendo cirugía plástica cosmética, fibrosis, lesión por reperfusión o daño sistémico por citocinas).
Los tejidos que podrían regenerarse usando la presente invención incluyen órganos (por ejemplo, páncreas, hígado, intestino, riñón, piel, endotelio), músculo (liso, esquelético, cardiaco), vasculatura (incluyendo la vascular y la linfática), tejido nervioso, hematopoyético, y esquelético (hueso, cartílago, tendón, y ligamento). De preferencia, la regeneración se produce con poca o ninguna cicatrización. La regeneración puede incluir también la angiogénesis.
Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden usarse para tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar trastornos gastrointestinales, que incluyen enfermedades y/o afecciones inflamatorias, infecciones, cánceres (por ejemplo, neoplasmas intestinales (tumor carcinoide del intestino delgado, linfoma no Hodgkin del intestino delgado, linfoma del intestino delgado)), y úlceras, tales como úlceras pépticas.
Los trastornos gastrointestinales incluyen disfagia, odinofagia, inflamación del esófago, esofagitis péptica, reflujo gástrico, fibrosis y estructuración submucosal, lesiones de Mallory-Weiss, lipomas, cánceres epidérmicos, adenocarcinomas, trastornos de retención gástrica, gastroenteritis, atrofia gástrica, cánceres gástrico/de estómago, pólipos de estómago, trastornos autoinmunes como anemia perniciosa, estenosis pilórica, gastritis (bacteriana, viral, eosinófila, inducida por estrés, erosiva crónica, atrófica, de células plasmáticas, y de Menetrier) y enfermedades peritoneales (por ejemplo, quiloperitoneo, hemoperitoneo, quiste mesentérico, linfadenitis mesentérica, oclusión vascular mesentérica, paniculitis, neoplasmas, peritonitis, neumoperitoneo, absceso subfrénico.
Los trastornos gastrointestinales incluyen también trastornos asociados con el intestino delgado, tales como el síndrome de mala absorción, distensión, síndrome de intestino irritable, intolerancia al azúcar, enfermedad celíaca, úlceras duodenales, duodenitis, esprúe tropical, enfermedad de Whipple, linfangiectasia intestinal, enfermedad de Crohn, apendicitis, obstrucciones del íleo, divertículo de Meckel, divertículos múltiples, fracaso de la rotación completa del intestino delgado y grueso, linfoma, y enfermedades bacterianas y parasíticas (tales como diarrea del Viajero, tifoideas y paratifoideas, cólera, infección por nemátodos (Ascariasis lumbricoides), anquilostomas (Ancylostoma duodenale), oxiuros (Enterobius vermicularis), acantocéfalos, Taenia saginata, Echinococcus granulosus, Diphyllobothrium spp. y T. solium).
Las enfermedades y/o los trastornos del hígado incluyen colestasis intrahepática (síndrome de Alagille, cirrosis hepático biliar), hígado graso (hígado graso alcohólico, síndrome de Reye), vena hepática, trombosis de la vena hepática, degeneración hepatolenticular, hepatomegalia, síndrome hepatopulmonar, síndrome hepatorrenal, hipertensión portal (varices esofágicas y gástricas), absceso hepático (absceso hepático amébico), cirrosis hepática (alcohólica, biliar y experimental), enfermedades hepáticas alcohólicas (hígado graso, hepatitis, cirrosis), parasítica (equinococosis hepática, fascioliasis, absceso hepático amébico), ictericia (hemolítica, hepatocelular y colestática), colestasis, hipertensión portal, agrandamiento del hígado, ascitis, hepatitis (hepatitis alcohólica, hepatitis intrafamiliar, hepatitis crónica (autoinmune, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, inducida por fármacos), hepatitis tóxica, hepatitis viral humana (hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E), enfermedad de Wilson, hepatitis granulomatosa, cirrosis biliar secundaria, encefalopatía hepática, hipertensión portal, varices, encefalopatía hepática, hemangiomas biliares primarios, cirrosis biliar, colangitis esclerosante primaria, adenoma hepatocelular, cálculos, insuficiencia hepática (encefalopatía hepática, insuficiencia hepática aguda), y neoplasmas hepáticos (ancriomiolipoma, metástasis del hígado calcificado, metástasis del hígado quístico, tumores epiteliales, hepatocarcinoma fibrolamelar, hiperplasia focal nodular, adenoma hepático, adenoma quístico hepatobiliar, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular, hepatoma, cáncer de hígado, hemangioendotelioma hepático, hamartoma mesenquimal, tumores mesenquimales del hígado, hiperplasia nodular regenerativa, tumores benignos de hígado (quistes hepáticos, quistes simples, enfermedad del hígado poliquístico, adenoma quístico hepatobiliar, quistes coledocales, tumores mesenquimales, hamartoma mesenquimal, hemangioendotelioma infantil, hemangioma, peliosis hepática, lipomas, seudotumor inflamatorio, tumores epiteliales variados, epitelio del conducto biliar (hamartoma del conducto biliar, adenoma del conducto biliar), hepatocitos (adenoma, hiperplasia focal nodular, hiperplasia nodular regenerativa), tumores malignos del hígado (hepatocelular, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular, colangiocelular, colangiocarcinoma, adenocarcinoma quístico, tumores de los vasos sanguíneos, angiosarcoma, sarcoma de Kaposi, hemangioendotelioma, otros tumores, sarcoma embrionario, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinosarcoma, teratoma carcinoide, carcinoma escamoso, linfoma primario)), peliosis hepática, porfiria eritrohepática, porfiria hepática (porfiria intermitente aguda, porfiria cutánea tardía), síndrome de Zelli Neger).
Las enfermedades y/o los trastornos pancreáticos incluyen pancreatitis aguda, pancreatitis crónica (pancreatitis aguda necrotizante, pancreatitis alcohólica), neoplasmas (adenocarcinoma del páncreas, adenocarcinoma quístico, insulinoma, gastrinoma y glucacronoma, neoplasmas quísticos, tumores de las células de los islotes, pancreoblastoma) y otras enfermedades pancreáticas (por ejemplo, fibrosis quística, quiste seudopancreático, fístula pancreática, insuficiencia)).
Las enfermedades de la vesícula biliar incluyen cálculos en la vesícula (colelitiasis y coledocolitiasis), síndrome de postcolecistectomía, diverticulosis de la vesícula biliar, colecistitis aguda, colecistitis crónica, tumores del conducto biliar, y mucocele.
Las enfermedades y/o los trastornos del intestino grueso incluyen colitis asociada a antibióticos, diverticulitis, colitis ulcerosa, megacolon adquirido, abscesos, infecciones fúngicas y bacterianas, trastornos anorrectales (por ejemplo, fisuras, hemorroides), enfermedades colónicas (colitis, neoplasia colónica, cáncer de colon, pólipos colónicos adenomatosos (por ejemplo, adenoma velloso), carcinoma de colon, cáncer colorrectal, diverticulitis colónica, diverticulosis colónica, megacolon, enfermedad de Hirchsprung, megacolon tóxico, enfermedades de las sigmoideas, proctocolitis, neoplasmas sigmoideos, estreñimiento, enfermedad de Crohn, diarrea (diarrea infantil, disentería), enfermedades duodenales (neoplasias duodenales, obstrucción duodenal, úlcera duodenal, duodenitis) enteritis (enterocolitis), enteropatía por VIH, enfermedades ileales (neoplasias ileales, ileitis), enfermedades inmunoproliferativas del intestino delgado, enfermedad intestinal inflamatoria (colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn), atresia intestinal, enfermedades parasíticas (anisakiasis, balantidiasis, infecciones blastoquísticas, criptoesporidiosis, dientamoebiasis, disentería amebiana, giardiasis), fístula intestinal (fístula rectal), neoplasmas intestinales (neoplasmas cecales, neoplasmas colónicos, neoplasmas duodenales, neoplasmas del íleo, pólipos intestinales, neoplasias yeyunales, neoplasmas rectales), obstrucción intestinal (síndrome del bucle aferente, obstrucción duodenal, heces impactadas, seudo obstrucción intestinal, vólvulo cecal, intosuscepción), perforación intestinal, pólipos intestinales (pólipos colónicos, síndrome de Gardner, síndrome de Peutz-Jeghers), enfermedades yeyunales (neoplasmas yeyunales), síndromes de mala absorción (síndrome del bucle ciego, enfermedad celíaca, intolerancia a la lactosa, síndrome del intestino corto, esprúe tropical, enfermedad de Whipple), oclusión vascular mesentérica, neumatosis cistoides intestinales, enteropatías con pérdida de proteínas (linfagiectasis intestinal), enfermedades rectales (enfermedades del ano, incontinencia fecal, hemorroides, proctitis, fístula rectal, prolapso rectal, rectocele), úlcera péptica (úlcera duodenal, esofagitis péptica, hemorragia, perforación, úlcera de estómago, síndrome de Zollinger-Ellison), síndromes de postgastrectomía (síndrome de dumping), enfermedades del estómago (por ejemplo, aclorhidria, reflujo duodenogástrico (reflujo biliar), ectasia vascular antral gástrica, fístula gástrica, obstrucción de la salida gástrica, gastritis (atrófica o hipertrófica), gastroparesis, dilatación del estómago, divertículos del estómago, neoplasmas del estómago (cáncer gástrico, pólipos gástricos, adenocarcinoma gástrico, pólipo gástrico hiperplásico), rotura del estómago, úlcera de estómago, vólvulo de estómago), tuberculosis, visceroptosis, vómitos (por ejemplo, hematemesis, hiperemesis grávida, náuseas y vómitos postoperatorios) y colitis hemorrágica.
Otras enfermedades y/o trastornos del sistema gastrointestinal incluyen las enfermedades del tracto biliar, tales como, gastroesquisis, fístula (por ejemplo, fístula biliar, fístula esofágica, fístula gástrica, fístula pancreática), neoplasmas (por ejemplo, neoplasmas del tracto biliar, neoplasmas esofágicos, tales como adenocarcinoma del esófago, carcinoma de células escamosas esofágicas, neoplasmas gastrointestinales, neoplasmas pancreáticos, tales como adenocarcinoma del páncreas, neoplasma quístico mucinoso del páncreas, neoplasmas quísticos pancreáticos, pancreatoblastoma, y neoplasmas peritoneales), enfermedad esofágica (por ejemplo, enfermedades bullosas, candidiasis, acantosis glicogénica, úlcera, varices esofágicas de Barrett, atresia, quistes, divertículos (por ejemplo, divertículos de Zenker), fístula (por ejemplo, fístula traqueoesofágica), trastornos de motilidad (por ejemplo síndrome de CREST, trastornos de la deglución, acalasia, espasmo, reflujo gastroesofágico), neoplasmas, perforación (por ejemplo, síndrome de Boerhaave, síndrome de Mallory-Weiss), estenosis, esofagitis, hernia de diafragma (por ejemplo, hernia de hiato); enfermedades gastrointestinales, tales como gastroenteritis (por ejemplo, cólera morboso, infección por virus de Norwalk), hemorragia (por ejemplo, hematemesis, melena, hemorragia por úlcera péptica), neoplasmas del estómago (cáncer gástrico, pólipos gástricos, adenocarcinoma gástrico, cáncer de estómago)), hernia (por ejemplo, hernia diafragmática congénita, hernia femoral, hernia inguinal, hernia obturadora, hernia umbilical, hernia ventral), y enfermedades intestinales (por ejemplo, enfermedades cecales (apendicitis, neoplasmas cecales)).
Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o os polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden tener actividad quimiotáctica. Una molécula quimiotáctica atrae o moviliza células (por ejemplo, monocitos, fibroblastos, neutrófilos, células T, células mastocíticas, eosinófilos, células epiteliales y/o endoteliales) a un sitio concreto en el cuerpo, tal como inflamación, infección, o sitio de hiperproliferación. Las células movilizadas pueden a continuación rechazar y/o sanar el trauma o anormalidad particular.
Las proteínas de fusión de la transferrina modificada de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención pueden aumentar la actividad quimiotáctica de células concretas. Estas moléculas quimiotácticas pueden usarse a continuación para tratar la inflamación, infección, trastornos hiperproliferativos, o cualquier trastorno del sistema inmune aumentando el número de células dirigidas hacia una localización concreta en el cuerpo.
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Animales transgénicos
En una forma de realización de la presente invención se contempla la producción de animales transgénicos no humanos que contienen una construcción de fusión de la transferrina modificada con semivida aumentada en suero, estabilidad aumentada en suero o biodisponibilidad aumentada de la presente invención. En algunas formas de realización puede usarse lactoferrina como la porción de Tf de la proteína de fusión de tal manera que la proteína de fusión se produce y secreta en la leche. En otras formas de realización, la presente invención incluye la producción de proteínas de fusión de la Tf en leche.
Se ha descrito la producción satisfactoria de animales transgénicos no humanos en una serie de patentes y publicaciones, tales como, por ejemplo la Patente de EEUU Nº 6.291.740 (otorgada el 18 de septiembre de 2001); la patente de EEUU Nº 6.281.408 (otorgada el 28 de agosto de 2001); y la Patente de EEUU Nº 6.271.436 (otorgada el 7 de agosto de 2001).
La capacidad de alterar el componente genético de animales, tales como mamíferos domesticados que incluyen vacas, cerdos, cabras, caballos, ganado y ovejas, permite numerosas aplicaciones comerciales. Estas aplicaciones incluyen la producción de animales que expresan grandes cantidades de proteínas exógenas en una forma que puede recogerse fácilmente (por ejemplo, expresión en la leche o en la sangre), la producción de animales con mayor ganancia de peso, eficiencia de la alimentación, composición de la res muerta, producción o contenido de leche, resistencia a enfermedades y resistencia a la infección por microorganismos específicos y la producción de animales que tienen índices de crecimiento o comportamiento reproductor potenciados. Los animales que contienen secuencias de ADN exógeno en su genoma se denominan animales transgénicos.
El procedimiento más ampliamente usado para la producción de animales transgénicos es la microinyección de ADN en los pronúcleos de los embriones fertilizados (Wall y col., J. Cell. Biochem. 49:113 [1992]). Otros procedimientos para la producción de animales transgénicos incluyen la infección de embriones con retrovirus o con vectores retrovirales. Se ha informado la infección de embriones de ratón antes y después de la implantación con retrovirus de tipo natural o recombinante (Janenich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 1260 [1976]; Janenich y col., Cell 24: 519 [1981]; Stuhlmann y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7151 [1984]; Jahner y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 6927 [1985]; Van der Putten y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 6148-6152; Stewart y col., EMBO J. 6: 383-388 [1987]).
Un medio alternativo para infectar embriones con retrovirus es la inyección de virus o células que producen virus en el blastocele de embriones de ratón (Jahner, D. y col., Nature 298: 623 [1982]). Se ha informado la introducción de transgenes en la línea germinal de ratones usando infección retroviral intrauterina de embriones de ratón parcialmente gestados (Jahner y col., supra [1982]). Se ha informado la infección de embriones de bovino y ovino con retrovirus o vectores retrovirales para crear animales transgénicos. Estos protocolos implican la microinyección de partículas retrovirales o células con el crecimiento detenido (es decir, tratadas con mitomicina C) que expulsan partículas retrovirales al espacio perivitelino de los huevos fertilizados o de los embriones tempranos (Solicitud Internacional PCT WO 90/08832 [1990]; y Haskell y Bowen, Mol. Reprod. Dev., 40:386 [1995]). La Solicitud Internacional PCT WO 90/08832 describe la inyección del virus B de la leucemia de felinos de tipo natural en el espacio perivitelino de embriones de oveja en la etapa de 2 a 8 células. Se demostró que los fetos derivados de los embriones inyectados mostraban múltiples sitios de integración.
La Patente de EEUU Nº 6.291.740 (otorgada el 18 de septiembre de 2001) describe la producción de animales transgénicos mediante la introducción de ADN exógeno en los oocitos premaduros y maduros, los oocitos no fertilizados (es decir, los oocitos previo a la prefertilización) usando vectores retrovirales que traducen las células en división (por ejemplo, vectores derivados del virus de la leucemia de murino [VLM]). Esta patente describe también los procedimientos y las composiciones para la dirección por el promotor del citomegalovirus, así como la expresión de diversas proteínas recombinantes de LTR en un tumor mamario de ratón.
La Patente de EEUU Nº 6.281.408 (otorgada el 28 de agosto de 2001) describe los procedimientos para producir animales transgénicos usando células madre embrionarias. Brevemente, se usaron células madre embrionarias en un cultivo simultáneo de células mixtas con mórula para generar animales transgénicos. Se introdujo el material genético extraño en las células madre embrionarias antes del cultivo simultáneo mediante, por ejemplo, electroporación, microinyección o liberación retroviral. Se seleccionaron las células ES transfectadas de esta manera para las integraciones en el gen mediante un marcador de selección tal como neomicina.
La Patente de EEUU Nº 6.271.436 (otorgada el 7 de agosto de 2001) describe la producción de animales transgénicos usando procedimientos que incluyen el aislamiento de células germinales primordiales, cultivando estas células para producir líneas de células derivadas de células germinales primordiales, transformando las células germinales primordiales y las líneas celulares cultivadas, y usando estas células transformadas y las líneas celulares para generar animales transgénicos. Se aumentó mucho la eficiencia con la que se generaron los animales transgénicos, permitiendo por tanto el uso de la recombinación homóloga en la producción de especies animales transgénicas no
roedores.
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Terapia génica
En una forma de realización de la presente invención se contempla el uso de las construcciones de fusión de la transferrina modificada para la terapia génica en el que una proteína de transferrina modificada o dominio de transferrina se une a una proteína o péptido terapéutico. Las construcciones de fusión de la transferrina modificada con semivida en suero o estabilidad en suero aumentadas son idealmente adecuadas para los tratamientos de terapia génica.
Se ha descrito el uso satisfactorio de la terapia génica para expresar una proteína de fusión soluble. Brevemente, se demostró recientemente la terapia génica mediante inyección de un vector de adenovirus que contiene un gen que codifica una proteína de fusión soluble constituida por el antígeno 4 de los linfocitos citotóxicos (CTLA4) y la porción Fc de la inmunoglobulina G1 humana en Ijima y col. (Human Gene Therapy (Estados Unidos) 12/9: 1063-1077, 2001). En esta aplicación de la terapia génica, se trató satisfactoriamente un modelo de artritis inducida por colágeno de tipo II en murino, mediante la inyección intraarticular del vector.
Se describe también la terapia génica en una serie de patentes de EEUU que incluyen la Patente de EEUU Nº 6.225.290 (otorgada el 1 de mayo de 2001); la Patente de EEUU Nº 6.187.305 (otorgada el 13 de febrero de 2001); y la Patente de EEUU Nº 6.140.111 (otorgada el 31 de octubre de 2000).
La Patente de EEUU Nº 6.225.290 proporciona los procedimientos y construcciones en los que células epiteliales intestinales de un sujeto mamífero se alteran genéticamente para incorporar operativamente un gen que expresa una proteína que tiene un efecto terapéutico deseado. Se llevó a cabo la transformación de células intestinales mediante la administración de una formulación compuesta principalmente por ADN desnudo, y el ADN puede administrarse por vía oral. Las rutas de administración oral u otras rutas gastrointestinales proporcionan un procedimiento sencillo de administración, mientras que el uso de ácido nucleico desnudo evita las complicaciones asociadas con el uso de vectores virales para llevar a cabo la terapia génica. La proteína expresada se secretó directamente en el tracto gastrointestinal y/o el torrente sanguíneo para obtener niveles terapéuticos en sangre de la proteína tratando de ese modo al paciente que necesita la proteína. Las células epiteliales intestinales transformadas proporcionan curas terapéuticas a corto o largo plazo de las enfermedades asociadas con una deficiencia en una proteína concreta o que son adecuadas para el tratamiento mediante la sobreexpresión de una proteína.
La Patente de EEUU Nº 6.187.305 proporciona los procedimientos para dirigir un gen o ADN en células de vertebrados, particularmente de origen mamífero. Brevemente, se introdujo el ADN en las células primarias o secundarias de origen vertebrado mediante la recombinación homóloga o dirigiendo el ADN, que se introdujo en el ADN genómico de las células primarias o secundarias en un sitio preseleccionado.
La Patente de EEUU Nº 6.140.111 (otorgada el 31 de octubre de 2000) describe vectores retrovirales de terapia génica. Los vectores retrovirales que se dan a conocer incluyen un sitio de inserción para los genes de interés y son capaces de expresar elevados niveles de la proteína derivada de los genes de interés en una amplia variedad de tipos celulares transfectados. Se dan a conocer también los vectores retrovirales que carecen de un marcador seleccionable, volviéndolos de esta manera adecuados para la terapia génica humana en el tratamiento de una diversidad de estados de enfermedad sin la expresión simultánea de un producto marcador, tal como un antibiótico. Estos vectores retrovirales son especialmente adecuados para el uso en algunas líneas celulares de empaquetamiento. La capacidad de los vectores retrovirales para insertarse en el genoma de las células de mamífero les hace candidatos particularmente prometedores para uso en la terapia génica de las enfermedades genéticas en seres humanos y animales. La terapia génica implica normalmente (1) añadir nuevo material genético a las células del paciente in vivo, o (2) eliminar células del paciente del cuerpo, añadir nuevo material genético a las células y reintroducirlas en el cuerpo, es decir, terapia génica in vitro. Pueden encontrarse análisis sobre cómo llevar a cabo la terapia génica en una diversidad de células usando vectores retrovirales, por ejemplo, en las Patentes de EEUU Nº 4.868.116, otorgada el 19 de septiembre de 1989, y Nº 4.980.286, otorgada el 25 de diciembre de 1990 (células epiteliales), los documentos WO 89/07136 publicado el 10 de agosto de 1989 (células hepatocitos), EP 378.576 publicado el 25 de julio de 1990 (células fibroblastos), y WO 89/05345 publicado el 15 de Junio de 1989 y WO/90/06997, publicado el 28 de junio de 1990 (células endoteliales).
Sin otra descripción, se cree que un experto en la técnica puede, usando la descripción anterior y los siguientes ejemplos ilustrativos, realizar y utilizar la presente invención y poner en práctica los procedimientos reivindicados. Por ejemplo, un experto será rápidamente capaz de determinar la actividad biológica, tanto in vitro como in vivo, de las construcciones de proteína de fusión de la presente invención en comparación con la actividad comparable del resto terapéutico en su estado no fusionado a la transferrina. De manera similar, un experto en la técnica será rápidamente capaz de determinar la semivida y la estabilidad en suero de las construcciones según la presente invención. Los siguientes ejemplos de trabajo apuntan por consiguiente específicamente a las formas de realización preferidas de la presente invención, y no deben tomarse de ninguna manera como limitantes del resto de la memoria descriptiva.
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Ejemplos Ejemplo 1 Transferrina NC(N)
El punto de partida para esta variante es la transferrina en la que se sustituyeron las regiones alrededor de los sitios de N glicosilación del dominio C (N413-S415 y N611-T613 de ID. SEC. Nº 3) injertando sobre las regiones estructuralmente equivalentes del dominio N.
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N413
Se sustituyó la región 413-427 (ID. SEC. Nº 3) del dominio C con 86-96 (ID. SEC. Nº 3) del dominio N. De ser necesario, la región exacta sustituida puede extenderse más a cada lado de los residuos dados para mejorar la remodelación. Como puede observarse debajo de la secuencia alrededor de las regiones resaltadas para sustitución (subrayadas), la estructura del dominio N y del dominio C es prácticamente idéntica.
130
Como parte de la remodelación de esta región es necesaria la mutación de C637 (ID. SEC. Nº 3) a por ejemplo G637. C637 (ID. SEC. Nº 3) forma un enlace disulfuro C418, que está sustituido en esta remodelación. De no mutarse C637, quedaría una cisteína libre.
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N611
Se sustituyó la región 610-620 (ID. SEC. Nº 3) del dominio C con 276-283 (ID. SEC. Nº 3) del dominio N. De ser necesario, la región exacta sustituida puede extenderse más a cada lado de los residuos dados para mejorar la remodelación. Como puede observarse debajo de la secuencia alrededor de las regiones resaltadas para sustitución (subrayadas), la estructura del dominio N y del dominio C es prácticamente idéntica. Las cisteínas en este segmento, C615 y C620 forman un enlace disulfuro entre sí por lo que no son necesarios más cambios para tratar esto.
131 
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Alineación de las variantes Hu Tf N413Q/N611Q (Hu Tf NQ) y NC (N)
1310
132 
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Ejemplo 2 Transferrina NN
Esta variante(s) de la transferrina comprende una duplicación del dominio N. La secuencia utilizada es la de los aminoácidos 4-330 con T5 mutado a P5 para proporcionar el pliegue requerido en esta región. Para generar tal variante, el ADNc requiere la optimización del codón para uno u otro de los dos dominios N para evitar la recombinación homóloga en el vector de expresión.
El punto en el que está unido el segundo dominio N puede incluir la mayor parte, si no la totalidad, del conector peptídico (331-339). De usarse todo el conector entonces debería incluirse una cisteína libre ya que C339 normalmente forma un enlace disulfuro con C596 en el dominio C para el que no hay equivalente en el dominio N. En este caso existen dos opciones, mutar o delecionar C339 y dejar el resto de la molécula como está o dejar C339 y elimina, mutar o injertar sobre la región estructuralmente equivalente del dominio C.
133 
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El extremo C terminal de la variante NN difiere del extremo C terminal normal de la Tf en que su longitud final es 13 aminoácidos más corta. Hay otras dos opciones, añadir el extremo C terminal normal en el extremo del segundo dominio N o continuar el extremo del dominio N usando el conector peptídico de alguna manera.
134 
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Usar el extremo C terminal natural (TSSLLEACTFRRP, aminoácidos 667 a 679 de ID. SEC. Nº 3) del dominio C haría necesaria la mutación de C674 a por ejemplo G674 ya que este residuo normalmente forma un enlace disulfuro con C402 del dominio C. Este disulfuro normalmente sujeta el extremo C terminal y, como tal, su deleción puede hacer que el extremo C terminal sea más accesible. Como alternativa, podría eliminarse N74, el equivalente estructural de C402, o mutarse a una cisteína, o injertarse la región con la región similar del dominio C.
135 
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De incluirse el conector peptídico (CPEAPTDEC, aminoácidos 331-339 de ID. SEC. Nº 3), con la deleción de la cisteína terminal, los extremos C terminales estarían orientados de manera diferente por estar enroscados en la dirección opuesta a los extremos C terminales normales. Para una fusión C terminal esto puede dar como resultado una mejor biodisponibilidad ya que está más expuesto. Un enlace disulfuro podría, potencialmente, anclar el péptido. En el extremos C terminal hay un enlace disulfuro formado entre C474 y C655. Este enlace podía introducirse mutando G229 del segundo dominio N a una cisteína. Como alternativa, C331 puede formar naturalmente un enlace con C474. Si no se produce ninguna de estas opciones, será necesario mutar C474 para evitar que quede una cisteína libre. La modificación al dominio N duplicado podría continuar usando más regiones estructuralmente equivalentes del dominio C de considerarse necesario.
Se construyó un modelo para la transferrina NN superponiendo un segundo dominio N (9-339), N', sobre el modelo de Tf Hu, delecionando el dominio C de Tf Hu a 344 y uniendo a continuación los dos dominios N juntos. A partir de allí los cambios se realizaron como se detalló anteriormente.
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Alineación de la variante Tf NN (C)
136
137
138 
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<110> Turner, Andrew J.
\hskip1cm
Sadeghi, Homayoun 
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<120> Proteínas de fusión de la transferrina modificada que comprenden dominios amino o carboxilo de transferrina duplicados
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> 54710-5003-WO
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/406.977
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 30-08-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2318
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (51)..(2147)
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<223> GenBank Nº NM_001063, gen y proteína de la transferrina
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> sig_peptide
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<222> (51)..(107)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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139
140
141
142 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 698
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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143
144
145 
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<210> 3
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<211> 679
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Proteína transferrina madura
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
146
147
148 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> CARACTERÍSTICA MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido antifusogénico T-20 de VIH
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
149 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la inmunodeficiencia humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido antifusogénico T-1249 de VIH y T786 de VSR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
150 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus sincitial respiratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido antifusogénico T1584 de VSR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
151 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus sincitial respiratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido antifusogénico T112 de VSR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
152 
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<210> 8
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<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región de variante de corte y empalme de lactoferrina, de Nº de acceso de Genbank AAA59479
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
153 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 679
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
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<220>
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<223> Transferrina humana modificada para reducir la glicosilación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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154
156 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 672
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Transferrina humana modificada para reducir la glicosilación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
157
158
159 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 674
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<212> PRT
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<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Variante 1JNF de transferrina modificada
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 11
160
161
162 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 12
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<211> 673
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<212> PRT
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<213> artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Transferrina modificada de 2 dominios N
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 12
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163
164
165 
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<210> 13
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<211> 667
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<212> PRT
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<213> artificial
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<220>
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<223> Transferrina modificada de 2 dominios N y extremo terminal del dominio C
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<400> 13
166
167
168

Claims (37)

1. Una proteína de fusión de la transferrina que comprende un resto de transferrina (Tf) y al menos una proteína o péptido terapéutico, en la que dicho resto de transferrina se selecciona del grupo constituido por
(i)
un resto de transferrina que comprende dos o más dominios N de transferrina;
(ii)
un resto de transferrina que comprende un dominio N de transferrina y un dominio C de transferrina que ha sido modificado por sustitución de aminoácidos de las regiones del dominio C o aminoácidos para las regiones correspondientes o aminoácidos del dominio N según se muestra en ID. SEC. Nº 2 ó 3, para presentar patrones de glicosilación y propiedades de unión del hierro de un dominio N de la transferrina nativa o de tipo natural según se muestra en ID. SEC. Nº 2 ó 3;
(iii)
un resto de transferrina que comprende dos o más dominios C de transferrina que están modificados para inhibir o prevenir la glicosilación y la unión al receptor de Tf; y
(iv)
un resto de transferrina constituido por dos dominios N de transferrina;
en la que dicho resto de transferrina prolonga la estabilidad en el suero, la semivida en circulación in vivo y la biodisponibilidad de dicha proteína terapéutica.
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2. Una proteína de fusión de la transferrina según la reivindicación 1, en la que el resto de transferrina comprende dos o más dominios N de transferrina.
3. Una proteína de fusión de la transferrina según la reivindicación 1, en la que la transferrina está constituida por dos dominios N de transferrina.
4. Una proteína de fusión de la transferrina según la reivindicación 1, en la que el resto de transferrina comprende un dominio N de transferrina y un dominio C de transferrina que se ha modificado por sustitución de aminoácidos de las regiones del dominio C o aminoácidos para las regiones correspondientes o aminoácidos del dominio N según se muestra en ID. SEC. Nº 2 ó 3, para presentar patrones de glicosilación y propiedades de unión de hierro de un dominio N de transferrina nativa o de tipo natural según se muestra en ID. SEC. Nº 2 ó 3.
5. Una proteína de fusión de la transferrina según la reivindicación 2, en la que el resto de transferrina no está glicosilado.
6. Una proteína de fusión de la reivindicación 5, en la que la semivida en suero de la proteína o péptido terapéutico está aumentada en comparación con la semivida en suero de la proteína o péptido terapéutico en estado no fusionado.
7. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que la proteína o péptido terapéutico está fusionado al extremo C terminal del resto de transferrina.
8. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que la proteína o péptido terapéutico está fusionado al extremo N terminal del resto de transferrina.
9. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que la proteína o péptido terapéutico está insertado en al menos un bucle del resto de transferrina.
10. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que el resto de transferrina tiene afinidad reducida por un TfR.
11. La proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que el resto de transferrina es lacto transferrina (lactoferrina).
12. Una proteína de fusión de la reivindicación 10, en la que el resto de transferrina no se une a TfR.
13. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que el resto de transferrina tiene afinidad reducida por el hierro.
14. Una proteína de fusión de la reivindicación 13, en la que el resto de transferrina no une el hierro.
15. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que el resto de transferrina comprende al menos una mutación que evita la glicosilación.
16. Una proteína de fusión de la reivindicación 15, en la que la proteína transferrina es lacto transferrina (lactoferrina).
17. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que un conector peptídico une la proteína o péptido terapéutico al resto de transferrina.
18. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que el resto de transferrina tiene al menos una sustitución, deleción o adición de aminoácido en la región bisagra para impedir el cambio conformacional necesario para la unión del hierro o el reconocimiento del receptor de Tf.
19. Una proteína de fusión de la reivindicación 18, en la que dicha región horquilla se selecciona del grupo constituido por el residuo 94 al residuo 96 de ID. SEC. Nº 3, el residuo 245 al residuo 247 de ID. SEC. Nº 3, y el residuo 316 al residuo 318 de ID. SEC. Nº 3 del dominio N.
20. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que dicho resto de transferrina tiene al menos una sustitución, deleción o adición de aminoácido en una posición en ID. SEC. Nº 3 seleccionada del grupo constituido por los residuos Asp 63, Gly 65, Tyr 95, Tyr 188, Lys 206, His 207, His 249, Thr 120, Arg 124, Ala 126 y Gly 127 del dominio N.
21. Una proteína de fusión de la reivindicación 9, en la que la proteína o péptido terapéutico sustituye al menos un bucle.
22. Una proteína de fusión de la reivindicación 4, en la que los residuos del dominio C que corresponden a los aminoácidos 413-427 de ID. SEC. Nº 3 están sustituidos con los residuos del dominio N que corresponden a los aminoácidos 86-96 de ID. SEC. Nº 3.
23. Una proteína de fusión de la reivindicación 4, en la que los residuos del dominio C que corresponden a los aminoácidos 610-620 de ID. SEC. Nº 3 están sustituidos con los residuos del dominio N que corresponden a los aminoácidos 276-283 de ID. SEC. Nº 3.
24. Una proteína de fusión de la transferrina según la reivindicación 1, en la que el resto de transferrina comprende dos o más dominios C de transferrina que están modificados para inhibir o evitar la glicosilación y la unión al receptor de Tf.
25. Una proteína de fusión de la transferrina de la reivindicación 24, en la que el resto de transferrina se ha modificado para inhibir o evitar la unión del hierro.
26. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de la reivindicación 1.
27. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 26.
28. Una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 26 o un vector de la reivindicación 27.
29. Un procedimiento para expresar una proteína de fusión de Tf que comprende cultivar una célula huésped de la reivindicación 29 en condiciones en las que exprese la proteína de fusión codificada.
30. Una célula huésped de la reivindicación 28, en la que la célula es procariota o eucariota.
31. Una célula huésped de la reivindicación 30, en la que la célula es una célula de levadura.
32. Un animal transgénico no humano que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 26.
33. Un procedimiento para producir una proteína de fusión de Tf que comprende aislar una proteína de fusión de una muestra obtenida de un animal transgénico no humano de la reivindicación 32.
34. Un procedimiento de la reivindicación 33, en el que el resto de transferrina es un resto de lactoferrina.
35. Un procedimiento de la reivindicación 34, en el que la muestra es un líquido biológico de un animal transgénico no humano.
36. Un procedimiento de la reivindicación 35, en el que el líquido es suero o leche.
37. Una proteína de fusión de la reivindicación 1 para uso en el tratamiento de una enfermedad o síntoma de enfermedad en un paciente.
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