JP2009540799A

JP2009540799A - 血液脳関門標的化抗体

Info

Publication number: JP2009540799A
Application number: JP2009514526A
Authority: JP
Inventors: エリックブイ．シュスタ，; シンエックス．ワン，; ヨングクピー．チョー，
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 2006-06-07
Filing date: 2007-06-07
Publication date: 2009-11-26
Also published as: US20080019984A1; WO2007143711A2; EP2029621A2; US7744879B2; WO2007143711A3; CA2653444A1; AU2007256639A1

Abstract

本発明は、受容体及び結合リガンドのエンドサイトーシス／トランスサイトーシスをもたらす脳内皮細胞受容体と結合する抗体を提供する。実施形態によっては、リガンドは、薬学的に活性な化合物と抗体を含み、抗体は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通る化合物の送達に関する。本発明は、培養細胞単層からライブラリを選抜することによって、内皮細胞特異的抗体を特定する方法も提供する。さらに本発明は、抗体と結合する内皮細胞受容体を特定することによって、さらなる同族リガンド及びそれらに関連した輸送系を単離し、且つ抗体によって標的化されたトランスサイトーシス輸送体を特定する標的受容体を提供することを可能にする。
【選択図】図４

Description

（関連出願の相互参照）
この本出願は、２００６年６月７日に出願された米国特許仮出願第６０／８１１，６１８号（全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される）の利益を主張する。

（連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載）
本研究は一部、米国立衛生研究所から助成金番号ＮＳ０５２６４９の援助を受けている。米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。

（発明の技術分野）
本発明は概して、内皮細胞表面受容体を認識する抗体、及びこのような抗体を特定する方法に関する。

脳及び神経系の疾患に対する治療法は、脳の血管が血流中に運ばれるほとんどの物質に対して不浸透性であるために極めて制限されている。血液脳関門（ＢＢＢ）と総称される脳の血管は、身体の末梢部で見出される血管に比べて特殊である。ＢＢＢ内皮細胞（ＥＣ）と、星状膠細胞、周皮細胞及びニューロン等の神経細胞との密接な付着（apposition）が、観察された不浸透性に寄与する表現型特性を誘導する。ＢＢＢを含むＥＣ間の密着結合が傍細胞輸送を制限する一方で、飲小胞及び空間の欠如は非特異的な経細胞輸送を制限する。これらの要因が合わさって、血液から脳への分子流出を５００ダルトン未満に制限すると共に、脂溶性である分子に制限する。したがって、所望の薬理学的特性を有する薬物が偶発的に血管を自由に通るサイズ及び親油性特質を備えるような状況を除いてほとんどの場合、輸送ビヒクルとして、大量の輸送表面積（ヒト脳の毛細血管４００マイルで２１ｍ^２を超える）の血流を用いることはできない。このような制限のために、全ての小分子の調合薬の９８％超、並びに新興群のタンパク質及び遺伝子治療薬のほぼ１００％がＢＢＢを通過しないことが推測される。

ＢＢＢによって与えられた物理的障壁に加えて、ｐ−糖タンパク質（ＭＤＲ１）等の排出輸送体及び多剤耐性関連タンパク質ファミリ（ＭＲＰ）成員は、小さくて脂溶性の小分子の脳への取り込みをさらに制限するのに働く。図１Ａは、血管におけるホースラディッシュペルオキシダーゼの隔離を示すラットの脳（Ｖ＝脳室）断片の顕微鏡写真であり、ＢＢＢを欠く毛細血管によって灌流された脳の小領域では、タンパク質が脳組織に容易に拡散する。また、図２ＡはＢＢＢの不浸透性を示す：ヒスタミン（１１１Ｄａ）は血管内に隔離されたままであり、脳内部には侵入しない。

脳腫瘍、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び脳卒中等の神経系の疾患が世界中の人々を苦しめ続けているが、このような疾患を治療する新規の治療法は不足している。治療法の不足は一部、効果的な脳輸送戦略の不足に起因している可能性がある。この治療法不足のために、さらに米国立衛生研究所の腫瘍及び脳卒中進行の検討グループは、研究の最優先事項として脳血管関門を通って標的化する薬物又は遺伝子に対する革新的戦略の探求を確認した。米国立衛生研究所（ＮＩＨ）のガイドラインは、基礎神経科学のこのような躍進が診療所に伝えられ得ることを指示しており、「薬剤送達戦略及び／又は脳の特定領域を標的化する能力を要求している」。したがって、標的化及び経ＢＢＢ輸送に適切なビヒクルの非存在下では、新規のＣＮＳ薬のパイプラインが神経障害を患う人々に不適であり続けると考えられる。近年、脳卒中の保護能、ヒト被験体の脳への直接注入後のパーキンソン病症状の好転、並びにパーキンソン病、及びアルツハイマー病、ハンチントン病及び多発性硬化症等の他の神経変性疾患の潜在的治療に対する神経幹細胞の直接的に特殊分化する能力に対して、例えば、ニューロトロフィンとして知られるタンパク質治療薬が研究されている。極めて有望な治療薬ではあるが、これらの栄養素はＢＢＢを通ることは容易ではなく、広範囲に及ぶ効果的な投与には非侵襲性の送達系が必要である。

現在の脳送達戦略は特に侵襲性であり、ＢＢＢを避ける必要がある。薬物を注入したポリマー粒子の埋め込みに、神経外科を必要とする戦略が用いられるが、脳組織中の細胞外液が静止しているために、治療容積は制限されており、単純な分子拡散によって、２〜３ｍｍというわずかな距離しか浸透できない。同様の方法は、薬物の脳室への直接注射であるが、脳脊髄液が迅速に除去され、１日に４〜５回入れ替わるので、このような脳室内注射に関しても、脳組織への浸透は制限される。さらに、タンパク質治療薬（例えば、パーキンソン病に対するグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ））が、渦流ポンプによる連続薬物注入を用いた神経外科的に埋め込まれたカテーテルを通って送達している。高浸透圧溶液、並びに血液から脳へと分子を自由に通過させるセロトニン及びブラジキニンペプチド等の血管作用剤を用いて、ＢＢＢの破壊を研究している。ＢＢＢの変化によって、通常脳から排除される溶質及び免疫因子が自由にアクセスするために毒性作用を引き起こす可能性があるので、この方法は主に臨床的に末期の患者のみに用いられる。

上述の侵襲性戦略は、治療容積が制限された疾患（例えば局在化した非転移性の脳腫瘍）で成功することができる。しかし、反復治療計画を必要とする慢性症状、又はアルツハイマー病等の脳の大部分に存在する疾患に対して、非侵襲性の薬物送達戦略は実質的により好ましく、且つ実用的である。

広範囲に及ぶ薬物分布を与えるのに脳血管網を利用する、多種多様な非侵襲性の脳薬物送達法が研究されている。脳の毛細血管網は、毛細血管間の平均間隔がちょうど４０μｍであり、且つ、原則的にそれぞれの脳細胞が自身の血管を栄養供給のために有するほど十分高密度である（図２）。さらに、ＢＢＢの脳側に薬物が蓄積するようなＢＢＢの内皮障壁を乗り越えることができる場合、拡散距離は、それぞれの脳細胞が薬物にアクセス可能であるぐらい十分短い。結果として侵襲性の方法に比べて、広範囲の治療容積を得ることができる。これらの非侵襲性輸送系／機構は一般的に、以下の３つの群にまとめることができる：１、非特異的な取り込み；２、担体媒介性輸送；及び３、受容体媒介性輸送（図３）。

非特異的な取り込み機構はＢＢＢを通る或る程度の輸送を可能にするが、感受性及び特異性を欠いている。カチオン性タンパク質形質導入ドメインは非特異的な担体領域（realm）に分けられ、ＨＩＶＴＡＴペプチドが、腹腔内注射後に脳間質にアクセスすることを示したが、その後の薬物動態解析によって、迅速な除去及び幅広い組織取り込みには、薬理学的効果を得るために非常に高い用量が必要となることが示された。別の非特異的な取り込み機構は、ポリソルベート８０によるナノ粒子の界面活性剤被覆である。脳取り込み機構は未だに解明されていないが、in vivoでの粒子の不安定性によって、短期間の薬理学的効果及び可能なＢＢＢ浸透性が導かれる。これらの非特異的な方法は双方とも選択的な標的化の欠如があり、全身的作用と共に、身体にわたって活性化合物を幅広く分布させる。

担体媒介性薬物輸送は、選択的で且つ小分子溶質に対して立体特異的な内因性膜貫通タンパク質の存在に依存する。例えば、パーキンソン病を治療するのに投与されるＬ−ドーパは、大きなアミノ酸輸送体（ＬＡＴ−１）を用いることによって脳に入る。血液脳関門を通る輸送の成功は、Ｌ−ドーパがフェニルアラニンの芳香環上で２つのヒドロキシル基が置換されただけのフェニルアラニン構造に似ていた結果である。ビオチン化薬物の送達に飽和ビオチン輸送系を用いることも試みられてきた。さらに、ＡＩＤＳ薬物ＡＺＴの排出が担体媒介性で進行すると考えられる。しかし、これらの選択膜孔によって受けられる立体特異的及び立体的な制約のために、適用は潜在的に制限される。

受容体媒介性輸送は、細胞表面受容体の外表面エピトープの結合、及びトランスサイトーシスとして知られるエネルギー集約型経細胞輸送プロセスの誘発を伴う（図３）。天然リガンド、又はトランスサイトーシスプロセスを誘発することができる抗体と結合した場合、薬物をこれらの門脈を利用して送達することができる。この方法は、サイズが最大１００ｎｍの小分子、タンパク質、遺伝子、ナノ粒子及びリポソームを非侵襲性輸送することに成功している。トランスサイトーシスに対して一般的に標的となる受容体は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、トランスフェリン受容体、及びインスリン受容体である。吸収媒介性トランスサイトーシスを伴う同様の特異性の低いプロセスは、受容体クラスター化及びトランスサイトーシス経路の活性化を促進するカチオン化タンパク質と共に用いられている。内因性リガンドの正常な輸送を破壊しないような方法では、戦略として細胞表面受容体を標的とすることが多い。したがって、正常な代謝経路に及ぶ影響が制限される。さらに、トランスサイトーシスは小胞輸送系を利用するので、この戦略は、担体媒介性輸送のサイズ及び形状の制約による制限を全くというほど受けない。

特に、そのリガンドに対して高い親和性及び特異性が与えられるＢＢＢ受容体媒介性トランスサイトーシス系を標的化するのに、抗体が十分適している。例として、インスリン及びトランスフェリン受容体の細胞外エピロープを認識する適切に標的化された抗体は、ＢＢＢを通って効果的に輸送されると共に経内皮経路を介して脳間質に蓄積される人工輸送体物質として作用することができる。さらに、様々なサイズ及び組成の薬物又は薬物担体と結合する場合、ＢＢＢ標的化抗体は、セラピュティックカーゴ（therapeutic cargo）の脳取り込みを媒介する。抗トランスフェリン受容体抗体を用いて、メトトレキサート等の小分子の非侵襲性輸送が達成されている。抗トランスフェリン受容体抗体を用いることによって、静脈内投与後に、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、及び塩基性線維芽細胞成長因子等のタンパク質が脳に送達された。後の２つの場合、ラットの中大脳動脈閉塞モデルにおける１回排出量（stroke volume）の減少が促進された。また、抗トランスフェリン受容体抗体を用いて、in vivoでリポソーム及び遺伝子を含有するリポソームが送達されている。特に、遺伝子含有抗体標的化リポソームが、パーキンソン病の実験モデルにおけるチロシンヒドロキシラーゼ活性の回復に関してラット脳、及びヒト化抗インスリン受容体抗体を用いて霊長類の脳へと標的化している。さらに、ペグ化免疫リポソームを介する新規の群のＲＮＡ干渉薬物の脳送達によって、ヒト脳腫瘍の実験モデルを埋め込んだマウスの生存率が増大したことが実証されている。さらに、抗トランスフェリン受容体結合ナノ粒子が産生されている。最終的に、抗体が脳の微小血管（microvsculature）と結合するか、又は完全にはトランスサイトーシスせずに内在化するとしても、薬物送達の利点を有し得る。脂溶性小分子薬物を充填したリポソーム又はナノ粒子と結合する場合、薬物の局所ＢＢＢ濃度が上がり、脳排出系の回避を補助することによって、脳取り込みを促進する可能性があり得る。最終的に、トランスサイトーシス又はさらには内在化せずに結合が起こる場合、ＢＢＢ特異的抗体受容体又はリガンドの特定が、輸送体系の成分を特徴付けて特定するのを助け、さらに内在化及びトランスサイトーシスを行う抗体を最適化するのを助ける。総合的に、これらの結果は、薬物の脳への非侵襲性の輸送に対する抗体標的化トランスサイトーシス系の潜在的有用性を示している。

先の研究において抗体媒介性輸送に関する展望が示されたにもかかわらず、現在の抗体標的化試薬は、特異性及び輸送効率を欠いている。受容体媒介性トランスサイトーシスプロセスから導かれた初期結果は、多くの形式での薬物又は薬物担体の送達が堅固であるために有望であるが、一般的な臨床的成功のために取り組む必要がある深刻な欠点も幾つかある。本方法は、トランスフェリン及びインスリン受容体等を遍在的に発現する受容体に依存する。このことによって、脳以外の組織で不要な副作用も有し得る潜在的に高価な薬剤が誤って標的化される。さらに、本方法では概して、悪い標的化、及び理想的ではないＢＢＢ浸透性の結果として実際に標的とする脳に達するのは、注射量のわずかな割合（１％〜４％）である。この投与治療薬の９６％〜９９％の喪失が、特に、臨床試験の様々な段階で、現在７００個近くの薬物を含むタンパク質及び遺伝子ベースの医薬品に対して薬物製造コストがかかるので、これらの送達アプローチの開発の障害となる可能性がある。最終的に、上述の概念立証（proof-of-concept）実験に用いられる抗体は、マウス由来のものであるか、又は一部ヒト化されたもののいずれかであり、これによって、ヒト患者における望ましくない免疫反応が引き起こされる可能性がある。したがって、脳内皮受容体を特異的に認識する完全なヒト抗体の特定によって、薬物送達の標的化及び効率が大いに向上され、副作用が最小限に抑えられる。

本発明は、受容体及び結合リガンドのエンドサイトーシスをもたらす内皮細胞受容体と結合する抗体を提供する。１つの例示的な実施の形態では、本発明は、配列番号１〜３４のいずれかで表わされるアミノ酸配列を有する単離された抗体断片を含む。別の実施の形態では、本発明は、配列番号１〜３４のいずれかで表わされるアミノ酸をコードする配列を有する単離された核酸を提供する。好ましい変形によっては、単離された抗体断片は一本鎖可変領域（scFv）断片である。他の好ましい変形では、単離された抗体は、Ｆａｂ、ＩｇＧ、又は内皮細胞受容体に特異的な任意の他のリガンドである。

別の好ましい実施の形態において、本発明は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通って薬学的に活性な化合物を運ぶのに有用な薬学的に活性な化合物と結合する抗体を含む薬学的組成物である。

別の例示的な実施の形態において、本発明は、配列番号１〜３４のいずれかで表わされるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された発現ベクターである。他の実施の形態では、本発明は、配列番号１〜３４のいずれかで表わされるアミノ酸配列をコードする単離された核酸を含有する発現ベクターを含む精製及び単離された宿主細胞を含む。宿主細胞は、抗体を発現可能な任意の細胞（例えば菌類、チャイニーズハムスター卵巣細胞を含む哺乳動物細胞；例えばバキュロウイルス発現系を用いた昆虫細胞；植物細胞（例えばトウモロコシ、イネ及びシロイヌナズナ等））であり得ることを理解するべきである。

さらに別の例示的な実施の形態において、本発明は、脳内皮細胞受容体と結合可能な抗体断片を発現する方法であって、（ａ）酵母細胞上に抗体断片を提示する工程、（ｂ）脳内皮細胞培養物から抗体を提示する酵母細胞を選抜する工程、（ｃ）脳内皮細胞受容体と特異的に結合する提示された抗体断片を特定する工程、（ｄ）発現ベクターにおいて工程（ｃ）で特定された抗体断片をコードする単離された核酸を挿入する工程、及び（ｅ）宿主細胞を前記発現ベクターで形質転換する工程を含む、脳内皮細胞受容体と結合可能な抗体断片を発現する方法を含む。この実施の形態の変形（versions）によっては、宿主細胞は、酵母、細菌及びこれらの組合せから成る群から選択される。好ましい実施の形態としては、宿主細胞はサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）又は大腸菌（E. coli）である。

別の例示的な実施の形態において、本発明は、脳内皮細胞特異的抗体を特定する方法である。この実施の形態は、酵母細胞表面上に抗体断片を提示する工程、脳内皮細胞培養物から提示された抗体を選抜する工程、脳内皮細胞上における膜受容体との特異的な結合体を単離する工程、及び特異的な結合体を特定する工程によって、内皮細胞特異的抗体を特定することを含む。好ましい実施の形態によっては、内皮細胞培養物が細胞単層とされている。

さらに別の例示的な実施の形態において、本発明は、エンドサイトーシス及びトランスサイトーシスで機能しこれらに関連する内皮細胞受容体を特定する方法であって、培養内皮細胞単層を調製し該内皮細胞単層から酵母提示された抗体ライブラリを選抜する工程、抗体結合内皮細胞を単離する工程、及び同族受容体を特定する工程を含む、エンドサイトーシス及びトランスサイトーシスで機能しこれらに関連する内皮細胞受容体を特定する方法を含む。

ＢＢＢ輸送系を標的化する新規のヒト抗体は多大な有用性を有する。トランスフェリン及びインスリン系等の十分に研究された系を利用した抗体送達戦略とは違い、これらのリガンドがこれから特定される膜タンパク質である場合、新規の受容体媒介性輸送系を特定することは非常に困難である。したがって、本発明者らは、ＢＢＢ結合の要求される機能性を有する完全なヒト抗体を特定する新規の選択方法を開発している。この技法の効力（power）によって、いずれの成分の起源であるかに関する予備知識がない、潜在的な薬物送達ベクター及びその同族の細胞表面受容体（受容体媒介性担体系）が同時選択される。図４は、本発明によるこのような抗体の選択に対する一般的なスキームを示す。

本発明の別の態様は、血液脳関門での抗体標的、特に内在化（エンドサイトーシス）及びトランスサイトーシスに関する分子機構を表す標的に関する。したがって、本発明は、
非還元条件下でヒトscFvＡで免疫沈降した際の分子量が約１２４ｋＤａの精製scFvＡ抗原に関する。本発明者らは、この抗原が無傷脳毛細血管で発現されることを特定し実証している。

したがって、本発明は、抗体−血液脳関門輸送体系をさらに包含する。このような系は、（ａ）無傷の脳毛細血管で発現する、非還元条件下でヒトscFvＡで免疫沈降した際の分子量が約１２４ｋＤａである抗原、及び（ｂ）scFvＡ抗原と結合する精製抗体を含む。精製抗体は、配列番号１〜５のいずれかで表わされるアミノ酸配列を有し、より好ましくは前記抗体は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するscFvＡである。或る特定の実施の形態では、精製抗体は、薬学的に活性な化合物と組み合わせて与えられる。

開示の抗体−血液脳関門輸送体系に基づいて、本発明は、血液脳関門を通って、被験体の脳に薬学的に活性な化合物を送達する方法も考慮する。このような方法は、抗体が血液脳関門を通って被験体の脳に薬学的に活性な化合物を送達することに関するように、配列番号１〜５のいずれかで表わされるアミノ酸配列を有する精製抗体と組み合わせて、薬学的に活性な化合物を被験体に投与することを含む。

本発明による物及び方法の様々な例示的な実施形態のこれらの及び他の特徴及び利点が、以下の本発明による方法の様々な例示的な実施形態の詳細な説明で記載されるか、又はそれから明らかである。

本発明の方法の様々な例示的な実施形態は、添付の図面を参照して詳細に説明される。

図１Ａ及び図１Ｂは、血液脳関門の不浸透性を示す顕微鏡写真である。図１Ａは、ＢＢＢを欠く小さい脳室周囲器官を除いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼは脳血管に隔離されており、実質組織にアクセスしていないことを示す（上記の正中***）。図１Ｂは、ＢＢＢの有効性を示す。わずか１１１Ｄａの放射標識ヒスタミンは、マウスの脳又は脊髄に侵入することができない。血管網の広がり状態（extent）を示すヒト小脳皮質の血管鋳型の電子顕微鏡写真である。スケールバーは４０μｍである。様々なＢＢＢ輸送オプションの模式図である。抗体媒介性脳内皮細胞のトランスサイトーシスの一態様のフローチャート図である。可変領域の位置及び一本鎖抗体可変断片（scFv）の起源を示す免疫グロブリン分子の図である。可変の軽鎖領域及び重鎖領域はフレキシブルなポリペプチドリンカーで連結され、無傷抗体の最小結合サブユニットを含む。図６Ａ〜図６Ｄは、抗原がフルオレセインであるscFv構築物（４−４−２０）の酵母表面提示の模式図である。scFvタンパク質は、酵母粒子の表面上でフルオレセインと積極的に結合するscFvタンパク質を表面提示させる自己集合化接合アグルチニンタンパク質（Ａｇａ１ｐ及びＡｇａ２ｐ）と融合する。図６Ａは４−４−２０を提示する酵母の位相差画像である。図６Ｂはフルオレセイン−デキストラン（ＦＩＴＣ−デキストラン）と結合した４−４−２０を提示する酵母の蛍光画像である。図６Ｃは、無関係のscFvを提示する酵母（Ｄ１．３）の位相差画像である。図６Ｄは、ＦＩＴＣ−デキストランと結合しないＤ１．３酵母の蛍光画像である。４−４−２０ scFvを提示する酵母と、ＦＩＴＣ標識ＲＢＥ４細胞との間の特異的な相互作用を示す位相差画像である。４−４−２０酵母細胞と、ビオチン化されニュートラアビジン−ＦＩＴＣ（ＮＡＦＩＴＣ）標識された（上の列）、又は非標識（下の列）のＲＢＥ４細胞との結合。酵母細胞及びＲＢＥ４細胞は、それぞれ４μｍ及び２０μｍのサイズで区別することができる。各洗浄工程の前後で、同じ顕微鏡視野の画像を撮影した。スケールバー：５０μｍ。示されるように、ＦＩＴＣ標識細胞は、３回の洗浄後でも酵母との結合の継続を示すが、非ＦＩＴＣ標識細胞は示さない。複数回の濃縮に対するscFv親和性の効果を示す棒グラフである。４−４−２０、４Ｍ５．３及びＤ１．３酵母（１：１：１×１０^５）を含有する混合物をＮＡＦＩＴＣ標識ＲＢＥ４細胞単層から選抜した。各回後、混合物中の４−４−２０及び４Ｍ５．３の割合をフローサイトメトリで評価した。黒塗りの棒グラフ（solid bars）は４−４−２０の割合に対応し、斜線の棒グラフは４Ｍ５．３の割合に対応する。点線は、フローサイトメトリ分析の検出限界を示す。ＢＢＢ結合及び内在化するscFvを特定する生物選抜の全体的な戦略を示す模式図である。生物選抜を介したＲＢＥ４結合scFvの濃縮を示す図である。図１１Ａ〜図１１Ｇは、細胞単層選抜及びハイスループット酵母クローンプロファイリング戦略の模式図である。図１１Ａは９６ウェルプレートでの酵母増殖；図１１Ｂは酵母のＲＢＥ４培養物への添加；図１１Ｃは誘導された酵母；図１１Ｄは非誘導；図１１Ｅは最初のＰＣＲ又は結合体；図１１Ｆは結合体の「フィンガープリント」を与え、生殖細胞系ファミリを特定する制限消化；図１１Ｇは特有のscFvクローンのシークエンシング、をそれぞれ示す。 scFv変異体の結合を要約する表である。（ａ）特有のscFvは相同性でまとめられた。各クラスのscFv抗体は、最低でも１つのＣＤＲ３で全ての他のクラスと異なる（２０％アミノ酸相同性）。ＣＤＲ１及びＣＤＲ２の多様性を制限するライブラリに関する非免疫基礎、並びにＶＨ及びＶＬのＣＤＲ３は、結合特異性及び親和性を求めるのに主要な役割を果たすという事実を考慮して、クラスを定義するのにＣＤＲ３領域に焦点が当てられた。クラスの中で、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３（＊８５％アミノ酸相同性）は全て、相同性が高い。（ｂ）アミノ酸配列及びＢｓｔＮＩ消化パターンによって、scFvが特有であると見なされた。（ｃ）推定scFvアミノ酸配列をＩｇＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.hig.gov/igblast/）にかけることによって、生殖細胞系抗体の遺伝子使用を求めた。（ｄ）小さい縮尺のスクリーンにおける発生頻度に基づき、scFvＡ又はscFvＤのいずれかの総数で、ＶＨＣＤＲ２酵母のノーザンブロット実験で差し引かれたクローンを計数し、その推定値を示す。クローンscFvＡとの配列相同性を示すscFvクローンＢ、Ｇ、Ｃ及びＫの配列アラインメントを示す図である。ＶＨは可変重鎖領域；ＶＬは可変軽鎖領域；ＣＤＲは相補性決定領域、をそれぞれ示す。配列相同性を共有するscFvクローンＤ、Ｉ及びＨの配列アラインメントを示す図である。ＶＨは可変重鎖領域；ＶＬは可変軽鎖領域；ＣＤＲは相補性決定領域、をそれぞれ示す。クローンＦは、可変軽鎖（ＶＬ）ドメインは同様の相同性があるが、可変重鎖（ＶＨ）ドメインとは相同性がないことを示す、scFvクローンＡ、Ｃ、Ｂ、Ｇ、Ｋ及びＦの配列アラインメントを示す図である。ＶＨは可変重鎖領域；ＶＬは可変軽鎖領域；ＣＤＲは相補性決定領域、をそれぞれ示す。分泌タンパク質がscFvに適切な重量を有することを示すポリアクリルアミドゲル（上のパネル）、並びにＲＢＥ４細胞によるscFvの結合及び内在化を要約する表（下のパネル）を示す図である。ＲＢＥ４細胞によるscFvＡの特異的な結合及び内在化を示すが、scFvＤでは示されない、ＲＢＥ４結合scFvの二重蛍光染色を示す顕微鏡写真の集合である。 scFvＡ及びscFvＤの平衡結合性を示す図である。左側のパネルは生ＲＢＥ４細胞とのscFvＡ相互作用に対する結合等温線を示す。プロットは、適合単量体平衡結合関数及び２つの別個の実験の実験データを示す。右側のパネルはＲＢＥ４細胞との二量体化scFvＤ相互作用に対する結合等温線を示す。プロットは、見かけの親和性（結合力）を生じるのに用いられた適合単量体平衡結合関数及び２つの別個の実験の実験データを示す。挿入図は、結合曲線を作成するのに用いられた生のフローサイトメトリヒストグラムを示す。 scFvＡ（Ａ）、scFvＤ（Ｄ）、scFvＪ（Ｊ）及びＯＸ２６scFv（Ｏ）に対する抗原の酵母提示免疫沈降を示す図である。無関係の抗ニワトリ卵リゾチームscFv（Ｎ）をネガティブコントロールとして用いた。免疫沈降産物は、非還元（ＮＲ）又は還元（Ｒ）いずれかのゲル電気泳動によって分離され、抗ビオチン抗体又は抗トランスフェリン受容体抗体（ＯＸ２６）で標識した。 scFvの結合及び内在化特性を評価する蛍光顕微鏡写真である。ＲＢＥ４細胞は、細胞表面標識に関して４℃で精製された前二量体化scFvＡ、scFvＤ、無関係のscFv４−４−２０又はＯＸ２６モノクローナル抗体で充填してから、３７℃にシフトし、細胞輸送を促進した。その後、サポニン（ＳＡＰ）処理で細胞を透過化しながら又は透過化しないで、細胞を４℃でＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５結合抗マウスＩｇＧ、その後ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８結合抗マウスＩｇＧで標識した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ標識画像のマージ画像が示される。スケールバー：２０μｍ。 scFvＡが、in vivoで発現された脳内皮抗原を認識することを示す蛍光顕微鏡写真である。凍結ラット脳切片を、scFvＡ（１）又は４−４−２０（４）及び脳内皮細胞マーカーＧＳＡ−ＦＩＴＣ（２，５）で同時に標識した。（３，６）は、scFvとＧＳＡ−ＦＩＴＣ標識との重複を示すマージ画像である。scFvＡに対して、無関係のscFv４−４−２０は全く標識が得られなかった。マウス脳切片及び新たに単離した毛細血管で、同様の結果が観察された。最終的に、ＲＢＥ４培養物に関する抗原密度の序列に酷似して、定性的な標識強度は、in vivoでのscFvＡ抗原密度が、トランスフェリン受容体のそれより高かったことを示した（データ図示せず）。スケールバー：５０μｍ。

本発明は、細胞機構が、血液脳関門（ＢＢＢ）を通って薬物及び／又は治療薬を輸送するのに最も効率的且つ効果的な方法であり得るという見解に基づいている。多種多様な細胞輸送体及び受容体機構が特定されているが、これらは内皮受容体に対するリガンドの特異性、並びに受容体に対するリガンドの親和性及び結合力（avidity）の両方によって制限される。さらに、今までのところ特定されてない抗体リガンド及び受容体の特定によって、ＢＢＢを通って化合物を輸送するより良好なツールが与えられる。

本発明者らは、脳内皮細胞膜と結合する一本鎖抗体断片（scFv）に対するヒトscFvライブラリを探査している。脳内皮細胞と結合するとして特定されたscFvサブセットもこれらの細胞に取り込まれ、これはＢＢＢトランスサイトーシス系に関する基質であり得ることを示している。またscFvは、内皮由来の輸送系を表すパターンで脳組織片において全てのサイズの血管を特異的に標識する。他の脳細胞では標識は検出されない。このクラスのscFv及びその関連のＢＢＢ輸送系は、脳への非侵襲性薬物送達に関して新規の機構を表す。

本発明を説明する前に、記載される特定の方法、プロトコル及び試薬に限定されず、これらを変えることができることが理解される。本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の範囲（添付の特許請求の範囲によってのみ限定される）の限定を意図しないことも理解されるべきである。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「或る（a）」、「或る（an）」、及び「その（the）」は、他に文脈上ではっきりと示されない限り、複数形を含むことに留意すべきである。したがって、例えば「或る細胞（a cell）」への言及は、複数のこのような細胞及び当業者に既知のその同意語等を含む。さらに、「或る（a）」（又は「或る（an）」)、「１つ又は複数」及び「少なくとも１つ」という用語は本明細書で交換可能に用いることができる。「含む」、「包含する」、及び「有する」という用語が交換可能に用いることができることにも留意するべきである。

他で定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に用いることができるが、ここでは好ましい方法及び材料が記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、本発明に関連して用いられ得る刊行物で報告される化学物質、細胞株、ベクター、動物、機器、総計分析及び方法を記載及び開示する目的で、参照により本明細書に援用される。本発明が、従来の発明のためにこのような開示を先行する権利がないことを認めるものと解釈されることは本明細書には存在しない。

本明細書で用いられるような「被験体」は、哺乳動物及び非哺乳動物を意味する。「哺乳動物」は、ヒト、チンパンジー及び他の類人猿及びサル種等の非ヒト霊長類；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、及びブタ等の家畜；ウサギ、イヌ、及びネコ等の飼育動物；ラット、マウス、及びテンジクネズミ等の齧歯類を含む研究動物等を含む（が、これらに限定されない）哺乳類の任意の成員を意味する。非哺乳動物の例としては、鳥類等が挙げられるが、これに限定されない。「被験体」という用語は特定の年齢又は性別を示さない。

本明細書で用いられるような「投与すること」又は「投与」は、本発明の組成物を身体に、好ましくは体循環に導入する任意の手段を含む。例としては、経口；頬、舌下、肺、経皮、経粘膜、並びに皮下注射、腹腔内注射、静脈注射、及び筋肉内注射が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で用いられる場合、「薬学的組成物」は、好適な希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤及び補助剤と共に、治療的に有効な量のＢＢＢトランスサイトーシス化合物（「薬学的に活性な化合物」とも称される）を意味し、集合的には「薬学的に許容可能な担体」と呼ばれる。本明細書で用いられる場合、「有効量」及び「治療的に有効な量」という用語は、毒性、放射線、又はアレルギー反応等の過度な副作用もなく、所望の治療反応を得るのに十分な活性のある治療剤（単数又は複数）の量を表す。具体的な「有効量」は、治療される特定状態、被験体の健康状態、治療される動物の種類、治療期間、（もしあれば）併用療法の性質、並びに用いられる具体的な製剤設計及び化合物及びその誘導体の構造等の因子によって明らかに変わる。この場合、（ａ）神経学的な又は脳の疾患（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病及び／又は癌）の予防、及び（ｂ）神経学的な又は脳の疾患（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病及び／又は癌）の好転又は安定化の１つ又は複数が得られた場合、治療的に有効な量であると推測される。所定の実験を通じて当業者は、最適な有効量を容易に求めることができる。

薬学的組成物は液体、又は凍結乾燥若しくはそうでなければ乾燥した製剤であり、ｐＨ及びイオン強度等の様々な緩衝用希釈剤（例えば、トリスＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、表面への吸着を防ぐ添加剤（例えばアルブミン又はゼラチン）、洗浄剤（例えばＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、胆汁酸塩）、可溶化剤（例えばグリセロール、ポリエチレングリセロール）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、増量物質又は張性修飾剤（例えばラクトース、マンニトール）、ポリエチレングリコール等のポリマーとタンパク質との結合剤、金属イオンとの錯体化剤、或いはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル等の重合化合物の粒子調製物内への若しくは上への、又はリポソーム、マイクロエマルション、ミセル、単膜（milamellar）小胞若しくは多重膜小胞、赤血球ゴースト、又はスフェロプラスト上への物質の取り込みを含む。このような組成物は物理的状態、可溶性、安定性、in vivo放出速度、及びin vivoクリアランス速度に影響する。制御又は持続放出組成物には、脂溶性デポー（例えば脂肪酸、ワックス、オイル）中の製剤が含まれる。

さらに、本明細書で用いられる「薬学的に許容可能な担体」は当業者に既知であり、０．０１Ｍ〜０．１Ｍ、及び好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液又は０．９％生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、このような薬学的に許容可能な担体は、水溶性又は非水溶性の溶液、懸濁液及び乳濁液であり得る。非水溶性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水溶性担体としては、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、乳濁液又は懸濁液が挙げられる。

本発明における「治療すること」又は「治療」は、疾患、症状、又は障害に対抗する目的での被験体の管理及び治癒を意味する。この用語は、予防治療（すなわち予防的治療及び緩和的治療）並びに治癒治療の両方を包含する。治療は、症状若しくは合併症の発症を予防するための本発明の化合物の投与、症状若しくは合併症の緩和、又は疾患、症状若しくは障害の排除を含む。

１つの例示的な実施形態において、本発明は配列番号１〜３４のいずれかで表わされるアミノ酸配列を有する単離された抗体断片を含む。好ましい変型によっては、単離された抗体断片は一本鎖可変領域（scFv）断片である。

別の例示的な実施形態において、本発明は、受容体及び結合リガンドのエンドサイトーシスをもたらす内皮細胞受容体と結合する抗体を提供する。実施形態によっては、本発明は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通って薬学的に活性な化合物を運ぶのに有用な薬学的に活性な化合物と結合する抗体を含む薬学的組成物である。

別の例示的な実施形態において、本発明は、配列番号１〜３４のいずれかで表わされるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。他の実施形態では、本発明は、配列番号１〜３４のいずれかで表わされるアミノ酸配列をコードする単離された核酸を含有する発現ベクターを含む精製及び単離された宿主細胞を含む。宿主細胞は、抗体を発現可能な任意の細胞（例えば菌類、チャイニーズハムスター卵巣細胞を含む哺乳動物細胞；例えばバキュロウイルス発現系を用いた昆虫細胞；植物細胞（例えばトウモロコシ、イネ及びシロイヌナズナ等））であり得ることを理解するべきである。概して例えば、Verma, R.他, J Immunol Methods. 1998 Jul 1;216（1-2）: 165-81を参照されたい。

さらに別の例示的な実施形態において、本発明は、脳内皮細胞受容体と結合可能な抗体断片を発現する方法であって、（ａ）酵母細胞上に抗体断片を提示する工程、（ｂ）脳内皮細胞培養物から抗体を提示する酵母細胞を選抜する工程、（ｃ）脳内皮細胞受容体と特異的に結合する提示された抗体断片を特定する工程、（ｄ）発現ベクターにおいて工程（ｃ）で特定された抗体断片をコードする単離された核酸を挿入する工程、及び（ｅ）宿主細胞を発現ベクターで形質転換する工程を含む、脳内皮細胞受容体と結合可能な抗体断片を発現する方法を含む。この実施形態の変形によっては、宿主細胞は、酵母、細菌及びこれらの組合せから成る群から選択される。好ましい実施形態によっては、宿主細胞はサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）又は大腸菌（E. coli）である。

別の例示的な実施形態において、本発明は、脳内皮細胞特異的抗体を特定する方法である。この実施形態は、酵母細胞表面上に抗体断片を提示する工程、脳内皮細胞培養物から提示された抗体を選抜する工程、脳内皮細胞上の膜受容体との特異的な結合体を単離する工程、及び特異的な結合体を特定する工程によって、内皮細胞特異的抗体を特定することを含む。好ましい実施形態によっては、内皮細胞培養物が細胞単層である。

さらに別の例示的な実施形態において、本発明は、エンドサイトーシス及びトランスサイトーシスで機能する、又はそれらに関連する内皮細胞受容体を特定する方法であって、培養内皮細胞単層を調製し内皮細胞単層から酵母提示された抗体ライブラリを選抜する工程、抗体結合内皮細胞を単離する工程、及び同族受容体を特定する工程を含む、エンドサイトーシス及びトランスサイトーシスで機能する、又はそれらに関する内皮細胞受容体を特定する方法を含む。

ＢＢＢ輸送系を標的化する新規のヒト抗体は多大な有用性を有する。トランスフェリン系及びインスリン系等の十分に研究された系を利用した抗体送達戦略とは違い、これらのリガンドがこれから特定されねばならない膜タンパク質である場合、新規の受容体媒介性輸送系を特定することは非常に困難である。したがって、本発明者らは、ＢＢＢ結合の要求される機能性を有する完全なヒト抗体を特定する新規の選択方法を開発している。この技法の効力によって、いずれの成分の同一性に関する予備知識がない、潜在的な薬物送達ベクター及びその同族の細胞表面受容体（受容体媒介性担体系）が同時選択される。図４は、本発明によるこのような抗体の選択に対する一般的なスキームを示す。

ＢＢＢで受容体媒介性輸送系を標的化するのに抗体を用いる場合、ＢＢＢ内皮細胞を通って脳組織に薬物分子及び薬物担体を効率的にトランスサイトーシスすることができる。血液から脳へのこのような非侵襲性送達は、内因性輸送系に関する代理リガンドとして作用する抗体の結果である。現在知られている抗体標的化脳送達系には、トランスフェリン系及びインスリン受容体系が含まれる。これらの受容体は、身体全体に遍在的に発現され、これによって高価な調合薬が誤って標的化される。

標的となる神経障害によっては、本発明による抗体ベースの標的化を用いて、in vivoで多種多様な脳薬物荷（drug cargoes）（例えば薬理化合物又は同様に薬学的に活性な化合物）を首尾よく送達することができる。本明細書で用いられる「薬学的に活性な化合物」及び「薬理化合物」という用語は、疾患又は障害の影響を治療又は緩和するのに有用な任意の化合物を表すものとする。例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病）及び多発性硬化症等の神経変性病を含む疾患は、神経栄養因子（神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ）及びインスリン様成長因子（ＩＧＦ）を含むが、これらに限定されない）等の薬物の使用によって標的化することができる。さらに、治療的潜在性があることが示され、且つ本発明の抗体によって送達され得る他の化合物は、神経ペプチド（Ｐ物質、神経ペプチドＹ、血管活性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、ドーパミン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、エンドルフィン、エンケファリン及びサイロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）を含むが、これらに限定されない）である。さらに、治療薬としては、サイトカイン、抗不安薬、鎮痙剤、ポリヌクレオチド、導入遺伝子（例えば、神経障害（不安症、うつ病、統合失調症、及び睡眠障害等の精神病、並びに癲癇、発作性障害、脳卒中及び脳血管障害、脳炎及び髄膜炎、記憶及び認知障害、疼痛及び身体外傷を含むが、これらに限定されない）等に用いられ得る小分子干渉ＲＮＡを含む）が挙げられ得る。

特に、そのリガンドに対する高い親和性及び特異性を与えるＢＢＢ受容体媒介性トランスサイトーシス系を標的化するのに、抗体が十分適している。例として、インスリン及びトランスフェリン受容体の細胞外エピトープを認識する適切に標的化された抗体は、ＢＢＢを通って効果的に輸送され、且つ経内皮経路を介して脳間質に蓄積される人工輸送体物質として作用することができる。さらに、様々なサイズ及び組成の薬物又は薬物担体と結合する場合、ＢＢＢ標的化抗体は、治療荷の脳取り込みを媒介する。抗トランスフェリン受容体抗体を用いて、メトトレキサート等の小分子の非侵襲性輸送が達成されている。抗トランスフェリン受容体抗体を用いることによって、静脈内投与後に、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、及び塩基性線維芽細胞成長因子等のタンパク質が脳に送達された。後の２つの場合、ラットの中大脳動脈閉塞モデルにおける１回排出量の低減が促進された。また、抗トランスフェリン受容体抗体を用いて、in vivoでリポソーム及びリポソームが含有する遺伝子が脳に送達されている。特に、遺伝子含有抗体標的化リポソームが、パーキンソン病の実験モデルにおけるチロシンヒドロキシラーゼ活性の回復に関してラット脳、及びヒト化抗インスリン受容体抗体を用いて霊長類の脳へと標的化している。さらに、ペグ化免疫リポソームを介する新規の群のＲＮＡ干渉薬物の脳送達によって、ヒト脳腫瘍の実験モデルを埋め込んだマウスの生存率が増大したことが実証されている。さらに、抗トランスフェリン受容体結合ナノ粒子が産生されている。最終的に、抗体が脳の微小血管と結合するか、又は完全にはトランスサイトーシスせずに内在化するとしても、薬物送達の利点を有し得る。脂溶性小分子薬物を充填したリポソーム又はナノ粒子と結合する場合、薬物の局所ＢＢＢ濃度が上がり、脳排出系を補助することによって、脳取り込みを促進する可能性があり得る。さらに、内在化せずに、又は完全にはトランスサイトーシスしないが、内在化して結合する能力によって、輸送体系の特徴付け及び特定、並びに内在化及び／又はトランスサイトーシスする抗体の最適化を可能にすることが以前から知られていたＢＢＢ内皮受容体又はリガンドが特定される。総合的に、これらの結果は、薬物の脳への非侵襲性の輸送に対する抗体標的化トランスサイトーシス系の有用性を示している。

理解され得るように、本発明の一態様は、血液脳関門での抗体標的、特に内在化（エンドサイトーシス）及びトランスサイトーシスに関する分子機構を表す標的に関する。したがって、本発明は、非還元条件下でヒトscFvＡで免疫沈降した際の分子量が約１２４ｋＤａの精製抗原に関する。本発明者らは、この抗原が無傷脳毛細血管で発現されることを特定し実証している。さらに、本発明者らは、scFvＢ、scFvＣ、scFvＧ、及びscFvＫがそれぞれ、scFvＡで免疫沈降した約１２４ｋＤａの抗原を認識し、且つ免疫沈降することができることを実証している。したがって、scFvＡ、scFvＢ、scFvＣ、scFvＧ及びscFvＫ（それぞれ、配列番号１〜５）はそれぞれ、本発明の血液脳標的化抗体として有用である。

したがって、本発明は、抗体−血液脳関門輸送系をさらに包含する。このような系は、（ａ）無傷の脳毛細血管で発現する、非還元条件下でヒトscFvＡで免疫沈降した際の分子量が約１２４ｋＤａである抗原、及び（ｂ）配列番号１〜５のいずれかで表わされるアミノ酸配列を有する、上記抗原と結合する精製抗体を含む。好ましくは精製抗体は、scFvＡ抗体（配列番号１）であり、さらにより好ましくはscFvＡ抗体は、薬学的に活性な化合物と組み合わせて与えられる。

開示の抗体−血液脳関門輸送体系に基づいて、本発明は、血液脳関門を通って、被験体の脳に薬学的に活性な化合物を送達する方法も意図する。このような方法は、抗体が血液脳関門を通って被験体の脳に薬学的に活性な化合物を送達することに関するように、配列番号１〜５のいずれかで表わされる１つに記載のアミノ酸配列を有する精製抗体と組み合わせて、薬学的に活性な化合物を被験体に投与することを含む。好ましくは精製抗体は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するscFvＡ抗体である。

概して、抗体を薬学的に活性な化合物と結合、接続及び連結させる方法が当該技術分野で既知である。例えば、Wu AM, Senter PD著「武装抗体：免疫抱合体に対する保護及び攻撃（Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates）」, Nat Biotechnol. 2005 Sep;23（9）: 1137-46、及びTrail PA, King HD, Dubowchik GM著「癌の標的治療に関するモノクローナル抗体の薬物免疫抱合体（Monoclonal antibody drug immunoconjugates for targeted treatment of cancer）」, Cancer Immunol Immunother. 2003 May;52（5）:328-37；Saito G, Swanson JA, Lee KD著「可逆的なジスルフィド結合を介する結合を利用した薬物送達戦略：細胞活性低減の役割及び部位（Drug delivery strategy utilizing conjugation via reversible disulfide linkages: role and site of cellular reducing activities）」, Adv Drug Deliv Rev. 2003 Feb 10;55（2）: 199-215を参照されたい。さらに、本発明の抗体は、リポソーム、ナノ粒子、又は薬学的に活性な化合物を充填した他の類似の担体と組み合わせて与えられ得る。このような組成物を調製する方法は当該技術分野で既知である（例えばSugano他「ドキソルビシンを充填したリポソームの抗体標的化は、重症複合免疫不全の確立したヒト肺腫瘍異種移植片の増殖及び転移拡散を抑制する（Antibody Targeting of Doxorubicin-loaded Liposomes Suppresses the Growth and Metastatic Spread of Established Human Lung Tumor Xenografts in Severe Combined Immunodeficient）」Mice Cancer Research 60, 6942-6949, December 15, 2000、及びMartin他著「分析化学におけるナノ材料（Nanomaterials in Analytical Chemistry）」, Analytical Chemistry News & Features, May 1, 1998; pp. 322 A-327 Aを参照されたい）。本明細書で用いられる「薬学的に活性な化合物と組み合わせた抗体」という語句は、製造方法によって限定されないものとし、このような組成物は、当該技術分野で既知の結合、接続、連結及び装飾の技法（これらに限定されない）によって作製され得る。

以下に記載の実施例は、疾患ベースの適用に必須の成分である抗体送達ベクターを開示する。このようなベクターの特定は、革新的なコンビナトリアルな抗体スクリーニング技術とＢＢＢ及び脳の薬物送達分野の専門的技術とを組み合わせて複雑な送達課題に対処する。

概して上記のように得られた化合物及び本発明による方法の様々な例示的な実施形態が、以下の実施例を参照してより容易に理解されるであろう。これらの実施例は例示として与えられ、いかようにも本発明を限定することを意図しない。

（実施例１）
大きいscFvライブラリを用いた脳内皮細胞表面のin vitroプロファイリング
脳内皮細胞表面タンパク質（潜在的なＢＢＢ固有輸送系）及び抗体標的化試薬（薬物送達ベクター）の両方を同時に特定するために、本発明者らは、新規の細胞表面プロファイリング又は「選抜」技法の検証を行った。この技法は、酵母の表面上で提示されたナイーブ一本鎖抗体（scFv、図５）のコンビナトリアルライブラリを用いて、内皮細胞表面をプローブする。抗体ライブラリは、１０^９個までの異なるscFvを含有し、この多様な集合体が「in vitro免疫系」であると考えることができる。これに関して、抗体−細胞表面抗原対は、ハイスループット様式で特定することができる。酵母表面提示は、抗体及びＴ細胞受容体の直接評価の技術として十分に確立されている。提示系は、ポリペプチドリンカーを介した、一本鎖抗体と、内因性酵母接合（mating）アグルチニンとの繋留を伴う（図６）。このプラットフォームは、細胞外環境をサンプリングする主な位置にある場合、酵母細胞表面上の所定のscFvの１０^４〜１０^５コピーの提示をもたらす。単一の酵母クローンは、抗体のライブラリから単離されると、「モノクローナル」scFv産生因子として作用する。内皮細胞表面標的化の有効性のプロファイリングのために、酵母細胞−内皮細胞スクリーニングを行うことが可能であることを確認する実験をモデルリガンド系で行った。それから、同様のスクリーニングを行い、脳内皮細胞表面の構成成分のエンドサイトーシスを認識するscFvを特定した。

（実施例２）
モデルリガンドでの酵母細胞−内皮細胞標的化
初めに、モデルscFv表面リガンド系を用いて、選抜方法の有効性を研究した（Wang, X. X.及びShusta, E. V.著「哺乳動物の細胞表面選択におけるscFv提示酵母の使用（The use of scFv-displaying yeast in mammalian cell surface selections）」. J Immunol Methods 2005, 304, 30-42）（その全体が全ての目的のために本明細書に援用される）。要するに、ハプテンフルオレセインを表面リガンドとして用い、抗フルオレセインscFv（４−４−２０）を酵母提示された抗体として用いた。この系によって、選抜の成功に関する因子を詳しく研究した。酵母提示４−４−２０は、フルオレセイン化されたラット脳内皮細胞（ＲＢＥ４細胞株、Roux, F.他著「不死化ラット脳の微小血管内皮細胞におけるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性及びアルカリホスファターゼ活性の調節（Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells）」. J Cell Physiol 1994, 159, 101-13.）との特異的な相互作用を示し（図７）、ちょうど３回で、大きいバックグラウンドの非結合の無関係酵母（１／１０^６）から回収することができた。これらの高効率の選択には、低存在量の膜タンパク質（輸送体）に対する感受性及び適用性を示す細胞１つ当たり１７００個と少ないフルオレセインリガンドが必要であった。遊離フルオレセインの競合因子の添加によって、酵母−ＥＣ相互作用を完全に取り除くことが可能であり、これによって相互作用の特異性が確認された。

ナイーブ酵母ライブラリがナノモル範囲の親和性を有する抗体を含有するので、抱合体形成に対するscFv親和性の効果を調べた。様々な細胞表面ＦＩＴＣ強度で、４−４２−０（Ｋｄ＝１．３ｎＭ）及び高親和性変異型４Ｍ５．３（Ｋｄ＝２７０ｆＭ）の両方を含有する希釈混合物に関して、濃縮度を分析した。要するに、１：１：１０^５の４−４−２０：４Ｍ５．３：非結合体混合物を、様々なフルオレセインリガンド密度を有するＮＡＦＩＴＣ標識単層に適用した。４℃で２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、非特異的な結合体を除去した。３回の連続濃縮にわたって、４−４−２０及び４Ｍ５．３の同時濃縮を分析した（図７）。細胞１つ当たり１７００個のリガンドで、両方のscFvがほぼ等しい効率で濃縮し、中間のリガンド密度では、４Ｍ５．３はより迅速に濃縮した。これらの場合、３ラウンド後の最終産物は、高親和性の４Ｍ５．３ scFvとバランスを保ちながら、１５％〜２５％の４−４−２０を含有した（図８）。この結果は、単一細胞表面標的に対して複数のscFvクローンを抽出することが可能であることを示し、またこの方法を用いて、複数の抗原に対するscFvを同時に濃縮することができることを示唆している。したがって、次の工程は、真の内皮抗原に対する選抜選択を完了させることであった。図９で示されるように、酵母提示ライブラリの細胞培養物選抜に関する最初の戦略を展開した。

（実施例３）
血液脳関門結合及び内在化scFvの特定に関する全体的な戦略
ファージ提示の限界を考慮して、脳内皮細胞と結合するscFvの特定のためのより強力な分析として、図９で示された戦略を展開した。要するに、図９で模式図的に表されるように、scFvライブラリを脳内皮細胞のin vitro培養物と混合した。酵母細胞が内皮細胞上でタンパク質表面に対する抗体を有する場合、酵母細胞は、適切な条件下で内皮細胞と結合することができる。タンパク質表面が高レベルで存在する場合、結合はより強固になり得る。これによって、酵母結合体を回収し、さらなる結合及び精製を行うことができた。特定の結合体を機能性試験にかけ、これらが内皮細胞によってエンドサイトーシス及びトランスサイトーシスを行うことができるか否かを試験し、さらに脳−エピトープ特異性を確認した。これは、全細胞でスクリーニングした酵母提示された抗体の最初の例である。ファージ提示の代わりに酵母提示（ＹＳＤ）を用いて抗体のスクリーニングを行うことには多くの利点がある。ＹＳＤは、scFvライブラリを発現する酵母のフロックリン（flocculin）欠損株のために、バックグラウンド結合が非常に低く、これに対してファージ粒子は、哺乳動物の標的細胞と非特異的に結合することによって、擬陽性結合体を与える傾向がある。さらに、ＹＳＤにおける低バックグラウンドが、シグナル対ノイズ比を増大させることによって、結合クローンを迅速に濃縮し、低い親和性で結合するクローンを特定する能力ももたらす。酵母は、その表面上で５００００個〜１０００００個のscFvを発現するのに対し、ファージ提示された抗体ライブラリは０〜５Ａｂ／ファージしか発現しない。この多数の発現された表面scFvによって、比較的低い親和性のＡｂとその抗原との間の強い相互作用を蓄積させることができる結合力の効果のために、弱い結合体のさらなる特定が可能になる。さらに、scFv発現カセットを分泌発現ベクターにシャトルすることによって、酵母表面上で提示されるscFvを可溶性タンパク質として容易に産生することができる。このようにして、scFvの内在化研究を行うことができる。

（実施例４）
脳内皮細胞結合クローンに関するヒト非免疫scFvライブラリのスクリーニングの成功
本発明者らは、実施例１に記載された研究で用いたのと同一の酵母提示様式でヒト非免疫scFvライブラリを保有する。このようなライブラリを作製する方法は当該技術分野で既知であり、例えば、Feldhaus他. at Nat Biotechnol. 21（2）: 163-70（2003）（参照により本明細書に援用される）で記載されている。ライブラリは、in vivoヒト抗体の重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の多様性のほとんどを表す約１×１０^９個のscFvから成る。ライブラリがナイーブであるので、抗原に対して事前にスクリーニングを行わず、これによって広く多様な範囲の抗原と結合する抗体を提供することができる。高い親和性（Ｋ_ｄ＝１ｎＭ〜１０００ｎＭ）で、ハプテン抗原（フルオレセイン）、リン酸化状態が異なるペプチド抗原（ｐ５３）、タンパク質抗原（リゾチーム）、及び細胞表面受容体（上皮成長因子受容体）の細胞外部分と結合するscFvのパネルを単離するのに、ライブラリを用いることに成功した。scFvライブラリを用いたＲＢＥ４ラットの脳内皮細胞のプロファイリングに、実施例１に記載された酵母−ＥＣ標的化方法を用いた。要するに、酵母ライブラリを１００ｃｍ^２のＲＢＥ４細胞に適用し、結合する酵母クローンを回収及び増幅した（図９）。２０ｃｍ^２、１０ｃｍ^２、及び１０ｃｍ^２のＲＢＥ４細胞それぞれで３回以上、このプロセスを繰り返した。ライブラリの多様性が低下するので、内皮細胞の表面積は、それぞれのラウンドで段階的に低下する必要があった。したがって、濃縮プールを網羅的にカバーするのに調べる酵母クローンを少なくする必要がある。ちょうど４回目の選択の後、回収した酵母の数は、ＲＢＥ４細胞に適用された酵母の数とほぼ同じであり、このことはほとんど全プールが、内皮細胞結合酵母クローンから成っていたことを示す（図１０）。次に、回収された酵母プール由来の個々のクローンをハイスループット基礎で分析し、scFv媒介性の酵母−ＲＢＥ４細胞結合の同一性を決定した。

（実施例５）
生物選抜（Biopanning）を介したＲＢＥ４結合scFvの特定及び濃縮の有効性
本発明者らは、実施例２で記載されたモデル系に基づき、生物選抜抗体ライブラリスクリーニング法を開発した。このモデルをＹＳＤ scFvライブラリに適用し、ＢＢＢ結合及び内在化抗体を特定した。ライブラリの調製は、本明細書で言及された参照と共に、Wang他 at Nat. Methods, 4（2）: 143-5（2007）（参照により本開示に援用される）に記載されている。図１０は、この方法を用いる複数回の濃縮の効果を示す。図１０に示されるように、３回目の後に比べると、４回目の選抜後で、ＲＢＥ４細胞で保持される酵母細胞が多く存在していた。さらに、５回目の後、ほとんど全ての投入酵母集団が回収され、このことは４回のスクリーニングが、ＢＢＢ結合体を「取り出す（pull out）」のに明らかに十分であり、脳の特異性に関してスクリーニングするのに、他の細胞型又は内皮に対する前減算（presubtraction）実験を利用することができることを示している。ライブラリの回収率は、図１０の下のパネルの表に列記されている。複数回の漸進的選抜後、増大するライブラリの回収率によって、この方法の有効性が示される。これに対して、ネガティブコントロールである４−４−２０酵母の値は同じままであった。

（実施例６）
ＲＢＥ４結合競合酵母クローンのハイスループット分析
本発明の毛細血管選抜系が図１０で示される結果で例示されたが、依然として本発明者らにはライブラリでクローンを迅速に再検討する方法が必要であった。したがって、本発明者らは、結合クローンのハイスループットスクリーニング及びシークエンシングを可能にする方法を開発した。要するに、scFv発現を酵母クローンの表面上で誘導するように、９６ウェルフォーマットで酵母クローンを増殖した（図１１Ａ）。次いで、ＲＢＥ４細胞単層が入った９６ウェルプレートに酵母を直接移した（図１１Ｂ）。適切な洗浄後、９６ウェルプレートを光学顕微鏡でスキャンした。ＲＢＥ４細胞単層上の酵母の保持によって、結合を正確に媒介する酵母クローンを簡単に特定した（図１１Ｃ）。内皮細胞の結合が、単に酵母株における擬似的な遺伝子突然変異の結果ではないことを確認するために、scFv発現を誘導しない炭素源で培養した酵母を用いて、平行プレートを試験した（図１１Ｄ）。インキュベーン工程及び洗浄工程後、誘導された結合体クローン（図１１Ｃ）は、多くの酵母を遊離させたが、非誘導酵母では比較的少なかった（図１１Ｄ）。非結合体クローンは、誘導群及び非誘導群の両方でほとんどの酵母を遊離しなかった。この特定のスクリーニングでは酵母の突然変異は特定されず、全ての結合がscFv媒介性であった。酵母結合体が特定されたら、コロニーＰＣＲを行い、それぞれのscFvクローンのオープンリーディングフレームを増幅した（図１１Ｅ）。要するに、制限酵素ＢｓｔＮＩを用いて、酵母細胞から直接、scFvをコードするプラスミドを増幅した。この酵素はＤＮＡを頻繁に切断するため、異なるＤＮＡが、異なる消化パターン又はフィンガープリントを示す（図１１Ｆ）。概して、特有のscFvクローンは、５ヌクレオチドＢｓｔＮＩの認識部位が多く存在するために異なる制限プロファイルを示す。特有のＢｓｔＮＩ消化を有するscFvをシークエンシングにかけた。特有の制限パターンを示すそれぞれのクローンのＰＣＲ産物を直接シークエンシングし、生殖細胞系起源をＩｇＧＢＬＡＳＴで特定した（図１１Ｇ）。特有のクローンの概要が図１２で示される表で与えられる。

（実施例７）
結合するscFv変異体の要旨
図１２は、scFv変異体の結合を要約する表である。図１２に示されるように、今日までに全２０００個のクローンがスクリーニングされている。２０００個のクローンの中で、１７６０個がＲＢＥ４細胞と結合した。結合クローンは図１２で列記される。同じ生殖細胞系を使用したscFvが１つにまとまるように、クローンを編成した。それぞれのサブセットのscFvは高い配列相同性を共有する。しかし、この相同性にもかかわらず、１つのアミノ酸だけが変わったＣＤＲが異なる抗原と結合することができ、このことからそれぞれが特有の結合体であり得る。さらに、クローンが同じ抗原と結合した場合であっても、これらは異なる親和性で結合し得る。さらに、scFvの幾つかは、スクリーニングされた全てのクローンの中のわずか１回で現れることに留意するべきである。このことによって、他にこのような珍しい結合体が検出されていないために、開発されたハイスループットなスクリーニング方法の効力が示される。

（実施例８）
scFv生殖細胞系ファミリの特定
これらのクローンに対する生殖系列ファミリの使用は図１２に要約される。特有のscFvは相同性によってまとめられた。各クラスのscFv抗体は、最低でも１つのＣＤＲ３で全ての他のクラスと異なる（２０％未満のアミノ酸相同性）。ＣＤＲ１及びＣＤＲ２の多様性を制限するライブラリに関する非免疫基礎、並びにＶＨ及びＶＬのＣＤＲ３は、結合特異性及び親和性を求めるのに主要な役割を果たすという事実を考慮して、クラスを定義するのにＣＤＲ３領域に焦点が当てられた。クラスの中で、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３（８５％超のアミノ酸相同性）は全て、相同性が高い。図１２は、scFvＡ及びscFvＤが分析クローンで優勢であることも示す。このため、本発明者らが、初めにscFvＡ及びscFvＤを特定してから、ハイスループット方法を用いて非Ａクローン又は非Ｄクローンを分析するin situノーザンブロット法を開発したので、より多くのクローンを分析することが回避される。

この方法を用いて、４回の選抜由来の総数約２０００個のクローンを分析している。これまで特定された３４個の特有のscFvの中で、統計的考察に基づき、複数回でわずか数個のクローンしか回収されず、４回濃縮プールでは多くの特有のクローンが残る。回収されるクローンに関する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の生殖細胞系起源を図１２に示し、２つのクローン（Ｅ及びＪ）は、重鎖可変領域のみから成る。完全な方法によって、１０００個のＢＢＢ結合scFvクローンの迅速な分析が可能になる。scFvＡ様クローンの配列アラインメントが図１３で与えられ、scFvＤ様クローンのアラインメントが図１４で与えられ、scFvＡ様クローンを有するscFvＦのアラインメントが図１５で与えられる。

（実施例９）
ＲＢＥ４によるscFvの結合及び内在化
酵母ライブラリの有効性に関する試験は、結合クローンの特定から開始したが、トランスサイトーシスにおけるこれらの使用には、scFvが内在化し得ることがさらに必要である。したがって、scFvがＲＢＥ４で内在化し得るか否かを調べるのに、scFvも試験した。酵母は内在化させるには大きすぎるので、酵母細胞培養物中でscFvを可溶化タンパク質として産生した。これを行うために、ＹＳＤプラスミド中のscFv遺伝子を分泌プラスミドにサブクローニングし（実施例１０の下部に記載）、それからscFvを酵母細胞培養培地に分泌した。要するに、図１２における幾つかのscFvに関するscFvオープンリーディングフレームを、ｍｇ／Ｌレベルの活性のある精製scFvを得る酵母発現系にサブクローニングした（Shusta, E.V.他「Ｔ細胞受容体操作に関する安定足場の直接評価（Directed evolution of a stable scaffold for T-cell receptor engineering）」. Nat Biotechnol 2000, 18, 754-9；Shusta, E. V.他「一本鎖抗体断片の産生に関するサッカロマイセス・セレヴィシエの分泌能の増大（Increasing the secretory capacity of Saccharomyces cerevisiae for production of single-chain antibody fragments）」. Nat Biotechnol 1998, 16, 773-7；Shusta, E.V.他「酵母ポリペプチド融合表面の提示レベルは、熱安定性及び可溶性分泌効率を予測する（Yeast polypeptide fusion surface display levels predict thermal stability and soluble secretion efficiency）」. J Mol Biol 1999, 292, 949-56）。この系は、ガラクトース誘導性ＧＡＬ１−１０プロモータによって調節され、精製のために、ｃ末端のｃ−ｍｙｃエピトープ及び６ヒスチジンエピトープタグを含む。

図１６は、ポリアクリルアミドゲル上での可溶性scFvの電気泳動の結果を示し（上のパネル）、全てがscFvに関して２８ｋＤａ〜３５ｋＤａの範囲の適切なサイズを示し、発現レベルが１〜４ｍｇ／ｍｌの範囲である。図１７で示されるように、ＲＢＥ４細胞がこれらの可溶性scFvで標識された場合、Ａ群はＲＢＥ４細胞の強い標識を示し、内在化することもできた。一方で、Ｄ群のscFv及びscFvＦは、ＲＢＥ４細胞との結合は示したが、内在化しなかった。これらの実験の結果は、図１６の下のパネル及び以下で要約される。

細胞内在化を媒介する能力に関して、クラス１、２、及び３のscFvの幾つかを評価した。scFvを抗ｃｍｙｃエピトープタグ抗体と前二量体化（predimerized）して、受容体クラスター化及びエンドサイトーシスに必要であることが多い二価性を与えた。次いで、４℃で二量体化scFvを生ＲＢＥ４細胞に適用して、細胞表面標識を得た。続いて、３０分間、ＲＢＥ４細胞を３７℃に移し、細胞輸送（cellular trafficking）を可能にした（図１７及び図２０）。クラス１のscFvＡはＲＢＥ４細胞内の血管構造に迅速に内在化したが、クラス２のscFvＤ及びクラス３のscFvＦは、ＲＢＥ４細胞表面と結合したが、内在化を促進しなかった。コントロールの抗フルオレセイン抗体（４−４−２０）は結合も取り込みも示さなかった。異なる内在化パターンによって示唆されるように、scFvＡ及びＯＸ２６は、同じ輸送系で競合しない。さらに、結合及び内在化前のＲＢＥ４細胞の脱グリコシル化（マンノシダーゼ及びノイラミニダーゼ）には、観察可能な効果がなかったので、輸送体−scFvＡ相互作用は、グリコシル化状態に感受性ではない。さらに、図１２で示されるscFvＡのクローンＢ、Ｃ、Ｇ及びＫの高い相同性によって、このファミリの成員が、内在化を促進するのに等しく効果的であり得ることが示される。

さらに具体的には、細胞表面標識のために４℃で、ＲＢＥ４細胞を前二量体化scFvＡ、scFvＤ、scFv４−４−２０（エンドサイトーシスに必要であることが多い受容体クラスター化を促進するのに二量体化した）、又はＯＸ２６モノクローナル抗体で標識してから、３７℃にシフトし、細胞輸送を促進した。次いで、サポニン（ＳＡＰ）処理で細胞を透過化しながら又は透過化しないで、細胞を４℃でＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５結合抗マウスＩｇＧ、その後ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８結合抗マウスＩｇＧで標識した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ標識画像のマージ画像は図２０で示される。（サポニン処理をした（上段左）及びサポニン処理をしない（中央上）scFvＡ標識に比べて）scFvＡは表面及び細胞内の両方の標識を示した。これに対して、scFvＤ（上段右）は、サポニン処理下で表面標識のみを示した。４−４−２０対照scFvでは標識されなかった（下段右）。これらの結果は、scFvＡがＲＢＥ４細胞内で血管構造に迅速に内在化したが、scFvＤ及びscFvＦは、ＲＢＥ４表面と結合したが、内在化を促進しなかったことを示す。参考値として、ＯＸ２６ＭＡｂ（図２０の下段左）によって、in vitro及びin vivoで脳内皮細胞を通るエンドサイトーシス及びトランスサイトーシスが実証されている。述べられたように、図１７は、ＲＢＥ４細胞によるscFvＡの特異的な結合及び内在化を示すが、scFvＤでは示されないＲＢＥ４結合scFvの二重蛍光染色を示す顕微鏡写真さらに示した類似のデータを提示する。

本発明者らは、クラス１のscFvが、３〜４μｇ／ｍＬの上清又は精製材料のいずれかで、はっきりした結合シグナルを示したが、クラス２のscFv（scFvＤ）及びクラス３のscFv（scFvＦ）には、細胞表面免疫標識を得るのに、約１０倍高い２０〜８０μｇ／ｍＬの精製濃度を必要としたことを実証した。生ＲＢＥ４細胞の結合親和性に関して、クラス１のscFvＡは、Ｋｄ＝８２±１５ｎＭの親和性を保有する一方で、この方法を用いては、単量体タンパク質としてのクラス２のscFvＤの親和性を求めることができなかった。代わりに、本発明者らは、エピトープタグ抗体との前二量体化後のscFvＤの結合特性を評価した（結合力＝２．０±０．１ｎＭ）。比較すると、ファージミド選抜を用いて単離した抗トランスフェリン受容体の親和性は、１３５ｎＭと測定され、本発明者らの酵母選抜系で単離したscFvＡと同程度の親和性であった。

図１８は、scFvＡ及びscFvＤの平衡結合性を提示する。図１８の左側のパネルは、生ＲＢＥ４細胞とのscFvＡ相互作用に関する結合等温線を示す。プロットは、適合単量体平衡結合関数及び２つの独立実験の実験データを示す。図１８の右側のパネルは、ＲＢＥ４細胞との二量体化scFvＤ相互作用に対する結合等温線を提示する。プロットは、見かけの親和性（結合力）を生じるのに用いられた適合単量体平衡結合関数及び２つの独立実験の実験データを示す。挿入図は、結合曲線を作成するのに用いられた生のフローサイトメトリヒストグラムを示す。

したがって、本明細書で開示された結果は、ＭＡｂの供給源としてハイブリドーマ調整培地（hybridoma-conditioned medium）を用いるアプローチと類似の簡易な生化学試験に、酵母培養上清を直接用いることができる。さらに、実施例１１で記載されるように、ｃ末端の６ヒスチジンエピトープを用いて、標識及び輸送試験のためにscFvを精製することができる。

（実施例１０）
scFvに関する抗原の免疫沈降
scFvで認識される抗原の性質を評価するために、本発明者らは、新規の酵母免疫沈降手順を開発した。本発明者らは、洗浄剤が可溶化したビオチン化ＲＢＥ４溶解物から同族の原形質膜抗原を直接的に免疫沈降するのにscFvを提示した酵母を用いた。好都合なことに、免疫沈降粒子として酵母を使用することによって、従来の免疫沈降法で必要となるさらなる任意のscFvタンパク質のサブクローニング、産生又は固定化をすることなく、抗原をサイジングさせた。本発明者らは、抗ビオチンウェスタンブロッティングによって免疫沈降産物を評価し（図１９）、このようなブロットにおける少量のバックグラウンドは、免疫沈降プロセスの特異性の直接的な指標であった。クラス１のscFvＡ（１２４ｋＤａが非還元で、幾つかの高分子量バンドが還元されている）、クラス２のscFvＤ（１０４ｋＤａが非還元で、１１７ｋＤａが還元されている）及びクラス６のscFvＪ（１２２ｋＤａが非還元で、１２７ｋＤａが還元されている）で免疫沈降された抗原は異なっていた（図１９）。相同性ベースのscFvのクラス割り当てによって予測されるように、他のクラス１のscFv（scFvＢ、scFvＣ、scFvＧ及びscFvＫ）は、scFvＡに対して見られたものと同一の免疫沈降産物が得られ、クラス２のscFvＩは、クラス２のscFvＤで見られたものと同様であった（データ図示せず）。還元scFvＡサンプルで現れる複数のバンドは、scFvＡで特異的に認識された抗原と共に、タンパク質複合体又は場合によっては複数の特異的抗原の他のビオチン化成員の同時免疫沈降が行われ得ることを示唆している。したがって、薬物送達の基礎を形成する新規の抗体−血液脳関門輸送体の組合せを示すscFv抗原系が特定された。

（実施例１１）
精製scFvＡがin vivoで脳血管系を標識する
これまでに記載されたハイスループット方法によって、ＲＢＥ４細胞と特異的に結合し、且つ培養物中でエンドサイトーシスし得るscFvクローンを特定した。しかし、本発明者らは、また培養物中で特定されたクローンが、in vivoで脳内皮細胞と結合することを確認することを望んでいた。したがって、培養物中でscFvＡで標的化された抗原が、in vivoで内皮細胞にも存在することを最初に確認する必要があった。図２１は、scFvＡ標的抗原密度及び脳の局在化の評価を示す。具体的には、左側のパネルは、ＲＢＥ４細胞に対する抗原密度のフローサイトメトリ評価を示す。抗トランスフェリン受容体モノクローナル抗体（ＯＸ２６）、ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（図示せず）、前二量体化scFvＡ、前二量体化scFvＤ、及び前二量体化コントロール用４−４−２０scFvを抗原飽和濃度で用い、抗原密度の直接的な比較をするためにＲＢＥ４細胞を標識した。次いで、フローサイトメトリによって、ＲＢＥ４細胞上に存在する抗原部位の相対数を評価した。scFvＡ抗原は、scFvＤで見られたものより約３倍高いレベルで、トランスフェリン受容体で見られたものより５．５倍多く存在していた。また、ＯＸ２６モノクローナル抗体は、免疫標識実験でscFvＡと競合せず、また結合前のＲＢＥ４細胞の脱グリコシル化（マンノシダーゼ及びノイラミニダーゼ）には、観察可能な効果がなかったので、輸送体−scFvＡ相互作用は、グリコシル化状態に感受性でもなかった。

図２１の右側のパネルは、scFvＡが脳血管系を選択的に認識していることを示す。脳毛細血管特異性が高いレクチンであるグリフォニア・シンプリシフォリア（Griffonia simplicifolia）アグルチニン（ＧＳＡ）でのscFvＡ標識の共局在化が完了し、全ての脳血管がscFvＡ抗原を発現することを示した。scFvＡ（画像１）又は４−４−２０（画像４）と、脳内皮細胞マーカーＧＳＡ−ＦＩＴＣ（画像２、画像５）とで凍結ラット脳切片を同時に標識した。画像３及び画像６は、scFv及びＧＳＡ−ＦＩＴＣの標識の重複を示すマージ画像である。scFvＡとは対照的に、無関係のscFv４−４−２０は全く標識をもたらさなかった。マウスの脳切片及び新たに単離した毛細血管で、同様の結果が観察された。最終的に、ＲＢＥ４培養物に関する抗原密度の序列に酷似して、定性的な標識強度は、in vivoでのscFvＡ抗原密度が、トランスフェリン受容体に関するそれより高かったことを示した（データ図示せず）。画像３に示すスケールバーは５０μｍの長さである。したがって、scFvＡは、in vivoで脳組織の血管成分を特異的に標識し、その抗原は内皮由来のものである。

（実施例１２）
材料及び方法
以下で、上記の実施例の項で用いられる材料及び方法の詳細な説明を行う。

scFvライブラリの増殖及び誘導
ＳＤ−ＣＡＡ（２０．０ｇ／Ｌのデキストロース、６．７ｇ／Ｌの酵母窒素塩基、５．０ｇ／Ｌのカザミノ酸、１０．１９ｇ／ＬのＮａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、８．５６ｇ／ＬのＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏ）、加えて５０μｇ／ｍＬのカナマイシン中で、ＥＢＹ１００酵母８（ａ、ＧＡＬ１−ＡＧＡ１：：ＵＲＡ３ｕｒａ３−５２ｔｒｐ１ｌｅｕ２・１ｈｉｓ３・２００ｐｅｐ４：：ＨＩＳ２ｐｒｂ１・１．６Ｒｃａｎ１ＧＡＬ）における非免疫ヒトscFvライブラリを３０℃で２４時間増殖した（ＯＤ６００〜１０）。続いて、ＲＢＥ４単層から選抜する前に、２０℃で２２時間、１０倍過剰のライブラリ多様性で酵母（５×１０^９）を、ＳＧ−ＣＡＡ培地（デキストロースがガラクトースに置き換わったことを除いてＳＤ−ＣＡＡと同じ）５００ｍＬ中で誘導した。

ＲＢＥ４細胞単層からのscFvライブラリ選抜
ＲＢＥ４細胞が、in vivoのＢＢＢで特徴的である多くの特質を示すことがこれまでに実証されているので、脳内皮細胞源として、ＲＢＥ４ラットの脳内皮細胞株を用いた。ＲＢＥ４細胞は、非形質転換表現型を示し、典型的な内皮マーカーを発現し、星状膠細胞の合図（cues）に反応し、強固な密着結合タンパク質であるオクルディンの発現及び正確な局在化等のＢＢＢに特異的な性質を示す。さらに、グルコース（ＧＬＵＴ１）、大きい中性アミノ酸（ＬＡＴ１）、及び鉄（トランスフェリン受容体）を輸送する輸送体、ＢＢＢの能動拡散において機能する輸送体（ｐ−糖タンパク質、ＭＤＲ１）を含む脳内皮細胞で特徴的である原形質膜局在化輸送体をＲＢＥ４細胞で発現する。ＲＢＥ４細胞は、Francoise Roux博士から頂いたものであり、これまでに記載されたように維持した。選抜する前に２日間、２５％密集度（confluency）で、Ｉ型コラーゲン被覆（Sigma）６ウェルプレート上でＲＢＥ４細胞を播種した。１ｍＭのＣａＣｌ_２、０．５ｍＭのＭｇ_２ＳＯ_４及び０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充した０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）（洗浄緩衝液）で、１０倍過剰のライブラリサイズで誘導された酵母細胞（５×１０^９個の酵母）を２回洗浄し、１００ｃｍ^２のＲＢＥ４細胞単層上に酵母混合物を滴下して、単層にわたるさらなる分布を確実にした。酵母の密度（５×１０^７酵母／ｃｍ^２）は、酵母が完全にＲＢＥ４単層を被覆する選抜の上限である。高密度の選抜によって、結合酵母が約３０％回収されるが、ライブラリの多様性を適切に過剰サンプリングもする。次いで、単層を４℃で２時間インキュベートし、酵母−ＲＢＥ４細胞を接触させた。洗浄方法を最適化し、親和性がナノモルのＲＢＥ４細胞と結合するscFvモデルを回収した。得られた方法は、２５回ゆっくりとプレートを振盪させることによって氷冷洗浄緩衝液でＲＢＥ４層を洗浄すること、５回プレートを循環させること（２回反復）、及び１０回プレートを循環させることを伴っていた。それぞれの工程後に洗浄上清を取り除き、新たな洗浄緩衝液で置き換えた。洗浄工程後、洗浄緩衝液１ｍＬをそれぞれのウェルに添加し、プレートから全てのセルを削り落とし、共にプールした。酵母／ＲＢＥ４細胞混合物をカナマイシン補充ＳＤ−ＣＡＡ５ｍＬ中で再懸濁し、３０℃で一晩増殖させたあと、２０℃で２０時間ＳＧ−ＣＡＡ誘導した。並行して、回収した細胞の一部をＳＤ−ＣＡＡ寒天プレート上で培養し、各回の後、回収された酵母細胞の総数を定量した。１回目の後、プールの多様性が大幅に減少したので、酵母選抜密度が、５×１０^６酵母／ｃｍ^２まで下がり、ＲＢＥ４領域は、２回目で２０ｃｍ^２、３〜５回目で１０ｃｍ^２まで下がった。２回目の選抜後、回収された酵母クローン数は８．２×１０^４個で、抗フルオレセインscFv（４−４−２０）を提示するコントロール用酵母による並行実験では、選抜戦略が主にＲＢＥ４結合酵母クローンを得ていたことを示す同じ洗浄計画を用いても、ほとんどバックグランドは示されなかった。酵母−ＲＢＥ４相互作用がscFvに基づくことを確認するために、Ｚｙｍｏｐｒｅｐ酵母ミニプレップキット（Zymo Research）を用いて、幾つかのＲＢＥ４結合酵母クローン（３回目で７個、４回目で１２個）に関するscFvコードプラスミドを回収した。次いで、酢酸リチウム法を用いて、scFvをコードするプラスミドを酵母表面提示親株ＥＢＹ１００に再び形質転換し、Ｔｒｐ＋形質転換体を選択した。再び形質転換したクローンとのＲＢＥ４結合が確認された後、Ｇａｌ１−１０（５’−ＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＴＧＴＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴ−３’、配列番号３５）及びαターミネータプライマー（５’−ＧＴＴＡＣＡＴＣＴＡＣＡＣＴＧＴＴＧＴＴＡＴ−３’、配列番号３６）（ＵＷ−マディソンバイオテクノロジーセンター（UW-Madison Biotechnology Center））でプラスミドをシークエンシングした。

回収した酵母クローンのハイスループット分析
上記のように、最初にＳＤ−ＣＡＡで、その後ＳＧ−ＣＡＡで酵母を通常に増殖し、scFv発現を促進させた。しかし、９６ウェルフォーマットを用いた場合、この技法によって、比較的低レベルのscFv表面発現レベル、及びscFvを提示する酵母の割合の低下が得られた。したがって、９６ウェルプレートに関して、scFv提示方法を最適化し、ＳＧ−ＣＡＡにおける同時増殖及び誘導によって、従来の酵母提示法を用いて観察されたものと同程度の効率を有するscFv提示が可能になったことを見出した。したがって、ハイスループットスクリーニングに関して、９６ウェルプレートで、酵母クローンをＳＧ−ＣＡＡ（誘導サンプル）及びＳＤ−ＣＡＡ（対照の非誘導サンプル）２００μＬに接種し、３０℃で２４時間インキュベートした。並行のＳＧ培養物と同程度の総酵母数を確保するためにＳＤ培養物１６０μＬを取り除いた後、酵母の９６ウェルプレートを遠心分離し、上清を慎重に取り除いた。それから、洗浄緩衝液１５０μＬで酵母を１回洗浄し、洗浄緩衝液１５０μＬ中で再懸濁させた。並行して、９６ウェルプレートで密集するまで培養したＲＢＥ４細胞を氷冷洗浄緩衝液で１回洗浄した。その後、酵母クローンをＲＢＥ４単層の入った対応ウェルに移し、４℃で２時間インキュベートした。洗浄後、光学顕微鏡を用いて、scFv酵母クローンの結合能を評価した。目視検査の後、酵母クローンは、誘導酵母が結合したままであったのに対し、同じクローン由来の非誘導酵母は洗い流されていた。

全酵母細胞ＰＣＲによって、結合酵母クローンによって包含されるscFv遺伝子を直接増幅した。要するに、少量の新たな非誘導酵母コロニーを０．２％ＳＤＳ３０μＬに移し、ボルテックスして、−８０℃で２分間凍結し、９５℃で２分間インキュベートした（温度シフトは１回繰り返した）。その後、ＰＮＬ６フォワードプライマー（５’−ＧＴＡＣＧＡＧＣＴＡＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧ−３’、配列番号３７）及びＰＮＬ６リバースプライマー（５’−ＴＡＧＡＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＣＧＴＴＣ−３’、配列番号３８）によるＰＣＲ反応鋳型として、細胞溶解液１μＬを用いた。続いて、６０℃で１４時間、ＰＣＲ産物２０μＬをＢｓｔＮＩ（New England Biolabs）の制限酵素処理にかけた。特有のscFvクローン特定のために、制限酵素処理産物を３％アガロースゲル上に分離させた。特有のＢｓｔＮＩ処理パターンを提示するそれぞれのクローンのＰＣＲ産物を、ＲｅｖＳｅｑＰ２（５’−ＣＣＧＣＣＧＡＧＣＴＡＴＴＡＣＡＡＧＴＣ−３’、配列番号３９）及びＦｏｒＳｅｑＰ２（５’−ＴＣＴＧＣＡＧＧＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧ−３’、配列番号４０）プライマーでシークエンシングした。その後、この配列をＩｇＢＬＡＳＴプログラムで分析し、ヒト生殖細胞系起源と特定した（ＩｇＢＬＡＳＴはＮＣＢＩウェブサイト：www.ncbi.nlm.nih.govで利用可能である）。

酵母コロニーのノーザンブロッティング
酵母コロニーのノーザンブロッティングを用いて、酵母結合プールからクラス１及びクラス２のscFvを検出し、事前に差し引いた。ＲＮａｓｅの汚染を排除するために、標準的なノーザンブロッティング実験に関する試薬及び取扱説明書を準備した。ＳＤ−ＣＡＡ寒天プレート上で、酵母クローンをを培養し、得られたコロニーをエタノール殺菌したニトロセルロース膜上に移した。次いで、コロニー充填膜をＳＧ−ＣＡＡ寒天プレートの上部に細胞側を上にして載せ、３０℃で２日間インキュベートして、scFv遺伝子の転写を誘導した。ノーザンブロッティングのために誘導された酵母コロニーを調製するために、１０％ＳＤＳを染み込ませたワットマン濾紙上に、ニトロセルロース膜を載せ、６５℃で３０分間インキュベートした。６５℃で３０分間ホルムアルデヒドを染み込ませた濾紙に移すことでフィルタを固定した（３×ＳＳＣ、ｄｄＨ_２Ｏ中の１０％ホルムアルデヒド）。続いて、真空下で、８０℃で２時間、空気乾燥した膜を焼成した。製造業者の取扱説明書（IDT）に従ってＳＴＡＲＦＩＲＥキットを用いて、１０残基の３２^Ｐ−ｄＡＴＰで、クラス１のＶＨＣＤＲ２及びクラス２のＶＨＣＤＲ２に対応するオリゴヌクレオチドプローブを放射標識し、シンチレーション計測によって、その比放射能を求めた。生殖細胞系のＶ領域の一部であるので、ＶＨＣＤＲ２領域は、クラス１とクラス２との間で１００％の相同性を示し、したがってハイブリダーゼーションベースの控除の影響を受けやすかった。この膜は、４３℃で２時間、前ハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド、５×デンハート溶液、５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、０．１％サケ***ＤＮＡ）中で遮断された後、４３℃で一晩、ハイブリダイズされた（８×１０５ｃｐｍ／ｍｌのそれぞれのプローブを有する前ハイブリダイゼーション緩衝液）。ハイブリダイゼーション後、ニトロセルロース膜を以下の通りに洗浄した：室温で８分間、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；室温で８分間、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；室温で８分間、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；５０℃で３０分間、０．１×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ。次いで、−８０℃で２４時間又は７２時間、この膜をＥＣＬＨｙｐｅｒｆｉｌｍ（Amersham）に曝露した。これらの差し引かれたスクリーニングにおけるプローブとしてＶＨＣＤＲ２を用いたが、回収されたscFvクローンの多様性は、ＣＤＲプローブの任意の組合せを用いて差し引かれることによって、回収されたscFvクローンの多様性を所望の通りに容易に広げることができる。

scFvの分泌及び精製
ＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限消化によるＢｓｔＮＩに用いられたＰＣＲ産物から、scFvに関するオープンリーディングフレームを単離し、scFv分泌で広範囲に用いられたscFv酵母分泌ベクター（ｐＲＳ３１６−ＧＡＬ４−４−２０）に組み込んだ。次いで、得られたｐＲＳ３１６−ＧＡＬscFvプラスミドを、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを過剰発現する酵母株ＹＶＨ１０に形質転換した。３０℃で７２時間、２×ＳＣＡＡアミノ酸（１９０ｍｇ／ＬのＡｒｇ、１０８ｍｇ／ＬのＭｅｔ、５２ｍｇ／ＬのＴｙｒ、２９０ｍｇ／ＬのＩｌｅ、４４０ｍｇ／ＬのＬｙｓ、２００ｍｇ／ＬのＰｈｅ、１２６０ｍｇ／ＬのＧｌｕ、４００ｍｇ／ＬのＡｓｐ、４８０ｍｇ／ＬのＶａｌ、２２０ｍｇ／ＬのＴｈｒ、１３０ｍｇ／ＬのＧｌｙ、２０ｍｇ／Ｌのロイシン及びウラシルを欠くトリプトファン）で補充した最小ＳＤ培地（２％デキストロース、０．６７％酵母窒素塩基）でscFv分泌ベクターを包含する酵母を増殖した。その後、２０℃で７２時間、非特異的担体として、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを有するＳＧ−ＳＣＡＡ（デキストロースをガラクトースで置換）で、scFv分泌を誘導した。精製scFvを必要とする実験のために、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）を用いて、本明細書で先に記載したように、バッチ５０ｍＬ又は１Ｌから、６つのヒスチジンタグを付けたscFvを精製した。

４％積層ゲル及び１２．５％分離ゲルによるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、その後クーマシーブルー染色によって、scFvのサイズ、純度及び分泌収率を分析した。一連の炭酸脱水酵素標準（３１ｋＤａ）と比較し、且つＢＣＡタンパク質分析（Pierce）によって、タンパク質濃度を評価した。並行してまた、ウェスタンブロッティングで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離されたタンパク質をニトロセルロース膜（BioRad）上にブロットした。５％脱脂乳を補充したＴＢＳＴ溶液（８ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、２０ｍＭのトリスでｐＨ７．６に調製）中で４℃で一晩、ニトロセルロース膜を遮断し、１μｇ／ｍＬの９Ｅ１０抗ｃ−ｍｙｃ抗体（Covance）、その後抗マウスＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合体（Sigma）でプローブした。増感化学発光を用いて検出を行い、定量のために、NIHのＩｍａｇｅＪソフトウェアでＥＣＬｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Amersham）への複時点暴露を評価した。

親和性測定
ＲＢＥ４細胞を４℃で様々なscFvＡ濃度で標識し、抗ｃｍｙｃ（９Ｅ１０）抗体、その後抗マウスＩｇＧＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５の標識によって、結合したscFvを検出した。蛍光強度は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータによってモニタリングし、わずかの結合リガンドを定量するのに用いた。scFvＡ結合データを平衡結合モデルに適合させ、一価の親和性の解離定数（Ｋｄ）を求めた。細胞標識分析は、scFvＤが抗エピトープタグ抗体９Ｅ１０と前二量体化したので、単量体scFvＤを用いて結合曲線を作成し、リガンド結合測定に必須の結合力を与えるのに十分な感度がなかった。したがって、scFvＤ二量体標識細胞を抗マウスＩｇＧのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５抱合体でプローブし、フローサイトメトリで評価した。得られたデータを平衡結合モデルに適合させ、見かけの親和性（結合力）を導いた。抗原密度実験に関して、６２．５ｎＭの前二量体化scFvＡ、scFvＤ、４−４−２０ scFv、ＯＸ２６モノクローナル抗体、又はＩｇＧ２ａアイソタイプコントロールによって４℃で生ＲＢＥ４細胞を標識した。標識強度の定量比較を容易にするのに、それぞれのサンプルで均一な二次抗体（抗マウスＩｇＧＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５抱合体）を用いた。これらの抗体標識濃度は、細胞表面の抗原の飽和結合に適切であり、細胞表面の標識は、フローサイトメトリで定量的に評価した。

scFv−ＲＢＥ４免疫細胞化学
scFvの細胞内在化を促進するのに重要な要素であることが多い二価性を与える方法として、９Ｅ１０抗体によるｃ−ｍｙｃエピトープタグを介するscFvの前二量体化を利用した。この目的のために、初めにＲＢＥ４結合scFvを９Ｅ１０でインキュベートし、人工二量体を形成した。等量の精製scFv（１ｍＭのＣａＣｌ_２、０．５ｍＭのＭｇ_２ＳＯ_４で補充したＰＢＳ中で４０％ヤギ血清を用いて、scFvＡでは８μｇ／ｍＬ、又はscFvＤ及び４−４−２０では３２μｇ／ｍＬに希釈した）及び１０μｇ／ｍＬの９Ｅ１０を混合し、室温で１時間インキュベートして、人工二量体を形成した。約９０％の密集度のＲＢＥ４細胞を洗浄緩衝液で３回洗浄した。次いで、４℃で３０分間、ＲＢＥ４細胞をscFv人工二量体又はＯＸ２６モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）（Serotec）でインキュベートした後、さらに３０分間、３７℃に切り替えた。４℃で３０分間、細胞表面結合scFvを標識するのに、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ５５５（Molecular Probes）と結合した抗マウスＩｇＧ二次抗体を適用させた。その後、４℃で５分間、洗浄緩衝液で希釈した０．５％サポニン（SigmaAldrich）で細胞を浸透させた後、４℃で３０分間、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Molecular Probes）と結合した抗マウスＩｇＧ抗体で標識して、内在化scFvを検出した。それから、標識細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、蛍光顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ７０）を用いて調べた。

酵母提示免疫沈降
同族原形質膜抗原を免疫沈降するのに、ヒトscFvライブラリから選択されたscFv提示酵母細胞を直接用いた。抗ニワトリ卵リゾチーム（Ｄ１．３）scFvを提示する酵母細胞をネガティブコントロールとして用いた。ＮｈｅＩ−ＸｈｏＩ断片としてｐＲＳ３１６−ＧＡＬＯＸ２６からＯＸ２６ scFvオープンリーディングフレームを切断し、ｐＣＴ−ＬＷＨＩにライゲートすることによって、ポジティブコントロールとして、抗トランスフェリン受容体ＯＸ２６ scFv酵母提示プラスミドを作製した。酵母クローンを上記のように培地５０ｍＬで培養、誘導した。誘導された酵母を遠心分離で回収し、ＰＢＳ中の３％（体積／体積）ホルマリンで洗浄して固定した。０．５ｍｇ／ｍＬのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Pierce）を用いて、ＲＢＥ４原形質膜タンパク質をビオチン化した。ＲＢＥ４細胞溶解物を調製するために、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Calbiochem）で充填した、１％（ｗ／ｖ）ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（scFvＡ、Ｂ、Ｃ及びＪ、Sigma）又は０．１％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００（scFvＤ、Ｉ、Ｊ、及びＯＸ２６、Sigma）の洗浄ＰＢＳ溶液を用いて、約５×１０^６個のビオチン化ＲＢＥ４細胞を溶解した。免疫沈降のために、細胞溶解タンパク質４００μｇを約１０^８個の酵母細胞と混合し、４℃で一晩、インキュベートした。１５分間、０．４Ｍのトリス（ｐＨ６．８）中の０．５％ＳＤＳ３０μＬで酵母細胞を再懸濁することによって、免疫沈降産物の溶出を行った。存在する還元剤（ＤＴＴ）を用いて又は用いずに、溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％分離ゲル）で分離し、ニトロセルロース膜（BioRad）上でブロットした。その後、上記のように、抗ビオチンモノクローナル抗体（０．５μｇ／ｍＬのクローンＢＴＮ．４、Labvision）、ＯＸ２６モノクローナル抗体（５μｇ／ｍＬ、Serotec）、又は抗インスリン受容体・−サブユニットモノクローナル抗体（１μｇ／ｍＬのクローンＣＴ−３、Labvision）でウェスタンブロッティングを行った。scFvＡもscFvＤも免疫沈降産物、又は細胞溶解物によるウェスタンブロッティングフォーマットでは活性はなく、生細胞を有する自然条件下で、選択の結果がもたらされたと考えられた。

scFvＡによるラット脳切片の免疫組織化学標識
成体の雄スプレイグドーリーラットの脳から脳組織片を調製した。液体窒素浴を用いて、組織凍結培地（Triangle Biomedical Sciences）で脳を急速凍結し、７μｍの環状切片を凍結脳から切断した。室温で３０分間、ＰＢＳＣＭ中の４０％ヤギ血清及び０．２％トリトンＸ−１００で脳切片を遮断した。４０％ヤギ血清で精製scFvＡ又は４−４−２０を希釈し、室温で１時間、等量の１０μｇ／ｍＬの９Ｅ１０でインキュベートして、人工二量体を形成した。次いで、４℃で１時間、scFvＡ人工二量体で脳切片をインキュベートした。４℃で３０分間、フィコエリトリン結合抗マウスＩｇＧ及びＦＩＴＣ結合グリフォニア・シンプリシフォリアレクチン（１０μｇ／ｍｌのＧＳＡ−ＦＩＴＣ、Sigma）から成る二次標識溶液を適用した。洗浄後すぐに、氷上で１０分間、脳切片を４％パラホルムアルデヒドで固定して、蛍光顕微鏡で調べた。

上述の実施例で記載されたように、本発明は、培養内皮細胞から酵母提示された抗体ライブラリを選抜し、同時に１つ又は複数の抗原に対して異なる親和性の複数の結合体を単離する方法を提供する。結合クローンを単離し、次いで、内皮細胞を用いて、エンドサイトーシス及びトランスサイトーシスを誘発するこれらの能力を確認した。

本発明は、上記で概説された様々な例示的な実施形態と共に記載されているが、知られているか、現時点で予測されていないか、又はおそらく予測されないかにかかわらず、様々な変更、修正、変形、改良、及び／又は同等置換が、当該技術分野において少なくとも通常の技術を有する者（当業者）とって明らかになり得る。したがって、上記のような本発明による例示的な実施形態は、限定ではなく例示として意図される。本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、様々な変更が為され得る。これによって、本発明は、これらの例示的な実施形態の既知の又は後に開発される変更、修正、変型、改良及び／又は同等置換を含むように意図される。

Claims

配列番号１〜３４のいずれかで表わされるアミノ酸配列を有する抗体断片を含む単離されたポリペプチド。
前記抗体断片が、配列番号１〜５のいずれかで表わされるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
前記抗体断片が、配列番号で表わされるアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
前記抗体断片が、脳内皮細胞と結合し且つ脳内皮細胞により内在化される、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
前記抗体断片が、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
前記抗体断片が、一本鎖可変領域（scFv）抗体である、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
配列番号１〜３４のいずれかで表わされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
薬学的に活性な化合物と組み合わせて、配列番号１〜３４のいずれかで表わされる単離された抗体断片を含む組成物。
前記抗体断片が、配列番号１〜５のいずれかで表わされる、請求項８に記載の組成物。
前記抗体断片が、配列番号１で表わされる、請求項９に記載の組成物。
配列番号１〜３４のいずれかで表わされるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む精製及び単離された発現ベクター。
請求項１１に記載の発現ベクターを含む精製及び単離された宿主細胞。
脳内皮細胞受容体と結合可能な抗体断片を発現する方法であって、
（ａ）酵母細胞上に抗体断片を提示する工程、
（ｂ）脳内皮細胞培養物又は脳血管単離物から前記抗体を提示する酵母細胞を選抜する（panning）工程、
（ｃ）脳内皮細胞受容体と特異的に結合する提示された抗体断片を特定する工程、
（ｄ）発現ベクターにおいて工程（ｃ）で特定された前記抗体断片をコードする単離された核酸を挿入する工程、及び
（ｅ）宿主細胞を前記発現ベクターで形質転換すること、
を含む、脳内皮細胞受容体と結合可能な抗体断片を発現する方法。
前記宿主細胞が、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）又は大腸菌（E. coli）である、請求項１３に記載の方法。
脳内皮細胞特異的抗体を特定する方法であって、
（ａ）酵母細胞の表面上に抗体断片を提示する工程、
（ｂ）脳内皮細胞培養物又は脳血管単離物から前記抗体を提示した酵母細胞を選抜する工程、及び
（ｃ）脳内皮細胞特異的抗体を特定する工程、
を含み、
前記抗体が脳内皮細胞と特異的に結合する、脳内皮細胞特異的抗体を特定する方法。
前記脳内皮細胞培養物が単層である、請求項１５に記載の方法。
エンドサイトーシス又はトランスサイトーシスで機能する内皮細胞受容体を特定する方法であって、
（ａ）培養内皮細胞単層を調製する工程、
（ｂ）前記内皮細胞単層から酵母提示された抗体ライブラリを選抜する工程、
（ｃ）抗体結合内皮細胞を単離する工程、及び
（ｄ）前記抗体が前記内皮細胞と結合する同族受容体を特定する工程、
を含む、エンドサイトーシス又はトランスサイトーシスで機能する内皮細胞受容体を特定する方法。
無傷の脳毛細血管で発現する、非還元条件下でヒトscFvＡで免疫沈降した際の分子量が約１２４ｋＤａである精製scFvＡ抗原。
抗体−血液脳関門輸送体系であって、
（ａ）無傷の脳毛細血管で発現する、非還元条件下でヒトscFvＡで免疫沈降した際の分子量が約１２４ｋＤａである抗原、及び
（ｂ）配列番号１〜５のいずれかで表わされるアミノ酸配列を有する、前記抗原と結合する精製抗体、
を含む、抗体−血液脳関門輸送系。
前記抗原と結合する前記精製抗体が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載の抗体−血液脳関門輸送系。
前記精製抗体が、薬学的に活性な化合物と組み合わせて与えられる、請求項１９に記載の抗体−血液脳関門輸送系。
血液脳関門を通して、薬学的に活性な化合物を被験体の脳に送達する方法であって、配列番号１〜５のいずれかで表わされるアミノ酸配列を有する精製抗体と組み合わせて、薬学的に活性な化合物を被験体に投与する工程を含み、該抗体が、該血液脳関門を通る、該薬学的に活性な化合物の前記被験体の脳への送達に関する、前記血液脳関門を通して、薬学的に活性な化合物を被験体の脳に送達する方法。
前記精製抗体が、配列番号１で表わされる配列を有する、請求項２２に記載の方法。