CN110283797B

CN110283797B - 一种酪氨酸酶及其基因、工程菌和制备方法

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Publication number: CN110283797B
Application number: CN201910537732.7A
Authority: CN
Inventors: 刘逸寒; 王洪彬; 路福平; 徐泽华; 李玉
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2019-06-20
Filing date: 2019-06-20
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2039-06-20
Also published as: CN110283797A

Abstract

本发明属于酶的基因工程技术领域，涉及一种来源于阿耶波多氏芽孢杆菌的新型酪氨酸酶及其基因、工程菌和制备方法，其技术方案是利用分子生物学手段和基因工程技术，通过菌种筛选获得一株能够产生酪氨酸酶的阿耶波多氏芽孢杆菌，通过PCR技术扩增出该新型酪氨酸酶的基因，然后将该新型酪氨酸酶基因，分别在枯草芽胞杆菌表达***、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌***中进行表达，获得重组菌株，实现新型酪氨酸酶的制备。同时该新型细菌酪氨酸酶在进行蛋白交联、检测酚类化合物等工业上有较好的作用。

Description

一种酪氨酸酶及其基因、工程菌和制备方法

技术领域：

本发明涉及一种来源于阿耶波多氏芽孢杆菌的新型酪氨酸酶及其基因、工程菌和制备方法，具体涉及通过基因工程技术和分子生物学手段获得表达该新型酪氨酸酶的重组表达菌株，以及该细菌酪氨酸酶蛋白在食品、医药、环境等方面的应用，属于酶的基因工程技术领域。

背景技术：

酪氨酸酶(Tyrosinase，EC 1.14.18.1)，又称多酚氧化酶、儿茶酚氧化酶等，是一种结构复杂的含多亚基的含铜金属酶，兼有单加氧酶和氧化酶两种功能，广泛存在于微生物、动植物和人体中。在植物中，酪氨酸酶一般称为多酚氧化酶，在昆虫中则称为酚氧化酶，在微生物和人体中才称为酪氨酸酶。酪氨酸酶催化酪氨酸氧化成多巴，多巴氧化形成多巴醌反应，控制黑色素细胞的活性，是黑色素合成的关键酶。Claus等人对酪氨酸酶的氨基酸组成进行比对分析时进一步发现，许多真核及原核的酪氨酸酶的铜离子结合位点都高度保守。酪氨酸酶催化反应具有单酚酶和双酚酶活性，能催化氧化单酚和双酚成为苯醌，两个反应都需要氧分子参与。酪氨酸酶是含铜金属酶，其活性中心含有两个铜离子结合位点，在催化过程中，由于铜离子结合氧原子数不同，酪氨酸酶可分为三种形态：氧化态(E_oxy)、还原态(E_met)和脱氧态(E_deoxy)。这三种酶形态的存在和相互转化是酪氨酸酶独特双重催化的基础。在单酚酶循环中，E_oxy与单酚反应生成苯醌和E_deoxy，后者与O₂结合，最终又重新生成E_oxy。在双酚酶循环中，E_oxy与双酚反应生成苯醌和E_met，后者将另一种双酚转化为苯醌，其自身转化为E_deoxy形态，双酚是E_deoxy形成的必要因素。酪氨酸酶的单酚酶活性表现出特异的时滞，直到E_oxy提供足够的双酚。时滞长短受酶的来源、单酚酶浓度等影响，浓度增大，时滞缩短，但不可完全消除，而双酚可以完全消除时滞。

迄今为止，成功分离出酪氨酸酶的生物主要有真菌(包括霉菌、食用伞菌、酵母菌等)、细菌、裸子植物、被子植物，昆虫，脊索动物类，哺乳动物等。酪氨酸酶虽然在不同的生物体内具有相似的生理功能，但他们的理化性质却有不同程度的差异性。不同来源的酪氨酸酶具有不同的分子特性，其蛋白分子量和等电点都有较大范围的变化，不同来源的酪氨酸酶的等电点分布在pH3.3至pH9.35 的范围内。在真菌中，酪氨酸酶的功能主要是与孢子形成、组织再生、致病性和提高极端环境下的适应力有关。真菌来源的酪氨酸酶没有信号肽。蘑菇来源的酪氨酸酶是迄今为止发现唯一含H型和L型两种不同亚基的酪氨酸酶。Selinheimo 等人研究了木霉来源的酪氨酸酶与R-酪蛋白的有效交联，然而与交联的效率并不高。

同真核生物来源的酪氨酸酶不同，细菌酪氨酸酶不仅等电点范围较广，而且在一级结构上的同源性也很低。Raper-Mason途径合成黑色素是由酪氨酸酶催化的一个过程，但细菌酪氨酸酶结构上的差异性决定了其作用机理与真菌酪氨酸酶相比也存在差异。通过比对NCBI数据库可以发现，细菌来源的酪氨酸酶的保守区域很少且氨基酸的组成与数目差异很大。尤其是在生长过程中，芽孢杆菌会产生一系列有益的代谢产物，刺激和促进宿主的生长。2006年，Matoba研究小组首次从抗生链霉菌中得到了酪氨酸酶的晶体结构。2011年，Sendovski等分离鉴定了巨大芽孢杆菌来源的酪氨酸酶的三维结构。同年，Matoba研究小组对链霉菌中酪氨酸酶三维结构进行解析，对研究细菌来源的酪氨酸酶具有指导意义。与真核生物相比，细菌来源的酪氨酸酶具有更加丰富的多样性，因此，细菌来源的酪氨酸酶的研究对于酪氨酸酶应用领域的扩展具有十分重要的意义。

酪氨酸酶的催化氧化反应可广泛用于蛋白交联。Da You Xu采用实用又经济的交联法，又称无载体固定化法，获得交联酪氨酸酶聚集体作为催化剂，有效治理污水中的酚类化合物。目前，酪氨酸酶已被应用于生物抑制剂、有机合成、结合固定化等，此外，酪氨酸酶在生物传感器和生物检测等方面也有其相关应用。

枯草芽胞杆菌属于革兰氏阳性菌。枯草芽胞杆菌表达***具有以下优点：1、能够高效地分泌各种蛋白质；2、许多枯草芽胞杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽胞杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并且生长迅速，对营养物质无特殊要求等优点；4、密码子偏爱性不明显；5、发酵过程简单，枯草芽胞杆菌属于好氧菌，无需厌氧发酵设备，发酵结束后，简单的分离发酵液和细菌菌体，即可进入目的蛋白的分离、纯化回收阶段；6、具有抗逆性，可以生产多种耐热性酶制剂。枯草芽孢杆菌表达***已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型，是表达外源基因较为理想的工具。

地衣芽孢杆菌是一种革兰氏阳性腐生性微生物。地衣芽孢杆菌表达***具有以下优点：1、酶系丰富，能够高效地分泌各种蛋白质且产酶量更高；2、地衣芽孢杆菌具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖；3、它可能以孢子形式存在，从而抵抗恶劣的环境；在良好环境下，则可以生长态存在；4、地衣芽孢杆菌耐热性较好；5、地衣芽孢杆菌具有完善的蛋白分泌体系，蛋白合成和分泌能力能达到20-25mg/ml；6、地衣芽孢杆菌的活菌成分是芽孢休眠体，具有耐酸性、耐高温、耐干燥等特性；7、遗传背景研究较清楚，能够通过基因表达调控机制实现目的蛋白的高水平表达。

解淀粉芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌。解淀粉芽孢杆菌表达***具有以下优点：1、次级代谢产物丰富，能够产生抗菌蛋白、脂肽类和聚酮类等多种抗菌物质；2、解淀粉芽孢杆菌产生的蛋白具有较好的亲水性、稳定性和较高活性；3、解淀粉芽孢杆菌可以产生多种生理活性物质和氨基酸类物质；4、在解淀粉芽孢杆菌中，蛋白质及酶类抑菌物质合成所涉及的基因数量较少，有利于基因重组及表达；5、解淀粉芽孢杆菌具有较广的抑菌谱，它具无污染、不产生抗药性、有利于人体安全等优点，有较好的发展前景。

在本发明中，新型酪氨酸酶编码基因来源于阿耶波多氏芽孢杆菌，它属于细菌，对阿耶波多氏芽孢杆菌基因组中新型酪氨酸酶编码基因进行克隆，新型酪氨酸酶基因在枯草芽胞杆菌表达***、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌表达***中进行表达，分别得到枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的高稳定性酪氨酸酶游离表达重组菌株，重组菌株发酵后，经过相应的处理，可以得到高稳定性酪氨酸酶。

发明内容：

本发明的目的在于克服和避免目前工业上生产酪氨酸酶所存在的不足之处，并提供一种来源于阿耶波多氏芽孢杆菌的新型细菌酪氨酸酶及表达该新型细菌酪氨酸酶基因的工程菌株。

本发明实现目的的技术路线如下：以阿耶波多氏芽孢杆菌的基因组为模板，并根据已报道的阿耶波多氏芽孢杆菌酪氨酸酶成熟肽基因，分析其保守序列，设计本发明的酪氨酸酶成熟肽基因的扩增引物P1和P2，其中，上游引物P1和下游引物P2是用来扩增在枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中表达的目的基因，上、下游引物分别引入限制性酶切位点EcoR I、Not I。通过PCR 克隆获得阿耶波多氏芽孢杆菌的酪氨酸酶基因Tyr，将其与pBSA43载体连接后，构建重组质粒pBSA43-Tyr；转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-Tyr。再次将验证正确的重组质粒pBSA43-Tyr，分别在枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中成功表达，得到产高稳定性新型酪氨酸酶的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得高产的高稳定性新型酪氨酸酶。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之一为：一种新型细菌酪氨酸酶，所述酪氨酸酶来源于一株经发明人筛选的阿耶波多氏芽孢杆菌，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No.2所示；

所述酪氨酸酶以L-酪氨酸为底物测定新型酪氨酸酶酶学性质时，最适作用温度为60℃，最适作用pH为5.0；

同时，以L-酪氨酸为底物测定该新型酪氨酸酶的pH稳定性和热稳定性，结果表明：pH3-10范围内，4℃保温168h后残余酶活在60％以上；在pH＝7下， 35℃以下保温2h后残余酶活在60％以上；

所述酪氨酸酶的编码基因为Tyr，碱基序列如序列表中的SEQ ID No.1所示。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之二为：将上述基因重新构建重组载体，并在枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的高效表达，得到产高稳定性新型酪氨酸酶的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得高产的高稳定性新型酪氨酸酶；

用于表达所述的新型细菌酪氨酸酶的宿主细胞分别为枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌，表达载体为pBSA43。

本发明的实验步骤概述如下：

1、一种来源于阿耶波多氏芽孢杆菌的新型酪氨酸酶基因，构建表达该新型酪氨酸酶的重组菌株(枯草芽胞杆菌WB600/pBSA43-Tyr、地衣芽胞杆菌TCCC 11965/pBSA43-Tyr和解淀粉芽胞杆菌CGMCC 11218/pBSA43-Tyr),以及该新型细菌酪氨酸酶的制备过程包括如下步骤：

(1)通过高通量菌种筛选获得一株能够产生酪氨酸酶的菌株，即阿耶波多氏芽孢杆菌；

(2)以阿耶波多氏芽孢杆菌的基因组为模板，根据已报道阿耶波多氏芽孢杆菌酪氨酸酶成熟肽基因，分析其保守序列，设计本发明的酪氨酸酶成熟肽基因的扩增引物P1和P2，通过PCR克隆获得阿耶波多氏芽孢杆菌的酪氨酸酶基因Tyr，将其与大肠杆菌-芽胞杆菌穿梭质粒pBSA43连接后，构建重组质粒pBSA43-Tyr，转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-Tyr；

(3)将重组质粒pBSA43-Tyr转化入枯草芽胞杆菌WB600、地衣芽孢杆菌 TCCC11965和解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218，构建获得重组菌株 WB600/pBSA43-Tyr、TCCC11965/pBSA43-Tyr和CGMCC11218/pBSA43-Tyr；

(4)将重组菌株进行发酵制备高稳定性新型细菌酪氨酸酶；

(5)制备高稳定性新型酪氨酸酶。

有益效果：

1、本发明通过特定的能够产生酪氨酸酶的高通量菌株筛选，获得一株能够产生酪氨酸酶的细菌菌株，即阿耶波多氏芽孢杆菌，通过PCR扩增获得的该菌株的酪氨酸酶基因，经测序为一段新的碱基序列。

2、本发明中通过枯草芽胞杆菌表达新型酪氨酸酶重组菌株、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌游离表达新型酪氨酸酶重组菌株发酵后制备的新型重组酪氨酸酶具有如下的酶学性质的优点：以L-酪氨酸为底物测定新型酪氨酸酶酶学性质时，最适作用温度为60℃，最适作用pH为5.0；同时该新型细菌酪氨酸酶在 35℃以下，pH3-10的范围内活力稳定。

3、该新型细菌重组酪氨酸酶对蛋白交联具有较好的效果。因此，该重组酪氨酸酶在实际应用中具有较大应用潜力。

附图说明：

图1为本发明新型酪氨酸酶成熟肽基因的PCR扩增电泳图；

其中：M为DNA Marker，1、2分别为酪氨酸酶成熟肽基因Tyr；

图2为本发明重组质粒pBSA43-Tyr双酶切验证图；

其中：M为DNA Marker，1为重组质粒pBSA43-Tyr经EcoR I和Not I双酶切图；

图3为本发明阿耶波多氏芽孢杆菌的基因组电泳图；

其中：M为DNA Marker，1为阿耶波多氏芽孢杆菌基因组电泳图；

图4最适作用温度曲线；

图5最适作用pH曲线。

具体实施方式：

下面结合实例对本发明的技术内容做进一步的说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明所使用的地衣芽胞杆菌为TCCC11965，公开于：Development andapplication of a CRISPR/Cas9system for Bacillus licheniformis genome editing[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2019,122:329-337，目前保存于天津科技大学微生物菌种保藏管理中心，公众可从该中心获取菌种。

实施例1：阿耶波多氏芽孢杆菌新型酪氨酸酶成熟肽基因的获得

1、新型酪氨酸酶成熟肽基因来源于本实验室筛选出的阿耶波多氏芽孢杆菌，提取其基因组DNA，其中阿耶波多氏芽孢杆菌基因组DNA的提取步骤如下：

(1)从甘油管中接种划线于LB固体平板中，37℃静置培养12h；

(2)从培养菌体的平板上挑取一个单菌落接种于含5mL液体LB培养基中，于220r/min，37℃条件下培养12h；

(3)将菌液分装到灭菌的1.5mL微量离心管中，12000r/min离心1min收集菌体，弃上清；

(4)将沉淀重悬于200μL预冷的溶液I中用枪头反复吹打混匀，并加入50μL 的50mg/mL溶菌酶，37℃水浴1h；

(5)加入20μL的10％SDS以及10μL的蛋白酶K，65℃水浴2-3h；

(6)加入250μL新配的溶液II，盖紧管口，温和地将1.5mL的EP管上下翻转6～8次，使EP管中的菌体充***解；

(7)加入350μL预冷的溶液III，立即温和地将1.5mL的EP管上下翻转6～8 次，此时EP管中会出现白色絮状沉淀；

(8)以12000r/min离心10min，将上清转移到另一EP管中，加等体积的Tris 饱和酚/氯仿(1∶1)混合溶液，混合均匀后，12000r/min离心10min，再将上清转移到另一EP管中；

(9)反复抽提2次，再用等体积氯仿抽提1次，去除痕量苯酚；

(10)加入2倍体积的无水乙醇，混匀，于-20℃放置30min。12000r/min离心10min收集沉淀；

(11)用70％乙醇洗涤沉淀2～3次，弃去残液；

(12)空气中干燥20-30min，用30μL灭菌的ddH₂O溶解沉淀；

2、通过NCBI基因库查找，根据已报道的阿耶波多氏芽孢杆菌酪氨酸酶成熟肽基因，分析其保守序列，设计本发明的酪氨酸酶成熟肽编码基因的扩增引物如下：

上游引物P1(SEQ ID NO.3)：

5’—CCGGAATTCGATGAGTAACAAGTACAAAGTTAGAAAAAACG—3’

下游引物P2(SEQ ID NO.4)：

5’—AAGGAAAAAAGCGGCCGCTGAGGACGTTTTGATTTTCTTAAT—3’

其中，上游引物P1和下游引物P2是用来扩增在枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中表达的目的基因，上、下游引物分别引入限制性酶切位点 EcoR I、Not I。

扩增模板为阿耶波多氏芽孢杆菌基因组DNA，其扩增的反应条件为：

10×Pyrobest BufferⅡ	5μL
		dNTP Mixture(2.5mM each)	5μL
上游引物P1	2μL
		下游引物P2	2μL
DNA模板	2μL
		Pyrobest DNA Polymerase(5U/μL)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	33.5μL
		总体积	50μL

扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min反应30个循坏；72℃延伸10min。PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到900bp左右的条带(图1)，用小量DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，并进行双酶切和纯化回收，得到本发明的阿耶波多氏芽孢杆菌新型酪氨酸酶成熟肽编码基因Tyr，见SEQ ID NO.1。也可根据SEQ ID NO.1所示的序列通过全基因合成的方式进行获取。

实施例2：枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌高稳定性新型酪氨酸酶重组菌的构建

1、表达载体pBSA43的构建

pBSA43是以大肠杆菌-芽胞杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个强的芽胞杆菌组成型启动子P43，以及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中果聚糖蔗糖酶信号序列sacB而获得。它带有Amp^r基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记；同时也具有Km^r基因，可以在枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌和解淀粉芽孢杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。

2、新型酪氨酸酶表达载体pBSA43-Tyr的构建

将经PCR扩增并经EcoR I和Not I双酶切后回收的新型酪氨酸酶基因(Tyr) 与同样双酶切的枯草芽胞杆菌表达载体pBSA43用连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞中，经Amp抗性筛选，挑选阳性转化子，提取转化子质粒，并进行单、双酶切验证(图2)和测序，确定构建获得正确的重组菌株JM109/pBSA43-Tyr。

3、重组表达载体pBSA43-Tyr分别转化枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌

将1μL(50ng/μL)的pBSA43-Tyr重组质粒分别加入到50μL的枯草芽胞杆菌 WB600、地衣芽孢杆菌TCCC11965和解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.11218感受态细胞中并混匀，之后转移到预冷的电转杯(1mm)中，冰浴1-1.5min后，电击一次(25μF，200Ω，4.5-5.0ms)。电击完毕之后，立即加入1mL复苏培养基 (LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)。37℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-24h，挑取阳性转化子，并进行单、双酶切验证，确定获得枯草芽胞杆菌重组菌株WB600/pBSA43-Tyr、地衣芽孢杆菌TCCC11965/pBSA43-Tyr和解淀粉芽孢杆菌CGMCC11218/pBSA43-Tyr。

实施例3：酪氨酸酶酶活的测定

在50mM的Tris-HCL缓冲液中加入0.75mM的L-酪氨酸和0.2μM氯化铜用做底物测量酪氨酸酶的单酚氧化活性。在96孔板中加入200μl底物，保温1min 后加入15μl酪氨酸酶，反应体系为215μl，在475nm下检测反应初始的OD值和反应5分钟的OD值得到反应的ΔOD值。

酪氨酸酶的最适温度在pH＝7的条件下分别测定其在0-90℃之间的酶活。

酪氨酸酶的最适pH在其最适温度的条件下分别测定其在pH＝3.0-10.0之间的酶活。

酪氨酸酶的热稳定性在其最适pH的条件下测定其在20-70℃之间保温0-2h 后的残余酶活，每隔20min测一次。

酪氨酸酶的pH稳定性在其最适温度下测定pH＝3.0-10.0之间保温0-7天后的残余酶活，每隔12h测一次。酶活的测定为三次平行实验，结果取平均值。

酶活的定义：475nm下，每生成1μmol多巴色素所需酶量为一个酪氨酸酶活力单位(U)。

通过上述方法测定新型酪氨酸酶的酶学性质，该新型酪氨酸酶酶学性质如下：

以酪氨酸为底物测定新型酪氨酸酶酶学性质时，最适作用温度为60℃(图 4)，最适作用pH为5.0(图5)；

以酪氨酸为底物测定该新型酪氨酸酶的热稳定性，结果表明：该新型细菌酪氨酸酶在pH＝7下，在35℃以下保温2h后残余酶活在60％以上。

以酪氨酸为底物测定该新型酪氨酸酶的pH稳定性，结果表明：该新型细菌酪氨酸酶在pH3-10范围内，4℃保温168h后残余酶活在60％以上。

实施例4：新型酪氨酸酶在枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌重组菌株中的表达及制备

将枯草芽胞杆菌重组菌株、地衣芽孢杆菌重组菌株和解淀粉芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-Tyr、TCCC11965/pBSA43-Tyr、CGMCC11218/pBSA43-Tyr接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜LB培养基中，继续以37℃，220r/min 培养48h，8000r/min离心收菌后得到发酵上清，即可获得高稳定性新型酪氨酸酶粗酶液，以L-酪氨酸为底物测定新型酪氨酸酶粗酶液酶活力(pH5、60℃条件下)，枯草芽胞杆菌表达新型酪氨酸酶重组菌株发酵后酪氨酸酶酶活可达到226U/mL，地衣芽胞杆菌表达新型酪氨酸酶重组菌株发酵后酪氨酸酶酶活可达到 313U/mL，解淀粉芽胞杆菌表达新型酪氨酸酶重组菌株发酵后酪氨酸酶酶活可达到438U/mL，然后采用分级盐析法沉淀新型酪氨酸酶，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得新型酪氨酸酶纯酶酶粉。

实施例5：新型酪氨酸酶的酶活提高

将本发明中的重组酪氨酸酶氨基酸序列在NCBI上BLAST进行同源比对，发现本发明中来自阿耶波多氏的酪氨酸酶序列与NCBI上阿耶波多氏来源的酪氨酸酶序列(WP_045290758.1)相似度为98％，采用实施例2、3、4相同的方法将二者在枯草芽胞杆菌重组菌株WB600中进行表达、发酵并测定发酵液酶活，结果显示本发明的新型酪氨酸酶酶活约是WP_045290758.1的2.7倍。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种酪氨酸酶及其基因、工程菌和制备方法

<130> 1

<141> 2019-06-20

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 912

<212> DNA

<213> 阿耶波多氏芽孢杆菌()

<400> 1

atgagtaaca agtacaaagt tagaaaaaac gtattgtctc ttacagacgc ggaaaaaaga 60

gattttattc gtgccgtgct aatactaaag aaaaaaggaa tatatgaccg ctatatagcc 120

tggcatggtg cagcaggtaa atttcatact cctccgagca gcgatcgaaa tgcagcacat 180

atgagttctg cttttttgcc gtggcatcgt gaataccttt tgcgattcga acgtgacctt 240

cagtccatcg attcagaagt aacccttcct tattgggaat gggaaacgga tgcacagctg 300

caggatccat cacaatcaca aatttggagc gcagatttta tgggaggaaa cggaaaccca 360

aaaaaagatt ttatcgtcga taccggcccc tttgtagctg ggcgctggac gacgatcgat 420

gaacaaggaa atccttccgg tgggctaaaa cgtaattttg gagcaacgaa agaggcacct 480

acactcccta ctcgagatga tgttctcaat gctttaaaaa taactaagta tgatacgccg 540

ccttgggata tgaccagcca aaacagcttt cgtaatcagc ttgaaggatt tattaacggc 600

ccgcagcttc acaatcgcgt acaccgttgg gttgggggac agatgggcgt tgtccctact 660

gctccgaatg atcctgtctt ctttttacac cacgcaaatg tagatcgtat ttgggctgta 720

tggcaaatgg ttcatcgcaa tcaaaactat cagccgatga aaaacgggcc atttggtcaa 780

aactttagag atccgatgta cccttggaat acaacccctg aagacgttat gaaccatcga 840

aagcttgggt acgtatacga tatagaatta agaaaatcaa aacgttcctc acaccaccac 900

caccaccact ga 912

<210> 2

<211> 303

<212> PRT

<213> 阿耶波多氏芽孢杆菌()

<400> 2

Met Ser Asn Lys Tyr Lys Val Arg Lys Asn Val Leu Ser Leu Thr Asp

1 5 10 15

Ala Glu Lys Arg Asp Phe Ile Arg Ala Val Leu Ile Leu Lys Lys Lys

20 25 30

Gly Ile Tyr Asp Arg Tyr Ile Ala Trp His Gly Ala Ala Gly Lys Phe

35 40 45

His Thr Pro Pro Ser Ser Asp Arg Asn Ala Ala His Met Ser Ser Ala

50 55 60

Phe Leu Pro Trp His Arg Glu Tyr Leu Leu Arg Phe Glu Arg Asp Leu

65 70 75 80

Gln Ser Ile Asp Ser Glu Val Thr Leu Pro Tyr Trp Glu Trp Glu Thr

85 90 95

Asp Ala Gln Leu Gln Asp Pro Ser Gln Ser Gln Ile Trp Ser Ala Asp

100 105 110

Phe Met Gly Gly Asn Gly Asn Pro Lys Lys Asp Phe Ile Val Asp Thr

115 120 125

Gly Pro Phe Val Ala Gly Arg Trp Thr Thr Ile Asp Glu Gln Gly Asn

130 135 140

Pro Ser Gly Gly Leu Lys Arg Asn Phe Gly Ala Thr Lys Glu Ala Pro

145 150 155 160

Thr Leu Pro Thr Arg Asp Asp Val Leu Asn Ala Leu Lys Ile Thr Lys

165 170 175

Tyr Asp Thr Pro Pro Trp Asp Met Thr Ser Gln Asn Ser Phe Arg Asn

180 185 190

Gln Leu Glu Gly Phe Ile Asn Gly Pro Gln Leu His Asn Arg Val His

195 200 205

Arg Trp Val Gly Gly Gln Met Gly Val Val Pro Thr Ala Pro Asn Asp

210 215 220

Pro Val Phe Phe Leu His His Ala Asn Val Asp Arg Ile Trp Ala Val

225 230 235 240

Trp Gln Met Val His Arg Asn Gln Asn Tyr Gln Pro Met Lys Asn Gly

245 250 255

Pro Phe Gly Gln Asn Phe Arg Asp Pro Met Tyr Pro Trp Asn Thr Thr

260 265 270

Pro Glu Asp Val Met Asn His Arg Lys Leu Gly Tyr Val Tyr Asp Ile

275 280 285

Glu Leu Arg Lys Ser Lys Arg Ser Ser His His His His His His

290 295 300

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ccggaattcg atgagtaaca agtacaaagt tagaaaaaac g 41

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

aaggaaaaaa gcggccgctg aggacgtttt gattttctta at 42

Claims

1.一种酪氨酸酶，其特征在于，所述酪氨酸酶的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种酪氨酸酶的编码基因，其特征在于，所述酪氨酸酶编码基因的碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的酪氨酸酶的制备方法，其特征在于，所述酪氨酸酶的制备方法包括如下步骤：

（1）将权利要求2所述的基因进行酶切，与表达载体连接得到了新的重组载体；

（2）将重组载体转化入宿主细胞中，得到重组菌株，之后将重组菌株发酵，得到高稳定性细菌酪氨酸酶。

4.含有权利要求2所述酪氨酸酶编码基因的重组载体或重组菌株。

5.根据权利要求4所述含有酪氨酸酶编码基因的重组载体，其特征在于，表达载体为pBSA43载体。

6.根据权利要求4所述含有酪氨酸酶编码基因的重组菌株，其特征在于，宿主细胞为枯草芽胞杆菌WB600或解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.11218。

7.根据权利要求1所述酪氨酸酶在蛋白交联、检测酚类化合物方面的应用。