CN110607319B - 一种适用于枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白的表达载体及应用 - Google Patents

一种适用于枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白的表达载体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白的表达载体及应用，属于基因工程和生物技术领域。该分泌载体是将编码信号肽SPphoD的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1)和编码分子伴侣PrsA的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.3)分别连接到pMA5‑P43上构建分泌质粒pMA5‑SPP。以pMA5‑SPP为载体，在枯草芽孢杆菌中表达L‑天冬酰胺酶，其胞外分泌量占总表达量的38％，胞外分泌量是常见信号肽SPpel介导下分泌量的2.95倍。

Description

一种适用于枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白的表达载体及应用
技术领域
本发明涉及一种适用于枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白的表达载体及应用，属于基因工程和生物技术领域。
背景技术
在利用微生物进行表达重组蛋白的过程中，良好的分泌性能降低产品回收成本，是重组蛋白能否进行工业生产的重要考量因素。信号肽是分泌蛋白N端的一段能介导蛋白分泌到胞外的肽链，对蛋白的分泌表达具有重要意义。分子伴侣在细胞中能识别并结合到不完整折叠或装配的蛋白，帮助这些蛋白进行折叠、分泌(Molecular microbiology,2010,8(4):727-37；Microbial cell factories,2015,14,92)。因此，在构建蛋白的分泌表达载体中，选择合适的信号肽及分子伴侣具有重要的意义。
枯草芽孢杆菌由于缺少细胞外膜而具有良好的分泌能力，是分泌生物制品的理想宿主。同时，枯草芽孢杆菌还具有食品安全性、基因信息清楚良好的生产技术和发酵基础等特性，因此被广泛应用于蛋白、食品添加剂、抗生素的生物发酵制备当中(Trends inbiotechnology,1992,10(7):247-56；Journal of clinical microbiology,1998,36(1):325-6；Nature,1997,390(6657):249-56.)。
以枯草芽孢杆菌为宿主菌分泌表达外源蛋白的过程中，构建含有有效的信号肽及分子伴侣的载体对蛋白的分泌具有重要意义。目前没有同时在载体上构建信号肽SPphoD基因及分子伴侣PrsA基因以提高枯草芽孢杆菌蛋白的分泌水平的文献报道。
L-天冬酰胺酶胞外分泌的相关报道相对较少，有研究表明，以枯草芽孢杆菌168为宿主菌，表达B.subtilis B11-06的L-天冬酰胺酶，胞外酶活占总酶活的57.1％(JournalOf Agricultural And Food Chemistry,2013,61(39):9428-9434)，但重组酶酶活只有9.98U/mL。以枯草芽孢杆菌168为宿主菌，表达Pyrococcus yayanosii来源的L-天冬酰胺酶，胞外、胞内酶活分别为23.31U/mL、65.72U/mL(Scientific Reports,2018,8(1):7915)，酶活水平有限。
因此，提供一种进一步提高L-天冬酰胺酶胞外分泌水平的方法，对于工业制备L-天冬酰胺酶有重要的应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌表达载体，是将编码信号肽SPphoD的基因和编码分子伴侣PrsA的基因连接到载体pMA5-P43上，得到表达载体pMA5-SPP；所述信号肽SPphoD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子伴侣PrsA的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。在本发明的一种实施方式中，将所述编码信号肽SPphoD的基因连接到载体pMA5-P43的多克隆位点EcoR V和Kpn I之间，在P43启动子的介导下表达，并将所述编码分子伴侣PrsA的基因连接到载体pMA5-P43的多克隆位点BamH I和Mlu I之间，在PpHpaII启动子的介导下表达。
所述pMA5-P43质粒是利用酶切连接将启动子P43连接到pMA5载体上得到的。
所述pMA5-P43质粒的构建方法具体是以正向引物F(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)和反向引物R(核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示)从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168基因组中扩增出启动子P43；用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切载体pMA5；利用同源重组试剂盒(
Figure BDA0002252620320000021
MultiS One-Step Cloning Kit，诺唯赞)将启动子P43连接到pMA5的多克隆位点EcoR I和Hind III之间，得到重组质粒pMA5-P43。
在本发明的一种实施方式中，所述编码信号肽SPphoD的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述编码分子伴侣PrsA的基因的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
本发明的第二个目的是提供一种基因工程菌，以上述表达载体为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的L-天冬酰胺酶。
在本发明的一种实施方式中，编码所述L-天冬酰胺酶的基因的核苷酸序列如SEQID NO.14所示。
本发明的第三个目的是提供上述基因工程菌的制备方法，是将编码L-天冬酰胺酶的基因连接到pMA5-SPP的限制性酶切位点Kpn I和Hind III之间，得到重组质粒，将该重组质粒转化到枯草芽孢杆菌168中，即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。
本发明的第四个目的是提供一种制备L-天冬酰胺酶的方法，是将上述基因工程菌接种于LB培养基中，35-39℃，200-220rpm，培养8-12h，按0.5-5％的接种量转接于新的LB培养基中，35-39℃培养20-30h，取发酵液离心，上清为胞外粗酶液，细胞破碎上清液为胞内粗酶液。
本发明的第五个目的是提供上述枯草芽孢杆菌表达载体在制备内源蛋白或外源蛋白中的应用。
本发明通过利用信号肽SPphoD介导蛋白分泌，并共表达分子伴侣PrsA协助蛋白转运出细胞膜，使用L-天冬酰胺酶胞外分泌量达到总表达量的38％，与用常见信号肽SPpel介导分泌表达相比，本发明提供的方法使L-天冬酰胺酶胞外分泌量提高了2.95倍。
具体实施方式
实施例1 表达载体pMA5-SPP的构建
(1)SPphoD及PrsA基因的扩增：以枯草芽孢杆菌168的基因组为模板，分别以F1primer(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)和R1 primer(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)、F2 primer(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)和R2 primer(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)为引物，分别克隆SPphoD和PrsA基因。
(2)在载体pMA5-P43的基础上，利用同源重组试剂盒(
Figure BDA0002252620320000031
MultiS One-Step Cloning Kit，诺唯赞)将信号肽SPphoD基因连接到其多克隆位点EcoR V和Kpn I之间，并将分子伴侣PrsA基因连接到其多克隆位点BamH I和Mlu I之间，构建出有利于蛋白分泌的表达载体pMA5-SPP。
实施例2 L-天冬酰胺酶分泌表达菌株的构建
以质粒pMA5-pyasnase(构建方法见文献：Xu L,Xian Z,Shuqin X,etal.Simultaneous cell disruption and semi-quantitative activity assays forhigh-throughput screening of thermostable L-asparaginases[J].ScientificReports,2018,8(1):7915.)为模板，以F3 primer(核苷酸SEQ ID NO.9所示)和R4 primer(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)为引物，扩增编码L-天冬酰胺酶的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)，并用同源重组试剂盒(
Figure BDA0002252620320000032
MultiS One-Step Cloning Kit)将基因连接到pMA5-SPP的限制性酶切位点Kpn I和Hind III之间，得到重组质粒。将得到的重组质粒化学法转化入枯草芽孢杆菌168感受态细胞中，即构建得到L-天冬酰胺酶分泌表达菌株B.subtilis/pMA5-SPP-pyasnase
实施例3 B.subtilis/pMA5-SPP-pyasnase分泌性测定
(1)将实施例2得到的重组菌B.subtilis/pMA5-SPP-pyasnase与仅由常见SPpel介导的L-天冬酰胺酶表达菌株(构建方法同实施例1和2，引物序列如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示)分别接种于10mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按0.5％的接种量转接于100mL LB培养基中，37℃培养24h，取发酵液于4℃、10000r/min离心10min，上清为胞外粗酶液，细胞破碎上清液为胞内粗酶液，用于酶活力的测定。
(2)L-天冬酰胺酶的酶活测定。
反应体系：100μL适当稀释后的酶液、800μL 25mmol·L-1L-天冬酰胺溶液(用50mmol·L-1、pH 8Tris-HCl缓冲液溶解L-天冬酰胺)，在40℃水浴中反应15min，加入100μL质量体积百分浓度为15％(w/v)的三氯乙酸溶液(TCA)终止反应。对照组在酶反应即水浴前加入100μL质量体积百分浓度为15％的TCA提前终止酶促反应。反应后在10000g转速下常温离心10min，显色反应体系为：200μL离心上清液、4.8mL ddH2O、200μL奈斯勒试剂，混匀后室温静置10-15min，于450nm波长处读取吸光度。同条件下。用不同浓度的氯化铵进行显色反应，绘制氨浓度标准曲线。L-天冬酰胺酶酶活通过测定酶促反应所生成氨的量来计算。
酶活单位：在一定条件下，每分钟内产生1μmol氨气所需的酶量为1个酶活单位。
在表达载体pMA5-SPP介导下L-天冬酰胺酶胞内、胞外酶活分别为105.4U/mL、40.12U/mL，酶蛋白分泌量占总表达量的38％，并且胞外分泌量是常见信号肽SPpel介导下的2.95倍。
对比例1
将编码信号肽SPphoD的基因和编码分子伴侣DnaK(氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示)的基因连接到载体pMA5-P43上，得到表达载体pMA5-SPD。将实施例中的pMA5-SPP替换为pMA5-SPD，其余同实施例中一致。结果显示，以pMA5-SPD为表达载体，表达后的L-天冬酰胺酶胞外酶活与常见SPpel介导的L-天冬酰胺酶表达菌株表达的胞外酶活相比，无显著性差异。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种适用于枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白的表达载体及应用
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggcatcgcgc gcggggaatt ctgataggtg gtatgttttc gcttgaactt 50
<210> 16
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tcccaggatc agcagtctca tgtgtacatt cctctcttac ctataat 47
<210> 17
<211> 611
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 17
Met Ser Lys Val Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Cys Val
1 5 10 15
Ala Val Leu Glu Gly Gly Glu Pro Lys Val Ile Ala Asn Ala Glu Gly
20 25 30
Asn Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ala Phe Lys Asn Gly Glu Arg Gln
35 40 45
Val Gly Glu Val Ala Lys Arg Gln Ser Ile Thr Asn Pro Asn Thr Ile
50 55 60
Met Ser Ile Lys Arg His Met Gly Thr Asp Tyr Lys Val Glu Ile Glu
65 70 75 80
Gly Lys Asp Tyr Thr Pro Gln Glu Val Ser Ala Ile Ile Leu Gln His
85 90 95
Leu Lys Ser Tyr Ala Glu Ser Tyr Leu Gly Glu Thr Val Ser Lys Ala
100 105 110
Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Glu Arg Gln Ala Thr
115 120 125
Lys Asp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Leu Glu Val Glu Arg Ile Ile Asn
130 135 140
Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Thr Asp Glu
145 150 155 160
Asp Gln Thr Ile Leu Val Tyr Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val
165 170 175
Ser Ile Leu Glu Leu Gly Asp Gly Val Phe Glu Val Arg Ser Thr Ala
180 185 190
Gly Asp Asn Arg Leu Gly Gly Asp Asp Phe Asp Gln Val Ile Ile Asp
195 200 205
His Leu Val Ser Glu Phe Lys Lys Glu Asn Gly Ile Asp Leu Ser Lys
210 215 220
Asp Lys Met Ala Leu Gln Arg Leu Lys Asp Ala Ala Glu Lys Ala Lys
225 230 235 240
Lys Asp Leu Ser Gly Val Ser Ser Thr Gln Ile Ser Leu Pro Phe Ile
245 250 255
Thr Ala Gly Glu Ala Gly Pro Leu His Leu Glu Leu Thr Leu Thr Arg
260 265 270
Ala Lys Phe Glu Glu Leu Ser Ser His Leu Val Glu Arg Thr Met Gly
275 280 285
Pro Val Arg Gln Ala Leu Gln Asp Ala Gly Leu Ser Ala Ser Glu Ile
290 295 300
Asp Lys Val Ile Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Ala Val Gln
305 310 315 320
Glu Ala Ile Lys Lys Glu Thr Gly Lys Glu Ala His Lys Gly Val Asn
325 330 335
Pro Asp Glu Val Val Ala Leu Gly Ala Ala Ile Gln Gly Gly Val Ile
340 345 350
Thr Gly Asp Val Lys Asp Val Val Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser
355 360 365
Leu Gly Ile Glu Thr Met Gly Gly Val Phe Thr Lys Leu Ile Asp Arg
370 375 380
Asn Thr Thr Ile Pro Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Ser Thr Ala Ala
385 390 395 400
Asp Asn Gln Thr Ala Val Asp Ile His Val Leu Gln Gly Glu Arg Pro
405 410 415
Met Ser Ala Asp Asn Lys Thr Leu Gly Arg Phe Gln Leu Thr Asp Ile
420 425 430
Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Ser Phe Asp Ile
435 440 445
Asp Lys Asn Gly Ile Val Asn Val Arg Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gly
450 455 460
Lys Glu Gln Asn Ile Thr Ile Lys Ser Ser Ser Gly Leu Ser Asp Glu
465 470 475 480
Glu Ile Glu Arg Met Val Lys Glu Ala Glu Glu Asn Ala Asp Ala Asp
485 490 495
Ala Lys Lys Lys Glu Glu Ile Glu Val Arg Asn Glu Ala Asp Gln Leu
500 505 510
Val Phe Gln Thr Glu Lys Thr Leu Lys Asp Leu Glu Gly Lys Val Asp
515 520 525
Glu Glu Gln Val Lys Lys Ala Asn Asp Ala Lys Asp Ala Leu Lys Ala
530 535 540
Ala Ile Glu Lys Asn Glu Phe Glu Glu Ile Lys Ala Lys Lys Asp Glu
545 550 555 560
Leu Gln Thr Ile Val Gln Glu Leu Ser Met Lys Leu Tyr Glu Glu Ala
565 570 575
Ala Lys Ala Gln Gln Ala Gln Gly Gly Ala Asn Ala Glu Gly Lys Ala
580 585 590
Asp Asp Asn Val Val Asp Ala Glu Tyr Glu Glu Val Asn Asp Asp Gln
595 600 605
Asn Lys Lys
610

Claims (1)

1.一种制备L-天冬酰胺酶的方法，其特征在于，将基因工程菌接种于LB培养基中，35-39℃，200-220rpm，培养8-12h；按0.5-5％的接种量转接于新的LB培养基中，35-39℃培养20-30h；
所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168为宿主，携带表达载体pMA5-SPP，
所述表达载体pMA5-SPP的构建方法是：将编码信号肽SPphoD的基因和编码分子伴侣PrsA的基因连接到载体pMA5-P43上，得到表达载体pMA5-SPP；
所述信号肽SPphoD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子伴侣PrsA的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述编码信号肽SPphoD的基因连接到载体pMA5-P43的多克隆位点EcoR V和Kpn I之间，在P43启动子的介导下表达；
所述编码分子伴侣PrsA基因连接到载体pMA5-P43的多克隆位点BamH I和Mlu I之间，在PpHpaII启动子的介导下表达；
所述编码信号肽SPphoD的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述编码分子伴侣PrsA的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述L-天冬酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
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