JP2018057354A - 変異型チロシナーゼ及びその利用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】微生物を用いてベタレイン色素等の製造方法の生産性を向上させる。【解決手段】特定のアミノ酸配列、又は特定のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、下記（ｉ）及び／又は（ｉｉ）の変異を有する、チロシナーゼ活性を有するタンパク質。（ｉ）特定のアミノ酸配列におけるS2、N3、Y5、I28、K30、G46、F48、S54、N57、W68、E71、S104、D127、N144、D166、D170、K173、W182、E187、N188、S189、Q193、E195、T220、H230、N233、W241、I243、Q251、N261、D264、Y267、P273、G283、及びI288からなる群より選ばれる１又は複数のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が、置換された変異。（ｉｉ）特定のアミノ酸配列におけるV218に相当するアミノ酸残基が置換された変異。【選択図】なし
Description
本発明は、変異型チロシナーゼ、並びにそれを好適に用い得るベタレイン色素等の製造方法に関する。
ベタレイン色素とは、天然では、ナデシコ目の植物およびある種の高等菌類にのみ含まれ、その化学構造中に窒素を含有することを特徴とする水溶性の色素である。ベタレイン色素は、構造上の特徴からベタキサンチンとベタシアニン類に分類されている。ベタキサンチンは黄色に発色し、ベタシアニン類は赤紫に発色するため従来から天然着色料として利用されている。
近年、ベタレイン色素が強力な抗酸化作用を有することが見出され、抗酸化剤としての活用も検討されている。さらに、ベタレイン色素が太陽エネルギーを効率よく吸収する性質を有することも見出され、色素増感型太陽電池の増感色素等への利用も期待されている。
このベタレイン色素の製造方法としては、植物から抽出し、精製する方法が一般的であるが、ベタレイン色素を含む植物は、マツバギク、ビート、サボテンなどのナデシコ目（ツルナ科、ヒユ科、スベリヒユ科、ツルムラサキ科、サボテン科、アカザ科、オシロイバナ科など）に限られている。そのため、高価であり、また、安定して供給することも難しい。
このベタレイン色素の製造方法としては、植物から抽出し、精製する方法が一般的であるが、ベタレイン色素を含む植物は、マツバギク、ビート、サボテンなどのナデシコ目（ツルナ科、ヒユ科、スベリヒユ科、ツルムラサキ科、サボテン科、アカザ科、オシロイバナ科など）に限られている。そのため、高価であり、また、安定して供給することも難しい。
近年、新たなベタレイン色素の製造方法として、ベタレイン色素の生産に関与する酵素であるチロシナーゼやＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）４，５−ジオキシゲナーゼ等の遺伝子を大腸菌や酵母などの微生物へ導入し、それらの微生物を用いて、グルコースやチロシンなどを基質としてベタレイン色素を一貫して合成する方法が開発されている（特許文献１，２）。
また、バチルス・メガテリウムのチロシナーゼに関しては、R209H、V218F、又はV218G
の変異を有するものが報告されており、該変異体では酵素学的性質が野生型に比べて変化したとされている（非特許文献１，２）。しかしながら、これらの変異型チロシナーゼを、ベタレイン色素等の合成に用いることについての記述はない。
の変異を有するものが報告されており、該変異体では酵素学的性質が野生型に比べて変化したとされている（非特許文献１，２）。しかしながら、これらの変異型チロシナーゼを、ベタレイン色素等の合成に用いることについての記述はない。
Ben-Yosef et al., Enzyme and Microbial Technology, 47.7 (2010): 372-376.
Goldfeder et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics1834.3 (2013): 629-633.
前述のように、ベタレイン色素を安定して持続的に、かつ低コストで製造・供給することの需要がある。しかしながら、特許文献１，２に記載の微生物を用いる製造方法では、
現状では生産速度が遅いため、生産効率が低く、工業化に耐えられるレベルではない。
そこで本発明は、微生物を用いてベタレイン色素等の製造方法の生産性を向上させることを課題とする。
現状では生産速度が遅いため、生産効率が低く、工業化に耐えられるレベルではない。
そこで本発明は、微生物を用いてベタレイン色素等の製造方法の生産性を向上させることを課題とする。
本発明者らは、微生物を用いる製造方法においてベタレイン色素等の生産性を向上させるためには、その生合成経路上で律速酵素であるチロシナーゼにアミノ酸変異を加えて、その触媒能を向上させることが有効であることに想到した。そして、鋭意研究の結果、チロシナーゼの触媒能向上に好適なアミノ酸変異を見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、下記（ｉ）及び／又は（ｉｉ）の変異を有する、チロシナーゼ活性を有するタンパク質（以降、「本発明の変異型チロシナーゼ」とも記す）。
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列におけるS2、N3、Y5、I28、K30、G46、F48、S54、N57、W68、E71、S104、D127、N144、D166、D170、K173、W182、E187、N188、S189、Q193、E195、T220、H230、N233、W241、I243、Q251、N261、D264、Y267、P273、G283、及びI288からなる群より選ばれる１又は複数のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が、K、H、R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S、及びTからなる群から選択されるアミノ酸残基に置換された変異。
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列におけるV218に相当するアミノ酸残基がK、H、R、E、D、Q、N、C、L、I、P、M、W、Y、A、S、及びTからなる群から選択されるアミノ酸残基
に置換された変異。
（２）前記変異が、配列番号２のアミノ酸配列における下記のいずれかの変異に相当する変異である、（１）に記載のタンパク質：
S2C、S2R、N3D、Y5N、I28S、K30E、G46D、F48L、S54N、N57T、W68R、E71G、S104T、D127E、N144H、D166E、D170E、K173E、W182R、E187R、N188K、S189T、Q193R、E195D、V218D
、T220S、H230Q、N233K、W241R、W241G、I243N、Q251P、N261D、D264E、Y267F、P273L、G283S、I288T。
（３）前記変異が、配列番号２のアミノ酸配列における下記のいずれかの変異に相当する変異である、（１）又は（２）に記載のタンパク質：
S2C、（S2C+Y5N）、（S2C+F48L）、（S2C+N188K）、（S2C+Q251P）、（S2C+D264E）、
（S2C+P273L）、（S2C+S104T+N261D）、（S2C+K173E+W182R）、（S2C+E71G+E195D+W241G
）、（S2C+Q193R+V218D+I288T）、（S2C+N3D+G46D+D127E+W241R）、（S2C+I28S+S54N+D170E+W182R）、（S2C+W68R+D166E+S189T+N233K）、（S2R+W241R+I243N）、V218D、D264E、
（K30E+E187R）、（N57T+Y267F）、（N57T+T220S+Y267F+G283S）、（N144H+H230Q）。
（１）配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、下記（ｉ）及び／又は（ｉｉ）の変異を有する、チロシナーゼ活性を有するタンパク質（以降、「本発明の変異型チロシナーゼ」とも記す）。
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列におけるS2、N3、Y5、I28、K30、G46、F48、S54、N57、W68、E71、S104、D127、N144、D166、D170、K173、W182、E187、N188、S189、Q193、E195、T220、H230、N233、W241、I243、Q251、N261、D264、Y267、P273、G283、及びI288からなる群より選ばれる１又は複数のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が、K、H、R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S、及びTからなる群から選択されるアミノ酸残基に置換された変異。
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列におけるV218に相当するアミノ酸残基がK、H、R、E、D、Q、N、C、L、I、P、M、W、Y、A、S、及びTからなる群から選択されるアミノ酸残基
に置換された変異。
（２）前記変異が、配列番号２のアミノ酸配列における下記のいずれかの変異に相当する変異である、（１）に記載のタンパク質：
S2C、S2R、N3D、Y5N、I28S、K30E、G46D、F48L、S54N、N57T、W68R、E71G、S104T、D127E、N144H、D166E、D170E、K173E、W182R、E187R、N188K、S189T、Q193R、E195D、V218D
、T220S、H230Q、N233K、W241R、W241G、I243N、Q251P、N261D、D264E、Y267F、P273L、G283S、I288T。
（３）前記変異が、配列番号２のアミノ酸配列における下記のいずれかの変異に相当する変異である、（１）又は（２）に記載のタンパク質：
S2C、（S2C+Y5N）、（S2C+F48L）、（S2C+N188K）、（S2C+Q251P）、（S2C+D264E）、
（S2C+P273L）、（S2C+S104T+N261D）、（S2C+K173E+W182R）、（S2C+E71G+E195D+W241G
）、（S2C+Q193R+V218D+I288T）、（S2C+N3D+G46D+D127E+W241R）、（S2C+I28S+S54N+D170E+W182R）、（S2C+W68R+D166E+S189T+N233K）、（S2R+W241R+I243N）、V218D、D264E、
（K30E+E187R）、（N57T+Y267F）、（N57T+T220S+Y267F+G283S）、（N144H+H230Q）。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
（５）（４）に記載のＤＮＡを含む、組換え発現ベクター。
（６）（５）に記載の組換え発現ベクターで形質転換された、微生物。
（７）大腸菌または酵母である、（６）に記載の微生物。
（８）（６）又は（７）に記載の微生物を培地中で培養する工程を含む、前記タンパク質の製造方法。
（５）（４）に記載のＤＮＡを含む、組換え発現ベクター。
（６）（５）に記載の組換え発現ベクターで形質転換された、微生物。
（７）大腸菌または酵母である、（６）に記載の微生物。
（８）（６）又は（７）に記載の微生物を培地中で培養する工程を含む、前記タンパク質の製造方法。
（９）（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質、又は前記タンパク質を含有する微生物若しくはその処理物の存在下で、水性媒体中で、チロシンをＬ−ＤＯＰＡに変換する工程を含む、Ｌ−ＤＯＰＡの製造方法。
（１０）（９）に記載のＬ−ＤＯＰＡの製造方法を含む、目的物質の製造方法であって、
前記目的物質は、アルカロイド、並びにカフェ酸及びその誘導体からなる群から選ばれるいずれかである、製造方法。
（１０）（９）に記載のＬ−ＤＯＰＡの製造方法を含む、目的物質の製造方法であって、
前記目的物質は、アルカロイド、並びにカフェ酸及びその誘導体からなる群から選ばれるいずれかである、製造方法。
（１１）（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質及びＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼを含有する微生物又はその処理物の存在下で、水性媒体中で、原料をベタレイン色素に変換する工程を含む、ベタレイン色素の製造方法。
（１２）前記変換工程の前に、前記微生物を水性媒体中で培養する工程を含む（１１）に記載の製造方法。
（１３）前記変換工程において、前記微生物として休止菌体を用いる、（１１）又は（１２）に記載の製造方法。
（１４）前記原料が、チロシン、及び／又は糖質原料である、（１１）〜（１３）のいずれかに記載の製造方法。
（１５）さらに、チロシン以外のアミノ酸又はアミンの存在下で行われる、（１１）〜（１４）のいずれかに記載の製造方法。
（１６）前記変換工程において、前記水性媒体が、アスコルビン酸、ＵＤＰ−グルコース、銅、及び鉄からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む、（１１）〜（１５）のいずれかに記載の製造方法。
（１７）前記ベタレイン色素がベタキサンチンである、（１１）〜（１６）のいずれかに記載の製造方法。
（１２）前記変換工程の前に、前記微生物を水性媒体中で培養する工程を含む（１１）に記載の製造方法。
（１３）前記変換工程において、前記微生物として休止菌体を用いる、（１１）又は（１２）に記載の製造方法。
（１４）前記原料が、チロシン、及び／又は糖質原料である、（１１）〜（１３）のいずれかに記載の製造方法。
（１５）さらに、チロシン以外のアミノ酸又はアミンの存在下で行われる、（１１）〜（１４）のいずれかに記載の製造方法。
（１６）前記変換工程において、前記水性媒体が、アスコルビン酸、ＵＤＰ−グルコース、銅、及び鉄からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む、（１１）〜（１５）のいずれかに記載の製造方法。
（１７）前記ベタレイン色素がベタキサンチンである、（１１）〜（１６）のいずれかに記載の製造方法。
本発明により、触媒能が向上した変異型チロシナーゼが提供される。該酵素は、チロシンからＬ−ＤＯＰＡへの変換反応を効率的に触媒することができるため、該酵素を含有する微生物等を用いることにより、グルコースやチロシン等の安価な原料からＬ−ＤＯＰＡを経てベタレイン色素等を高い生産性で安定的に製造することができる。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
＜１＞本発明の変異型チロシナーゼ
本発明の変異型チロシナーゼは、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列と90％以上、好ましくは95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。配列番号２のアミノ酸配列は、バチルス・メガテリウム菌（Bacillus megaterium）由来のチロ
シナーゼ（以降「野生型チロシナーゼ」とも記す）のアミノ酸配列である。
なお、本明細書において、「同一性」（identity）は、「相同性」（homology）を指すことがある。
また、本明細書において、アミノ酸は特記しない限りＬ体である。
本発明の変異型チロシナーゼは、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列と90％以上、好ましくは95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。配列番号２のアミノ酸配列は、バチルス・メガテリウム菌（Bacillus megaterium）由来のチロ
シナーゼ（以降「野生型チロシナーゼ」とも記す）のアミノ酸配列である。
なお、本明細書において、「同一性」（identity）は、「相同性」（homology）を指すことがある。
また、本明細書において、アミノ酸は特記しない限りＬ体である。
また、本発明の変異型チロシナーゼは、後述するチロシナーゼ活性が損なわれない限り、配列番号２のアミノ酸配列において、後述の変異の他に、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位等の変異が加えられたアミノ酸配列であってもよい。ここで、１個又は数個とは、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。かかる変異としては保存的変異が好ましく、代表的なものとしては保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場
合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミ
ノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で
、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換
、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、Asp
からAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの
置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの
置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの
置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの
置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへ
の置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミ
ノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で
、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換
、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、Asp
からAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの
置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの
置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの
置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの
置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへ
の置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
さらに、本発明の変異型チロシナーゼは、下記（ｉ）及び／又は（ｉｉ）の変異を有する。
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列におけるS2、N3、Y5、I28、K30、G46、F48、S54、N57、W68、E71、S104、D127、N144、D166、D170、K173、W182、E187、N188、S189、Q193、E195、T220、H230、N233、W241、I243、Q251、N261、D264、Y267、P273、G283、及びI288からなる群より選ばれる１又は複数のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が、K、H、R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S、及びTからなる群から選択されるアミノ酸残基に置換された変異。
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列におけるV218に相当するアミノ酸残基がK、H、R、E、D、Q、N、C、L、I、P、M、W、Y、A、S、及びTからなる群から選択されるアミノ酸残基
に置換された変異。
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列におけるS2、N3、Y5、I28、K30、G46、F48、S54、N57、W68、E71、S104、D127、N144、D166、D170、K173、W182、E187、N188、S189、Q193、E195、T220、H230、N233、W241、I243、Q251、N261、D264、Y267、P273、G283、及びI288からなる群より選ばれる１又は複数のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が、K、H、R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S、及びTからなる群から選択されるアミノ酸残基に置換された変異。
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列におけるV218に相当するアミノ酸残基がK、H、R、E、D、Q、N、C、L、I、P、M、W、Y、A、S、及びTからなる群から選択されるアミノ酸残基
に置換された変異。
上記表記において、数字の左側の文字はアミノ酸残基を、数字は配列番号２のアミノ酸配列におけるＮ末端からの位置を、それぞれ表し、本明細書において以降も同様とする。
（ｉ）及び／又は（ｉｉ）の変異の数の合計は、特に限定されないが、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
前記変異の位置における置換後のアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基であれば、（ｉ）及び（ｉｉ）に記載の各選択肢の何れであってもよいが、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列における下記のいずれかの変異に相当する変異が挙げられる：
S2C、S2R、N3D、Y5N、I28S、K30E、G46D、F48L、S54N、N57T、W68R、E71G、S104T、D127E、N144H、D166E、D170E、K173E、W182R、E187R、N188K、S189T、Q193R、E195D、V218D
、T220S、H230Q、N233K、W241R、W241G、I243N、Q251P、N261D、D264E、Y267F、P273L、G283S、I288T。
上記表記において、数字の左側の文字はアミノ酸残基を、数字は配列番号２のアミノ酸配列におけるＮ末端からの位置を、数字の右側の文字は変異後のアミノ酸残基を、それぞれ表し、本明細書において以降も同様とする。例えば、「S2C」は、配列番号２における
２位のセリン残基がシステイン残基に置換された変異を表す。
S2C、S2R、N3D、Y5N、I28S、K30E、G46D、F48L、S54N、N57T、W68R、E71G、S104T、D127E、N144H、D166E、D170E、K173E、W182R、E187R、N188K、S189T、Q193R、E195D、V218D
、T220S、H230Q、N233K、W241R、W241G、I243N、Q251P、N261D、D264E、Y267F、P273L、G283S、I288T。
上記表記において、数字の左側の文字はアミノ酸残基を、数字は配列番号２のアミノ酸配列におけるＮ末端からの位置を、数字の右側の文字は変異後のアミノ酸残基を、それぞれ表し、本明細書において以降も同様とする。例えば、「S2C」は、配列番号２における
２位のセリン残基がシステイン残基に置換された変異を表す。
本発明の変異型チロシナーゼが有する変異としてさらに好ましいのは、後述の実施例２において波長470nmのUV吸収で測定されたベタキサンチンの生成量が、野生型チロシナー
ゼの好ましくは１．３倍以上、より好ましくは１．５倍以上、さらに好ましくは２倍以上であることが確認されたいずれかの変異である。
ゼの好ましくは１．３倍以上、より好ましくは１．５倍以上、さらに好ましくは２倍以上であることが確認されたいずれかの変異である。
そのような変異としては、配列番号２のアミノ酸配列における下記のいずれかの変異に相当する変異が挙げられる：
S2C、（S2C+Y5N）、（S2C+F48L）、（S2C+N188K）、（S2C+Q251P）、（S2C+D264E）、
（S2C+P273L）、（S2C+S104T+N261D）、（S2C+K173E+W182R）、（S2C+E71G+E195D+W241G
）、（S2C+Q193R+V218D+I288T）、（S2C+N3D+G46D+D127E+W241R）、（S2C+I28S+S54N+D170E+W182R）、（S2C+W68R+D166E+S189T+N233K）、（S2R+W241R+I243N）、V218D、D264E、
（K30E+E187R）、（N57T+Y267F）、（N57T+T220S+Y267F+G283S）、（N144H+H230Q）。
これらのうち、上記実施例におけるベタキサンチン生産量が特に優れていた（S2C+D264E）、（S2C+N3D+G46D+D127E+W241R）がより好ましい。
上記表記において、「+」で表される２以上の変異の併記は、二重変異又はそれ以上の
多重変異を表す。例えば、（S2C+Y5N）は、変異型チロシナーゼがS2C変異とY5N変異とを
同時に有することを表す。
S2C、（S2C+Y5N）、（S2C+F48L）、（S2C+N188K）、（S2C+Q251P）、（S2C+D264E）、
（S2C+P273L）、（S2C+S104T+N261D）、（S2C+K173E+W182R）、（S2C+E71G+E195D+W241G
）、（S2C+Q193R+V218D+I288T）、（S2C+N3D+G46D+D127E+W241R）、（S2C+I28S+S54N+D170E+W182R）、（S2C+W68R+D166E+S189T+N233K）、（S2R+W241R+I243N）、V218D、D264E、
（K30E+E187R）、（N57T+Y267F）、（N57T+T220S+Y267F+G283S）、（N144H+H230Q）。
これらのうち、上記実施例におけるベタキサンチン生産量が特に優れていた（S2C+D264E）、（S2C+N3D+G46D+D127E+W241R）がより好ましい。
上記表記において、「+」で表される２以上の変異の併記は、二重変異又はそれ以上の
多重変異を表す。例えば、（S2C+Y5N）は、変異型チロシナーゼがS2C変異とY5N変異とを
同時に有することを表す。
また、別の観点からは、上記変異のうちS2C変異、又はS2Cと１又はそれ以上の変異との組み合わせからなる多重変異であることも好ましい。
好ましい例としては、S2C、（S2C+D264E）、（S2C+N3D+G46D+D127E+W241R）が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい例としては、S2C、（S2C+D264E）、（S2C+N3D+G46D+D127E+W241R）が挙げられるが、これらに限定されない。
変異の位置は、必ずしも変異型チロシナーゼのアミノ酸配列におけるN末端からの絶対
的な位置を示すものではなく、配列番号２に記載のアミノ酸配列との相対的な位置を示すものである。例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するチロシナーゼにおいて、n
位よりもN末端側の位置で１個のアミノ酸残基が欠失した場合、このn位はN末端からn-1番目のアミノ酸残基となる。このような場合であっても、前記アミノ酸酸残基は、n位のア
ミノ酸残基とみなされる。アミノ酸置換の絶対的な位置は、対象のチロシナーゼのアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列とのアラインメントにより、決定することができる。この場合のアラインメントの方法は、公知の遺伝子解析ソフトウェアが利用可能である。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。
的な位置を示すものではなく、配列番号２に記載のアミノ酸配列との相対的な位置を示すものである。例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するチロシナーゼにおいて、n
位よりもN末端側の位置で１個のアミノ酸残基が欠失した場合、このn位はN末端からn-1番目のアミノ酸残基となる。このような場合であっても、前記アミノ酸酸残基は、n位のア
ミノ酸残基とみなされる。アミノ酸置換の絶対的な位置は、対象のチロシナーゼのアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列とのアラインメントにより、決定することができる。この場合のアラインメントの方法は、公知の遺伝子解析ソフトウェアが利用可能である。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。
さらに、本発明の変異型チロシナーゼは、チロシナーゼ活性を有するタンパク質である。
本明細書において「チロシナーゼ活性」とは、チロシンのフェノール環の３位に水酸基を付加することができる酵素活性をいう。ただし、チロシン以外の化合物を基質としてそれを水酸化する活性をも有することは排除されない。
具体的には、本発明の変異型チロシナーゼは、チロシンをＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（以降、「Ｌ−ＤＯＰＡ」と記す）に変換する酵素活性を有することが好まししく、野生型チロシナーゼに比して増強した該活性を有することがさらに好ましい。
チロシナーゼ活性を有するか否かは、対象タンパク質が、チロシンの３位を水酸化する活性を通常のアッセイ方法で測定することにより判定が可能である。例えば、チロシンに、対象タンパク質を作用させ、チロシンから変換されたＬ−ＤＯＰＡ量を直接的に測定することで、その酵素活性を確認することができる。
本明細書において「チロシナーゼ活性」とは、チロシンのフェノール環の３位に水酸基を付加することができる酵素活性をいう。ただし、チロシン以外の化合物を基質としてそれを水酸化する活性をも有することは排除されない。
具体的には、本発明の変異型チロシナーゼは、チロシンをＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（以降、「Ｌ−ＤＯＰＡ」と記す）に変換する酵素活性を有することが好まししく、野生型チロシナーゼに比して増強した該活性を有することがさらに好ましい。
チロシナーゼ活性を有するか否かは、対象タンパク質が、チロシンの３位を水酸化する活性を通常のアッセイ方法で測定することにより判定が可能である。例えば、チロシンに、対象タンパク質を作用させ、チロシンから変換されたＬ−ＤＯＰＡ量を直接的に測定することで、その酵素活性を確認することができる。
本発明の変異型チロシナーゼは、それをコードする遺伝子（以降「変異型tyr遺伝子」
と記す）を適当なベクターに挿入し、得られた組換えベクターを適切な宿主に導入して形質転換したり、変異型tyr遺伝子を宿主の染色体上に導入したりして、発現させることに
よって製造することができる。また、後述するＬ−ＤＯＰＡの製造方法に用いる、変異型チロシナーゼを含有する微生物は、前記組組換えベクターを適切な宿主微生物に導入したり、変異型tyr遺伝子を宿主の染色体上に導入したりすることによって取得することがで
きる。
と記す）を適当なベクターに挿入し、得られた組換えベクターを適切な宿主に導入して形質転換したり、変異型tyr遺伝子を宿主の染色体上に導入したりして、発現させることに
よって製造することができる。また、後述するＬ−ＤＯＰＡの製造方法に用いる、変異型チロシナーゼを含有する微生物は、前記組組換えベクターを適切な宿主微生物に導入したり、変異型tyr遺伝子を宿主の染色体上に導入したりすることによって取得することがで
きる。
変異型tyr遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるチロシナーゼ
の特定の部位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されるように、野生型チロシナーゼをコードする遺伝子、例えばバチルス・メガテリウム菌の野生型チロシナーゼをコードする遺伝子（以降、「野生型tyr遺伝子」と記す；配列番号１）の塩基配列を改変するこ
とによって取得することができる。
なお、野生型tyr遺伝子は、前記特定の変異を有さない限り、それ以外の変異を有して
いてもよい。また、バチルス・メガテリウム菌の野生型tyr遺伝子に替えて、そのホモロ
グ、例えばバチルス・メガテリウムの野生型チロシナーゼと構造が類似する他の微生物のチロシナーゼをコードする遺伝子を用いてもよい。他の微生物としては、例えば、Bacillus flexus、Bacillus aryabhattai等が挙げられる。
の特定の部位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されるように、野生型チロシナーゼをコードする遺伝子、例えばバチルス・メガテリウム菌の野生型チロシナーゼをコードする遺伝子（以降、「野生型tyr遺伝子」と記す；配列番号１）の塩基配列を改変するこ
とによって取得することができる。
なお、野生型tyr遺伝子は、前記特定の変異を有さない限り、それ以外の変異を有して
いてもよい。また、バチルス・メガテリウム菌の野生型tyr遺伝子に替えて、そのホモロ
グ、例えばバチルス・メガテリウムの野生型チロシナーゼと構造が類似する他の微生物のチロシナーゼをコードする遺伝子を用いてもよい。他の微生物としては、例えば、Bacillus flexus、Bacillus aryabhattai等が挙げられる。
また、野生型チロシナーゼをコードする遺伝子として、導入する宿主微生物のコドン使用頻度に応じて塩基配列を最適化したものを用いてもよい。コドン最適化は、例えば、J.
Microbiol. Biotechnol. (2012), 22(3), 316-325に記載の方法や、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社のＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅＴＭサービスを利用する方法がある。
例えば、大腸菌発現用に最適化したtyr遺伝子としては配列番号３の塩基配列が、酵母
発現用に最適化したtyr遺伝子としては配列番号４の塩基配列が、それぞれ挙げられる。
Microbiol. Biotechnol. (2012), 22(3), 316-325に記載の方法や、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社のＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅＴＭサービスを利用する方法がある。
例えば、大腸菌発現用に最適化したtyr遺伝子としては配列番号３の塩基配列が、酵母
発現用に最適化したtyr遺伝子としては配列番号４の塩基配列が、それぞれ挙げられる。
また、野生型チロシナーゼをコードする遺伝子は、配列番号１、３又は４の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブ、又は前記相補的な塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るDNAであって、かつ、チロシナー
ゼ活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。
ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%、特に好まし
くは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同
士がハイブリダイズしない条件、例えば、42℃でのハイブリダイゼーション、及び1×SSC、0.1%のSDSを含む緩衝液による42℃での洗浄処理を挙げることができ、65℃でのハイブ
リダイゼーション、及び0.1×SSC、0.1%のSDSを含む緩衝液による65℃での洗浄処理をよ
り好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、tyr遺伝子の相補配列の一部であっても
よい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、
ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
ゼ活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。
ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%、特に好まし
くは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同
士がハイブリダイズしない条件、例えば、42℃でのハイブリダイゼーション、及び1×SSC、0.1%のSDSを含む緩衝液による42℃での洗浄処理を挙げることができ、65℃でのハイブ
リダイゼーション、及び0.1×SSC、0.1%のSDSを含む緩衝液による65℃での洗浄処理をよ
り好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、tyr遺伝子の相補配列の一部であっても
よい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、
ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
DNAの目的部位に目的の変異を起こす部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth.
in Enzymol., 154, 367 (1987)）などがある。
in Enzymol., 154, 367 (1987)）などがある。
得られた変異型tyr遺伝子を宿主となる微生物に導入するに際しては、プラスミドベク
ター上に変異型tyr遺伝子ＤＮＡを導入しても、相同組み換えにより染色体（ゲノム）上
に該ＤＮＡを導入してもよい。
微生物に変異型tyr遺伝子を導入する際には、適当なプロモーターを該遺伝子の５'−側上流に組み込むことが好ましく、加えてターミネーターを３'−側下流にそれぞれ組み込
むことがより好ましい。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、該酵素遺伝子自身のプロモーター及びターミネーターであってもよいし、他のプロモーター及びターミネーターに置換してもよい。これら各微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
ター上に変異型tyr遺伝子ＤＮＡを導入しても、相同組み換えにより染色体（ゲノム）上
に該ＤＮＡを導入してもよい。
微生物に変異型tyr遺伝子を導入する際には、適当なプロモーターを該遺伝子の５'−側上流に組み込むことが好ましく、加えてターミネーターを３'−側下流にそれぞれ組み込
むことがより好ましい。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、該酵素遺伝子自身のプロモーター及びターミネーターであってもよいし、他のプロモーター及びターミネーターに置換してもよい。これら各微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
なお、ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
好ましい宿主としては、構築した組換えDNAの複製起点と変異型tyr遺伝子が機能し、組換えDNAが複製可能でかつ変異型tyr遺伝子の発現が可能な微生物ならば、特に限定されない。例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌等のグラム陰性細菌、グラム陽性細菌としてはバチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌等のコリネ型細菌、その他に酵母、カビなどの細胞等を用いることができる。
宿主微生物として大腸菌を用いる場合、大腸菌の親株としては、例えば、Ｋ１２株又はＢ株、加えてこれらの誘導体を用いることが好ましい。本発明で用いることのできる親株としては、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＴＨ２、ＴＯＰ１０、及びこれらの改良株が挙げられ、これらの菌株は市販されている。加えて、例えば一遺伝子破壊株であるＫＥＩＯコレクションで使用されているＢＷ２５１１３株なども利用可能であり、これらはナショナルバイオリソースプロジェクトより分与が可能である。
大腸菌の組換え方法としては、目的とする遺伝子または配列を含むＤＮＡ断片をプラスミドベクターに導入することにより、大腸菌内で前記酵素遺伝子の発現増強が可能な組換えプラスミドベクターを得て、このプラスミドベクターを菌体内へ導入する方法等が挙げられる。
大腸菌に目的とする遺伝子または配列を導入することができるプラスミドベクターとしては、大腸菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。プラスミドベクターとしては、例えば、Ｐ１５Ａ、ＣｏｌＥ１（ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ）、ＲＳＦ１０３０、ｐＳＣ１０１、ＣｌｏＤＦ１３などの複製開始点をもつものを好適に用いることができる。
大腸菌に目的とする遺伝子または配列を導入することができるプラスミドベクターとしては、大腸菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。プラスミドベクターとしては、例えば、Ｐ１５Ａ、ＣｏｌＥ１（ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ）、ＲＳＦ１０３０、ｐＳＣ１０１、ＣｌｏＤＦ１３などの複製開始点をもつものを好適に用いることができる。
また、プロモーターとしては、大腸菌において機能するものであればいかなるプロモーターであってもよく、導入される遺伝子自身のプロモーターであってもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター及びλＰＬプロモーター等を用いることができる。
本発明で用いることができるプラスミドベクターは、例えば、ｐＥＴシリーズ（ノバジェン）、Ｄｕｅｔ Ｖｅｃｔｏｒシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＤＵＡＬシリーズ（ストラタジェン）、ｐＭＡＬシリーズ（ＮＥＢ）、ｐＧＥＸシリーズ（ＧＥヘルスケア）、ｐＫＫ２２３（ＧＥヘルスケア）ｐＴｒｃシリーズ（ライフテクノロジーズ）、ｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（タカラバイオ）等が挙がられる。
８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（タカラバイオ）等が挙がられる。
また、上記の組換え方法に代えて、あるいは、上記の組換え方法に加えて、公知の相同組換え法によって、変異型tyr遺伝子を導入したり、置換したり、増幅したり、加えて、
染色体上へ導入された当該遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによっても高発現株を得ることができる。
染色体上へ導入された当該遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによっても高発現株を得ることができる。
宿主微生物として、コリネ型細菌（coryneform bacterium）を用いる場合、コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌又はアースロバクター属に属する細菌等が挙げられ、これらのうち、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが好ましく、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）に属する
細菌がより好ましい。
細菌がより好ましい。
本発明において用いることのできる親株としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−
１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテ
リウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２、ココリネバクテリウム・グルタミカムＡＴ
ＣＣ３１８３１、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。
１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテ
リウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２、ココリネバクテリウム・グルタミカムＡＴ
ＣＣ３１８３１、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。
なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Lielbl, W. et al. International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260）、本発明においては、ブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３株、及びその変異株ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株はそれぞれ、
コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株と同
一の株であるものとする。また、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター）（〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２０号室）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−３０６８として寄託さ
れ、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９７の受託番号で寄託されている。
ム・フラバムＭＪ−２３３株、及びその変異株ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株はそれぞれ、
コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株と同
一の株であるものとする。また、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター）（〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２０号室）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−３０６８として寄託さ
れ、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９７の受託番号で寄託されている。
本発明の方法において親株として用いられる上記の微生物としては、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
コリネ型細菌に前記遺伝子をプラスミドベクターにより導入する際、利用できるプラスミドベクターの具体例は、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１；Plasmid vol.36(1)p62-66(1996)
に記載のｐＣ２又はその改変プラスミド等を挙げることができる。
に記載のｐＣ２又はその改変プラスミド等を挙げることができる。
また、上記の組換え方法に代えて、あるいは、上記の組換え方法に加えて、公知の相同組換え法によって、変異型tyr遺伝子を導入したり、置換したり、増幅したり、加えて、
染色体上へ導入された当該遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによっても高発現株を得ることができる。
染色体上へ導入された当該遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによっても高発現株を得ることができる。
宿主微生物として、酵母を用いる場合、親株として用いる酵母の種類は特に限定されないが、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、シゾサッカロマイセス属、キャンディダ属、ヤロウィア属、ロドトルラ属、リポマイセス属、クルイベロマイセス属、ロドスポリジウム属、トリコデルマ属または、トルロプシス属、ピキア属等に属する酵母を親株として用いることが好ましい。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、デバリオマイセス・ニ
ルソニ（Debaryomyces nilssonii）、デバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、キャンディダ・グラブラータ（Candida glabrata）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）、キャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ロドトルラ・グ
ルティニス（Rhodotorula glutinis）、リポマイセス・リポフェラス（Lipomyces lipoferus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ロドスポリジウム
・トルロイディス（Rhodosporidium toruloides）、トリコデルマ・リセイ（Trichodermareesei）、トルロプシス・コリキュロサ（Torulopsis colliculosa）、ピキア・ファリノサ（Pichia farinosa）等が挙げられる。これらの中で、代謝工学的手法が用いやすいこ
とからサッカロミセス属が最も好ましい。
ルソニ（Debaryomyces nilssonii）、デバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、キャンディダ・グラブラータ（Candida glabrata）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）、キャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ロドトルラ・グ
ルティニス（Rhodotorula glutinis）、リポマイセス・リポフェラス（Lipomyces lipoferus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ロドスポリジウム
・トルロイディス（Rhodosporidium toruloides）、トリコデルマ・リセイ（Trichodermareesei）、トルロプシス・コリキュロサ（Torulopsis colliculosa）、ピキア・ファリノサ（Pichia farinosa）等が挙げられる。これらの中で、代謝工学的手法が用いやすいこ
とからサッカロミセス属が最も好ましい。
さらに、サッカロミセス属は、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ｕｒａ３などの栄養要求性の遺伝型であることが望ましく、例えば、サッカロミセス・セレビジエＹＰＨ４９９株（ＭＡＴａ ｕｒａ３ ｌｙｓ２ ａｄｅ２ ｔｒｐ１ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２）（ＡＴＣＣ２０４６７９：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ又はＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より入手できる）、サッカロミセス・セレビジエＦＹ１６７９−０６ｃ株（ＭＡＴα ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｈｉｓ３）（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ社から入手できる）、サッカロミセス・セレビジエＢＹ４７４１株（ＭＡＴａ，ｈｉｓ３Δ１，ｌｅｕ２Δ０，ｍｅｔ１５Δ０，ｕｒａ３Δ０）（Ｙｅａｓｔ １４：１１５−１３２（１９９８）、ＡＴＣＣ２０１３８８）なども用いることができる。
酵母において変異型tyr遺伝子を導入する方法としては、公知の手法を用いることがで
き、形質転換体において形質転換の目的とした酵素が発現していればよく、遺伝子の導入の方法は限定されない。用いるプラスミドベクターとしては、例えば、次の３つのプラスミドベクターが挙げられる。
（ｉ）酵母に常在する２μｍプラスミドの複製配列を利用した多コピーのＹＥｐ型ベクターを用いることができる。本発明において酵母に遺伝子を導入するために使用できるプラスミドの具体例としては、２μｍプラスミド由来のｐＡＵＲ１１２ベクター（タカラバイオ社製）やｐＥＳＣベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、ｐＹＥＳベクター（ライフテクノロジーズ）などが挙げられる。これらのベクターは市販されている。
（ｉｉ）自律複製配列（ＡＲＳ）とセントロメア配列（ＣＥＮ）を利用した低コピー安定型のＹＣｐ型ベクターを用いることができる。本発明において用いることのできるプラスミドベクターとしては、例えば、ｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ）等が挙げられる。
（ｉｉｉ）染色体組込みを目的とした酵母内では自律複製をしないＹＩｐ型のプラスミドを用いることができる。これは、酵母の高い相同組換え能を利用するものであり、染色体ゲノムと相同な配列を両端に置き、選択可能なマーカー遺伝子、プロモーター及びター
ミネーターに挟まれた形で希望の遺伝子をＹＩｐ型のプラスミドに組み込み、これを酵母内に導入することで、外来遺伝子は染色体内に組み込まれ、安定的に外来遺伝子を発現することが期待できる。これは一般的な大腸菌や酵母用のプラスミドを用いて構築することが可能であるほか、ＰＣＲや合成ＤＮＡを用いて作製することが可能である。
き、形質転換体において形質転換の目的とした酵素が発現していればよく、遺伝子の導入の方法は限定されない。用いるプラスミドベクターとしては、例えば、次の３つのプラスミドベクターが挙げられる。
（ｉ）酵母に常在する２μｍプラスミドの複製配列を利用した多コピーのＹＥｐ型ベクターを用いることができる。本発明において酵母に遺伝子を導入するために使用できるプラスミドの具体例としては、２μｍプラスミド由来のｐＡＵＲ１１２ベクター（タカラバイオ社製）やｐＥＳＣベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、ｐＹＥＳベクター（ライフテクノロジーズ）などが挙げられる。これらのベクターは市販されている。
（ｉｉ）自律複製配列（ＡＲＳ）とセントロメア配列（ＣＥＮ）を利用した低コピー安定型のＹＣｐ型ベクターを用いることができる。本発明において用いることのできるプラスミドベクターとしては、例えば、ｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ）等が挙げられる。
（ｉｉｉ）染色体組込みを目的とした酵母内では自律複製をしないＹＩｐ型のプラスミドを用いることができる。これは、酵母の高い相同組換え能を利用するものであり、染色体ゲノムと相同な配列を両端に置き、選択可能なマーカー遺伝子、プロモーター及びター
ミネーターに挟まれた形で希望の遺伝子をＹＩｐ型のプラスミドに組み込み、これを酵母内に導入することで、外来遺伝子は染色体内に組み込まれ、安定的に外来遺伝子を発現することが期待できる。これは一般的な大腸菌や酵母用のプラスミドを用いて構築することが可能であるほか、ＰＣＲや合成ＤＮＡを用いて作製することが可能である。
本発明において用いることのできるプロモーターとしては、宿主酵母で機能しうるものであれば特に制限されないが、例えば、ＰＧＫ遺伝子のプロモーター（３−ホスホグリセラートキナーゼ 1983、Science、219、620-625）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒドホ
スフェートデヒドロゲナーゼ 1979、J.Biol.Chem.、254、9839-9845）をコードするＴＤＨ遺伝子のプロモーター、ＴＥＦ１遺伝子（伸長因子１ 1985、J.Biol.Chem.、260、3090-3096）のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼをコードするＡＤＨ遺伝子のプロモーター、グルコースの存在下に抑制される調節可能なＣＹＣ１遺伝子のプロモーター（1981、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、78、2199-2203）、チアミンにより調節され得るＰＨ
Ｏ５遺伝子のプロモーター（1982、EMBO J.、1、675-680）、グルコース非存在下でガラ
クトースにより誘導されるＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
スフェートデヒドロゲナーゼ 1979、J.Biol.Chem.、254、9839-9845）をコードするＴＤＨ遺伝子のプロモーター、ＴＥＦ１遺伝子（伸長因子１ 1985、J.Biol.Chem.、260、3090-3096）のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼをコードするＡＤＨ遺伝子のプロモーター、グルコースの存在下に抑制される調節可能なＣＹＣ１遺伝子のプロモーター（1981、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、78、2199-2203）、チアミンにより調節され得るＰＨ
Ｏ５遺伝子のプロモーター（1982、EMBO J.、1、675-680）、グルコース非存在下でガラ
クトースにより誘導されるＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
また、上記の組換え方法に代えて、あるいは、上記の組換え方法に加えて、公知の相同組換え法によって、変異型tyr遺伝子を導入したり、置換したり、増幅したり、加えて、
染色体上へ導入された当該遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターの置換などによっても高発現株を得ることができる。
なお、酵母の形質転換は、例えば、エレクトロポレーション法（Fromm ME,et al. Nature 1986, 319(6056):791-793）、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法（Ito,H.et al, (1983) J. Bacteriol. 153(1), 163-168）等によって行うことができ、二種以上のプラス
ミドを導入することもできる。また、酵母における遺伝子の発現増強は、公知の相同組換え法によって宿主のゲノム上で該遺伝子を多コピー化させることによって行うこともできる。例えば、ゲノム組込型プラスミドのうち多コピーがゲノムに組み込まれるベクターを用いる方法（Bio/Technol. 1991, 9, 1382-1385）が挙げられる。ゲノム上の各遺伝子を
含む発現単位の挿入箇所は、クロチルアルコールもしくはその異性体の合成関連遺伝子や生育関連遺伝子の発現が阻害されない箇所であれば何れのものでもよい。
染色体上へ導入された当該遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターの置換などによっても高発現株を得ることができる。
なお、酵母の形質転換は、例えば、エレクトロポレーション法（Fromm ME,et al. Nature 1986, 319(6056):791-793）、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法（Ito,H.et al, (1983) J. Bacteriol. 153(1), 163-168）等によって行うことができ、二種以上のプラス
ミドを導入することもできる。また、酵母における遺伝子の発現増強は、公知の相同組換え法によって宿主のゲノム上で該遺伝子を多コピー化させることによって行うこともできる。例えば、ゲノム組込型プラスミドのうち多コピーがゲノムに組み込まれるベクターを用いる方法（Bio/Technol. 1991, 9, 1382-1385）が挙げられる。ゲノム上の各遺伝子を
含む発現単位の挿入箇所は、クロチルアルコールもしくはその異性体の合成関連遺伝子や生育関連遺伝子の発現が阻害されない箇所であれば何れのものでもよい。
＜２＞変異型チロシナーゼの製造方法
本発明の変異型チロシナーゼは、上記のようにして得られる変異型tyr遺伝子を含む組
換えDNAを導入した微生物（形質転換体）を、該遺伝子が発現可能な条件で培養し、微生
物を増殖させ、該遺伝子がコードするタンパク質を発現させることにより製造することができる。培養に用いる培地としては、目的の微生物が増殖し得るものであれば特に制限されず、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。
本発明の変異型チロシナーゼは、上記のようにして得られる変異型tyr遺伝子を含む組
換えDNAを導入した微生物（形質転換体）を、該遺伝子が発現可能な条件で培養し、微生
物を増殖させ、該遺伝子がコードするタンパク質を発現させることにより製造することができる。培養に用いる培地としては、目的の微生物が増殖し得るものであれば特に制限されず、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュークロース、グリセロール、エタノール、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる、
有機微量栄養源としては、ビタミンB1などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる、
有機微量栄養源としては、ビタミンB1などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
培養条件は、用いる微生物によって適宜設定すればよく、例えば、培養温度は20℃〜45℃、好ましくは24℃〜45℃で培養することが好ましい。培養は通気培養が好ましく、酸素濃度は、飽和濃度に対して5〜50%に、望ましくは10%程度に調節して行うことが好ましい
。また、培養中のpHは5〜9が好ましい。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等を使用することができる。
。また、培養中のpHは5〜9が好ましい。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等を使用することができる。
上記のような条件下で、好ましくは10時間〜120時間程度培養することにより、微生物
のペリプラズムに変異型チロシナーゼが蓄積する。
なお、使用する宿主及びtyr遺伝子の設計によっては、微生物内にチロシナーゼを蓄積
させることや、もしくは、微生物外にチロシナーゼを分泌生産させることも可能である。
のペリプラズムに変異型チロシナーゼが蓄積する。
なお、使用する宿主及びtyr遺伝子の設計によっては、微生物内にチロシナーゼを蓄積
させることや、もしくは、微生物外にチロシナーゼを分泌生産させることも可能である。
変異型チロシナーゼは、微生物体内に含まれたまま、すなわち「変異型チロシナーゼを含有する微生物」として使用することもできるが、微生物から抽出した粗酵素画分又は精製酵素として使用してもよい。変異型チロシナーゼは、通常のペリプラズム酵素の抽出と同様の方法、例えば浸透圧ショック法、凍結融解法等により、抽出することができる。また、変異型チロシナーゼの精製は、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿等、酵素の精製に通常用いられる手法を適宜組み合わせて行うことができる。微生物外にチロシナーゼが分泌生産される場合は、培地から採取した変異型チロシナーゼを使用することができる。
変異型チロシナーゼを含有する微生物の処理物としては、変異型チロシナーゼが機能可能な状態で含まれる限り特に制限されず、微生物の破砕物、微生物の抽出物、それらの部分精製物、又は精製酵素等、及び、それらをアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した微生物体、又は変異型チロシナーゼを樹脂等の固相に固定化した固定化酵素などが挙げられる。
＜３＞目的物質の製造方法
上記のようにして得られる本発明の変異型チロシナーゼ、又は該変異型チロシナーゼを含有する微生物もしくはその処理物の存在下で、水性媒体中で、チロシンをＬ−ＤＯＰＡに変換する工程により、Ｌ−ＤＯＰＡを製造することができる。さらに前記Ｌ−ＤＯＰＡへの変換工程を経て、ベタレイン色素等のアルカロイド並びにカフェ酸及びその誘導体などの目的物質を製造することができる。例えば、チロシンを出発物質又は中間体として、Ｌ−ＤＯＰＡを経由してベタレイン色素が生成される経路の概略を図１に示す。
上記のようにして得られる本発明の変異型チロシナーゼ、又は該変異型チロシナーゼを含有する微生物もしくはその処理物の存在下で、水性媒体中で、チロシンをＬ−ＤＯＰＡに変換する工程により、Ｌ−ＤＯＰＡを製造することができる。さらに前記Ｌ−ＤＯＰＡへの変換工程を経て、ベタレイン色素等のアルカロイド並びにカフェ酸及びその誘導体などの目的物質を製造することができる。例えば、チロシンを出発物質又は中間体として、Ｌ−ＤＯＰＡを経由してベタレイン色素が生成される経路の概略を図１に示す。
Ｌ−ＤＯＰＡの製造においては、チロシンに本発明の変異型チロシナーゼ、又は該変異型チロシナーゼを含有する微生物もしくはその処理物を作用させて、該変異型チロシナーゼの触媒活性によりＬ−ＤＯＰＡに変換する。ここで、本発明の変異型チロシナーゼとしては粗酵素画分又は精製酵素のいずれでもよく、本発明の変異型チロシナーゼを含有する微生物の処理物も特に限定されず、これらは＜２＞で述べた説明に準ずる。
Ｌ−ＤＯＰＡの製造における原料としては、チロシン及び／又は糖質原料を用いることができる。ここでチロシンとしては、純度９０％以上の市販品を好適に用いることができる。
糖質原料としては、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、スクロース、マルトース、ラクトース、ラフィノース、サッカロース、デンプン、セルロースなどの炭水化物やグリセリン、マンニトール、リビトール、キシリトールなどのポリアルコール類等の発酵性糖質類等を用いることができ、中でもグルコースが好ましい。
変異型チロシナーゼを含有する微生物を用いる場合、糖質原料からチロシンを合成する代謝フラックスが充分に強くない場合は、原料として糖質原料およびチロシンを用いることが好ましく、特にグルコースおよびチロシンを用いることが好ましい。一方、前記微生物において、糖質原料からチロシンを合成する代謝フラックスが強い場合は、原料として糖質原料のみを用いることができ、目的物質の製造プロセスの低コスト化のためには好ましい。
糖質原料としては、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、スクロース、マルトース、ラクトース、ラフィノース、サッカロース、デンプン、セルロースなどの炭水化物やグリセリン、マンニトール、リビトール、キシリトールなどのポリアルコール類等の発酵性糖質類等を用いることができ、中でもグルコースが好ましい。
変異型チロシナーゼを含有する微生物を用いる場合、糖質原料からチロシンを合成する代謝フラックスが充分に強くない場合は、原料として糖質原料およびチロシンを用いることが好ましく、特にグルコースおよびチロシンを用いることが好ましい。一方、前記微生物において、糖質原料からチロシンを合成する代謝フラックスが強い場合は、原料として糖質原料のみを用いることができ、目的物質の製造プロセスの低コスト化のためには好ましい。
Ｌ−ＤＯＰＡの製造に用いる水性媒体としては特に制限はなく、例えば、水；リン酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、ほう酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、トリス緩衝液などの緩衝液；メタノール、エタノールなどのアルコール類；酢酸エチルなどのエステル類；アセトンなどのケトン類；アセトアミドなどのアミド類等が挙げられる。また、変異型チロシナーゼを含有する微生物を用いる場合は、その微生物の種類に応じて適当な培地を使用すればよく、例えば、炭素源、窒素源、無機塩及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地を使用できる。
ここで、炭素源は、上記微生物が資化しうる炭素源であれば特に限定されないが、例えば、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられる。
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が用いられる。
また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加してもよい。
ここで、炭素源は、上記微生物が資化しうる炭素源であれば特に限定されないが、例えば、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられる。
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が用いられる。
また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加してもよい。
また、変換工程を行う条件は、本発明の変異型チロシナーゼが完全に酵素活性を失わない条件であれば特に限定されないが、通常１０℃〜４５℃で１２時間〜９６時間実施することができる。
変換により生成したＬ−ＤＯＰＡを原料として、アルカロイド並びにカフェ酸及びその誘導体などの目的物質を任意の方法で製造することができる。その際、Ｌ−ＤＯＰＡは、精製又は粗精製して後続の反応に供してもよいし、そのまま微生物内で代謝経路により反応を進行させてもよい。
ここで、アルカロイドとは、ベタレイン色素（ベタシアニン類、ベタキサンチン類）、アドレナリン前駆体（ドロキシドパ、カルビドパ等）等を含み、その他にもアガランサミン、モルヒネ等の種々のアルカロイド系化合物も、Ｌ−ＤＯＰＡを出発物質又は中間体として製造できることが知られている。
Ｌ−ＤＯＰＡからアルカロイド類へは、周知の反応経路で製造することができ、例えば、Ｌ−ＤＯＰＡから種々のベタレイン色素を製造する具体的な経路を図２〜４に示す。
Ｌ−ＤＯＰＡからアルカロイド類へは、周知の反応経路で製造することができ、例えば、Ｌ−ＤＯＰＡから種々のベタレイン色素を製造する具体的な経路を図２〜４に示す。
また、カフェ酸及びその誘導体は、下記一般式（１）で表される化合物をいう。
の原子又は置換基である。任意の原子としては、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルカリ金属原子が挙げられ、任意の置換基としては、それぞれ独立して、水酸基、重水酸基、チオール基、第一級〜第四級アミノ基、イミノ基、アゾ基、アゾキシル基、ジアゾ基、アジド基、ヒドラジン基、ニトロ基、ニトロソ基、尿素基、チオ尿素基、シアネート基、チオシアネート基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、硫酸基、スルホニル基、スルホキシド基、リン酸基、ホスホニル基、硼酸基、ボロニル基、ケイ素含有基、ゲルマニウム含有基、ニトリル基、イソニトリル基、ジスルフィド基、置換カルボニル基、ホルミル基、各種エステル基、各種チオエステル基、各種カーボネート基、各種チオカーボネート基、各種アミド基、カルボキシル基、ピリジル基、フェニル基、ビフェニル基、テルフェニル基、ナフチル基、アンスリル基、フェナンスリル基、ペンタセニル基、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数１〜１２のアルコキシ基、炭素数１〜１２のアルカノイル基、炭素数１〜１２のアルカノイロキシ基、炭素数１〜１２のアルキルチオエーテル基、炭素数１〜１２のアルケニル基、炭素数１〜１２のアルキニル基または炭素数１〜１２のフルオロアルキル基等が挙げられる。
カフェ酸及びその誘導体として代表的なフェルラ酸等は、バイオエンジニアリングプラスチック材料として注目されている。これらは、Ｌ−ＤＯＰＡの脱アミノ反応を経て任意の反応経路で製造することができる。
＜４＞ベタレイン色素の製造方法
前述の目的物質の製造方法のさらなる態様として、本発明の変異型チロシナーゼ及びＤ
ＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼを含有する微生物又はその処理物の存在下で、水性媒体中で、原料からベタレイン色素を製造する方法について以下に説明する。
前述の目的物質の製造方法のさらなる態様として、本発明の変異型チロシナーゼ及びＤ
ＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼを含有する微生物又はその処理物の存在下で、水性媒体中で、原料からベタレイン色素を製造する方法について以下に説明する。
ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ（ＤＯＤ）とは、Ｌ−ＤＯＰＡのエクストラジオール開裂を触媒する活性を有する酵素である。この酵素により、原料又は中間体であるチロシンからチロシナーゼによって変換されたＬ−ＤＯＰＡが、４，５−ｓｅｃｏ−ＤＯＰＡに変換され、さらに、それに続く自発的反応を経て、ベタラミン酸へと変換される（図２）。
ＤＯＤを発現する微生物は、例えば特許文献１，２等に記載の方法で作製することができる。
ＤＯＤを発現する微生物は、例えば特許文献１，２等に記載の方法で作製することができる。
（原料及び添加物）
ベタレイン色素の原料としては、＜３＞で述べたＬ−ＤＯＰＡの製造における原料の説明に準ずる。
ベタレイン色素の原料としては、＜３＞で述べたＬ−ＤＯＰＡの製造における原料の説明に準ずる。
また、ベタキサンチンを製造する場合は、ベタキサンチンはベタラミン酸にアミノ酸又はアミンが結合した化合物であるため、チロシン以外の該アミノ酸又は該アミンを上記原料に加えて添加してもよい。
チロシン以外のアミノ酸としては、天然型アミノ酸であっても、非天然型アミノ酸であってもよい。天然型アミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンが挙げられ、これらをチロシン以外のアミノ酸として添加すると、ベタキサンチンとして、それぞれ、アラニン−ベタキサンチン、アルギニン−ベタキサンチン、アスパラギン−ベタキサンチン、アスパラギン酸−ベタキサンチン、システイン−ベタキサンチン、グルタミン−ベタキサンチン、グルタミン酸−ベタキサンチン、グリシン−ベタキサンチン、ヒスチジン−ベタキサンチン、イソロイシン−ベタキサンチン、ロイシン−ベタキサンチン、リシン−ベタキサンチン、メチオニン−ベタキサンチン、フェニルアラニン−ベタキサンチン、プロリン−ベタキサンチン、セリン−ベタキサンチン、トレオニン−ベタキサンチン、トリプトファン−ベタキサンチン、チロシン−ベタキサンチン、バリン−ベタキサンチンが製造される。
チロシン以外のアミノ酸としては、天然型アミノ酸であっても、非天然型アミノ酸であってもよい。天然型アミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンが挙げられ、これらをチロシン以外のアミノ酸として添加すると、ベタキサンチンとして、それぞれ、アラニン−ベタキサンチン、アルギニン−ベタキサンチン、アスパラギン−ベタキサンチン、アスパラギン酸−ベタキサンチン、システイン−ベタキサンチン、グルタミン−ベタキサンチン、グルタミン酸−ベタキサンチン、グリシン−ベタキサンチン、ヒスチジン−ベタキサンチン、イソロイシン−ベタキサンチン、ロイシン−ベタキサンチン、リシン−ベタキサンチン、メチオニン−ベタキサンチン、フェニルアラニン−ベタキサンチン、プロリン−ベタキサンチン、セリン−ベタキサンチン、トレオニン−ベタキサンチン、トリプトファン−ベタキサンチン、チロシン−ベタキサンチン、バリン−ベタキサンチンが製造される。
非天然型アミノ酸としては、例えば、ｍ−チロシン、メトキシフェニルアラニン、メチルシステイン、アリルアラニン、プロパルギルアラニン、アリルグリシン、プロパルギルグリシン、エチルアラニン、メチルアスパラギン酸、メチルシステイン、メチルロイシン、メチルフェニルアラニン、メチルトリプトファン、メチルチロシン、メチルバリン、α−メチル−２−ブロモフェニルアラニン、α−メチル−３−ブロモフェニルアラニン、α−メチル−４−ブロモフェニルアラニン、α−メチル−２−ヨードフェニルアラニン、α−メチル−３−ヨードフェニルアラニン、α−メチル−４−ヨードフェニルアラニン、α−メチル−２−ニトロフェニルアラニン、α−メチル−３−ニトロフェニルアラニン、α−メチル−４−ニトロフェニルアラニン、α−メチル−β−（４−ビスフェニル）アラニン等が挙げられる。これらをチロシン以外のアミノ酸として添加すると、ベタキサンチンとして、それぞれ、ｍ−チロシン−ベタキサンチン、メトキシフェニルアラニン−ベタキサンチン、メチルシステイン−ベタキサンチン、アリルアラニン−ベタキサンチン、プロパルギルアラニン−ベタキサンチン、アリルグリシン−ベタキサンチン、プロパルギルグリシン−ベタキサンチン、エチルアラニン−ベタキサンチン、メチルアスパラギン酸−ベタキサンチン、メチルシステイン−ベタキサンチン、メチルロイシン−ベタキサンチン、メチルフェニルアラニン−ベタキサンチン、メチルトリプトファン−ベタキサンチン、メチルチロシン−ベタキサンチン、メチルバリン−ベタキサンチン、α−メチル−２−ブロモフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−３−ブロモフェニルアラニン−ベタ
キサンチン、α−メチル−４−ブロモフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−２−ヨードフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−３−ヨードフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−４−ヨードフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−２−ニトロフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−３−ニトロフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−４−ニトロフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−β−（４−ビスフェニル）アラニン−ベタキサンチンが製造される。
キサンチン、α−メチル−４−ブロモフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−２−ヨードフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−３−ヨードフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−４−ヨードフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−２−ニトロフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−３−ニトロフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−４−ニトロフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−β−（４−ビスフェニル）アラニン−ベタキサンチンが製造される。
アミンとしては、天然型アミンであっても、非天然型アミンであってもよい。
天然型アミンとしては、例えばメチルアミン、エタノールアミン、ピペリジン、ヒスタミン、ドーパミン、フェネチルアミン、チラミン、３−メトキシチラミン、γ−アミノ酪酸、ノルアドレナリン、セロトニン、ムッシモール、スペルミジン、スペルミン等が挙げられる。これらをアミンとして添加すると、ベタキサンチンとして、それぞれ、メチルアミン−ベタキサンチン、エタノールアミン−ベタキサンチン、ピペリジン−ベタキサンチン、ヒスタミン−ベタキサンチン、ドーパミン−ベタキサンチン、フェネチルアミン−ベタキサンチン、チラミン−ベタキサンチン、３−メトキシチラミン−ベタキサンチン、γ−アミノ酪酸−ベタキサンチン、ノルアドレナリン−ベタキサンチン、セロトニン−ベタキサンチン、ムッシモール−ベタキサンチン、スペルミジン−ベタキサンチン、スペルミン−ベタキサンチンが製造される。
天然型アミンとしては、例えばメチルアミン、エタノールアミン、ピペリジン、ヒスタミン、ドーパミン、フェネチルアミン、チラミン、３−メトキシチラミン、γ−アミノ酪酸、ノルアドレナリン、セロトニン、ムッシモール、スペルミジン、スペルミン等が挙げられる。これらをアミンとして添加すると、ベタキサンチンとして、それぞれ、メチルアミン−ベタキサンチン、エタノールアミン−ベタキサンチン、ピペリジン−ベタキサンチン、ヒスタミン−ベタキサンチン、ドーパミン−ベタキサンチン、フェネチルアミン−ベタキサンチン、チラミン−ベタキサンチン、３−メトキシチラミン−ベタキサンチン、γ−アミノ酪酸−ベタキサンチン、ノルアドレナリン−ベタキサンチン、セロトニン−ベタキサンチン、ムッシモール−ベタキサンチン、スペルミジン−ベタキサンチン、スペルミン−ベタキサンチンが製造される。
非天然型アミンとしては、例えばエチルアミン、ピペラジン、モルホリン、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンエキサミン、ヘキサメチレンジアミン、１，３−ブタジエン−１−アミン、１，３，５−ヘキサトリエン−１−アミン、アニリン、４−ビフェニルアミン、アマンタジン等が挙げられる。これらをアミンとして添加すると、ベタキサンチンとして、それぞれ、エチルアミン−ベタキサンチン、ピペラジン−ベタキサンチン、モルホリン−ベタキサンチン、エチレンジアミン−ベタキサンチン、ジエチレントリアミン−ベタキサンチン、トリエチレンテトラミン−ベタキサンチン、テトラエチレンペンタミン−ベタキサンチン、ペンタエチレンエキサミン−ベタキサンチン、ヘキサメチレンジアミン−ベタキサンチン、１，３−ブタジエン−１−アミン−ベタキサンチン、１，３，５−ヘキサトリエン−１−アミン−ベタキサンチン、アニリン−ベタキサンチン、４−ビフェニルアミン−ベタキサンチン、アマンタジン−ベタキサンチンが製造される。
また、上記原料に加えて、目的のベタレイン色素を生産するために必要な酵素を添加してもよい。例えば、図３の経路でベタニン（ベタシアニン類）を製造する場合は、例えばＬ−ＤＯＰＡオキシダーゼ及びｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ ５−Ｏ−グルコシルトランスフェ
ラーゼを添加すればよい。また、図４の経路でベタニン（ベタシアニン類）を製造する場合は、Ｌ−ＤＯＰＡオキシダーゼ及びベタニジン ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼを添加すればよい。
ラーゼを添加すればよい。また、図４の経路でベタニン（ベタシアニン類）を製造する場合は、Ｌ−ＤＯＰＡオキシダーゼ及びベタニジン ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼを添加すればよい。
（培養工程）
培養工程は、本発明の変異型チロシナーゼ及びＤＯＤを含有する微生物を水性媒体中で培養する工程である。本工程は、前記微生物を増殖させたり、その状態を調えたりするために行なうものであるため、通常は、上述した原料のうち、前記微生物の生育に必要な原料のみを、具体的には、糖質原料（好ましくはグルコース）のみを培地に加える。
ただし、本発明の変異型チロシナーゼ及びＤＯＤなどのベタレイン色素生産に必要な酵素を何らかの誘導性プロモーター下に配置している場合は、上記プロモーターの種類により適切に選択される誘導剤を培養工程途中に添加する必要がある。
なお、本発明の微生物が充分な量、存在する場合等は、本工程は省略して、次の変換工程を行なうことができる。
培養工程は、本発明の変異型チロシナーゼ及びＤＯＤを含有する微生物を水性媒体中で培養する工程である。本工程は、前記微生物を増殖させたり、その状態を調えたりするために行なうものであるため、通常は、上述した原料のうち、前記微生物の生育に必要な原料のみを、具体的には、糖質原料（好ましくはグルコース）のみを培地に加える。
ただし、本発明の変異型チロシナーゼ及びＤＯＤなどのベタレイン色素生産に必要な酵素を何らかの誘導性プロモーター下に配置している場合は、上記プロモーターの種類により適切に選択される誘導剤を培養工程途中に添加する必要がある。
なお、本発明の微生物が充分な量、存在する場合等は、本工程は省略して、次の変換工程を行なうことができる。
本工程で用いる水性媒体（培地）については、＜３＞で述べたＬ−ＤＯＰＡの製造における培地の説明に準ずる。
また、培養条件は、微生物の生育が可能であれば特に制限はなく、通常、培養温度１０℃〜４５℃で１２時間〜９６時間実施することができる。微生物が、酵母である場合、水性媒体の温度を、好ましくは１６℃以上、より好ましくは２０℃以上、また、好ましくは３０℃以下、より好ましくは２５℃以下とする。
また、培養条件は、微生物の生育が可能であれば特に制限はなく、通常、培養温度１０℃〜４５℃で１２時間〜９６時間実施することができる。微生物が、酵母である場合、水性媒体の温度を、好ましくは１６℃以上、より好ましくは２０℃以上、また、好ましくは３０℃以下、より好ましくは２５℃以下とする。
（変換工程）
変換工程は、本発明の変異型チロシナーゼ及びＤＯＤを含有する微生物またはその処理物の存在下、水性媒体中で原料をベタレイン色素へと変換する工程である。本工程は、原料をベタレイン色素へと変換することを目的とするものであり、原料としては、上述のチロシン及び／又は糖質原料を用いればよい。
変換工程は、本発明の変異型チロシナーゼ及びＤＯＤを含有する微生物またはその処理物の存在下、水性媒体中で原料をベタレイン色素へと変換する工程である。本工程は、原料をベタレイン色素へと変換することを目的とするものであり、原料としては、上述のチロシン及び／又は糖質原料を用いればよい。
また、上述の培養工程で培養された微生物の菌体を、休止菌体として、本工程に用いることも好ましい。微生物の菌体を休止菌体とする方法としては、培養工程で得られた培養液から遠心操作等による菌体を回収する方法や、水、または、微生物の生育に必要な炭素源、および窒素源を含有しないバッファー等により洗浄することにより、菌体を回収する方法等が挙げられる。
また、前記微生物は処理物の態様で本工程に供してもよく、処理物については＜２＞で述べた説明に準ずる。
また、前記微生物は処理物の態様で本工程に供してもよく、処理物については＜２＞で述べた説明に準ずる。
本工程で用いる水性媒体（培地）に特に制限はなく、用いる微生物の種類に応じて適宜設定することができ、前記培養工程に記載したものと同様のものを用いることができる。
好ましくは、水性媒体は、アスコルビン酸、ＵＤＰ−グルコース、銅および鉄からなる群から選ばれる少なくとも一種を含み、より好ましくは、アスコルビン酸、ＵＤＰ−グルコース、銅、及び鉄を含む。
好ましくは、水性媒体は、アスコルビン酸、ＵＤＰ−グルコース、銅および鉄からなる群から選ばれる少なくとも一種を含み、より好ましくは、アスコルビン酸、ＵＤＰ−グルコース、銅、及び鉄を含む。
また、反応は、本発明の変異型チロシナーゼ及びＤＯＤを含有する微生物の生育が可能な条件、またはベタレイン色素生産に関与する酵素が完全に酵素活性を失わない条件であれば特に制限はなく、通常、反応温度１０℃〜４５℃で１２時間〜９６時間実施する。本発明の微生物が、酵母である場合、水性媒体の温度を、好ましくは１６℃以上、より好ましくは２０℃以上、また、好ましくは３０℃以下、より好ましくは２５℃以下とするとベタレイン色素の生産効率が向上する傾向にあり、好ましい。
なお、本製造方法に用いる微生物が、本発明の変異型チロシナーゼ及びＤＯＤを含めベタレイン色素を合成する代謝経路をすべて有するものである場合は、上述の培養工程と特に区別することなく連続して本工程を実施してもよい。
本製造方法に用いる微生物は、本発明の変異型チロシナーゼ及びＤＯＤの他に、目的とするベタレイン色素の合成に関与する酵素をも含有することが好ましい。
そのような酵素としては、例えば、Ｌ−ＤＯＰＡオキシダーゼ、フェノール性水酸基に糖を付加する酵素、ｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ、ベ
タニジン ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ、ベタニジン ６−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ等が挙げられる。これらの酵素を発現する微生物は、例えば特許文献１，２等に記載の方法で作製することができる。
そのような酵素としては、例えば、Ｌ−ＤＯＰＡオキシダーゼ、フェノール性水酸基に糖を付加する酵素、ｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ、ベ
タニジン ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ、ベタニジン ６−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ等が挙げられる。これらの酵素を発現する微生物は、例えば特許文献１，２等に記載の方法で作製することができる。
Ｌ−ＤＯＰＡオキシダーゼは、Ｌ−ＤＯＰＡを酸化しｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡへと変換する活性を有する酵素である。本製造方法に用いる微生物が、さらにＬ−ＤＯＰＡオキシダーゼ活性を有すると、図３および図４の代謝経路におけるｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡの生成が促進されるため好ましい。
フェノール性水酸基に糖を付加する酵素とは、ｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡやベタニジンが有するｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ骨格の５位や６位に存在するフェノール性水酸基に糖を付加することができる活性を有する酵素である。本製造方法に用いる微生物が、さらにフェノール性水酸基に糖を付加する酵素活性を有していると、図３および図４の代謝経路におけるｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ グルコシドやベタシアニンの生成が促進されるため好ましい。
本製造方法に用いる微生物が、さらにｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ ５−Ｏ−グルコシルトラ
ンスフェラーゼ活性を有する場合は、図３の代謝経路によるベタシアニン類の製造に好適である。
また、本製造方法に用いる微生物が、さらにベタニジン ５−Ｏ−グルコシルトランス
フェラーゼ活性を有する場合は、図４の代謝経路によりベタシアニン類の製造に好適である。
また、本製造方法に用いる微生物が、さらにベタニジン ６−Ｏ−グルコシルトランス
フェラーゼ活性を有する場合は、図４に準じる代謝経路によりｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡの６位に糖が付加されたベタシアニン類の製造に好適である。
ンスフェラーゼ活性を有する場合は、図３の代謝経路によるベタシアニン類の製造に好適である。
また、本製造方法に用いる微生物が、さらにベタニジン ５−Ｏ−グルコシルトランス
フェラーゼ活性を有する場合は、図４の代謝経路によりベタシアニン類の製造に好適である。
また、本製造方法に用いる微生物が、さらにベタニジン ６−Ｏ−グルコシルトランス
フェラーゼ活性を有する場合は、図４に準じる代謝経路によりｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡの６位に糖が付加されたベタシアニン類の製造に好適である。
（回収工程）
上述の変換工程の後に、必要に応じて、水性媒体からベタレイン色素を回収する工程を行うことが好ましい。
回収は周知の方法で行うことができ、例えば、有機溶媒を用いる抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィーなどにより、水性媒体（培地）または微生物内からベタレイン色素を回収することができる。さらに、必要に応じて、定法により精製してもよい。
上述の変換工程の後に、必要に応じて、水性媒体からベタレイン色素を回収する工程を行うことが好ましい。
回収は周知の方法で行うことができ、例えば、有機溶媒を用いる抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィーなどにより、水性媒体（培地）または微生物内からベタレイン色素を回収することができる。さらに、必要に応じて、定法により精製してもよい。
本製造方法で製造され得るベタレイン色素について、以下に説明する。
ベタレイン色素は、ベタキサンチンとベタシアニン類に大別することができる。
ベタキサンチンは、ベタラミン酸に、アミノ酸またはアミンがイミン結合した化合物群の総称であり、その構造は、以下の式（２）または式（３）として表される。
ベタレイン色素は、ベタキサンチンとベタシアニン類に大別することができる。
ベタキサンチンは、ベタラミン酸に、アミノ酸またはアミンがイミン結合した化合物群の総称であり、その構造は、以下の式（２）または式（３）として表される。
式（２）、（３）においてＲ１、Ｒ２及びＲ３は、水素原子、炭素数１〜４０の直鎖または分岐鎖または環状の飽和もしくは不飽和炭化水素基からなる群から選択される１種である。ただし該炭化水素基の水素原子の一部または全部は、ハロゲン原子、アシル基、アミド基、アミノ基、アルコキシ基、アルデヒド基、イミダゾール基、インドール基、オキソ基、カルボキシル基、グアニジノ基、シアノ基、スルホ基、チオール基、ニトロ基、ヒドロキシル基およびフェニル基からなる群から選択される少なくとも一種で置換されていてもよく、該炭化水素基は、イミニウムの窒素を含有する形で環を形成していてもよい。さらに該イミダゾール基、該インドール基および該フェニル基の芳香環の一部または全部は、上記と同様の置換基群から選択される少なくとも一種にて置換されていてもよい。また、該炭化水素基の炭素原子の一部は、硫黄原子、酸素原子、窒素原子、リン原子から選択される少なくとも一種で置換されていてもよい。
例えば、Ｒ１が水素原子、Ｒ２が炭素数３の直鎖炭化水素基であり、イミニウムの窒素を含有する形で環を形成する化合物は、プロリン−ベタキサンチンである。また、Ｒ１が水素原子、Ｒ２が炭素数３の直鎖炭化水素基であり、該炭化水素基の末端の水素原子の一つがグアニジノ基で置換された化合物は、アルギニン−ベタキサンチンである。Ｒ１が水素原子、Ｒ２が炭素数１の炭化水素基であり、該炭化水素基の水素原子の一つがイミダゾール基で置換された化合物は、ヒスチジン−ベタキサンチンである。Ｒ１が水素原子、Ｒ２が炭素数４の直鎖炭化水素基であり、該炭化水素基の末端から２番目の炭素原子が硫黄原子に置換された化合物は、メチオニン−ベタキサンチンである。Ｒ１が水素原子、Ｒ２が炭素数１の炭化水素基であり、該炭化水素基の水素原子の一つがインドール基で置換された化合物は、トリプトファン−ベタキサンチンである。Ｒ１が水素原子、Ｒ２が炭素数１の炭化水素基であり、該炭化水素基の水素原子の一つがフェニル基で置換され、さらに該フェニル基のパラ位の水素原子がヒドロキシル基で置換された化合物は、チロシン−ベタキサンチンである。
また、本製造方法において原料として、任意の非天然型アミノ酸を用いれば、非天然型のアミノ酸が付加されたベタキサンチンをも製造することができ、例えば、以下の式（４）で表されるものが挙げられる。
式（４）において、Ｒは、炭素数１〜４０の直鎖または分岐鎖または環状の飽和もしくは不飽和炭化水素基からなる群から選択される１種である。ただし該炭化水素基の水素原子の一部または全部は、ハロゲン原子、アシル基、アミド基、アミノ基、アルコキシ基、アルデヒド基、イミダゾール基、インドール基、オキソ基、カルボキシル基、グアニジノ基、シアノ基、スルホ基、チオール基、ニトロ基、ヒドロキシル基およびフェニル基からなる群から選択される少なくとも一種で置換されていてもよく、該炭化水素基は、イミニウムの窒素を含有する形で環を形成していてもよい。さらに、該イミダゾール基、該インドール基および該フェニル基の芳香環の一部または全部は、上記と同様の置換基群から選択される少なくとも一種にて置換されていてもよい。さらに該炭化水素基の炭素原子の一部は、硫黄原子、酸素原子、窒素原子、リン原子から選択される少なくとも一種で置換されていてもよい。
式（４）において、Ｒが、直鎖または分岐鎖のアルキル基である場合、その炭素数が１〜１０であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。この場合、Ｒが、エチル基、プロピル基、およびイソブチル基からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが特に好ましい。
式（４）において、Ｒが、直鎖または分岐鎖のアルケニル基である場合、その炭素数が１〜１０であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。この場合、Ｒが、アリル基、１−ブテニル基、および２−ブテニル基からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが特に好ましい。
式（４）において、Ｒが、直鎖または分岐鎖のアルケニル基である場合、その炭素数が１〜１０であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。この場合、Ｒが、アリル基、１−ブテニル基、および２−ブテニル基からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが特に好ましい。
式（４）において、Ｒが、直鎖または分岐鎖のアルキニル基である場合、その炭素数が１〜１０であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。この場合、Ｒが、エチニル基、１−ブチニル基、および２−ブチニル基からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが特に好ましい。
式（４）において、Ｒが、直鎖または分岐鎖のアリール基である場合、その炭素数が１〜２０であることが好ましく、１〜１０であることがより好ましい。この場合、Ｒが、ベンジル基、トリル基、およびフェネシル基からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが特に好ましい。
式（４）において、Ｒが、直鎖または分岐鎖のアリール基である場合、その炭素数が１〜２０であることが好ましく、１〜１０であることがより好ましい。この場合、Ｒが、ベンジル基、トリル基、およびフェネシル基からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが特に好ましい。
前記式（４）で表される化合物は、強力な抗酸化活性を有するという性質を生かし、抗酸化剤等に好適に用いることができる。
一方、ベタシアニンとは、ベタニジンのフェノール性水酸基に糖類がグリコシド結合した化合物群の総称であり、その構造は以下の式（５）で表される。
一方、ベタシアニンとは、ベタニジンのフェノール性水酸基に糖類がグリコシド結合した化合物群の総称であり、その構造は以下の式（５）で表される。
式（５）において、Ｒ４およびＲ５のうちどちらかは水素原子であり、もう一方は式（６）で表される糖鎖である。
式（６）においてＲ６は、水素原子、炭素数１〜２０の直鎖または分岐鎖の飽和もしくは不飽和炭化水素基からなる群から選択される１種である。ただし該炭化水素基の水素原子の一部または全部は、ハロゲン原子、アシル基、アミド基、アミノ基、アルコキシ基、アルデヒド基、イミダゾール基、インドール基、オキソ基、カルボキシル基、グアニジノ基、シアノ基、スルホ基、チオール基、ニトロ基、ヒドロキシル基およびフェニル基からなる群から選択される少なくとも一種で置換されていてもよい。また、該イミダゾール基、該インドール基および該フェニル基の芳香環の一部または全部は、上記と同様の置換基群から選択される少なくとも一種にて置換されていてもよい。さらに該炭化水素基の炭素原子の一部は、硫黄原子、酸素原子、窒素原子、リン原子から選択される少なくとも一種で置換されていてもよい。
式（６）においてＲ７は、水素原子またはグリコシル基からなる群から選択される１種である。ただし、該グリコシル基の水素原子の一部または全部は、炭素数１〜２０の直鎖または分岐鎖の飽和もしくは不飽和炭化水素基からなる群から選択される１種で置換されていてもよい。ただし該炭化水素基の水素原子の一部または全部は、ハロゲン原子、アシル基、アミド基、アミノ基、アルコキシ基、アルデヒド基、イミダゾール基、インドール基、オキソ基、カルボキシル基、グアニジノ基、シアノ基、スルホ基、チオール基、ニトロ基、ヒドロキシル基およびフェニル基からなる群から選択される少なくとも一種で置換されていてもよい。また、該イミダゾール基、該インドール基および該フェニル基の芳香環の一部または全部は、上記と同様の置換基群から選択される少なくとも一種にて置換されていてもよい。さらに該炭化水素基の炭素原子の一部は、硫黄原子、酸素原子、窒素原子、リン原子から選択される少なくとも一種で置換されていてもよい。
例えば、Ｒ５が水素原子、Ｒ４がＲ６、Ｒ７が水素であるグルコース鎖である場合は、ベタニンである。Ｒ４が水素原子、Ｒ５がＲ６、Ｒ７が水素であるグルコース鎖である場
合は、ゴンフレニンＩである。
さらに、本明細書においては、ベタシアニン類は上記のベタシアニンの類縁体も含む概念であり、例えば式（６）で、２位のカルボキシル基が脱離した式（７）で表される構造の化合物や、１４、１５位の炭素間が不飽和化された式（８）で表される構造の化合物などもベタシアニン類である。ここでＲ４、Ｒ５の定義は上述と同様である。
合は、ゴンフレニンＩである。
さらに、本明細書においては、ベタシアニン類は上記のベタシアニンの類縁体も含む概念であり、例えば式（６）で、２位のカルボキシル基が脱離した式（７）で表される構造の化合物や、１４、１５位の炭素間が不飽和化された式（８）で表される構造の化合物などもベタシアニン類である。ここでＲ４、Ｒ５の定義は上述と同様である。
さらに、本製造方法において付加させる糖の種類を変えることにより、非天然型のベタシアニン類をも製造することもできる。例えば、糖供与体として、ＵＤＰ−ガラクトースを用いれば、ベタニジンにガラクトースが付加した式（９）に表される非天然型ベタシアニン類が製造できる。同様に、糖供与体として、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＵＤＰ−イズロン酸、ＵＤＰ−キシロース、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース等を用いれば、ＵＤＰやＧＤＰに結合した糖がベタニジンに付加した非天然型ベタシアニン類を製造することができる。これら化合物は強力な抗酸化活性を有することから、抗酸化剤等に好適に利用することができる。
以下、具体的な実験例をあげて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の態様にのみ限定されない。
＜実施例１＞チロシナーゼ遺伝子の変異ライブラリーの構築
エラー易発性ＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ；以降「ｅｐＰＣＲ」と記す）
は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ（登録商標） ＰＣＲ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕ
ｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて、Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ（登録商標） ＰＣＲ Ｒａｎ
ｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌに掲載のプロトコルに基づいて実施した。
ｅｐＰＣＲ条件は、以下の通り実施した。
５μＬ １０×ＴＩＴＡＮＩＵＭＴＭ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ
３μＬ ８ｍＭ ＭｎＳＯ４
１μＬ ２ｍＭ ｄＧＴＰ
１μＬ ５０×ｄＮＴＰ Ｍｉｘ
１μＬ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ
１μＬ ＢＭＴＹＲ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１ （１ｎｇ／μＬ）
１μＬ ＴＩＴＡＮＩＵＭＴＭ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
３７μＬ Ｈ２Ｏ
エラー易発性ＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ；以降「ｅｐＰＣＲ」と記す）
は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ（登録商標） ＰＣＲ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕ
ｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて、Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ（登録商標） ＰＣＲ Ｒａｎ
ｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌに掲載のプロトコルに基づいて実施した。
ｅｐＰＣＲ条件は、以下の通り実施した。
５μＬ １０×ＴＩＴＡＮＩＵＭＴＭ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ
３μＬ ８ｍＭ ＭｎＳＯ４
１μＬ ２ｍＭ ｄＧＴＰ
１μＬ ５０×ｄＮＴＰ Ｍｉｘ
１μＬ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ
１μＬ ＢＭＴＹＲ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１ （１ｎｇ／μＬ）
１μＬ ＴＩＴＡＮＩＵＭＴＭ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
３７μＬ Ｈ２Ｏ
上記ＢＭＴＹＲ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１は、特開２０１５−１９２６６８号公報に記載のプラスミドＤＮＡであり、上記Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘは、２つのｅｐＰＣＲ用プライマー（配列番号５及び６）の混合液であり、Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ中のｅｐＰＣＲ用Ｆｗプライマー、およびｅｐＰＣＲ用Ｒｖプライマーの濃度はそれぞれ１０μＭである。
また、サイクルのパラメーターは以下の通りで実施した。
９８℃で３０秒、次いで、
９８℃で１０秒、５２℃で３０秒、６８℃で１分を３０サイクル。
また、サイクルのパラメーターは以下の通りで実施した。
９８℃で３０秒、次いで、
９８℃で１０秒、５２℃で３０秒、６８℃で１分を３０サイクル。
ｅｐＰＣＲの増幅産物の確認は、１％アガロース（アガロース−ＲＥ：ナカライテスク株式会社）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的断片の回収はＷｉｚａｒｄ（登録商標） ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ＵＰ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて行った。精製して得られたチロシナーゼ遺伝子（ＢＭＴＹＲ）のｅｐＰＣＲ産物を、制限酵素ＢｇｌII及びＸｈｏＩにて消化した。次いで、消化したｅｐＰＣＲ産物と、前記Ｃｌｅａｎ−ＵＰ Ｓｙｓｔｅｍで精製し、同一の酵素で消化したベクターｐＥＴＤｕｅｔ−１とをライゲーション反応で連結した
ライゲーションは、以下の条件で１６℃で一晩行った。
１．８μＬ ｅｐＰＣＲ産物（ＢｇｌII／ＸｈｏＩ処理済）
０．２μＬ ｐＥＴＤｕｅｔ（ＢｇｌII／ＸｈｏＩ処理済）
２μＬ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）
１．８μＬ ｅｐＰＣＲ産物（ＢｇｌII／ＸｈｏＩ処理済）
０．２μＬ ｐＥＴＤｕｅｔ（ＢｇｌII／ＸｈｏＩ処理済）
２μＬ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）
連結したＤＮＡ４μＬに対し、ケミカルコンピテント（Ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）な大腸菌ＤＨ５α５０μＬを混合し、ＤＨ５αを形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した。この培地上でコロニーを形成したクロ―ンを全てまとめて、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ
ＨＰ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出し、チロシナーゼ遺伝子の変異ＤＮＡライブラリーを得た。
ＨＰ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出し、チロシナーゼ遺伝子の変異ＤＮＡライブラリーを得た。
＜実施例２＞ベタキサンチン生産性評価による改良・変異型チロシナーゼの選抜
（１）変異型チロシナーゼ及びＤＯＤ共発現大腸菌ライブラリーの作製
実施例１で得られたチロシナーゼ遺伝子の変異ＤＮＡライブラリーと、特開２０１５−１９２６６８号公報に記載のプラスミドＤＮＡ ＭｊＤＯＤ／ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１とを混合したものを用いて、ケミカルコンピテント（Ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）な大腸菌（ＢＬ２１ ＳｔａｒＴＭ （ＤＥ３）株）を形質転換した。得られた組換え大腸菌を１００μｇ／ｍＬ アンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、コロニーを形成させた。
（１）変異型チロシナーゼ及びＤＯＤ共発現大腸菌ライブラリーの作製
実施例１で得られたチロシナーゼ遺伝子の変異ＤＮＡライブラリーと、特開２０１５−１９２６６８号公報に記載のプラスミドＤＮＡ ＭｊＤＯＤ／ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１とを混合したものを用いて、ケミカルコンピテント（Ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）な大腸菌（ＢＬ２１ ＳｔａｒＴＭ （ＤＥ３）株）を形質転換した。得られた組換え大腸菌を１００μｇ／ｍＬ アンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、コロニーを形成させた。
（２）一次スクリーニング
上記のコロニーを、コロニーピッカー（マイクロテック・ニチオン製 ＰＭ−２）を用
いて１００μｇ／ｍＬ アンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＬＢ寒天培地上に植菌し、３７℃で１８時間インキュベートすることでレプリカを作製した。９６ディープウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製 ＡＢ−０９３２）に本培養培地を５００μＬずつ添加し、上記レプリカから爪楊枝で各ウェルに植菌し、マキシマイザー（ＴＡＩＴＥＣ社製 Ｍ・ＢＲ−４２０ＦＬ）にて３０℃、６時間、１４００ｒｐｍで培養し、その後、２０℃、１８時間、１４００ｒｐｍで培養した。
また、上記ウェルの１つには特開２０１５−１９２６６８号公報に記載の組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤをコントロール条件として植菌した。
上記のコロニーを、コロニーピッカー（マイクロテック・ニチオン製 ＰＭ−２）を用
いて１００μｇ／ｍＬ アンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＬＢ寒天培地上に植菌し、３７℃で１８時間インキュベートすることでレプリカを作製した。９６ディープウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製 ＡＢ−０９３２）に本培養培地を５００μＬずつ添加し、上記レプリカから爪楊枝で各ウェルに植菌し、マキシマイザー（ＴＡＩＴＥＣ社製 Ｍ・ＢＲ−４２０ＦＬ）にて３０℃、６時間、１４００ｒｐｍで培養し、その後、２０℃、１８時間、１４００ｒｐｍで培養した。
また、上記ウェルの１つには特開２０１５−１９２６６８号公報に記載の組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤをコントロール条件として植菌した。
なお、上記本培養培地は、５×Ｍ９ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｓａｌｔｓ ２００ｍＬ、１Ｍ
ＣａＣｌ２ １００μＬ、１Ｍ ＭｇＳＯ４ ２ｍＬ、４０ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ ７５ｍＬ、１００ｇ／Ｌ Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ １００ｍＬ、１０ｇ／Ｌ チアミン塩酸塩 ２ｍＬ、５０ｍＭ ＦｅＳＯ４ １ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ ＣｕＳＯ４ １ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ １ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ １ｍＬ、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ＥｘｐｒｅｓｓＴＭＡｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ１ ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１ ２０ｍＬ、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２ ５０ｍＬ、およびＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ３ １ｍＬを、全量１Ｌになるように滅菌水に溶解したものを用いた。
ＣａＣｌ２ １００μＬ、１Ｍ ＭｇＳＯ４ ２ｍＬ、４０ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ ７５ｍＬ、１００ｇ／Ｌ Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ １００ｍＬ、１０ｇ／Ｌ チアミン塩酸塩 ２ｍＬ、５０ｍＭ ＦｅＳＯ４ １ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ ＣｕＳＯ４ １ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ １ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ １ｍＬ、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ＥｘｐｒｅｓｓＴＭＡｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ１ ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１ ２０ｍＬ、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２ ５０ｍＬ、およびＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ３ １ｍＬを、全量１Ｌになるように滅菌水に溶解したものを用いた。
上記培養の終了後、基質とアスコルビン酸との混合液（チロシン １６４．７ｍｇ、１Ｍ アスコルビン酸 ９．１ｍＬを、全量１００ｍＬになるように滅菌水に溶解したもの）を各ウェルに５０μＬずつ添加し、２０℃、２４時間、１４００ｒｐｍで反応させた。
上記反応後、反応液が入った９６ディープウェルプレートを室温、１０９０×ｇで遠心
分離を実施し、９６ウェルプレート（ＴＰＰ社製 ＴＩＳＳＵＥ ＣＵＬＴＵＲＥ ＴＥＳＴ ＰＬＡＴＥ ９６Ｆ）に上清を回収し、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社製 ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標） Ｐａｒａｄｉｇｍ（登録商標））を用いて、
波長４７０ｎｍのＵＶ吸収を測定した。測定で得られた各ウェルの吸光度のうち、コントロール条件のＥ．ｃｏｌｉ／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤのそれより高くなった株に関しては、以下に続く二次スクリーニング評価を実施した。
上記反応後、反応液が入った９６ディープウェルプレートを室温、１０９０×ｇで遠心
分離を実施し、９６ウェルプレート（ＴＰＰ社製 ＴＩＳＳＵＥ ＣＵＬＴＵＲＥ ＴＥＳＴ ＰＬＡＴＥ ９６Ｆ）に上清を回収し、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社製 ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標） Ｐａｒａｄｉｇｍ（登録商標））を用いて、
波長４７０ｎｍのＵＶ吸収を測定した。測定で得られた各ウェルの吸光度のうち、コントロール条件のＥ．ｃｏｌｉ／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤのそれより高くなった株に関しては、以下に続く二次スクリーニング評価を実施した。
（３）二次スクリーニング
（前培養工程）
上記一次スクリーニングで選抜した株に関して、同スクリーニングで作製したレプリカを１白金耳、前培養培地 ２ｍＬに植菌し、バイオシェーカー（ＴＡＩＴＥＣ社製 Ｇ・
ＢＲ−２００）で培養温度３０℃、１８０ｒｐｍで１８時間培養した。
なお、上記前培養培地は、５×Ｍ９ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｓａｌｔｓ ２００ｍＬ、１Ｍ
ＣａＣｌ２ １００μＬ、１Ｍ ＭｇＳＯ４ ２ｍＬ、１００ｇ／Ｌ Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ １００ｍＬ、１Ｍ Ｇｌｕｃｏｓｅ ２２ｍＬ、１０ｇ／Ｌ チアミン塩酸塩 ２ｍＬ、５０ｍＭ ＦｅＳＯ４ １ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ ＣｕＳＯ４ １ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ １ｍＬ、及び１００ｍｇ／ｍＬ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ １ｍＬを、全量１Ｌになるように滅菌水に溶解したものを用いた。
（前培養工程）
上記一次スクリーニングで選抜した株に関して、同スクリーニングで作製したレプリカを１白金耳、前培養培地 ２ｍＬに植菌し、バイオシェーカー（ＴＡＩＴＥＣ社製 Ｇ・
ＢＲ−２００）で培養温度３０℃、１８０ｒｐｍで１８時間培養した。
なお、上記前培養培地は、５×Ｍ９ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｓａｌｔｓ ２００ｍＬ、１Ｍ
ＣａＣｌ２ １００μＬ、１Ｍ ＭｇＳＯ４ ２ｍＬ、１００ｇ／Ｌ Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ １００ｍＬ、１Ｍ Ｇｌｕｃｏｓｅ ２２ｍＬ、１０ｇ／Ｌ チアミン塩酸塩 ２ｍＬ、５０ｍＭ ＦｅＳＯ４ １ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ ＣｕＳＯ４ １ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ １ｍＬ、及び１００ｍｇ／ｍＬ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ １ｍＬを、全量１Ｌになるように滅菌水に溶解したものを用いた。
（本培養工程）
上記で得られた前培養液を、前記本培養培地２０ｍＬに初期ＯＤ６００ｎｍの値が０．３５になるように植菌し、バイオシェーカー（ＴＡＩＴＥＣ社製 Ｇ・ＢＲ−２００）で培養温度２０℃、１８０ｒｐｍで２４時間培養することで、タンパク質の発現を誘導した。
上記で得られた前培養液を、前記本培養培地２０ｍＬに初期ＯＤ６００ｎｍの値が０．３５になるように植菌し、バイオシェーカー（ＴＡＩＴＥＣ社製 Ｇ・ＢＲ−２００）で培養温度２０℃、１８０ｒｐｍで２４時間培養することで、タンパク質の発現を誘導した。
（変換工程）
上記で得られた本培養液に、前記基質、アスコルビン酸混合液を２ｍＬ添加することで、ベタキサンチンの生産反応を開始し、バイオシェーカー（ＴＡＩＴＥＣ社製 Ｇ・ＢＲ−２００）で反応温度２０℃、１８０ｒｐｍで２４時間培養して、ベタキサンチンを生産させた。
上記で得られた本培養液に、前記基質、アスコルビン酸混合液を２ｍＬ添加することで、ベタキサンチンの生産反応を開始し、バイオシェーカー（ＴＡＩＴＥＣ社製 Ｇ・ＢＲ−２００）で反応温度２０℃、１８０ｒｐｍで２４時間培養して、ベタキサンチンを生産させた。
（吸光度測定）
上記で得られた反応液を１ｍＬ回収し、さらに遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間）して得られた上清を９６ウェルプレート（ＴＰＰ社製 ＴＩＳＳＵＥ ＣＵＬＴＵＲＥ ＴＥＳＴ ＰＬＡＴＥ ９６Ｆ）に回収し、プレートリーダーを用いて、波長４７０ｎｍのＵＶ吸収を測定した。測定で得られた各ウェルの吸光値のうち、コントロール条件のＥ．ｃｏｌｉ／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤの吸光値を１とした場合より吸光値が高かった試験区を表１に示した。
上記で得られた反応液を１ｍＬ回収し、さらに遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間）して得られた上清を９６ウェルプレート（ＴＰＰ社製 ＴＩＳＳＵＥ ＣＵＬＴＵＲＥ ＴＥＳＴ ＰＬＡＴＥ ９６Ｆ）に回収し、プレートリーダーを用いて、波長４７０ｎｍのＵＶ吸収を測定した。測定で得られた各ウェルの吸光値のうち、コントロール条件のＥ．ｃｏｌｉ／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤの吸光値を１とした場合より吸光値が高かった試験区を表１に示した。
（ＤＮＡ配列解析）
上記で得られた試験区で用いられた組換え大腸菌１〜２１に関して、各大腸菌が保有する変異型チロシナーゼのＤＮＡ配列を確認するために、各大腸菌を１００μｇ／ｍＬ アンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養し、ＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ ＨＰ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミド抽出を行い、３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いたシーケンス反応により変異型チロシナーゼのＤＮＡ配列を確認した。その結果、組換え大腸菌１〜２１が保有する変異型チロシナーゼは、表２に示すアミノ酸変異が導入されていることがわかった。
上記で得られた試験区で用いられた組換え大腸菌１〜２１に関して、各大腸菌が保有する変異型チロシナーゼのＤＮＡ配列を確認するために、各大腸菌を１００μｇ／ｍＬ アンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養し、ＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ ＨＰ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミド抽出を行い、３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いたシーケンス反応により変異型チロシナーゼのＤＮＡ配列を確認した。その結果、組換え大腸菌１〜２１が保有する変異型チロシナーゼは、表２に示すアミノ酸変異が導入されていることがわかった。
＜実施例３＞変異型チロシナーゼを発現させた大腸菌によるＬ−ＤＯＰＡ生産
（１）変異型チロシナーゼを発現するＬ−ＤＯＰＡ生産株の作製
実施例２で得られた変異型チロシナーゼをコードするＤＮＡを含むｐＥＴＤｕｅｔ−１プラスミドをケミカルコンピテント（Ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）な大腸菌ＢＬ２１ ｓｔａｒＴＭ（ＤＥ３）でそれぞれ形質転換し、得られた組換え大腸菌を１００μｇ／ｍＬ アンピシリンを含むＬＢ寒天培地でコロニーを形成させることにより、該変異型チロシナーゼをコードするＤＮＡを含むｐＥＴＤｕｅｔ−１プラスミドを保持した組換え大腸菌（後述の１３種類）を作製した。
（１）変異型チロシナーゼを発現するＬ−ＤＯＰＡ生産株の作製
実施例２で得られた変異型チロシナーゼをコードするＤＮＡを含むｐＥＴＤｕｅｔ−１プラスミドをケミカルコンピテント（Ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）な大腸菌ＢＬ２１ ｓｔａｒＴＭ（ＤＥ３）でそれぞれ形質転換し、得られた組換え大腸菌を１００μｇ／ｍＬ アンピシリンを含むＬＢ寒天培地でコロニーを形成させることにより、該変異型チロシナーゼをコードするＤＮＡを含むｐＥＴＤｕｅｔ−１プラスミドを保持した組換え大腸菌（後述の１３種類）を作製した。
（２）Ｌ−ＤＯＰＡ生産試験
（前培養工程）
上記の組換え大腸菌をそれぞれ前培養培地２ｍＬに植菌し、バイオシェーカー（ＴＡＩＴＥＣ社製 Ｇ・ＢＲ−２００）で培養温度３２℃、１８０ｒｐｍで１８時間培養した。
なお、上記全培養培地は、５×Ｍ９ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｓａｌｔｓ ２００ｍＬ、１Ｍ
ＣａＣｌ２ １００μＬ、１Ｍ ＭｇＳＯ４ ２ｍＬ、１００ｇ／Ｌ Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ １００ｍＬ、１Ｍ Ｇｌｕｃｏｓｅ ２２ｍＬ、１０ｇ／Ｌ チアミン塩酸塩 ２ｍＬ、５０ｍＭ ＦｅＳＯ４ １ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ ＣｕＳＯ４ １ｍＬ、および１００ｍｇ／ｍＬ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ １ｍＬを、全量１Ｌになるように滅菌水に溶解したものを用いた。
（前培養工程）
上記の組換え大腸菌をそれぞれ前培養培地２ｍＬに植菌し、バイオシェーカー（ＴＡＩＴＥＣ社製 Ｇ・ＢＲ−２００）で培養温度３２℃、１８０ｒｐｍで１８時間培養した。
なお、上記全培養培地は、５×Ｍ９ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｓａｌｔｓ ２００ｍＬ、１Ｍ
ＣａＣｌ２ １００μＬ、１Ｍ ＭｇＳＯ４ ２ｍＬ、１００ｇ／Ｌ Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ １００ｍＬ、１Ｍ Ｇｌｕｃｏｓｅ ２２ｍＬ、１０ｇ／Ｌ チアミン塩酸塩 ２ｍＬ、５０ｍＭ ＦｅＳＯ４ １ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ ＣｕＳＯ４ １ｍＬ、および１００ｍｇ／ｍＬ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ １ｍＬを、全量１Ｌになるように滅菌水に溶解したものを用いた。
（本培養工程）
上記前培養液を本培養培地 ２０ｍＬに初期ＯＤ６００ｎｍの値が０．３５になるよう
に植菌し、バイオシェーカー（ＴＡＩＴＥＣ社製 Ｇ・ＢＲ−２００）で培養温度３２℃、１８０ｒｐｍで２４時間培養することで、タンパク質の発現を誘導した。ただし、組換え大腸菌１２については、培養温度を２０℃とした。
なお、上記本培養培地は、５×Ｍ９ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｓａｌｔｓ ２００ｍＬ、１Ｍ
ＣａＣｌ２ １００μＬ、１Ｍ ＭｇＳＯ４ ２ｍＬ、４０ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ ７５ｍＬ、１００ｇ／Ｌ Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ １００ｍＬ、１０ｇ／Ｌ チアミン塩酸塩 ２ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ ＣｕＳＯ４ １ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ Ｃａｒｂｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｎ １ｍＬ、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ＥｘｐｒｅｓｓＴＭ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ１ ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１ ２０ｍＬ、ＯｎＥｘ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２ ５０ｍＬ、およびＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ３ １ｍＬを、全量１Ｌになるように滅菌水に溶解したものを用いた。
上記前培養液を本培養培地 ２０ｍＬに初期ＯＤ６００ｎｍの値が０．３５になるよう
に植菌し、バイオシェーカー（ＴＡＩＴＥＣ社製 Ｇ・ＢＲ−２００）で培養温度３２℃、１８０ｒｐｍで２４時間培養することで、タンパク質の発現を誘導した。ただし、組換え大腸菌１２については、培養温度を２０℃とした。
なお、上記本培養培地は、５×Ｍ９ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｓａｌｔｓ ２００ｍＬ、１Ｍ
ＣａＣｌ２ １００μＬ、１Ｍ ＭｇＳＯ４ ２ｍＬ、４０ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ ７５ｍＬ、１００ｇ／Ｌ Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ １００ｍＬ、１０ｇ／Ｌ チアミン塩酸塩 ２ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ ＣｕＳＯ４ １ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ Ｃａｒｂｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｎ １ｍＬ、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ＥｘｐｒｅｓｓＴＭ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ１ ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１ ２０ｍＬ、ＯｎＥｘ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２ ５０ｍＬ、およびＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ３ １ｍＬを、全量１Ｌになるように滅菌水に溶解したものを用いた。
（変換工程）
上記本培養の終了後、基質とアスコルビン酸との混合液（チロシン １６４．７ｍｇ、全量１００ｍＬになるように滅菌水に溶解したもの）を２ｍＬ添加することで、Ｌ−ＤＯＰＡの生産反応を開始し、バイオシェーカー（ＴＡＩＴＥＣ社製 Ｇ・ＢＲ−２００）で反応温度３２℃、１８０ｒｐｍで４時間反応させてＬ−ＤＯＰＡを生産させた。ただし、組換え大腸菌１２については、反応温度を２０℃、反応時間を９６時間とした。
上記本培養の終了後、基質とアスコルビン酸との混合液（チロシン １６４．７ｍｇ、全量１００ｍＬになるように滅菌水に溶解したもの）を２ｍＬ添加することで、Ｌ−ＤＯＰＡの生産反応を開始し、バイオシェーカー（ＴＡＩＴＥＣ社製 Ｇ・ＢＲ−２００）で反応温度３２℃、１８０ｒｐｍで４時間反応させてＬ−ＤＯＰＡを生産させた。ただし、組換え大腸菌１２については、反応温度を２０℃、反応時間を９６時間とした。
（Ｌ−ＤＯＰＡの定量分析）
上記で得られた反応液を１ｍＬ回収し、さらに遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間）して得られた上清を用いて、Ｎｅｘｅｒａ ＵＨＰＬＣシステム Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２（島津製作所製）にて定量分析を行った。カラムは、Ｋｉｎｅｔｅｘ ２．６ｕ ＨＩＬＩＣ
１００Ａ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製）を使用した。溶出は、１０ｍＭ クエン酸Ｂｕｆｆ
ｅｒ（ＳｏｌｖｅｎｔＡ）とアセトニトリル（ＳｏｌｖｅｎｔＢ）を用い、ＳｏｌｖｅｎｔＢの混合比を８０％にすることにより行った（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ、温度４０℃）。
その結果、変異型チロシナーゼを保有する組換え大腸菌によるＬ−ＤＯＰＡ生産量は、同条件で測定した野生型のＢＭＴＹＲのＬ−ＤＯＰＡの蓄積量を１としたとき、表３及び表４のとおりとなった。なお、表３及び表４中の番号は、表２中の変異体の番号に対応する。
上記で得られた反応液を１ｍＬ回収し、さらに遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間）して得られた上清を用いて、Ｎｅｘｅｒａ ＵＨＰＬＣシステム Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２（島津製作所製）にて定量分析を行った。カラムは、Ｋｉｎｅｔｅｘ ２．６ｕ ＨＩＬＩＣ
１００Ａ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製）を使用した。溶出は、１０ｍＭ クエン酸Ｂｕｆｆ
ｅｒ（ＳｏｌｖｅｎｔＡ）とアセトニトリル（ＳｏｌｖｅｎｔＢ）を用い、ＳｏｌｖｅｎｔＢの混合比を８０％にすることにより行った（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ、温度４０℃）。
その結果、変異型チロシナーゼを保有する組換え大腸菌によるＬ−ＤＯＰＡ生産量は、同条件で測定した野生型のＢＭＴＹＲのＬ−ＤＯＰＡの蓄積量を１としたとき、表３及び表４のとおりとなった。なお、表３及び表４中の番号は、表２中の変異体の番号に対応する。
本発明により、触媒能が向上した変異型チロシナーゼが提供される。該酵素は、チロシンからＬ−ＤＯＰＡへの変換反応を効率的に触媒することができるため、該酵素を含有する微生物等を用いることにより、グルコースやチロシン等の安価な原料からＬ−ＤＯＰＡを高い生産性で安定的に製造することができる。Ｌ−ＤＯＰＡはベタレイン色素等のアルカロイド化合物やカフェ酸及びその誘導体等、種々の有用な化合物の製造原料となり得るため、本発明は産業上の利用可能性が高い。
Claims (17)
- 配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、下記（ｉ）及び／又は（ｉｉ）の変異を有する、チロシナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列におけるS2、N3、Y5、I28、K30、G46、F48、S54、N57、W68、E71、S104、D127、N144、D166、D170、K173、W182、E187、N188、S189、Q193、E195、T220、H230、N233、W241、I243、Q251、N261、D264、Y267、P273、G283、及びI288からなる群より選ばれる１又は複数のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が、K、H、R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S、及びTからなる群から選択されるアミノ酸残基に置換された変異。
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列におけるV218に相当するアミノ酸残基がK、H、R、E、D、Q、N、C、L、I、P、M、W、Y、A、S、及びTからなる群から選択されるアミノ酸残基
に置換された変異。 - 前記変異が、配列番号２のアミノ酸配列における下記のいずれかの変異に相当する変異である、請求項１に記載のタンパク質：
S2C、S2R、N3D、Y5N、I28S、K30E、G46D、F48L、S54N、N57T、W68R、E71G、S104T、D127E、N144H、D166E、D170E、K173E、W182R、E187R、N188K、S189T、Q193R、E195D、V218D
、T220S、H230Q、N233K、W241R、W241G、I243N、Q251P、N261D、D264E、Y267F、P273L、G283S、I288T。 - 前記変異が、配列番号２のアミノ酸配列における下記のいずれかの変異に相当する変異である、請求項１又は２に記載のタンパク質：
S2C、（S2C+Y5N）、（S2C+F48L）、（S2C+N188K）、（S2C+Q251P）、（S2C+D264E）、
（S2C+P273L）、（S2C+S104T+N261D）、（S2C+K173E+W182R）、（S2C+E71G+E195D+W241G
）、（S2C+Q193R+V218D+I288T）、（S2C+N3D+G46D+D127E+W241R）、（S2C+I28S+S54N+D170E+W182R）、（S2C+W68R+D166E+S189T+N233K）、（S2R+W241R+I243N）、V218D、D264E、
（K30E+E187R）、（N57T+Y267F）、（N57T+T220S+Y267F+G283S）、（N144H+H230Q）。 - 請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
- 請求項４に記載のＤＮＡを含む、組換え発現ベクター。
- 請求項５に記載の組換え発現ベクターで形質転換された、微生物。
- 大腸菌または酵母である、請求項６に記載の微生物。
- 請求項６又は７に記載の微生物を培地中で培養する工程を含む、前記タンパク質の製造方法。
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質、又は前記タンパク質を含有する微生物若しくはその処理物の存在下で、水性媒体中で、チロシンをＬ−ＤＯＰＡに変換する工程を含む、Ｌ−ＤＯＰＡの製造方法。
- 請求項９に記載のＬ−ＤＯＰＡの製造方法を含む、目的物質の製造方法であって、
前記目的物質は、アルカロイド、並びにカフェ酸及びその誘導体からなる群から選ばれるいずれかである、製造方法。 - 請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質及びＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナー
ゼを含有する微生物又はその処理物の存在下で、水性媒体中で、原料をベタレイン色素に変換する工程を含む、ベタレイン色素の製造方法。 - 前記変換工程の前に、前記微生物を水性媒体中で培養する工程を含む、請求項１１に記載の製造方法。
- 前記変換工程において、前記微生物として休止菌体を用いる、請求項１１又は１２に記載の製造方法。
- 前記原料が、チロシン、及び／又は糖質原料である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の製造方法。
- さらに、チロシン以外のアミノ酸又はアミンの存在下で行われる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記変換工程において、前記水性媒体が、アスコルビン酸、ＵＤＰ−グルコース、銅、及び鉄からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記ベタレイン色素がベタキサンチンである、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の製造方法。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110283797A (zh) * | 2019-06-20 | 2019-09-27 | 天津科技大学 | 一种酪氨酸酶及其基因、工程菌和制备方法 |
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-
2016
- 2016-11-04 JP JP2016216287A patent/JP2018057354A/ja active Pending
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| US11932887B2 (en) | 2015-09-10 | 2024-03-19 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | CYP76AD1-beta clade polynucleotides, polypeptides, and uses thereof |
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| CN110283797A (zh) * | 2019-06-20 | 2019-09-27 | 天津科技大学 | 一种酪氨酸酶及其基因、工程菌和制备方法 |
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