CN111172143B

CN111172143B - D-木糖酸脱水酶及其应用

Info

Publication number: CN111172143B
Application number: CN202010026812.9A
Authority: CN
Inventors: 陈可泉; 麦丹丹; 王昕�
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2040-01-10
Also published as: CN111172143A

Abstract

本发明公开了一种D‑木糖酸脱水酶，所述D‑木糖酸脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1～4所示，本发明通过易错PCR对来自大肠杆菌的D‑木糖酸脱水酶YjhG进行定向进化，得到四种D‑木糖酸脱水酶YjhG基因序列，将其转化大肠杆菌，获得几组活力较高的突变株91号、96号、62号和286号，这几个菌株在12h内所消耗木糖酸分别为4.2g/L、4.8g/L、6.22g/L、5.43g/L，而出发菌株(亲株A)在同等条件下消耗的木糖酸为2.15g/L，分别提高了2.1倍、2.4倍、2.89倍、2.5倍。

Description

D-木糖酸脱水酶及其应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种D-木糖酸脱水酶及其应用。

背景技术

D-木糖酸脱水酶，***命名是D-木糖酸氢-裂解酶，能催化木糖酸脱水反应。目前木糖酸脱水酶有不同的菌株来源，比如嗜盐的古细菌富盐菌、新月丙杆菌和假单胞菌。不同来源的D-木糖酸脱水酶可以利用不同的底物，比如D-葡萄糖酸、D-木糖酸和D-木糖。虽然已知源自大肠杆菌的木糖酸脱水酶YjhG具有催化D-木糖酸脱水的酶学活性，但关于其性质的研究报道较少。

目前，已经可以确定D-木糖酸脱水酶是许多代谢途径中的重要酶。在一些高附加值的化学品如乙二醇、三元醇和四元醇等生物合成途径中，其中来源于大肠杆菌的木糖酸脱水酶YjhG被用来催化D-木糖酸脱水反应。例如在利用D-木糖通过生物途径生产D-1,2,4-丁三醇的过程中，该合成途径包括：(1)在D-木糖脱氢酶的催化下将D-木糖转化为D-木糖酸；(2)D-木糖酸在D-木糖酸脱水酶的催化下生成D-3-脱氧甘油戊酮糖酸；(3)D-3-脱氧甘油戊酮糖酸在2-酮酸脱羧酶的催化下生成D-3,4-二羟基丁醛；(4)在脱氢酶催化下D-3,4-二羟基丁醛生成D-1,2,4-丁三醇。该酶对微生物发酵生产乙二醇、三元醇和四元醇的产量和质量有重要影响，但是，木糖酸脱水酶存在着反应速率缓慢，导致催化反应时间较长。因此，继续筛选一种具有高催化效率的木糖酸脱水酶，以提高木糖酸脱水酶的反应速率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是通过定向进化的技术手段提供一种具有高催化效率的木糖酸脱水酶YjhG。

本发明还要解决的技术问题是提供上述木糖酸脱水酶YjhG在制备多元醇中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

D-木糖酸脱水酶，所述D-木糖酸脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1～4所示。

编码上述D-木糖酸脱水酶的基因序列在本发明的保护范围之内，将SEQ ID NO.：1～4所示的核苷酸序列翻译为基因序列即可得到本发明中所述的编码D-木糖酸脱水酶的基因序列。

一种重组质粒，该重组质粒中包含上述编码D-木糖酸脱水酶的基因序列。

一种重组细胞，该重组细胞中包含上述编码D-木糖酸脱水酶的基因序列。

上述D-木糖酸脱水酶在制备多元醇中的应用在本发明的保护范围之内。

作为优选，所述的多元醇为1,2,4-丁三醇。

一株产1,2,4-丁三醇的基因工程菌，在大肠杆菌中导入了本发明中的编码D-木糖酸脱水酶的基因序列。

产1,2,4-丁三醇的基因工程菌，该大肠杆菌中导入了D-木糖酸脱水酶基因、D-木糖脱氢酶基因、苯甲酰甲酸脱羧酶基因、醇脱氢酶基因，所述的D-木糖脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.：5所示、苯甲酰甲酸脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.：6所示、醇脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.：7所示。

上述产1,2,4-丁三醇的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)将D-木糖酸脱水酶基因、D-木糖脱氢酶基因、苯甲酰甲酸脱羧酶基因、醇脱氢酶基因分别克隆至表达质粒中，所述的表达质粒包括BT-62和BT-286，得到重组质粒，

(2)再将重组载体转化宿主菌，所述的宿主菌为Trans 1T1，得到产1,2,4-丁三醇的基因工程菌。

上述产1,2,4-丁三醇的基因工程菌在制备1,2,4-丁三醇中的应用在本发明的保护范围之内。

本发明通过易错PCR对所述来自大肠杆菌的D-木糖酸脱水酶YjhG的基因序列进行易错PCR，通过随机突变改变木糖酸脱水酶(YjhG)基因的密码子，易错PCR随机突变改变YjhG基因的密码子碱基的位置，最终筛选获得具有高木糖酸脱水酶活性的突变株91、96、62、286号。分别提取质粒，并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序确定突变的YjhG基因序列。

突变株91号(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)第143位碱基由T突变成C，相应的氨基酸由组氨酸突变成苏氨酸，第236位碱基由A突变成G，相应的氨基酸由赖氨酸突变成精氨酸；第520位碱基由G突变成A，相应的氨基酸由丙氨酸突变成苏氨酸；第938位碱基由T突变成C，相应的氨基酸由谷氨酰胺突变成脯氨酸。

突变株96号(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)第967位碱基由G突变成A，相应的氨基酸由丙氨酸突变成苏氨酸。

突变株62号(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)第967位碱基由G突变成A,相应的氨基酸由丙氨酸突变成苏氨酸，第1855位碱基由G突变成A，相应的氨基酸由天冬氨酸突变成天冬酰胺，第1898位碱基由C突变成T，相应的氨基酸由苏氨酸突变成异亮氨酸。

突变株286号(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)第163位碱基由T突变成C，相应的氨基酸由丝氨酸突变成脯氨酸，第203位氨基酸由G突变成A，相应的氨基酸由丝氨酸突变为天冬酰胺，第967位碱基由G突变成A,相应的氨基酸由丙氨酸突变成苏氨酸。

有益效果：本发明相比于现有技术，具有如下优势：

本发明应用易错PCR技术对YjhG基因进行随机突变改造，获得几组活力较高的突变株91号、96号、62号和286号，这几个菌株在12h内所消耗木糖酸分别为4.2g/L、4.8g/L、6.22g/L、5.43g/L，而出发菌株(亲株A)在同等条件下消耗的木糖酸为2.15g/L，分别提高了2.1倍、2.4倍、2.89倍、2.5倍。应用易错PCR技术对YjhG基因进行随机突变改造，获得了在以木糖酸为底物时转化效率明显提高的突变菌株，育种目标明确、效率高。

附图说明

图1第一轮易错PCR复筛后的突变菌株与重组菌株的酶活对比

图2第二轮易错PCR初筛后的突变菌株与重组菌株的酶活对比。

图3第二轮易错PCR复筛后的突变菌株与重组菌株的酶活对比。

图4第二轮易错PCR复筛后的突变菌株产丁三醇的对比。

图5第一轮易错PCR复筛后的突变菌株产丁三醇的对比。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例中所用的D-木糖酸脱水酶是来自大肠杆菌的基因，将该基因连接到pCWJ表达载体上，转化至大肠杆菌Trans 1T1感受态细胞中，得到的阳性克隆培养至OD 600为0.6-1.0，加IPTG终浓度为0.5mmol·L^-1，33℃培养12～18h获得。

实施例1：含YjhG基因菌株的构建

(1)利用YjhG基因5’端和3’端引物引入酶切位点(NcoI和HindⅢ)，对YjhG基因和pCWJ质粒进行双酶切，然后将YjhG基因连接到pCWJ载体上；

(2)将上述连接液转入大肠杆菌Trans 1T1的感受态细胞(全式金生物技术有限公司)里，涂布在带有50mg/L氯霉抗性的LB平板，37℃过夜培养。

(3)挑取平板上生长的单菌落，转接到含有50mg/L氯霉素抗性的LB培养基里，然后提取质粒，再经限制性内切酶Spe I和Kpn I进行酶切验证，最后得到了重组质粒pCWJ-YjhG。

实施例2：YjhG基因突变体库的构建

(1)将实施例1得到的大肠杆菌Trans 1T1/pCWJ-YjhG接种于LB液体培养基中，37℃摇床里培养，10h后，6000g离心5min,收集菌体细胞，用质粒小提试剂盒(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)抽提质粒pCWJ-YjhG；LB液体培养基组成为：蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，氯霉素50mg/L。

(2)易错PCR反应的建立：

(1a)设计含有限制性酶切位点的正向引物(YjhG-NcoI-F,CATGCCATGGAAATGTCTGTTCGCAATATTTTTGCTGAC,下划线为NcoI酶切位点)和反向引物(YjhG-Hin dⅢ-R,CCCAAGCT TTCAGTTTTTATTCATAAAATCGCGCAAAGC，下划线为HindⅢ酶切位点)；

(1b)配置50uL的易错PCR反应混合液：

易错PCR反应体系为：10×Taq buffer 5uL、Mn²⁺(50mmol/L)1uL、Mg²⁺(50mmol/L)7uL、DNA模板10uL、10×dNTP 5uL、上游引物YjhG-NcoI-F 2uL、下游引物YjhG-HindⅢ-R2uL、Taq酶0.5uL、ddH₂O 18uL；

(1c)将易错PCR反应混合液置于PCR仪上进行易错PCR扩增YjhG基因，扩增程序如下：

94℃变性3min，20个循环，每个循环包括94℃变性60s，57℃退火60s，72℃延伸60s，循环结束后，72℃无需延伸，然后保存在4℃下，扩增结束后，用浓度为1.5％琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物大小。

(3)YjhG基因突变体库的构建：

(2a)用琼脂糖回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收PCR扩增产物；

(2b)配置50uL的酶切反应混合液，用限制性内切酶NcoI和HindⅢ对步骤(2b)的胶回收后的PCR产物和pCWJ载体分别进行双酶切，双酶切体系为：片段DNA模板：42uL，内切酶NcoI：1.5uL，内切酶HindⅢ：1.5uL，10×Qcut Buffer：5uL，pCWJ载体体系为：pCWJ载体：42uL，内切酶NcoI：1.5uL，内切酶HindⅢ：1.5uL，10×Qcut Buffer：5uL。分别将其于37℃水浴锅中酶切45min；

(2c)将酶切产物在浓度为1.5％琼脂糖凝胶上电泳确认大小，来验证酶切效果，并将目的片段用纯化试剂盒回收，再将pCWJ载体切胶，用DNA凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收。

(2d)配置10uL的连接反应混合液，体系为：T4 Ligation Buffer:1uL，步骤(2c)获得的双酶切后的pCWJ载体：2.5uL，步骤(c)获得的双酶切后的DNA片段：3.5uL，T4 DNALigase：0.5uL，置于25℃水浴锅中反应30min。按《分子克隆实验指南》将连接产物转化至25uL大肠杆菌Trans 1T1感受态中。

(2f)最后将其涂布在LB固体培养基平板(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L,氯霉素50mg/mL),在37℃下正向放置以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜；

(2g)将转化平板上长出的所有转化子单菌落挑至含50mg/L氯霉素的LB固体培养基平板上划线，于37℃恒温培养箱倒置培养过夜。将长出的所有转化子用引物对其进行菌落PCR。

实施例3：高产YjhG的基因工程菌的获得

将实施例2中构建的突变体库中的转化子和pCWJ-YjhG菌株分别接入96孔板中的1mL LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，氯霉素50mg/mL)中，加入0.5mmol的IPTG，于33℃、200rpm转速下摇床培养12h，培养结束后，8000r/min、4℃离心10min,收集细胞，加入500uL木糖酸溶液使其终浓度为100g/L，500uL水，混匀后，于33℃，200rpm摇床转化12h，加入30mM高碘酸试剂，与木糖酸反应可以生成甲醛，通过酶标仪在410nm处测定吸光度值进行初筛，再利用高效液相检测进行复筛，筛选出YjhG的酶活比亲株A明显提高的突变株91号、96号，如图1所示，其中，91号突变株在12h内消耗的木糖酸为2.3g/L，96号突变株在12h内消耗的木糖酸为2.5g/L，图中未突变菌株YjhG菌株在12h内消耗的木糖酸为0.93g/L。

将基因工程菌91号与96号先分别进行如下培养：

(1)从平板上分别挑取重组菌株pCWJ-YjhG的单菌落接种到含有50mg/L氯霉素抗性的5mL LB的摇管里，37℃培养6～8h后转接到含有50mg/L氯霉素抗性的100mL的LB培养基里，培养至OD₆₀₀＝0.6～0.9，加入0.5mmol的IPTG，诱导12h离心收菌，得到重组菌株pCWJ-YjhG的细胞

(2)发酵培养：培养基配方：蛋白胨：10g/L，酵母粉：5g/L，氯化钠：5g/L，溶剂为水，将步骤(a)得到的细胞进行发酵培养，培养温度：33℃，培养时间：12h。

将预培养后的基因工程菌91号与96号分别加入木糖酸的水溶液，控制木糖酸溶液在初始反应体系中的浓度为20g/L，菌株的OD₆₀₀＝60，于37℃反应12h，通过高效液相色谱检测木糖酸消耗了多少。如图2所示，91号和96号突变株分别在12h内消耗了木糖酸4.2g/L和4.8g/L左右，比亲株A在同样条件下分别提高了2.1与2.4倍。

将91号与96号突变菌株的木糖酸脱水酶基因(YjhG)利用实施例1中的酶切位点将突变的YjhG片段切下来，将突变的YjhG基因与D-木糖脱氢酶基因、苯甲酰甲酸脱羧酶基因、醇脱氢酶基因分别导入质粒中，得到重组质粒BT-91、BT-96，然后将重组质粒分别转化宿主菌Trans 1T1，得到重组菌BT-T1-91和BT-T1-96。控制反应体系为20mL，底物为20g/L，OD＝60，pH＝7.0。如图5所示，突变菌株BT-T1-91和BT-T1-96在反应48h内消耗的木糖酸分别是11.13g/L和13.3g/L，与未突变菌株(PGP)相比，提高了约2倍和2.4倍，其中91号和96号突变菌株的1,2,4-丁三醇的产量分别达10.45g/L和12.55g/L，而未突变菌株的1,2,4-丁三醇的产量为5.75g/L，因此，与为突变菌株相比，提高了约1.86倍和2.1倍。

实施例4：对高产菌株96号再进行易错PCR

按照实施例1中的YjhG的突变库的构建再对突变株96号建立突变库，并构建到pCWJ载体上，按照实施例3的方法筛选出酶活较高的突变菌株。

实施例5：高产突变株YjhG基因序列的分析

将实施例4复筛得到的突变株62号与286号所含质粒按实施例1中所述方法获得，并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序确定突变的YjhG基因序列，并用DNAman软件进行序列比对；突变株62号基因的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示；突变株286号基因的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。

突变株YjhG突变位点分析：第967位碱基由G突变成A,相应的氨基酸由丙氨酸突变成苏氨酸，第1855位碱基由G突变成A，相应的氨基酸由天冬氨酸突变成天冬酰胺，第1898位碱基由C突变成T，相应的氨基酸由苏氨酸突变成异亮氨酸。

突变株286号第163位碱基由T突变成C，相应的氨基酸由丝氨酸突变成脯氨酸，第203位氨基酸由G突变成A，相应的氨基酸由丝氨酸突变为天冬酰胺，第967位碱基由G突变成A,相应的氨基酸由丙氨酸突变成苏氨酸。

实施例5：

将基因工程菌62号与286号先分别进行如下培养：

将预培养后的基因工程菌62号与238号分别加入木糖酸的水溶液，控制木糖酸溶液在初始反应体系中的浓度为20g/L，菌株的OD₆₀₀＝60，于37℃反应12h，通过高效液相色谱检测木糖酸消耗了多少。如图2所示，91号和96号突变株分别在12h内消耗了木糖酸4.2g/L和4.8g/L左右，比亲株A在同样条件下分别提高了2.1与2.4倍。

实施例6：

将62号与286号突变菌株的木糖酸脱水酶基因(YjhG)利用实施例1中的酶切位点将突变的YjhG片段切下来，将突变的YjhG基因与D-木糖脱氢酶基因、苯甲酰甲酸脱羧酶基因、醇脱氢酶基因分别导入质粒中，得到重组质粒BT-91、BT-96，然后将重组质粒分别转化宿主菌Trans 1T1，得到重组菌BT-T1-62和BT-T1-238。控制反应体系为20mL，底物为20g/L，OD＝60，pH＝7.0。如图3所示，突变菌株BT-T1-62和BT-T1-286的1,2,4-丁三醇的产量分别达18.2g/L和15.69g/L，而未突变菌株的1,2,4-丁三醇的产量为5.43g/L，因此，与为突变菌株相比，提高了约2.89倍和2.5倍。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> D-木糖酸脱水酶及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 655

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Val Arg Asn Ile Phe Ala Asp Glu Ser His Asp Ile Tyr Thr

1 5 10 15

Val Arg Thr His Ala Asp Gly Pro Asp Gly Glu Leu Pro Leu Thr Ala

20 25 30

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35 40 45

Asn Ala Gly Met Gly Trp Ser Pro Asp Glu Leu Asp Arg Asp Gly Ile

50 55 60

Leu Leu Leu Ser Thr Leu Gly Gly Leu Arg Gly Ala Asp Gly Arg Pro

65 70 75 80

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85 90 95

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130 135 140

Arg Leu Ile Arg Ser Leu Pro Asp Ala Lys Ala Val Ile Gly Val Ala

145 150 155 160

Ser Cys Asp Lys Gly Leu Pro Ala Thr Met Met Ala Leu Thr Ala Gln

165 170 175

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180 185 190

Lys Asp Gly Glu Asp Asn Gly Lys Val Gln Thr Ile Gly Ala Arg Phe

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

Ser Ala Arg Ala Ala Leu Asn Leu Ser Gln Lys Gly Ile Thr Thr Arg

275 280 285

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305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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405 410 415

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<210> 2

<211> 655

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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20 25 30

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35 40 45

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450 455 460

Gly Ile Tyr Tyr His Lys Gly Val Ala Lys Val Tyr Leu Ser Glu Lys

465 470 475 480

Ser Ala Ile Tyr Asp Ile Lys His Asp Lys Ile Lys Ala Gly Asp Ile

485 490 495

Leu Val Ile Ile Gly Val Gly Pro Ser Gly Thr Gly Met Glu Glu Thr

500 505 510

Tyr Gln Val Thr Ser Ala Leu Lys His Leu Ser Tyr Gly Lys His Val

515 520 525

Ser Leu Ile Thr Asp Ala Arg Phe Ser Gly Val Ser Thr Gly Ala Cys

530 535 540

Ile Gly His Val Gly Pro Glu Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ile Gly Lys

545 550 555 560

Leu Arg Thr Gly Asp Leu Ile Glu Ile Lys Ile Asp Cys Arg Glu Leu

565 570 575

His Gly Glu Val Asn Phe Leu Gly Thr Arg Ser Asp Glu Gln Leu Pro

580 585 590

Ser Gln Glu Glu Ala Thr Ala Ile Leu Asn Ala Arg Pro Ser His Gln

595 600 605

Asp Leu Leu Pro Asp Pro Glu Leu Pro Asp Asp Thr Arg Leu Trp Ala

610 615 620

Met Leu Gln Ala Val Ser Gly Gly Thr Trp Thr Gly Cys Ile Tyr Asp

625 630 635 640

Val Asn Lys Ile Gly Ala Ala Leu Arg Asp Phe Met Asn Lys Asn

645 650 655

<210> 3

<211> 655

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ser Val Arg Asn Ile Phe Ala Asp Glu Ser His Asp Ile Tyr Thr

1 5 10 15

Val Arg Thr His Ala Asp Gly Pro Asp Gly Glu Leu Pro Leu Thr Ala

20 25 30

Glu Met Leu Ile Asn Arg Pro Ser Gly Asp Leu Phe Gly Met Thr Met

35 40 45

Asn Ala Gly Met Gly Trp Ser Pro Asp Glu Leu Asp Arg Asp Gly Ile

50 55 60

Leu Leu Leu Ser Thr Leu Gly Gly Leu Arg Gly Ala Asp Gly Lys Pro

65 70 75 80

Val Ala Leu Ala Leu His Gln Gly His Tyr Glu Leu Asp Ile Gln Met

85 90 95

Lys Ala Ala Ala Glu Val Ile Lys Ala Asn His Ala Leu Pro Tyr Ala

100 105 110

Val Tyr Val Ser Asp Pro Cys Asp Gly Arg Thr Gln Gly Thr Thr Gly

115 120 125

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130 135 140

Arg Leu Ile Arg Ser Leu Pro Asp Ala Lys Ala Val Ile Gly Val Ala

145 150 155 160

Ser Cys Asp Lys Gly Leu Pro Ala Thr Met Met Ala Leu Ala Ala Gln

165 170 175

His Asn Ile Ala Thr Val Leu Val Pro Gly Gly Ala Thr Leu Pro Ala

180 185 190

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210 215 220

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225 230 235 240

Thr Ser Gln Val Val Ala Glu Gly Leu Gly Leu Ala Ile Pro His Ser

245 250 255

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260 265 270

Ser Ala Arg Ala Ala Leu Asn Leu Ser Gln Lys Gly Ile Thr Thr Arg

275 280 285

Glu Ile Leu Thr Asp Lys Ala Ile Glu Asn Ala Met Thr Val His Ala

290 295 300

Ala Phe Gly Gly Ser Thr Asn Leu Leu Leu His Ile Pro Ala Ile Ala

305 310 315 320

His Gln Thr Gly Cys His Ile Pro Thr Val Asp Asp Trp Ile Arg Ile

325 330 335

Asn Lys Arg Val Pro Arg Leu Val Ser Val Leu Pro Asn Gly Pro Val

340 345 350

Tyr His Pro Thr Val Asn Ala Phe Met Ala Gly Gly Val Pro Glu Val

355 360 365

Met Leu His Leu Arg Ser Leu Gly Leu Leu His Glu Asp Val Met Thr

370 375 380

Val Thr Gly Ser Thr Leu Lys Glu Asn Leu Asp Trp Trp Glu His Ser

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405 410 415

Asn Ala Asp Glu Val Ile Met Ser Pro Gln Gln Ala Lys Ala Arg Gly

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Leu Thr Ser Thr Ile Thr Phe Pro Val Gly Asn Ile Ala Pro Glu Gly

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485 490 495

Leu Val Ile Ile Gly Val Gly Pro Ser Gly Thr Gly Met Glu Glu Thr

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515 520 525

Ser Leu Ile Thr Asp Ala Arg Phe Ser Gly Val Ser Thr Gly Ala Cys

530 535 540

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545 550 555 560

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595 600 605

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<211> 655

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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Glu Met Leu Ile Asn Arg Pro Ser Gly Asp Leu Phe Gly Met Thr Met

35 40 45

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50 55 60

Leu Leu Leu Asn Thr Leu Gly Gly Leu Arg Gly Ala Asp Gly Lys Pro

65 70 75 80

Val Ala Leu Ala Leu His Gln Gly His Tyr Glu Leu Asp Ile Gln Met

85 90 95

Lys Ala Ala Ala Glu Val Ile Lys Ala Asn His Ala Leu Pro Tyr Ala

100 105 110

Val Tyr Val Ser Asp Pro Cys Asp Gly Arg Thr Gln Gly Thr Thr Gly

115 120 125

Met Phe Asp Ser Leu Pro Tyr Arg Asn Asp Ala Ser Met Val Met Arg

130 135 140

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145 150 155 160

Ser Cys Asp Lys Gly Leu Pro Ala Thr Met Met Ala Leu Ala Ala Gln

165 170 175

His Asn Ile Ala Thr Val Leu Val Pro Gly Gly Ala Thr Leu Pro Ala

180 185 190

Lys Asp Gly Glu Asp Asn Gly Lys Val Gln Thr Ile Gly Ala Arg Phe

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Glu Ile Leu Thr Asp Lys Ala Ile Glu Asn Ala Met Thr Val His Ala

290 295 300

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305 310 315 320

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340 345 350

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450 455 460

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485 490 495

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515 520 525

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530 535 540

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565 570 575

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580 585 590

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595 600 605

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625 630 635 640

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645 650 655

<210> 5

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtcttctg ctatctaccc gtctctgaaa ggtaaacgtg ttgttatcac cggtggtggt 60

tctggtatcg gtgctggtct gaccgctggt ttcgctcgtc agggtgctga agttatcttc 120

ctggacatcg ctgacgaaga ctctcgtgct ctggaagctg aactggctgg ttctccgatc 180

ccgccggttt acaaacgttg cgacctgatg aacctggaag ctatcaaagc tgttttcgct 240

gaaatcggtg acgttgacgt tctggttaac aacgctggta acgacgaccg tcacaaactg 300

gctgacgtta ccggtgctta ctgggacgaa cgtatcaacg ttaacctgcg tcacatgctg 360

ttctgcaccc aggctgttgc tccgggtatg aaaaaacgtg gtggtggtgc tgttatcaac 420

ttcggttcta tctcttggca cctgggtctg gaagacctgg ttctgtacga aaccgctaaa 480

gctggtatcg aaggtatgac ccgtgctctg gctcgtgaac tgggtccgga cgacatccgt 540

gttacctgcg ttgttccggg taacgttaaa accaaacgtc aggaaaaatg gtacaccccg 600

gaaggtgaag ctcagatcgt tgctgctcag tgcctgaaag gtcgtatcgt tccggaaaac 660

gttgctgctc tggttctgtt cctggcttct gacgacgctt ctctgtgcac cggtcacgaa 720

tactggatcg acgctggttg gcgt 744

<210> 6

<211> 1644

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgtatacag taggagatta cctgttagac cgattacacg agttgggaat tgaagaaatt 60

tttggagttc ctggtgacta taacttacaa tttttagatc aaattatttc acgcgaagat 120

atgaaatgga ttggaaatgc taatgaatta aatgcttctt atatggctga tggttatgct 180

cgtactaaaa aagctgccgc atttctcacc acatttggag tcggcgaatt gagtgcgatc 240

aatggactgg caggaagtta tgccgaaaat ttaccagtag tagaaattgt tggttcacca 300

acttcaaaag tacaaaatga cggaaaattt gtccatcata cactagcaga tggtgatttt 360

aaacacttta tgaagatgca tgaacctgtt acagcagcgc ggactttact gacagcagaa 420

aatgccacat atgaaattga ccgagtactt tctcaattac taaaagaaag aaaaccagtc 480

tatattaact taccagtcga tgttgctgca gcaaaagcag agaagcctgc attatcttta 540

gaaaaagaaa gctctacaac aaatacaact gaacaagtga ttttgagtaa gattgaagaa 600

agtttgaaaa atgcccaaaa accagtagtg attgcaggac acgaagtaat tagttttggt 660

ttagaaaaaa cggtaactca gtttgtttca gaaacaaaac taccgattac gacactaaat 720

tttggtaaaa gtgctgttga tgaatctttg ccctcatttt taggaatata taacgggaaa 780

ctttcagaaa tcagtcttaa aaattttgtg gagtccgcag actttatcct aatgcttgga 840

gtgaagctta cggaccgctc aacaggtgca ttcacacatc atttagatga aaataaaatg 900

atttcactaa acatagatga aggaataatt ttcaataaag tggtagaaga ttttgatttt 960

agagcagtgg tttcttcttt atcagaatta aaaggaatag aatatgaagg acaatatatt 1020

gataagcaat atgaagaatt tattccatca agtgctccct tatcacaaga ccgtctatgg 1080

caggcagttg aaagtttgac tcaaagcaat gaaacaatcg ttgctgaaca aggaacctca 1140

ttttttggag cttcaacaat tttcttaaaa tcaaatagtc gttttattgg acaaccttta 1200

tggggttcta ttggatatac ttttccagcg gctttaggaa gccaaattgc ggataaagag 1260

agcagacacc ttttatttat tggtgatggt tcacttcaac ttaccgtaca agaattagga 1320

ctatcaatca gagaaaaact caatccaatt tgttttatca taaataatga tggttataca 1380

gttgaaagag aaatccacgg acctactcaa agttataacg acattccaat gtggaattac 1440

tcgaaattac cagaaacatt tggagcaaca gaagatcgtg tagtatcaaa aattgttaga 1500

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tggatagaac tagttttgga aaaagaagat gcgccaaaat tactgaaaaa aatgggtaaa 1620

ttatttgctg agcaaaataa ataa 1644

<210> 7

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgaaggctg cagttgttac gaaggatcat catgttgacg ttacgtataa aacactgcgc 60

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atcggtgtgg tggcagaagt gggtccaggt gtcacctcat taaaaccagg cgatcgtgcc 240

agcgtggcgt ggttctacga aggatgcggt cattgcgaat actgtaacag tggtaacgaa 300

acgctctgcc gttcagttaa aaatgccgga tacagcgttg atggcgggat ggcggaagag 360

tgcatcgtgg tcgccgatta cgcggtaaaa gtgccagatg gtctggactc ggcggcggcc 420

agcagcatta cctgtgcggg agtcaccacc tacaaagccg ttaagctgtc aaaaattcgt 480

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gcgaagaatg tctttaacgc caaagtgatc gccattgatg tcaatgatga gcagttaaaa 600

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ccgccggagt ctatgagcct ggatatccca cgtcttgtgc tggatggtat tgaagtggtc 840

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aaagtggtgc cgaaagtcgc cctgcgtccg ttagcggaca tcaacaccat ctttactgag 960

atggaagaag gcaaaatccg tggccgcatg gtgattgatt tccgtcacta a 1011

Claims

1.D-木糖酸脱水酶，其特征在于，所述D-木糖酸脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1~4所示。

2.编码权利要求1所述D-木糖酸脱水酶的基因。

3.一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒中包含权利要求2所述的基因。

4.一种重组细胞，其特征在于，该重组细胞中包含权利要求2所述的基因。

5.权利要求1所述D-木糖酸脱水酶在制备多元醇中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的多元醇为1,2,4-丁三醇。

7.一株产1,2,4-丁三醇的基因工程菌，其特征在于，在大肠杆菌中导入了权利要求2所述的编码D-木糖酸脱水酶的基因。

8.根据权利要求7所述的产1,2,4-丁三醇的基因工程菌，其特征在于，该大肠杆菌中导入了D-木糖脱氢酶基因、苯甲酰甲酸脱羧酶基因、醇脱氢酶基因。

9.根据权利要求7所述的产1,2,4-丁三醇的基因工程菌的构建方法，其特征在于，

（1）将D-木糖酸脱水酶基因、D-木糖脱氢酶基因、苯甲酰甲酸脱羧酶基因、醇脱氢酶基因分别克隆至表达质粒中，所述的表达质粒包括pCWJ，得到重组质粒，

（2）再将重组载体转化宿主菌，所述的宿主菌为大肠Trans 1 T1，得到产1,2,4-丁三醇的基因工程菌。

10.权利要求7、8任一所述产1,2,4-丁三醇的基因工程菌在制备1,2,4-丁三醇中的应用。