CN112522173B

CN112522173B - 一种生产异源碱性蛋白酶的工程菌及其构建方法

Info

Publication number: CN112522173B
Application number: CN202011539757.XA
Authority: CN
Inventors: 路福平; 李玉; 刘逸寒; 陈雪佳; 王茂军; 王兴吉; 李庆刚; 王克芬; 刘文龙; 刘夫锋; 张�杰; 佟新伟
Original assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd; Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd; Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2020-12-23
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2040-12-23
Also published as: CN112522173A

Abstract

本发明目的是通过对基因工程宿主的定向改造，提供一株能够高效稳定生产异源蛋白酶的基因工程菌，以解淀粉芽孢杆菌为宿主，首先将宿主的8种胞外蛋白酶aprE、epr、mpr、vpr、nprE、bpr、wprA、aprX缺失，得到胞外蛋白酶缺陷型菌株；还将宿主的α‑淀粉酶和胞外多糖基因簇eps缺失；还将表达异源碱性蛋白酶的高拷贝质粒导入宿主，得到一株高效生产异源碱性蛋白酶的基因工程菌。并且该工程菌在发酵过程中粘性大大降低，利于产物蛋白酶的分离纯化。

Description

一种生产异源碱性蛋白酶的工程菌及其构建方法

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，特别涉及一种生产异源碱性蛋白酶的工程菌及其构建方法。

背景技术

碱性蛋白酶(Alkaline protease)，一类能够催化水解肽键的酶，其活性中心含丝氨酸，又称丝氨酸蛋白酶，在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，它不但能水解肽键，还具有水解酰胺键、酯键以及转酯和转肽的功能。这类酶广泛存在于动物胰脏、细菌、霉菌中，酶活性可受到二异丙基磷酰氟(DFP)、苯甲基磺酰氟(PMSF)和马铃薯抑制剂(PI)等的专一性抑制。碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。由于微生物分泌的蛋白酶均为胞外酶，与动、植物来源的蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高等特点；且高产菌株选育简单、快速，与中性蛋白酶相比，具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性且有一定的酯酶活力，易于实现工业化生产。

工业上用于生产蛋白酶的菌种主要为芽孢杆菌属，包括：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，其中，解淀粉芽孢杆菌强大的分泌能力使其成为最具潜力的异源蛋白表达宿主，此外，解淀粉芽孢杆菌还具有以下优点：(1)是国际公认的GRAS生物，非致病性，不产生外毒素及内毒素，对环境无污染；(2)细胞壁组成简单，便于蛋白的分泌，并且不含有热源性脂多糖；(3)分子生物实验中用到的很多噬菌体和质粒都可作为其转化的工具，且重组DNA容易转入；(4)蛋白被直接分泌到胞外的培养基中，不会积聚，有利于蛋白的下游回收和纯化，降低整个生产链的操作成本；(5)芽孢杆菌为单细胞生物，在发酵过程中可以达到很高的细胞密度，且培养基相对比较简单，成本低、产出高，符合工业生产的要求。目前在食品、酶制剂的工业生产中得到广泛应用，如大规模生产α-淀粉酶、蛋白酶、饲料添加剂、β-葡聚糖酶等。但在异源蛋白表达方面解淀粉芽孢杆菌仍存在表达***不稳定及表达量低的问题，由于解淀粉芽孢杆菌自身可以分泌多种胞外蛋白酶，而这些酶类可以对异源蛋白产生强烈的降解作用，因此，减少菌体自身蛋白酶的降解作用是提高外源蛋白酶表达的关键。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明目的是通过对基因工程宿主的定向改造，提供一株能够高效稳定生产异源蛋白酶的基因工程菌。并且该工程菌在发酵过程中粘性大大降低，利于产物蛋白酶的分离纯化。

本发明技术方案概述如下：

一种基因工程菌，以解淀粉芽孢杆菌为宿主，首先将宿主的8种胞外蛋白酶aprE、epr、mpr、vpr、nprE、bpr、wprA、aprX缺失，得到胞外蛋白酶缺陷型菌株；还将宿主的α-淀粉酶和胞外多糖基因簇eps缺失；还将表达异源碱性蛋白酶的高拷贝质粒导入宿主，得到一株高效生产异源碱性蛋白酶的基因工程菌。

优选的，所述解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.11218(生物保藏信息已公开于专利CN105087448B)。

优选的，所述异源碱性蛋白酶为嗜碱芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶。

优选的，所述表达异源碱性蛋白酶的高拷贝质粒含有核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的启动子pLY-2与信号肽amyE。

本发明还提供所述基因工程菌用于发酵生产碱性蛋白酶的用途，所述基因工程菌的发酵液中所述碱性蛋白酶的酶活最高达到19524U/mL或64328U/mL。

本发明还提供所述基因工程菌的构建方法，在一种具体实施方式中，主要是利用温敏型质粒介导的同源重组方法对宿主基因组上的8个胞外蛋白酶基因、α-淀粉酶基因及胞外多糖编码基因簇进行串联敲除，并导入含有异源碱性蛋白酶基因的表达质粒。

本发明还提供一种高效生产异源碱性蛋白酶的方法，所述方法是在适宜条件下培养所述基因工程菌，并从其培养物中收集碱性蛋白酶。

本发明的有益效果：

本发明通过串联敲除解淀粉芽孢杆菌基因组上的8个胞外蛋白酶基因、α-淀粉酶基因及胞外多糖基因簇eps，构建了一株主要胞外酶缺失的菌株，同时将表达嗜碱芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶的高拷贝质粒导入其中获得基因工程菌，经过48h发酵培养后发酵液中重组碱性蛋白酶的活性最高为19524U/mL；在5L发酵罐中，重组碱性蛋白酶活力达到了64328U/mL，本发明基因工程菌显著提高了异源蛋白酶的表达量。本发明通过敲除解淀粉芽孢杆菌自身分泌的主要胞外酶，减少自身蛋白酶对外源碱性蛋白酶表达的影响。该方法简单易行，适用于解淀粉芽孢杆菌***，为介导解淀粉芽孢杆菌表达***中异源蛋白酶基因的高效表达奠定基础，推动异源蛋白酶的工业化大规模生产，同时也可应用于其他异源基因的高效表达。

菌体分泌的蛋白酶分为胞内和胞外两种，其中，胞外蛋白酶需要在信号肽的引导下，进入分泌通道，通过分泌到细胞外发挥各种生理功能。在解淀粉芽孢杆菌中，主要有4种蛋白分泌途径：Sec分泌途径、Tat分泌途径、Com分泌途径和ABC分泌途径，其中，大多数蛋白都依靠Sec途径分泌，以2个精氨酸开头的信号肽则通过Tat途径分泌。通过Signal P软件分析碱性蛋白酶及a-淀粉酶的信号肽均为Sec分泌途径的信号肽，二者都是通过Sec途径进行分泌的。结合对发酵液进行质谱检测的分析结果得出解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218表达的胞外产物中，a-淀粉酶的表达量最高(图4、图5)，推测a-淀粉酶的分泌会占据碱性蛋白酶的分泌通道，因此敲除a-淀粉酶编码基因，及胞外多糖编码基因簇eps，通过缺失解淀粉芽孢杆菌分泌的主要胞外酶及阻碍胞外多糖合成的eps基因簇，降低发酵液的粘度，在提高目标蛋白表达量的同时，简化产物的分离纯化。

附图说明

图1：温敏型敲除载体T2的构建过程；

图2：同源重组敲除原理。

图3：胞外蛋白酶敲除菌株核酸电泳验证(其中△表示基因敲除菌株，CK是以未敲除菌株为模板的对照)。

图4：重组菌株J1发酵液的SDS-PAGE。

图5：发酵液质谱分析结果。

图6：amyE基因敲除菌株核酸电泳验证。

图7：eps基因簇结构示意图。

图8：eps基因簇敲除菌株核酸电泳验证。

图9：重组菌株J1、J2、J3核酸电泳验证。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

以下实施方案所使用的培养基及酶活测定方法如下：

种子培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；

发酵培养基：玉米粉64g/L，豆饼粉40g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，高温淀粉酶0.7g/L。

大肠杆菌感受态制备培养基：

LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；CaCl₂溶液：0.1mol/L。

解淀粉芽孢杆菌感受态制备培养基：

LBS培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，山梨醇9.1085g/L；

复苏培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，山梨醇9.1085g/L，甘露醇6.92246g/L。

本发明所用碱性蛋白酶酶活力测定方法参照GB/T 23527-2009附录B福林酚法进行，即1个酶活力单位(U/mL)定义为1mL酶液在40℃、pH 10.5条件下反应1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量。

以下实施方案中所涉及基因的核苷酸序列如下(NCBI登录号)：

aprE：GU825966.1(594bp至1742bp)；

epr：CP054415.1(全基因组3751547bp至3753295bp)；

mpr：CP054415.1(全基因组886397bp至887311bp)；

vpr：CP002634.1(全基因组3706130bp至3708541bp)；

nprE：K02497.1(254bp至1819bp)；

bpr：CP054415.1(全基因组1624354bp至1628643bp)；

wprA：CP018902.1(全基因组310740bp至313415bp)；

aprX：CP018902.1(全基因组983721bp至985049bp)；

amyE：MT590601.1(564bp至2108bp)；

eps：CP018902.1(全基因组2456935bp至2472647bp)。

本发明技术方案进一步详述如下：

本发明构建一株高效生产异源蛋白酶的基因工程菌，主要是利用温敏型质粒介导的同源重组方法对宿主基因组上的8个胞外蛋白酶基因、α-淀粉酶基因及胞外多糖编码基因簇进行串联敲除，并导入含有异源碱性蛋白酶基因的表达质粒，包括如下步骤：

1)根据解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218基因组上aprE、epr、mpr、vpr、nprE、bpr、wprA、aprX、amyE基因及胞外多糖编码基因簇eps的核苷酸序列，利用软件SnapGene分别设计各自的上下同源臂引物，同源臂长度大约控制在400～500bp，此长度的同源臂介导的敲除效率较高；

2)将上下同源臂扩增片段纯化回收，以回收产物为模板进行重叠PCR扩增出上下同源臂的重叠片段；

3)将重叠片段纯化回收，回收产物用Sac1、Sma1双酶切，纯化后与相同酶切割的T2温敏型载体连接，得到10种不同的温度敏感型敲除载体；

4)将连接产物化转到EC135的感受态细胞中，进行甲基化修饰，修饰后的质粒电转到解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218中，将阳性转化子在45℃和卡那霉素抗性的LB试管中传代培养，在该条件下，敲除载体的复制子无法正常复制，进而筛选出敲除载体整合在宿主基因组上的单交换菌株；将发生单交换的菌株在无抗LB试管中于37℃传代培养约5代，进行对点板实验，在卡那霉素抗性平板上不长而在无抗平板上生长的菌落初步认为敲除成功，经过菌落PCR验证及测序得到单基因敲除菌株；

5)将第二个敲除质粒电转至步骤4)中单基因敲除菌株的感受态细胞，经过单交换及双交换2次传代，筛选出第二个基因缺失的敲除菌株，并测序验证；在此基础上继续重复步骤4)的操作转入第三个敲除质粒、第四个敲除质粒…，最终获得8个胞外蛋白酶基因、α-淀粉酶基因及胞外多糖基因簇eps串联敲除的菌株；

6)利用电击转化方式将含有异源碱性蛋白酶基因的表达质粒电转至原宿主CGMCCNo.11218中，筛选得到阳性转化子，记为J1；同时将所述表达质粒电转化至5)过程中8个胞外蛋白酶基因敲除后的菌株中，记为J2；同时将所述表达质粒电转至步骤5)最终得到的8个胞外蛋白酶基因、α-淀粉酶基因及胞外多糖基因簇eps串联敲除的菌株，验证正确的转化子即为最终的工程菌，记为J3；

7)将重组菌株J1、J2、J3进行摇瓶发酵，48h后测定三种重组菌株的碱性蛋白酶活力。

需要说明的是，方案详述中使用的术语第一个、第二个仅表示将一个操作对象与另一个操作对象区分开，并非是限制或暗示了这些操作对象之间存在实际的顺序关系。

以下实施例进一步叙述各步骤具体操作及所得结果。

实施例1：

一株生产异源碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法。

1、敲除基因同源臂重叠片段的获得(以epr为例)。

根据解淀粉芽孢杆菌全基因组序列信息，以epr基因为例，通过SnapGene设计epr的上下游同源臂引物，并利用PCR扩增目的片段，将扩增出的上下游同源臂片段纯化回收，并以回收产物为模板进行重叠PCR，所用引物序列及酶切位点如表1所示。

扩增Epr同源臂时所用的反应体系为50μL，如下所示：

Epr的退火温度是56℃，延伸时间与基因长度相对应，反应程序如下：

重叠PCR所用的反应体系为50μL，如下所示：

重叠PCR的退火温度是56℃，延伸时间与基因长度对应，反应程序如下：

2、敲除载体的构建。

重叠PCR产物纯化后用Sma1-Sac1限制性核酸内切酶进行双酶切，然后对双酶切产物进行回收，再与经过相同酶切割的T2载体过夜连接，得到敲除载体。

酶切体系如下：

连接条件为16℃，6h或过夜连接，连接体系如下：

目的片段 4.5μL

线性T2片段 0.5μL

Solution I 5.0μL；

3、将连接产物化转到EC135的感受态细胞，进行甲基化修饰，过程如下：

(1)在-80℃冰箱中取出感受态，立即置于冰上3～5min；

(2)吸取8μL连接产物到感受态细胞中，并轻轻混匀，冰上放置20min；

(3)冰浴后将其转入42℃水浴锅，热击90s，随后立即冰浴3min，加入750μL LB复苏液；

(4)置于37℃，220r/min摇床复苏1h左右，涂布于含有100μg/mL卡那霉素、100μg/mL奇霉素的双抗平板，37℃培养箱培养12h。

将阳性转化子转接到含有卡那霉素及奇霉素抗性的液体LB培养基中37℃培养，待OD600达到0.2左右时，加入***糖于30℃条件下诱导培养约12h，利用Omega小量快速提取试剂盒提取质粒，按试剂盒附带说明书的操作步骤进行。

4、将甲基化修饰成功的敲除质粒电转至解淀粉芽孢杆菌中，电转方法如下：

(1)75％酒精清洗电转杯，在紫外灯下照射20min以上，并在冰上预冷。

(2)将100μL感受态和10ng质粒DNA混合加入电转杯，冰上放置3min。

(3)2500V电击，电击时间一般为4-6ms。

电击后立即加入1ml复苏培养基，37℃，复苏3h。涂布卡那霉素平板，37℃培养箱培养12h，筛选转化子进行验证。

挑取验证正确的阳性转化子于5mL添加卡那霉素抗性的LB液体培养基中，45℃，180r/min振荡培养12h后，取10μL菌液转接到新鲜的添加卡那霉素的5mL液体LB培养基中，记为第二代；连续传到第3代时，稀释涂布于卡那霉素平板，45℃培养12h后，菌落PCR验证敲除质粒是否整合在基因组的相应位置。

将发生单交换的菌落转接到5mL无抗LB液体培养基中，于37℃，220r/min摇床培养，每12h记为一代，连续传代3～4次，将菌液稀释涂布于无抗LB琼脂平板，长出的单菌落在无抗与卡那霉素抗性琼脂平板对点，筛选出在卡那霉素抗性平板上不长而在无抗平板上生长的菌落，并进行菌落PCR验证并测序。

5、再按照上述1-4的步骤敲除宿主的aprE、mpr、vpr、nprE、bpr、aprX、wprA、amyE及eps基因簇，同源臂扩增引物如表1，扩增体系及扩增程序同步骤1。得到敲除菌株。

表1敲除基因同源臂扩增引物

6、利用电击转化方法将含有异源碱性蛋白酶基因的表达质粒导入上述构建的3株基因工程菌，具体过程如下：

(1)由苏州金唯智生物科技有限公司合成pLY-2启动子与枯草芽孢杆菌amyE信号肽的核苷酸序列(如SEQ ID NO：1所示)；

(2)利用PCR技术以嗜碱芽孢杆菌基因组为模板扩增碱性蛋白酶基因(序列如GenBank：FJ940727.1所示)，对其进行纯化回收，引物见表1，反应体系及反应条件如下：

(3)利用从北京全式金生物技术有限公司购买的无缝克隆酶将pLY-2启动子与枯草芽孢杆菌amyE信号肽片段、嗜碱芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶基因回收片段及线性化载体pWB980连接；连接体系如下：

(4)将(3)中的反应体系50℃反应15min后化转到枯草芽孢杆菌WB600中，方法如下所述；

①挑取新活化的枯草芽孢杆菌WB600单菌落于5mL LB液体培养基中，37℃，220r/min，过夜培养；

②取100μL培养液转接至5mL SPI培养基中，37℃，220r/min培养至对数生长末期OD600＝1.2(约3–4h)；

③取200μL生长至对数期末的培养液至2mL SPII培养基中，37℃，100r/min培养1.5h；

④在上述SPII培养基的菌体中加入20μL 10mmol/L EGTA，37℃，100r/min培养10min；

⑤加入连接产物，37℃，100r/min培养30min；

⑥调节转速至220r/min，继续培养1.5h，取菌液涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB筛选平板，37℃培养12h，筛选阳性转化子进行验证。

提取验证正确的转化子的质粒，电转至原宿主CGMCC No.11218中，验证阳性转化子，记为J1；同时将质粒电转化至步骤5)过程中8个胞外蛋白酶基因敲除后的菌株中，记为J2；同时将质粒电转至步骤5)最终得到的敲除菌株，验证阳性转化子，记为J3；验证结果如图9所示。

实施例2：

异源碱性蛋白酶基因工程菌的表达及分析。

将新鲜LB平板上的重组菌株J1、J2与J3的单菌落分别接入50mL硫酸卡那霉素抗性的种子培养基中，37℃、220r/min振荡培养12h，以2％的接种量转接于含有卡那霉素抗性的发酵培养基中，于37℃、220r/min发酵培养48h。

按照国家标准GB/T 23527-2009附录B福林酚法测定重组菌株发酵上清液中碱性蛋白酶的酶活，经测定3株重组菌株的发酵上清液中碱性蛋白酶活力在48h达到最高，重组菌J3表达的重组碱性蛋白酶活力最高达到19524U/mL，是重组菌J1(酶活为13985U/mL)的1.40倍，是重组菌J2(酶活力为17042U/mL)的1.15倍。

实施例3：

重组碱性蛋白酶基因工程菌的放大实验。

挑取平板上的重组菌单菌落接入100mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220r/min。培养4h后，以2％的接种量转接到100mL的发酵培养基中，37℃，220r/min，培养8h后，以2％的接种量转接到装液量为3L的总体积为5L的发酵罐中进行放大实验。其中，发酵过程控制发酵罐中溶氧量为40％以上，搅拌速度为600-700rpm，温度为37℃，当pH＝7时开始补料(补料培养基：棉籽蛋白50g/L，糊精300g/L)，初始补料量为100g/h，整个发酵期间通过补料来控制DE值为15mg/mL-18mg/mL。发酵前期适当添加消泡剂来控制发酵过程中泡沫的产生。每隔两个小时取样，福林酚法测定碱性蛋白酶酶活。测得胞外蛋白酶重组菌株的碱性蛋白酶酶活在发酵58h后达到最大为64328U/mL，且发酵液的粘性大大降低，有效提高了溶氧，降低生产成本。

虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学、山东隆科特酶制剂有限公司

<120> 一种生产异源碱性蛋白酶的工程菌及其构建方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 725

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cattatgttt gaatttccgt ttaaagaatg ggctgcaagc cttgtgtttt tgttcatcat 60

tatcttatat tactgcatca gggctgcggc atccggaatg ctcatgccga gaatagacac 120

caaagaagaa ctgcaaaaac gggtgaagca gcagcgaata gaatcaattg cggtcgcctt 180

tgcggtagtg gtgcttacga tgtacgacag ggggattccc catacattct tcgcttggct 240

gaaaatgatt cttcttttta tcgtctgcgg cggcgttctg tttctgcttc ggtatgtgat 300

tgtgaagctg gcttacagaa gagcggtaaa agaagaaata aaaaagaaat catctttttt 360

gtttggaaag cgagggaagc gttcacagtt tcgggcagct ttttttatag gaacattgat 420

ttgtattcac tctgccaagt tgttttgata gagtgattgt gataatttta aatgtaagcg 480

ttaacaaaat tctccagtct tcacatcggt ttgaaaggag gaagcggaag aatgaagtaa 540

gagggatttt tgactccgaa gtaagtcttc aaaaaatcaa ataaggagtg tcaagaatgt 600

ttgcaaaacg attcaaaacc tctttactgc cgttattcgc tggattttta ttgctgtttc 660

atttggttct ggcaggaccg gcggctgcga gtgctgaaac ggcgaacaaa tcgaatgagc 720

ttaca 725

Claims

1.一种基因工程菌，以解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218为宿主，首先将宿主的8种胞外蛋白酶aprE、epr、mpr、vpr、nprE、bpr、wprA、aprX缺失，得到胞外蛋白酶缺陷型菌株；还将宿主的α-淀粉酶和胞外多糖基因簇eps缺失；还将表达异源碱性蛋白酶的高拷贝质粒导入宿主，得到一株高效生产异源碱性蛋白酶的基因工程菌；所述表达异源碱性蛋白酶的高拷贝质粒含有核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的启动子pLY-2与信号肽amyE；

所述aprE是NCBI：GU825966.1中的594bp至1742bp；所述epr是NCBI：CP054415.1中的3751547bp至3753295bp；所述mpr是NCBI：CP054415.1中的886397bp至887311bp；所述vpr是NCBI：CP002634.1中的3706130bp至3708541bp；所述nprE是NCBI：K02497.1中的254bp至1819bp；所述bpr是NCBI：CP054415.1中的1624354bp至1628643bp；所述wprA是NCBI：CP018902.1中的310740bp至313415bp；所述aprX是NCBI：CP018902.1中的983721bp至985049bp；所述amyE是NCBI：MT590601.1中的564bp至2108bp；所述eps是NCBI：CP018902.1中的2456935bp至2472647bp；所述异源碱性蛋白酶为嗜碱芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶。

2.权利要求1所述基因工程菌用于发酵生产碱性蛋白酶的用途。

3.一种高效生产异源碱性蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法是在适宜条件下培养权利要求1所述基因工程菌，并从其培养物中收集碱性蛋白酶。