CN101137749A - 新的微生物酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可获自木霉属菌种(Trichoderma spp.)的胞外酪氨酸酶和通过重组技术生产它们的方法和手段。这些酶特别用于交联食物蛋白。

Description

新的微生物酶及其应用
发明领域
本发明涉及酶技术，并且更确切地说，涉及新的真菌酶蛋白及其应用。本发明进一步涉及编码所述酶的多核苷酸，生产它们的方法和用于生产所述酶的表达载体和宿主细胞。
发明背景
酶用于各种类型的纸浆和造纸工业、纺织工业以及食品、饲料和饮料工业的生产过程。酶还用于化妆品和制药工业以及洗涤剂。工业化酶可以来源于动物、植物或微生物并且优选胞外酶。它们通常更为稳定并且易于通过重组技术生产。从宿主细胞中分离和纯化胞内酶成本高并且费力且因此如果所述的酶为胞外酶，即从细胞中分泌的蛋白质，那么是有利的。此外，需要的是可以以工业化规模大量生产所述的酶并且生物体是安全的且对培养而言是便利和经济的。
蛋白质为可再生原料中的重要成分且因此食品、纺织纤维等包含大量蛋白质。酶可以用于修饰蛋白质和改变它们在这些材料中的技术性能。蛋白质基质可以由能够降低蛋白质分子量的水解酶(蛋白酶)来修饰。蛋白质还可以由能够在蛋白质的氨基酸残基之间产生共价交联键的酶(作为实例的转谷氨酰胺酶，它在赖氨酸与谷氨酰胺残基之间产生同工肽键)或由能够氧化某些氨基酸残基的酶来修饰。氧化某些氨基酸残基反过来也可以导致交联键的形成。通过交联修饰蛋白质材料通常用于例如食品加工。就食品质量而言，质地是极为重要的因素。它不仅涉及感官知觉，而且涉及保水能力、胶凝和乳化性能以及稳定性。
通过蛋白质交联的酶辅助的结构改造可以应用于几种食品应用，例如肉类、鱼类、乳制品和谷类加工。转谷氨酰胺酶为众所周知的酶，例如，它用于使肉类部分低温结合在一起以便产生重构的肉类产品，使切碎的肉类产品的质地和保水能力改善，鱼生料结构的改善，具有良好保水性而无不良的脱水收缩作用的酸乳酪生产中的乳凝胶形成，防止烹调后面食制品的质地劣化，改善由低级面粉焙烤的面包的面包体积。例如，使用转谷氨酰胺酶对素食品进行酶促交联披露在WO03/007728中。
已知转谷氨酰胺酶通过在不同蛋白质中/之间形成ε(γ-谷氨酰)赖氨酸同工肽键催化蛋白质中或之间的交联，所述的蛋白质诸如为肌球蛋白、明胶和胶原蛋白、酪蛋白、酪蛋白酸盐、乳清蛋白、大豆蛋白、谷蛋白、卵蛋白(Kuraishi等，2001；Nielsen，1995)。然而，反应性依赖于蛋白质底物中的靶氨基酸，即赖氨酸和谷氨酰胺的可利用性和易接近性。因此，并非所有蛋白质均为转谷氨酰胺酶的合适的底物，这是因为蛋白质中的谷氨酰胺或赖氨酸残基的易接近性不足或质量有限。
使用氧作为电子受体的酚氧化酶特别适合于酶促方法，因为在反应中不需要单独的需昂贵再生的辅因子，即NAD(P)H/NAD(P)。这些酚氧化酶包括：例如，漆酶和酪氨酸酶。它们均为铜蛋白并且可以氧化各种酚类化合物。漆酶和酪氨酸酶的底物特异性部分重叠。
酪氨酸酶催化一酚类和芳族胺类的邻位-羟基化并且将邻-二酚类氧化成邻-醌类或将邻-氨基苯酚类氧化成邻-醌亚胺类(Lerch，1981)。传统上，可以基于对抑制剂的底物特异性和敏感性区分酪氨酸酶与漆酶。然而，这种区别目前基于结构特征。在结构上，酪氨酸酶与漆酶的主要差别在于酪氨酸酶具有双核铜位点，在其活性位点上带有两个III型铜，而漆酶在活性位点上总共带有四个铜原子(I型和II型铜和一对III型铜)。
酪氨酸酶能够将蛋白质中的酪氨酸残基氧化成相应的醌类，这些醌类可以进一步与例如游离巯基和/或氨基反应生成酪氨酸-半胱氨酸和酪氨酸-赖氨酸交联(Ito等，1984)。还提示了醌类通过彼此偶联形成酪氨酸-酪氨酸键合。
例如，通过漆酶交联蛋白质的方法已经披露在US2002/9770中。将来源于豆类和谷类的植物蛋白和动物蛋白，包括乳、蛋、肉类、血液和腱列为合适的底物。然而，漆酶与蛋白质并且还与其它可能的底物(例如酚类成分)形成游离基。因此，该过程比醌衍生的由酪氨酸酶催化的非游离基反应更难以控制。在漆酶催化的反应中，某些稳定的游离基也可以保留在基质内，导致解聚和随后的作为时间函数的基质破坏。真菌漆酶披露在US2002/19038中。
已经综述了酪氨酸酶交联食物蛋白的能力(Matheis和Whitaker，1984；Matheis和Whitaker，1987)。在这些研究中，使用了胞内蘑菇属(Agaricus)酪氨酸酶。蛋白质与酪氨酸酶的交联通过由蛋白质结合的酪氨酸形成邻-醌类进行。这些邻-醌类彼此缩合或与存在于蛋白质中的游离氨基和巯基反应。
已经提示酪氨酸酶用于交联乳清蛋白(Tha lmann和Loetzbeyr，2002)和改变面团的物理性能(Takasaki和Kawakishi，1997)。除了食物蛋白应用之外，酪氨酸酶还可以用于例如化妆品和药物领域(DE10244124)。WO99/57993中披露了交联酶在反刍动物饲料中的应用，且US2003/0177589中披露了用酪氨酸酶处理蛋白质纤维，由此防止例如羊毛织物皱缩的方法。通过使多肽，诸如明胶和多糖，诸如脱乙酰壳多糖与酪氨酸酶接触获得的结合物披露在WO2004/029096中。明胶-脱乙酰壳多糖结合物可以用于医学应用。酪氨酸酶也已经用于聚合为胶原蛋白纤维成分的原胶原大分子(Dabbous，1966)。在酪氨酸残基之间形成分子间和分子内交联键导致聚合。
酪氨酸酶广泛分布于自然界中。它们涉及植物、哺乳动物和昆虫中的黑色素和真黑素合成。在果实和蔬菜中，酪氨酸酶导致酶促褐变反应和哺乳动物中的色素沉着。在真菌中，酪氨酸酶的作用与细胞分化、孢子形成、毒力和发病机制相关(Sanchez-Ferr er等，1995)。
人所共知和表征的酪氨酸酶来源于哺乳动物。从结构和功能角度来看，最广泛研究的真菌酪氨酸酶来自双孢蘑菇(Agaricusbisporus)(Wichers等，1996)和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)(Lerch，1983)。此外，已经报导了少数细菌酪氨酸酶，其中链霉菌属(Streptomyces)酪氨酸酶得到最充分的表征(US5,801,047和US5,814,495)。此外，例如，已经披露了来自芽孢杆菌属(Bacillus)和漆斑菌属(Myro thecium)(EP919628)、毛霉菌(Mucor)(JP61115488)、Miriococcum(JP60062980)、曲霉属(Aspergillus)、Chaetotomastia、Ascovaginospora(Abdel-Raheem和Shearer，2002)、栓菌属(Trametes)(Tomsovsky和Homolka，2004)的酪氨酸酶。
已经描述了真菌胞内酪氨酸酶并且将它们推定为胞质酶(VanGelder等，1997)。实际上，迄今为止分析的真菌酪氨酸酶基因不具有信号序列，不过，有报导宣称在一些淡水子囊菌(Abdel-Raheem和Shearer，2002)、毛壳属(Chaetomium)(JP62205783)和栓菌属的菌种(Tomsovsky和Homolka，2004)的培养物上清液中检测到了酪氨酸酶活性。报导的培养物上清液中的酪氨酸酶活性可能因细胞自溶所致。
Score等，1997已通过初步和简单的平板分析研究了两种担子菌(Serpula lacrymans和单纯粉孢革菌(Conidiophorapu teana)与几种半知菌(木霉属的菌种和ScytaliumFY)之间的种间相互作用过程中的酚氧化酶和过氧化物酶产生。作者分别使用了萘酚和对甲酚作为漆酶和酪氨酸酶的特异性底物。在Serpula lacrymans和所有三种木霉属分离物中涉及的相互作用中检测到了漆酶。实际上，Hlker等2002近来已经分离和表征了来自木霉属的漆酶。基于来自初步平板试验的结果，也提示了在测试的木霉属菌种中的酪氨酸酶活性(Scor e，1997)。然而，并未分离或纯化酪氨酸酶。Mackie等，1999已经报导了当研究土壤细菌与真菌分离物之间的挥发性有机化合物相互作用时，在绿色木霉(Trichoderma viride)中的漆酶和酪氨酸酶活性。然而，迄今为止，尚未从木霉属中分离，也未进一步表征酪氨酸酶。
据报导链霉菌属具有胞外酪氨酸酶并且将该酶分泌到培养物上清液中，然而，酪氨酸酶自身并不具有用于分泌的信号序列。链霉菌属酪氨酸酶的分泌需要第二种具有信号序列的蛋白质(在抗生链霉菌(S.antibio ticus)中称作MelC1)(Leu等，1992；Tsai和Lee，1998)，并且这使得链霉菌属酪氨酸酶的工业化生产比天然分泌的酪氨酸酶更为繁琐和复杂。
微生物酪氨酸酶以异源方式产生。来自例如双孢蘑菇的酪氨酸酶基因已少量在大肠杆菌中得到表达(Wichers等，2003)。来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的酪氨酸酶基因me10在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中以异源方式产生(Fujita等，1995)。此外，来自抗生链霉菌的酪氨酸酶基因与可能在蛋白质分泌中涉及的ORF438蛋白质一起在大肠杆菌中被共同表达(Della-Cioppa等，1990，US5801047))。然而，在文献中报导的微生物酪氨酸酶的表达水平相对较低并且不能产生高滴度的酶。实际上，酪氨酸酶的利用率已经限制了该酶在不同应用中的测试。实际上，购自Sigma的蘑菇属酪氨酸酶已成为唯一的商购酪氨酸酶。然而，这种商购酶为具有相对低活性的粗制酶并且极为昂贵。
鉴于上述情况，仍然存在对在活性和利用率方面均具有所需性能的新的酪氨酸酶的需求。为便于回收，该酶应当以大量从细胞中分泌出来，由此在分离过程中避免对细胞破碎的需求并且可以避免由细胞碎片而引起的复杂情况。该酶应进一步适合于通过重组技术以商业可接受的量，经济地和以最小的环境和健康危险率生产。安全生物体的使用在食品应用中尤其重要。本发明符合这些要求。
尽管胞内蛋白质通过与信号序列偶联原则上也能在重组***中作为分泌产物产生，但是预计天然分泌的蛋白质对胞外产生更为有利。这是因为它们充分适合于分泌途径的蛋白质折叠和运输***。
发明概述
据我们所知本发明人已经鉴定了第一种真菌胞外酪氨酸酶。
本发明的一个目的在于提供所述的新酶。这些酶适用于蛋白质修饰。
本发明的另一个目的在于提供蛋白质修饰的方法以及该新酶的应用。
本发明的另一个目的在于提供生产该新酶的方法和用于其生产的手段。
本发明目前提供了在木霉属真菌中发现的新的酪氨酸酶。这些酶为胞外酶并且充分适合于重组生产和食物蛋白交联应用。木霉属一般被认为是同源和异源地极好的蛋白质生产者。另一个优点在于木霉属为众所周知的一般视为安全的生物体。
本发明涉及包含具有酪氨酸酶活性的区段的蛋白质，其中所述的蛋白质包含与如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列或与其酪氨酸酶活性片段具有至少70％同一性的氨基酸序列。该蛋白质可以获自木霉属的菌种。本发明进一步涉及编码该蛋白质的分离的多核苷酸，包含该多核苷酸的表达载体和包含该表达载体的宿主细胞。
本发明进一步涉及生产新的蛋白质的方法，该方法包括下列步骤：a)将编码所述蛋白质的多核苷酸***宿主细胞；b)使所述宿主细胞在适合于表达所述蛋白质的条件下生长；和c)任选地回收并且纯化产生的所述蛋白质。
另外，生产所述蛋白质的方法包括下列步骤：将有效增强胞外酪氨酸酶基因表达的启动子***宿主细胞，使所述启动子可操作地与所述基因连接，使所述宿主细胞在适合于所述蛋白质表达的条件下生长；和任选地回收并且纯化产生的所述蛋白质。
本发明还包括通过上述方法中的任一种获得的蛋白质。
本发明进一步包括具有酪氨酸酶活性的蛋白质在修饰包含蛋白质的材料或包含酪氨酸的肽类或在将酪氨酸氧化成L-多巴中的应用。提供了通过使包含蛋白质的材料或包含酪氨酸的肽类与具有酪氨酸酶活性的蛋白质接触修饰它们的方法，以及将酪氨酸氧化成L-多巴的方法，其中使酪氨酸与具有酪氨酸酶活性的蛋白质接触。
本发明的目的还有包含新的蛋白质的酶制品和由具有酪氨酸酶活性的蛋白质修饰过的包含蛋白质的材料。
本发明的具体实施方案如从属权利要求中所述。
本发明的其它目的，详细内容和优点从如下附图、详细描述和实施例中显而易见。
附图简述
附图1表示T.reeseiTYR1和TYR2氨基酸序列的比对。显示了一直到TYR2的C-末端切割位点的序列。信号序列在第一行。TYR1的推定的肽原切割位点如箭头所示。阴影部分显示了参与活性位点结构形成的氨基酸残基。带阴影的组氨酸为活性位点上两个Cu原子的配体。酪氨酸酶活性位点中所涉及的半胱氨酸与组氨酸之间的硫醚键由序列上方的水平线表示。
附图2表示用于转化T.reesei菌株的质粒pMS190的遗传学图谱。cbh1prom，cbh1启动子；Tcbh1，cbh1终止子；hph，潮霉素抗性基因；trpC，trpC终止子，CoIEI ori，大肠杆菌复制起点；bla，β-内酰胺酶基因。
附图3表示1小时和1-3天后pH2-8范围内的纯化的TYR2的稳定性。
附图4表示在30℃，40℃和50℃下测定的纯化的TYR2的热稳定性。
附图5表示在25℃，30℃和40℃下TYR2对肌原纤维蛋白的凝胶形成效率。
附图6表示使用和不使用TYR2处理的酪蛋白酸盐凝胶的硬度。
附图7披露了TYR2对最大距离Emax(mm)和在作为静止时间函数的小麦面团的Rmax参数下的距离Ex(mm)的作用。
附图8表示TYR2对作为静止时间函数的小麦面团的力(g)参数的作用。
发明详述
酪氨酸酶为通常已知的铜-酶。它在其活性位点上包含两个TIII-型铜并且它将各种酚类化合物氧化成相应的醌类。醌类为高度反应性的并且可以进一步以非酶促方式反应。酪氨酸酶的典型底物为酪氨酸，它首先被羟基化成多巴，然后进一步被该酶氧化成多巴醌。酪氨酸酶因此在同一种蛋白质中具有两种酶活性，即单酚单加氧酶活性(EC1.14.18.1)和儿茶酚氧化酶活性(EC1.10.3.1)。
Figure A20068000808100121
酪氨酸酶的底物特异性相对较宽并且该酶能够氧化若干多酚类和芳族胺类。然而，与漆酶(EC1.10.3.2)相反，酪氨酸酶无法氧化丁香阿哒嗪(syringaldazin)。
新蛋白质为胞外酪氨酸酶，即它们在其N-末端上带有在分泌过程中被切割掉的信号序列。该蛋白质在分泌过程中还能够进一步加工。换句话说，该蛋白质作为未成熟蛋白在胞内产生，它不一定具有酶促活性。在分泌过程中，该蛋白质被加工成为具有酶促活性的较小的蛋白质。该蛋白质的加工形式称作″成熟″蛋白。本发明的蛋白质″包含具有酪氨酸酶活性的区段″。这意味着该蛋白质可以为未加工的形式，但它至少包含酪氨酸酶活性所需的蛋白质的那一部分。换句话说，它包含成熟蛋白或至少包含其酶促活性片段。
可以通过本领域中一般公知的技术测定酪氨酸酶活性。L-多巴或酪氨酸可以用作底物，此后可以通过分光光度法监测多巴色素形成，或者可以通过监视耗氧量监测底物消耗。还可以在琼脂平板上通过添加适当底物，诸如酪氨酸观测酪氨酸酶活性，由此酪氨酸酶活性在菌落周围产生暗环带。
″信号序列″是指与蛋白质的N-末端部分结合的氨基酸序列，它有利于使蛋白质的成熟形式在细胞的外部分泌。蛋白质的成熟形式缺乏信号序列。
新的酪氨酸酶可以获自木霉属的菌种并且由可获自所述生物体的多核苷酸编码。本文所用的″可获自″是指蛋白质或多核苷酸可以获自木霉属菌种，但还包括与来源于该特定真菌或由其天然产生的类似的蛋白质和多核苷酸。等效物尤其可以在其它丝绸状真菌中发现。按照本发明的一个具体实施方案，新的蛋白质由可获自Trichodermareesei的多核苷酸编码。
称作tyr1(以支架19展示)(SEQ ID NO：1)和tyr2(以支架11展示)(SEQ ID NO：2)的来源于Trichoderma reesei的两种酪氨酸酶基因编码623(TYR1)(SEQ ID NO：3)和571(TYR2)(SEQ ID NO：4)个氨基酸的蛋白质。tyr1基因在下列核苷酸位置上包含3个内含子：I290-355；II487-571；III839-890。tyr2基因包含7个内含子：I159-397；II475-540；III624-725；IV774-832；V1199-1243；VI1429-1506；VII2123-2221。TYR1和TYR2均在N-末端上带有推定的信号序列，表明这些酶为胞外的。在数据库中最接近TYR1和TYR2的同源物为两种不同的推定来自玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)的酪氨酸酶(同一性分别为47％和46％)。已经在玉蜀黍赤霉的基因组测序工作中鉴定了这些蛋白质，但尚未证实它们具有酪氨酸酶活性。这两种T.reesei酪氨酸酶彼此具有30％同一性。一直到TYR2的C-末端切割位点的TYR1和TYR2的氨基酸序列的比对如附图1中所示。这些蛋白质在其N-末端上具有信号序列，这意味着它们为胞外的，即它们从细胞中分泌出来。信号序列预测程序提示TYR1的信号序列可以为20个氨基酸长度，而TYR2的信号序列可以为18个氨基酸长度。
至少TYR2在其C-末端进一步被蛋白水解加工，由此约1/3的该蛋白质被切割掉。可以预计TYR1也以类似的方式从其C-末端被加工。根据对胰蛋白酶消化肽段和溴化氰处理的酶的水解产物的质谱分析，TYR2的C-末端切割位点位于序列-GPNSG后的第410位氨基酸上(SEQID NO：4)。据报导许多真菌酪氨酸酶具有C-末端加工。根据文献所述，真菌酪氨酸酶在体内通过有限的蛋白酶剪切而活化，已经提示这种蛋白酶剪切打开了底物达到催化位点的通路(Decker和Tuczek，2000)。
此外，TYR1可以在其N-末端上的信号序列后包含肽原，该肽原在分泌过程中被特异性kex2-型肽酶切割掉。可能的切割位点可以位于序列S ITRRR后的第36与37氨基酸之间。
TYR1和TYR2在其活性位点上具有两个Cu-原子。该Cu-原子各自配位有三个组氨酸残基。可以在半胱氨酸和与Cu缔合的第二个组氨酸之间检测到也在其它真菌酪氨酸酶中发现的硫醚键。
新的蛋白质由可以获自通过使用引物扩增的木霉属菌种的DNA的多核苷酸编码，所述的引物选自如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8所示的序列。核酸的扩增一般为本领域公知的。通常使用在待扩增的序列每一侧杂交的正向和反向引物的引物对，通过PCR扩增该核酸序列。扩增的多核苷酸可以具有包含在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中的序列。新的蛋白质可以具有包含在SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中的氨基酸序列。″包含在″是指该序列具有所述序列的至少一部分。因此，所述的蛋白质可以仅包含SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4的酪氨酸酶活性片段。
如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中的一个或多个位点上的一种或多种氨基酸的添加、置换、缺失或***不一定影响蛋白质的分泌、加工或酶促特性。本发明的蛋白质因此可以与如SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列或与所述序列的酪氨酸酶活性片段具有至少70％或至少80％且尤其至少90％或至少95％的同一性。
按照本发明的一个实施方案，该蛋白质由能够与具有如SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2中所示序列的核酸杂交的多核苷酸编码。它包括与所鉴定序列的仅一部分杂交的序列。当然，它也包括与任一互补链杂交的序列。″杂交″是指分离的核酸链通过碱基配对与互补链连接的过程。杂交条件通常为中等或高度严格性的。例如，可以在50℃下的包含6x SSC(在0.09M柠檬酸钠中的0.9M NaCl，pH7)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)、5x Denhardt溶液和100μg/ml鲱精DNA的杂交混合物中进行中等严格性杂交。例如，可以在68℃下的相同杂交混合物中进行高度严格性杂交。
编码新蛋白质的多核苷酸可以具有SEQ ID NO：1或SEQ I D NO：2中包含的序列或能够与包含在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中的序列杂交。
因为新的酶为胞外的，所以它们特别适用于大规模生产。便利的是通过重组技术生产酪氨酸酶。这表示通过PCR反应扩增(Coen，2001)或其它的DNA重组方法(Sambrook等，1989)分离包含该酪氨酸酶基因的片段，在强启动子指导下将所述基因***表达载体中，将该载体转移到合适的宿主细胞中并且在促使酪氨酸酶产生的条件下培养该宿主细胞。通过重组技术在不同宿主***中生产蛋白质的方法为本领域众所周知的(Gellissen，2005)。另外，仅将强启动子可操作地与宿主染色体上的酪氨酸酶基因连接，由此所述基因的表达为超表达的。
本文所用的″表达载体″是指包含编码所述新蛋白质的多核苷酸的DNA构建体。为了能够指导蛋白质的表达，该载体包含下列可操作地连接的元件：转录启动子、编码所述蛋白质的区段和转录终止子。该载体可以为整合到染色体中的载体或自主复制的载体。
″宿主细胞″是指包含所述表达载体和能够表达由该载体所编码的蛋白质的任何宿主。宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞。可能的宿主为细菌、酵母和真菌，并且尤其是丝绸状真菌。按照一个优选的实施方案，以同源方式，即在木霉属中且尤其是在T.reesei中表达酪氨酸酶。其它可能的宿主可以为黑曲霉(Aspergil lusniger)、米曲霉、禾赤镰孢(Fusariumgraminearum)、朱红密孔菌(Pycnoporuscinnabarinus)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)、多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、Yarrowia lipolytica、啤酒糖酵母、大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
合适的启动子为具有强转录活性并且能够高度表达酪氨酸酶的启动子。用于在木霉属中表达的合适的强启动子为cbh1，并且可供选择的启动子为例如cbh2、eg11、xyn1、xyn2和tki1以及构巢曲霉(Aspergillus nidulans)gpdA的启动子。
按照本发明的一个具体的实施方案，所述的蛋白质通过下列步骤来生产：将编码胞外酪氨酸酶的DNA序列***宿主细胞，所述的DNA序列可以获自通过使用具有如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，或SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8中所示序列的引物对扩增的木霉属的DNA，在适合于表达的条件下使所述的宿主细胞生长并且从生长培养基中回收分泌的蛋白质且任选地纯化它。可以从生长培养基中分离该蛋白质并且通过本领域中公知的分离和纯化技术，诸如色谱、沉淀、离心、过滤、凝胶电泳等从其天然环境中进一步加以纯化。
本发明的酶制品为包含粗制或纯化形式的新酪氨酸酶的组合物。此外，它可以包含其它成分，包括其它蛋白质和酶。例如，它可以为蛋白质所分泌入的宿主细胞的生长培养基。
木霉属酪氨酸酶适用于使醌类形成任何种类的包含可与其反应的酚基的基质，随后例如在蛋白质基质中形成交联。
木霉属酪氨酸酶可以用于处理任何包含蛋白质的材料且尤其是具有相对高总含量或相对高含量的可及酪氨酸残基的蛋白质。此外，可以修饰包含酪氨酸的肽类。这些酶可以应用于不同类型的工业化应用，诸如药物、化妆品、纸浆和造纸、洗涤剂和纺织品工业以及饲料和食品工业。
木霉属酪氨酸酶尤其适合于处理包含蛋白质的食品，特别是肉类、乳制品、蔬菜和谷类材料。通过使食物蛋白与酪氨酸酶交联，食品的组织和流变学性质可以得到改善。
使用酪氨酸酶处理例如鱼类、禽类或其它肉类产品可以促进使用减少量的其它结构成形剂获得具有良好质地的产品。酪氨酸酶还可以用于胶凝，由此可以避免使用明胶。酪氨酸酶还可以用于防止脱水收缩，即水相分离，它是大量乳制品的问题，尤其是如果脂肪含量低，则更是如此。例如，在制备酸乳酪且尤其是低卡路里酸乳酪期间，固相与液相在贮藏过程中趋向于分离。这是令消费者不满的，但可以通过用酪氨酸酶处理酸乳酪中的原料得以防止。酪氨酸酶还可以用于焙烤过程，例如用于使面团硬化，这在制作冷冻面团产品中尤其需要。
酪氨酸酶可以进一步用于生产适用于治疗帕金森病的L-多巴和用于生产为用于化妆品工业的组分的黑色素。此外，酪氨酸酶可以用于交联蛋白质纤维或纤维衍生的聚合物，诸如丝绸、羊毛、开士米、阿尔帕卡毛或人毛发。
通过下列非限制性实施例解释本发明。然而，应理解以上描述和实施例中给出的实施方案仅用于解释，而各种改变和修改均可能发生在本发明的范围内。
实施例1
酪氨酸酶阳性微生物的平板筛选
按照文献选择用于酪氨酸酶活性筛选的指示剂。使用表1中所示浓度的L-酪氨酸、对甲酚、对香豆酸、酪胺、3-羟基-2-氨基苯甲酸和儿茶素。在37℃下使Trichoderma reesei在包含所选的指示剂(表1)(Difco)的麦芽汁琼脂上生长48天。目视观察平板上可能的颜色改变。
T.reesei表现出与L-酪氨酸、酪胺、3-羟基-2-氨基苯甲酸和儿茶素的清楚的阳性反应。结果清楚地表明T.reesei为酪氨酸酶阳性微生物。
表1.来自T.reesei的酪氨酸酶活性的平板试验筛选
指示剂 浓度(mM) 颜色改变
L-酪氨酸 10 ++
对甲酚 0.1 -
对香豆酸 1.0 -
酪胺 1.0 +
3-羟基-2-氨基苯甲酸 1.0 +
儿茶素 1.0 ++
实施例2
tyr1和tyr2基因从Trichoderma reesei中的分离
通过PCR由基因组T.reesei DNA扩增两种新的酪氨酸酶基因。用于tyr1的引物为正向的：
GCT ACC GCG GAT GGG CTT CCT CGC TCG CCT CAC(SEQ ID NO：5)
和反向的：
CTG AGG ATC CTC AGT GGT GGT GGT GGT GGT GCT CCC ACA ACA CCAATC TCA GCA T(SEQ ID NO：6)。
使用正向引物：
GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTA TCA TGC TGT TGT CAGGTC CCT CTC G(SEQ ID NO：7)和反向引物：
GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC AGT GGT GGT GGT GGTGGT GCA GAG GAG GGA TAT GGG GAA CGG CAA A(SEQ I D NO：8)扩增tyr2基因。
在制造商推荐的反应混合物中用Dynazyme EXT热稳定性聚合酶(Finnzymes，芬兰)进行PCR反应。PCR程序具有在94℃下3分钟的初始变性步骤，随后是在94℃下30秒，在52℃下45秒和在72℃下2.5分钟的25个循环。此后是在72℃下5分钟的最终延伸步骤。获得预计大小的PCR产物，使用本领域公知的方法在琼脂糖凝胶上运行并且使用Qiaquick Minelute凝胶纯化试剂盒从凝胶中纯化。使用TOPO-TA克隆试剂盒(Invitrogen)将tyr1基因片段克隆入pCR2.1TOPO载体。通过使用Gateway重组试剂盒(Invitrogen)进行的BP重组反应将tyr2基因片段转入pDONR221载体(Invi trogen)。对基因进行测序以便排除PCR突变。
实施例3
在强启动子下在Trichoderma reesei中tyr2基因的超表达
通过LR重组反应将tyr2基因片段从pDONR221载体转移到T.reesei表达载体pMS186中。该载体包含cbh1(纤维二糖水解酶1)启动子与终止子之间***的Gateway读框盒C(RfC)。该载体还具有用于选择T.reesei转化体的潮霉素抗性盒。如制造商所指导的使用Gateway重组试剂盒(Invitrogen)进行LR重组反应。在该重组过程中，将tyr2基因片段***cbh1启动子与终止子之间，从而得到质粒pMS190(附图2)。
基本上如(Penttil等，1987)所述将质粒pMS190转入T.reesei菌株VTT-D-00775并且在包含125μg/ml潮霉素B的平板上选择潮霉素抗性转化体。将转化体在包含选择培养基的平板上划线连续三圈并且使用平板测定法测试酪氨酸酶活性。测定平板具有木霉属基本培养基(Pent til等，1987)，该培养基含有2％乳糖作为碳源、1％邻苯二甲酸钠作为缓冲剂(pH5.5)、0.1mM CuSO4和1％酪氨酸作为指示剂底物。将转化体在平板上划线并且使其生长7天。在平板上观察到在划线周围出现深棕色的酪氨酸酶活性。发现了表现出清晰染色的几个阳性转化体。亲代菌株在本测定中未表现出染色。
实施例4
TYR2在液体培养物中的产生
使阳性转化体在摇瓶中的补充了4％乳糖、2％废酒糟、100mM P IPPS和2mM CuSO4的木霉属基本培养基(Penttil等，1987)中生长8天。使用15mML-多巴(L-3，4二羟基苯丙氨酸)(Sigma)作为底物，从培养的上清液样品中测定酪氨酸酶活性。还对浓度为2mM的L-酪氨酸(Sigma)测定了活性。在25℃下的0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)中进行活性测定，以便在475nm处监测多巴色素形成。使用的摩尔消光系数ε为3400M-1cm-1(Robb，1984)。通过使用双光束分光光度计(λ20，Perkin-Elmer，ber-l i ngen，德国)进行测定。将活性表示为纳开特(nkat)。三种最佳转化体产生了40，35和11nkat/ml的酪氨酸酶活性。
在Braun BiostatC-DCU3发酵罐(B.Braun Biotech，德国)中的20升培养基中培养在摇瓶中产生最高水平的酪氨酸酶的转化体pMS190/VTTD-00775/98，所述的培养基包含(gl-1)：乳糖20，废酒糟10，KH2PO415，和2mM CuSO4X5H2O，用NH4OH和H3PO4将pH调整至5.5-6并且培养温度在+28℃。在以450rpm搅拌，以8升分钟-1通气和0-30％进入空气的O2-富集条件下使溶解氧水平保持在30％以上。通过自动添加Struktol J633聚油酸酯消泡剂(Schil1&Sei lacher，德国)控制发泡。每日取样以便测定乳糖和总蛋白质浓度和酪氨酸酶活性。在发酵后，通过离心除去细胞并且使用超声将培养物上清液浓缩2.5x。
在培养6天后达到约300nka t/ml的水平。根据使用纯化的TYR2的比活性进行的计算，发酵中的最高活性相当于约1g/L酶。
实施例5
TYR2的纯化
首先使用Avicel微晶纤维素(0.2g/ml培养物上清液)处理离心浓缩的培养物上清液(在实施例4中获得)以便结合和除去纤维素酶。将样品在+4℃和恒定搅拌下孵育10分钟。通过离心(10,000r pm)收集上清液。使用Sephadex G-25粗粒柱(2.6x27cm；Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)将缓冲液更换成pH7.3的10mM Tris-HCl缓冲液。随后使用KTATM纯化器(Amer sham Biosc ience s，Uppsa la，瑞典)进行纯化步骤。使样品上首先用pH7.3的10mM Tris-HCl缓冲液预平衡的HiPrepTM16/10CM琼脂糖快速柱。用在Tris-HCl缓冲液中0-180mM NaCl的线性梯度(120ml)洗脱蛋白质。汇集酪氨酸酶阳性级分，使用Vivaspin20(10,000MWCO，PES，Vivascience)浓缩器将其浓缩至8.2ml并且上凝胶过滤柱，即用包含pH7.5的150mM NaCl的20mM Tris-HCl平衡的Hi-Prep26/60Sephacry1S-100HR柱(KTA，Pharmasia)。合并活性级分并且浓缩。
按照Laemmli(1970)进行SDS-PAGE(12％Tris-HCl Ready Gel，Bio-Rad)。通过用考马斯亮蓝(R350；Pharmacia)染色显示蛋白质带并且与分子量标记(预染色的SDS-PAGE标准品Broad Range Cat.no.161-0318，Bio-Rad)比较。
TYR2在PAGE上表现为双带。当使用凝胶过滤和反相色谱法进一步分析时，观察到仅一种蛋白质种类存在于纯化制品中，因此在凝胶上的双带为凝胶人工制品。有意义的是，如根据凝胶估计的纯化TYR2的分子量仅为45kDa，远低于根据推定的氨基酸序列计算的值(60.4kDa)。结果表明TYR2在其C-末端被加工。
纯化表如表2中所示。表中的凝胶过滤1和2是指酪氨酸酶阳性样品的不同合并。
表2.TYR2的纯化
纯化步骤 活性(nkat/ml) 蛋白质(mg/ml) 体积(ml) 比活性(nka t/mg) 活性产率(％) 纯化因子
培养物过滤液 769.9 23.4 60 33 100 1.0
Avicel处理 719.6 17.1 44 42 68.5 1.3
脱盐 389.1 12.7 63 31 53.1 0.9
阳离子交换色谱 1285 4.73 8.2 272 22.8 8.3
凝胶过滤(1) 369 2.16 5.5 171 4.4 5.2
凝胶过滤(2) 238 0.61 4.4 390 2.3 11.9
实施例6
TYR2的生化表征
通过Bio-Rad DC蛋白测定试剂盒(Bio-Rad，Richmond，美国)与作为标准品的牛血清清蛋白测定蛋白质浓度。通过使用HitachiU-2000分光光度计(Hitachi，Tokyo，日本)在280nm处监测吸光度进行一些蛋白质浓度测定。如实施例4中所述测定酪氨酸酶活性。
TYR2能够氧化L-酪氨酸和L-多巴二者。活性读数表明L-多巴产生的活性值高于L-酪氨酸约6倍。还通过按照酶促反应中的耗氧量测定对L-多巴和L-酪氨酸的酶活性证实了这一结果。按照文献所述，许多微生物酪氨酸酶需要SDS测定其活性。在活性测定中使用不同浓度的SDS测定SDS(Sigma)对酪氨酸酶活性的作用。令人意外地发现SDS抑制酶活性：在0.5mM SDS浓度下，酶仅保留了其活性的50％。
通过pH3.5-9.5范围内的等电聚焦(IEF：Ampholine PAGplate3.5-9.5，Amersham Bioscience)，使用LKB2117 Multiphor II电泳***(LKB Pharmacia，Bromma，瑞典)，按照制造商的说明测定来自培养物上清液的酶和纯化的酶的等电点(pI)。通过用在0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)中的15mML-多巴染色凝胶使包含酪氨酸酶活性的带显现并且通过考马斯蓝染色使蛋白质显现。当用考马斯蓝染色时，纯化的TYR2在pH～9下表现出两条带。在天然条件下的等电聚焦中，当用L-多巴染色时，培养物滤液和纯化的酪氨酸酶都未显示出清楚的带，而在约pH9时作为棕色环带观察到活性。
根据耗氧测量值研究了对于酪氨酸酶最佳的pH。使用包含测量范围在0-100％氧的纤维光学微型氧传感器的单通道测氧计(Precisionsensing GmbH，德国)进行了测定。将溶于pH7.0的0.1M磷酸钠缓冲液的15mM浓度L-多巴用作底物。使用1.8ml底物溶液和4.3μg纯化的reesei酪氨酸酶进行反应。按照其缓冲容量使用三种不同的缓冲液。使用了pH2-7范围的Mcllvaine缓冲液，pH7-9范围的Tris-HCl缓冲液(50mM)和pH8-9.5范围的硼酸盐缓冲液(12.5mM)。TYR2的最佳pH在8-8.5。该酶在5-9的相当宽的pH范围内具有相对高的活性。当使用Tris-HCl缓冲液时，在pH8-9值中观察到L-多巴的自氧化作用，而使用硼酸盐未观察到同种现象。在使用pH8，8.5和9.0的Tris-HC l缓冲液测定中，还进行了不添加酶的空白试验以便校准结果中的自氧化作用。酪氨酸酶的最佳pH看起来取决于缓冲液。
在Mcllvaine，50mM Na2HPO4-25mM柠檬酸缓冲液中通过在室温下以不同pH值孵育酶溶液测定在不同pH值下酶的稳定性。通过使用L-多巴作为底物测定酶溶液的活性来确定残留的酪氨酸酶活性。
在30，40和50℃下测定温度稳定性。在不同温度下孵育在20mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)中的酶溶液(320nkat/ml)并且在使用标准活性测定对15mML-多巴测定某些时间段的酪氨酸酶活性后确定残留的酶活性。该酶在中性和碱性pH下表现出良好的稳定性。当pH降至7以下时，该酶开始释放活性。
如上所述(Palonen等2003)通过MALDI-TOF质谱法，用UltraflexTM飞行时间仪(BrukerDaltonics，德国)测定酪氨酸酶的分子量和进行N-末端测序。如通过MALDI-TOF分析的酪氨酸酶的分子量约为42.9kDa。N-末端氨基酸分析显示N-末端被封闭。这意味着存在谷氨酰胺作为成熟蛋白中的第一个氨基酸。该结果与序列数据一致。
使用Varian Cary100Bio紫外-可见分光光度计测定纯化TYR2的光吸收光谱。纯化酪氨酸酶的紫外-可见光吸收光谱在280nm处具有蛋白质主峰，在330nm处具有肩峰。该肩峰为其带有桥连羟基的氧化形式的T3型铜对的指示。
实施例7
酪氨酸酶的底物特异性
通过耗氧量测定研究了酪氨酸酶对各种所选底物的底物特异性。底物浓度为2.5mM并且将化合物溶于pH7.0的0.1M磷酸钠缓冲液。使用1.8ml的2.5mM底物溶液和24μg纯化的TYR2进行反应。作为参比物，还进行了商购双孢蘑菇粗制酪氨酸酶(Sigma)的底物特异性测定。相应地，在该测定中使用了50μg的所述蘑菇酪氨酸酶。在本研究中使用的单-，二-和三-酚类化合物的结构如表3和4中所示。使用所选择的在肽链的不同位置上包含酪氨酸的模型肽类分析了TYR2和蘑菇属酪氨酸酶的活性(表5)。还测定了TYR2和蘑菇属酪氨酸酶对L-/DL-D-多巴和-酪氨酸的氧化(表6)。
表3.L-酪氨酸与单酚类化合物的T.reesei和蘑菇属酪氨酸酶相对于活性(％)。耗氧量基于02消耗曲线的线性部分
Figure A20068000808100241
表4.T.reesei和蘑菇属酪氨酸酶相对于L-酪氨酸与二-和三-酚类化合物的活性(％)。耗氧量基于02消耗曲线的线性部分
Figure A20068000808100251
表5.T.reesei和蘑菇属酪氨酸酶相对于L-酪氨酸与二-和三-酚类化合物的活性(％)。耗氧量基于O2消耗曲线的线性部分
TYR2 蘑菇属酪氨酸酶
底物** 相对耗氧量(％) 相对耗氧量(％)
Y 100 100
二酚类
YG 128 140
GY 292 115
**Y＝酪氨酸和G＝甘氨酸
表6T.reesei和蘑菇属酪氨酸酶对L-/DL-D-多巴和-酪氨酸的氧化
底物 TYR2相对耗氧量(％) +/-(％) 蘑菇属酪氨酸酶相对耗氧量(％)
L-多巴 100 100
DL-多巴 46 2 118
D-多巴 18 1 106
L-酪氨酸 100 100
DL-酪氨酸 40 3 102
D-酪氨酸 7 1 61
TYR2能够氧化许多在对位上带有OH-基团的取代的单酚类。酚羟基邻位上的任何侧链均产生位阻，从而导致对底物的低级氧化或不存在氧化。考虑到TYR2的耗氧速率，在底物结构上胺基的存在及其位置看来是重要的。酚羟基与氨基的位置越近，对底物的氧化就越缓慢。还在肽测定中观察到了氨基位置的相同影响。有意义的是，TYR2的底物特异性实质上不同于蘑菇属酪氨酸酶的底物特异性。与蘑菇属酪氨酸酶相比TYR2是立体特异性的。
从表5中可以看出，TYR2和蘑菇属酪氨酸酶能够氧化所测试的模型肽类。TYR2的氧化速率非常依赖于肽的长度和酪氨酸残基的位置。对二肽类的氧化比单一酪氨酸更容易并且在C-末端上带有酪氨酸残基的肽与酪氨酸位于N-末端上的肽相比是TYR2更好的底物。蘑菇属酪氨酸酶对酪氨酸残基的位置并不敏感。
令人意外的是，木霉属酪氨酸酶表现出对L-酪氨酸和L-多巴的高度立体特异性(表6)。L-对映体被氧化的速率远高于D-对映体。使用蘑菇属酪氨酸酶未观察到不同对映体之间氧化速率的差异。实际上，Espin等(1998)已经证实了蘑菇属酪氨酸酶在其对不同对映体的亲和力而非反应速率方面的立体特异性。在反应速率上明显的差异是合成化学中的优点。
还通过观察SDS-PAGE上MW的改变分析了TYR2在模型蛋白中的交联能力。结果表明TYR2能够交联α-酪蛋白和鸡肌原纤维，但无法交联牛血清清蛋白。详细情况在实施例8和9中给出。
实施例8.酪氨酸酶催化的肉蛋白交联
通过SDS-PAGE分析了TYR2所致的鸡胸肌原纤维的分离的盐溶性蛋白质(SSP)的分子量改变。按照Xiong和Brekke，1989分离SPP。为了进行酶处理，将SSP悬浮于pH7的包含0.6M NaCl的50mM磷酸钠缓冲液中至蛋白质浓度为3mg/ml。将每克蛋白质120nka t或240nkat的TYR2加入到该混悬液中。按照类似方式，但不添加酶处理对照混悬液。在30℃下孵育反应混合物。在2分钟，1小时，3小时和24小时的时间点抽取样品。加入SDS-PAGE样品缓冲液并且在沸水浴中加热样品。将20μg来自各样品的蛋白质加载到12％Tris-HCl聚丙烯酰胺凝胶上。按照Laemmli，1970进行SDS-PAGE。
通过与经过类似处理但未添加酶的蛋白质带的相对迁移率和染色强度比较试验性地鉴定了TYR2催化的蛋白质带的主要改变。在所采用的条件和剂量下，TYR2产生了下列可检测的电泳改变，它们在24小时酶处理后为最显著的：(1)在3小时处理后使用两种酶剂量的～200
kDa的肌球蛋白带逐渐消失；(2)在3小时处理后使用两种酶剂量的～36kDa的带逐渐消失；和(3)在24小时处理后未进入凝胶的大分子量蛋白质产物(>200kDa)出现。
还研究了TYR2在鸡肌原纤维基质中形成交联的能力作为测定低形变时凝胶形成能力的储能模量(G′)的发展。使用Bohlin流变仪在恒温下的加热过程中进行测定。按照Xiong和Brekke(1989)分离鸡胸肌原纤维，但从分离缓冲液中省去EDTA和NaN3。将分离的肌原纤维悬浮于pH6的补充了0.30M NaCl的50mM磷酸钠缓冲液中至蛋白质浓度为40mg/ml。用每克蛋白质240nkat的TYR2在25℃，30℃和40℃下将混悬液处理3小时。按照类似方式，但不添加酶处理对照样品。
结果表明TYR2处理肌原纤维样品导致G′的增加大于仅在磷酸钠缓冲液中处理的肌原纤维样品(参见附图5；从下到上的线表示：对照，25℃，对照30℃，对照40℃，TYR2，25℃，TYR2，30℃和TYR2，40℃)。处理温度的增加强化了凝胶形成。因此，TYR2与鸡胸肌原纤维蛋白质基质形成交联。
实施例9.Tyr2对乳蛋白的胶凝
将3％的商购酪蛋白酸盐在水中混合并且向该混合物中加入0.4％GDL(葡糖酸-δ-内酯)和20nka t/g蛋白质的TYR2。使该体系在室温下静置22小时，此后通过质地分析仪测定凝胶硬度(附图6)。酪氨酸酶处理使酪蛋白酸盐凝胶的硬度加倍。
实施例10.TYR2对小麦面团特性的影响
通过使用Kieffer伸长性手段(Stable MicroSy stems，Ltd.英国)研究了TYR2对小麦面团的大变形流变学的影响。测定作为酶剂量和面团静止时间的函数的面团伸长性和抗延伸性。
使用面粉调粉性记录仪(Brabender，德国)，用12g面粉和7.2ml液相(60％)混合小麦面粉。将酪氨酸酶(1和10nkat/g面粉)加入到水中，此后立即与面粉混合。混合时间为4分钟。随后，将面团放入模具中以便产生约10-12条测试条。将压模保持在室温下15-45分钟以使应力松弛。在Kieffer试验中，将面团条从中心开始延伸，直到超过面团条的弹性极限并且断裂为止。通过记录峰值力和最大值处和延伸极限处的距离测定最大抗性Rmax，最大伸长性Emax和Rmax下的伸长性Ex。在约22℃的室温下进行所有面团的制备，酶处理和测定。
来自Kieffer实验的结果如附图7和8中所示。它们表明TYR2增加了面团的最大抗性Rmax并且降低了Rmax下的面团伸长性Ex，从而表明了面团的硬化。增加酶的剂量强化了面团的硬化。
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<210>1
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<212>DNA
<213>Trichoderma reesei
<220>
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<210>2
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<212>DNA
<213>Trichoderma reesei
<220>
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<212>PRT
<213>Trichoderma reesei
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<213>Trichoderma reesei
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Figure A20068000808100492

Claims (38)

1.包含具有酪氨酸酶活性的区段的蛋白质，其中所述蛋白质包含与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列或其酪氨酸酶活性片段具有至少70％同一性的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的蛋白质，其可获自木霉属菌种(Trichodermaspp.)。
3.权利要求1所述的蛋白质，在其N-末端上包含信号序列。
4.权利要求1所述的蛋白质，其中该蛋白质为表现出酪氨酸酶活性的成熟蛋白。
5.权利要求1所述的蛋白质，其中该蛋白质由可获自通过使用引物对扩增的木霉属菌种的DNA的多核苷酸编码，所述的引物对具有如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8中所示的序列。
6.上述权利要求中任意一项所述的蛋白质，其中该蛋白质由可获自Trichoderma reesei的多核苷酸编码。
7.权利要求1所述的蛋白质，其中该蛋白质由具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中包含的序列的多核苷酸编码。
8.权利要求1所述的蛋白质，其具有SEQ ID NO：3或SEQ ID：4中包含的氨基酸序列。
9.权利要求1所述的蛋白质，其包含如SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4中所示的氨基酸序列的酪氨酸酶活性片段。
10.权利要求1所述的蛋白质，其中该蛋白质由能够与具有如SEQID NO：1或SEQ ID NO：2中所示序列的核酸杂交的多核苷酸编码。
11.权利要求1所述的蛋白质，其中该蛋白质为具有约42.9kDa的分子量，约9的pI，约8-8.5的最佳pH和在碱性或中性pH下具有活性的天然蛋白质。
12.分离的多核苷酸，其编码权利要求1-11中任意一项所述的蛋白质。
13.权利要求12所述的多核苷酸，其具有SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2中包含的序列或能够与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中包含的序列杂交。
14.表达载体，其包含权利要求12或13所述的多核苷酸。
15.权利要求14所述的表达载体，其中在强启动子，诸如cbh1下***所述的多核苷酸。
16.包含权利要求14或15所述表达载体的宿主细胞。
17.权利要求16所述的宿主细胞，其为丝绸状真菌或酵母菌种。
18.权利要求17所述的宿主细胞，其为木霉属的菌种，优选Trichoderma reesei。
19.生产权利要求1所述的蛋白质的方法，包括下列步骤：
a)将编码所述蛋白质的多核苷酸***宿主细胞；
b)使所述的宿主细胞在适合于表达所述蛋白质的条件下生长；和
c)任选地回收和纯化产生的所述蛋白质。
20.权利要求19所述的方法，包括：
a)将编码胞外酪氨酸酶的DNA序列***宿主细胞，所述的DNA序列可获自通过使用引物对扩增的木霉属菌种的DNA，所述的引物对具有如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8中所示的序列；
b)使所述的宿主细胞在适合于表达的条件下生长；和
c)从生长培养基中回收分泌的蛋白质并且任选纯化它。
21.权利要求19或20所述的方法，其中***的DNA获自T.reesei。
22.权利要求19-21中任意一项所述的方法，其中所述的宿主细胞为木霉属的菌种，优选T.reesei。
23.生产权利要求1所述的蛋白质的方法，包括下列步骤：将有效增强胞外酪氨酸酶基因表达的启动子***宿主细胞，使所述启动子可操作地与所述基因连接，使所述宿主细胞在适合于表达所述蛋白质的条件下生长，并且任选地回收和纯化产生的所述蛋白质。
24.通过权利要求19-23中任意一项所述方法获得的蛋白质。
25.权利要求1所述的具有酪氨酸酶活性的蛋白质在修饰包含蛋白质的材料中的应用。
26.权利要求25所述的应用，其中所述的蛋白质用于交联包含酪氨酸的蛋白质。
27.权利要求26所述的应用，其中所述的蛋白质用于交联食物蛋白，诸如肉类、乳制品、蔬菜和谷类材料。
28.权利要求25所述的应用，其中所述的蛋白质用于交联蛋白质纤维或纤维衍生的聚合物，诸如丝绸、羊毛、开士米、阿尔帕卡毛或人毛发。
29.权利要求1所述的蛋白质在修饰包含酪氨酸的肽类中的应用。
30.权利要求1所述的蛋白质在将酪氨酸氧化成L-多巴中的应用。
31.修饰包含蛋白质的材料的方法，其中使所述的物质与权利要求1所述的具有酪氨酸酶活性的蛋白质接触。
32.权利要求31所述的方法，包括交联包含酪氨酸的蛋白质。
33.权利要求32所述的方法，包括交联食物蛋白，诸如肉类、乳制品、蔬菜和谷类材料。
34.权利要求31所述的方法，包括交联蛋白质纤维或纤维衍生的聚合物，诸如丝绸、羊毛、开士米、阿尔帕卡毛或人毛发。
35.修饰包含酪氨酸的肽的方法，其中使所述的肽与权利要求1所述的具有酪氨酸酶活性的蛋白质接触。
36.将酪氨酸氧化成L-多巴的方法，其中使酪氨酸与权利要求1所述的具有酪氨酸酶活性的蛋白质接触。
37.包含权利要求1所述蛋白质的酶制品。
38.由权利要求1所述的具有酪氨酸酶活性的蛋白质修饰过的包含蛋白质的材料。
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C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20080305