CN109943546B - 一种谷氨酰胺转氨酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种谷氨酰胺转氨酶及其制备方法和应用。本发明通过提取枯草芽胞杆菌ATCC 23857基因组DNA，PCR扩增得到野生型带有酶原区的谷氨酰胺转氨酶btg基因序列，将扩增得到的野生型btg基因通过易错PCR进行随机突变，获得了一个突变体基因btgm。将突变体基因构建重组载体并在枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中成功表达，得到产酶活力提高的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得新型谷氨酰胺转氨酶。

Description

一种谷氨酰胺转氨酶突变体及其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种谷氨酰胺转氨酶及其制备方法和应用。

技术背景：

谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，简称TG)，是一种可以催化酰基转移反应的酶，它能使蛋白质分子中赖氨酸残基上的ε-氨基和谷氨酰胺残基上的γ-羟酰胺基相互作用，形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸键，使得蛋白质(或多肽)之间发生共价交联。从而改善蛋白质的结构和功能，影响蛋白质的性质，如发泡性、乳化性、乳化稳定性、热稳定性、保水性和凝胶能力等，进而改善食品的风味、口感、质地和外观等，目前已经被广泛应用于食品、纺织、制药等领域。此酶在食品工业中得到了推广应用，如肉制品、乳制品、豆制品等。通过TG交联蛋白质，可以改变蛋白质的结构并提高其的功能性质，并且不破坏，甚至可以改善食品的营养。例如TG能显著改善大豆分离蛋白的弹性和硬度，能使蛋白质分子更紧密地结合在一起，故可提高大豆分离蛋白凝胶强度，从而改善其口感、质地和外观等。

然而目前，仅茂源链霉菌TG(简称MTG)实现了商业化生产并被广泛应用于食品加工中。但随着食品加工业范围不断扩大，食品加工底料品种与日俱增，MTG作为目前唯一生产和应用的TG酶种，其在底物特异性、热稳定性等方面已经不能很好地满足各种食品加工底物和加工过程的需求。与MTG相比，枯草芽胞杆菌TG(简称BTG)的性质有较大区别，可为食品加工提供一种新的选择。BTG与目前广泛研究的MTG相比，具有基因来源不同，底物特异性不同等优点，但是BTG比活力低，这也限制了BTG的商业化生产，因此我们通过分子改造的方式提高BTG的比活力。

酶分子体外定向进化属于蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程的新策略。利用分子生物学手段在分子水平创造出分子的多样性，结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的突变体。它不需事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件进化机制，在体外改造酶基因，获得具有某些预期特征的结构酶。其中，易错PCR是指在扩增目的基因的同时，利用Taq酶不具备3’→5’校对功能，同时改变反应体系中Mn²⁺、Mg²⁺和各种dNTP的浓度，以一定的频率向目的基因随机引入碱基错配，导致目的基因发生随机突变。然而，经一次突变的基因一般很难获得满意的结果，由此又发展出连续易错PCR(Sequential Error-prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的产物作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行易错，使每一次获得的小突变不断进行积累而产生重要的有益突变。因此，具有独有的优势。

芽胞杆菌表达***具有以下优点：1、能够高效的分泌各种蛋白质；2、许多芽胞杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽胞杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并且生长迅速，对营养物质无特殊要求等优点；4、密码子偏爱性不明显；5、发酵过程简单，芽胞杆菌属于好氧菌，无需厌氧发酵设备，发酵结束后，简单的分离发酵液和细菌菌体可进入目的蛋白的分离、纯化回收阶段；6、具有抗逆性，可以生产多种耐热性酶制剂。

因此，本发明中，基于TG在大肠杆菌中的表达平台，利用易错PCR技术，对来源于枯草芽孢杆菌的TG基因btg进行分子改造，并在枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌体系中进行表达，以期得到酶活力提高的谷氨酰胺转氨酶。

发明内容：

本发明目的在于提供一种新型谷氨酰胺转氨酶及其制备方法和应用。

本发明实现上述目的的技术线路如下：

提取枯草芽胞杆菌ATCC 23857基因组DNA，通过PCR扩增得到野生型带有酶原区的谷氨酰胺转氨酶btg基因(SEQ ID NO.3所示)序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)，将扩增得到的野生型btg基因通过易错PCR进行随机突变，获得了一个突变体基因btgm。将突变体基因构建重组载体并在枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中成功表达，得到产酶活力提高的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得新型谷氨酰胺转氨酶。

在本发明中采用如下定义：

1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，采用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2、谷氨酰胺转氨酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示谷氨酰胺转氨酶突变体中突变的氨基酸。如Arg95Gly，表示位置95的氨基酸由野生型谷氨酰胺转氨酶的Arg替换成Gly，Arg95表示第95位的氨基酸为Arg，位置的编号对应于SEQ ID NO.4中野生型谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列编号；核苷酸表示方法与氨基酸表示方法类似，如G95，表示第95位的碱基为G，位置的编号对应于SEQ ID NO.3中野生型谷氨酰胺转氨酶的核苷酸序列编号。

本发明中，btg代表野生型谷氨酰胺转氨酶编码基因，BTG代表野生型谷氨酰胺转氨酶；btgm为谷氨酰胺转氨酶突变体基因；BTGM为谷氨酰胺转氨酶突变体。突变前后的碱基及氨基酸对照如下表：

谷氨酰胺转氨酶	碱基	氨基酸
			BTG	A283、G284、A285	Arg95
BTGM	G283、G284、A285	Arg95Gly

所述谷氨酰胺转氨酶突变体BTGM的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；

所述btgm基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；

表达所述突变体基因的宿主细胞为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌，表达载体为pBSA43；

优选地，所述枯草芽孢杆菌为WB600；

优选地，所述解淀粉芽孢杆菌为CGMCC No.11218；

优选地，所述地衣芽胞杆菌为TCCC11965。

本发明还提供上述谷氨酰胺转氨酶突变体制备方法，包括如下步骤：

(1)通过PCR或基因合成，获得SEQ ID NO.5所示的谷氨酰胺转氨酶突变体基因；

(2)将所述的谷氨酰胺转氨酶突变体基因酶切，连接到表达载体，得到携带谷氨酰胺转氨酶突变体编码基因的重组载体；

(3)将重组载体转化至宿主细胞，得到重组菌株；

(4)表达所述的重组菌株，纯化后获得如SEQ ID NO.6所示的谷氨酰胺转氨酶突变体BTGM；

经相同表达***表达后，突变体BTGM的比酶活是野生型BTG的2.3倍。

有益效果：

1、本发明中谷氨酰胺转氨酶突变体基因在芽孢杆菌中表达***中进行了表达，得到谷氨酰胺转氨酶突变体重组菌株，重组菌株发酵后，经相应的处理可得到谷氨酰胺转氨酶突变体。

2、本发明使用易错PCR技术，对野生型谷氨酰胺转氨酶进行随机突变，得到谷氨酰胺转氨酶突变体BTGM，比酶活是野生型谷氨酰胺转氨酶比酶活的2.3倍。

附图说明：

图1为野生型谷氨酰胺转氨酶基因的PCR扩增电泳图；

其中：M为DNAMarker，1为谷氨酰胺转氨酶酶原基因btg；2为谷氨酰胺转氨酶突变体基因btgm；

图2为JM109/pBAS43-btg和JM109/pBAS43-btgm酶切验证图；

其中：M为DNAMarker，1为pBSA43-btg经BamH I和HindШ双酶切；2为

pBSA43-btgm经BamH I和HindШ双酶切；

图3为本发明重组质粒pBSA43-btg酶切验证图；

其中：M为DNAMarker，1、2、3为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中重组质粒pBSA43-btg经BamH I和HindШ双酶切图；

图4为本发明重组质粒pBSA43-btgm酶切验证图

其中：M为DNAMarker，1、2、3为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中重组质粒pBSA43-btgm经BamH I和HindШ双酶切图；

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明所使用的地衣芽胞杆菌为TCCC11965，公开于：Development andapplication of a CRISPR/Cas9system for Bacillus licheniformis genome editing[J].International Journal of Biological Macromolecules,2019,122:329-337，目前保存于天津科技大学微生物菌种保藏管理中心，公众可从该中心获取菌种。

实施例1野生型谷氨酰胺转氨酶基因btg的获得

1.将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌体ATCC 23857于液氮中研碎，根据基因组提取试剂盒说明书提取枯草芽孢杆菌基因组。

2.以提取的枯草芽孢杆菌的基因组为模板，根据Genbank序列号CP032315.1登录的谷氨酰胺转氨酶序列，在ORF框上下游设计一对引物，分别引入限制性酶切位点BamH I、Hind Ⅲ，本发明的谷氨酰胺转氨酶基因的扩增引物如下：

上游引物P1(SEQ ID NO.1)：

5’-CGCGGATCCGATGATTATTGTATCAGGACAATTGC-3’

下游引物P2(SEQ ID NO.2)：

5’-CCCAAGCTTTTAGCGGACGATGCGGA-3’

以P1和P2作为上、下游引物，以枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶基因组为模板进行扩增；

其扩增的反应条件为：

上游引物P1	1.5μL
		下游引物P2	1.5μL
DNA模板	2.0μL
		Pyrobest酶	0.5μL
ddH2O	34.5μL

扩增条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸1min反应30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到735bp的条带(图1)，用小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到本发明的谷氨酰胺转氨酶的酶原区基因btg，将扩增获得的btg与载体pBSA43载体连接，得到重组质粒pBSA43-btg，并化转入JM109中，经双酶切验证(图2)，测序后如SEQ ID NO.3。

实施例2谷氨酰胺转氨酶突变体基因的获得

1、基于易错PCR技术进行随机突变，构建新型谷氨酰胺转氨酶，设计引物如下：

上游引物P1(SEQ ID NO.1)：

5’-CGCGGATCCGATGATTATTGTATCAGGACAATTGC-3’

下游引物P2(SEQ ID NO.2)：

5’-CCCAAGCTTTTAGCGGACGATGCGGA-3’

在易错PCR反应体系中，以P1和P2作为上下游引物，以野生型谷氨酰胺转氨酶基因btg为模板，进行易错PCR。

其扩增的反应条件为：

10×PCR缓冲液(无Mg<sup>2+</sup>)	10μL
		dATP	0.2μL
dGTP	0.2μL
		dCTP	1.0μL
dTTP	1.0μL
		上游引物P1	1.5μL
下游引物P2	1.5μL
		野生型谷氨酰胺转氨酶基因	1.0μL
Taq DNA聚合酶	1.0μL
		Mg<sup>2+</sup>(7mM)	28μL
Mn<sup>2</sup>+(0.15mM)	2μL
		ddH2O	52.6μL

扩增条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸1min反应30个循环；72℃延伸10min。

2、将获得的谷氨酰胺转氨酶突变体基因分别克隆入表达载体pBSA43中，得到若干重组质粒pBSA43-btgmx，并化转入JM109中，将重组质粒pBSA43-btg和pBSA43-btgmx转化枯草芽胞杆菌中，将重组菌接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜LB培养基中，继续以37℃，220r/min培养48h，即可制备获得谷氨酰胺转氨酶粗酶液，然后采用分级盐析法沉淀谷氨酰胺转氨酶，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得谷氨酰胺转氨酶纯酶酶粉，经纯净水溶解后测定酶活。

3、谷氨酰胺转氨酶酶活测定

反应液：以50mM的Tris-HCl(pH＝7.5)配置总体积300μL的反应液:N,N-二甲基酪蛋白0.2％,丹磺尸胺(MDC)12.5μΜ，DTT 4.5mM。

酶活力测定方法如下：

取200μL的反应液(pH 7.5)于96荧光孔板中，37℃保温1min，加入100μL的稀释适当倍数的酶液，以加入不含酶的Tris-HCl缓冲液为对照，反应20min后，记录激发波长350nm和发射波长500nm下检测荧光强度。每分钟催化1nmol/L的MDC***到N,N一二甲基酪蛋白所需的酶量定义为一个活力单位。

酶活力计算：

其中：

I代表反应后产物的荧光强度。

I₀代表不加酶对照的荧光强度。

[MDC]为反应体系中MDC的浓度。

比酶活(U/g)＝酶活力/蛋白浓度。

将所有突变体测酶活后与野生型谷氨酰胺转氨酶酶活比较，筛选出一株产酶活力是野生型的2.3倍的菌株。

4、序列测定

将上述菌株提取谷氨酰胺转氨酶基因序列，PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到735bp的条带(图1)，并进行测序(北京华大生物工程公司)，结果表明，扩增得到了谷氨酰胺转氨酶突变体基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，将该编码基因命名为btgm。

实施例3芽孢杆菌突变体谷氨酰胺转氨酶重组菌的构建

1、表达载体pBSA43的构建

pBSA43是以大肠杆菌-芽胞杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个强的芽胞杆菌组成型启动子P43，以及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中果聚糖蔗糖酶信号序列sacB而获得。它带有Amp^r基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记；同时也具有Km^r基因，可以在枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。pBSA43质粒的构建参见中国发明专利《解淀粉芽孢杆菌添加前体物发酵法生产抗病毒药物利巴韦林的生产工艺》CN 103146785B。

2、谷氨酰胺转氨酶表达载体pBSA43-btgm的构建

将经PCR扩增并经BamH I和Hind III双酶切后回收的谷氨酰胺转氨酶突变体基因btgm与同样双酶切表达载体pBSA43用连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞中，经Amp抗性筛选，挑选阳性转化子，提取转化子质粒，并进行双酶切验证(图2)和测序，确定构建获得正确的重组菌株JM109/pBSA43-btgm。

3、重组表达载体pBSA43-btgm和pBSA43-btg转化枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌。

将1μL(50ng/μL)的pBSA43-btgm和pBSA43-btg重组质粒分别加入到50μL的枯草芽胞杆菌WB600、解淀粉芽胞杆菌CGMCC No.11218、地衣芽胞杆菌TCCC11965感受态细胞中并混匀，之后转移到预冷的电转杯(1mm)中，冰浴1-1.5min后，电击一次(25μF，200Ω，4.5-5.0ms)。电击完毕之后，立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)。37℃摇床，震荡培养3h之后，将复苏物涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-24h，挑取阳性转化子，并进行双酶切验证(图3)(图4)，确定获得表达突变体基因btgm和野生型基因btg的枯草芽胞杆菌重组菌株、解淀粉芽胞杆菌重组菌株、地衣芽孢杆菌芽胞杆菌重组菌株，分别命名为WB600/pBSA43-probtgm、WB600/pBSA43-probtg、CGMCC No.11218/pBSA43-probtgm、CGMCC No.11218/pBSA43-probtg、TCCC11965/pBSA43-probtgm、TCCC11965/pBSA43-probtg。

实施例4谷氨酰胺转氨酶突变体在枯草芽胞杆菌重组菌株中的表达及制备。

分别将枯草芽胞杆菌突变体重组菌株WB600/pBSA43-probtgm和野生型重组菌WB600/pBSA43-probtg接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜LB培养基中，继续以37℃，220r/min培养48h，即可制备获得谷氨酰胺转氨酶粗酶液，然后采用分级盐析法沉淀谷氨酰胺转氨酶，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得谷氨酰胺转氨酶纯酶酶粉，经纯净水溶解后采用实施例2的方法测定酶活，结果显示，野生型BTG比酶活为223U/g，突变体BTGM比酶活为529U/g，较野生型BTG酶活力提高了2.37倍。

实施例5谷氨酰胺转氨酶突变体在解淀粉芽胞杆菌重组菌株中的表达及制备

分别将解淀粉芽胞杆菌突变体重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-probtgm和野生型重组菌CGMCC No.11218/pBSA43-probtg接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜LB培养基中，继续以37℃，220r/min培养48h，即可制备获得谷氨酰胺转氨酶粗酶液，然后采用分级盐析法沉淀谷氨酰胺转氨酶，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得谷氨酰胺转氨酶纯酶酶粉，经纯净水溶解后采用实施例2的方法测定酶活，结果显示，野生型谷氨酰胺转氨酶比酶活为251U/g，突变体BTGM比酶活为586U/g，突变体酶活力是野生型酶活力的2.33倍。

实施例6谷氨酰胺转氨酶突变体在地衣芽胞杆菌重组菌株中的表达及制备

分别将野生型重组菌TCCC11965/pBSA43-probtg和地衣芽胞杆菌突变体重组菌株TCCC11965/pBSA43-probtgm接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜LB培养基中，继续以37℃，220r/min培养48h，即可制备获得谷氨酰胺转氨酶粗酶液，然后采用分级盐析法沉淀谷氨酰胺转氨酶，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得谷氨酰胺转氨酶纯酶酶粉，经纯净水溶解后采用实施例2的方法测定酶活，结果显示，野生型谷氨酰胺转氨酶比酶活力为268U/g，突变体BTGM比酶活为643U/g，突变体酶活力是野生型酶活力2.40倍。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种谷氨酰胺转氨酶突变体及其制备方法和应用

<130> 1

<141> 2019-04-12

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

cgcggatccg atgattattg tatcaggaca attgc 35

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

cccaagcttt tagcggacga tgcgga 26

<210> 3

<211> 735

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis菌体ATCC 23857)

<400> 3

atgattattg tatcaggaca attgctccgt ccccaggata ttgaaaattg gcagattgat 60

caagatctga atccgctctt aaaagagatg attgagacgc ctgttcagtt tgattatcat 120

tcaattgctg aactgatgtt tgagcttaaa ctgcggatga atattgtagc agcggcaaag 180

acgctgcaca aaagcggggc gaagtttgcc acttttttaa aaacatacgg gaatacaacg 240

tattggaggg tttcaccgga gggcgccttg gagctgaaat acagaatgcc gccttcaaaa 300

gcgattcggg acattgcaga gaacggcccg ttttatgcgt ttgaatgcgc aaccgcaatc 360

gttatcattt attacttggc cttaatcgat acaatcggag aagataaatt caatgccagc 420

tttgacagaa ttattttata tgactggcat tatgagaaat tgccgatata tacggaaaca 480

ggacaccact ttttccttgg agattgtttg tattttaaga atcctgaatt tgatccgcaa 540

aaggcgcaat ggagaggcga aaatgtgata ctactggggg aagataaata ttttgcccat 600

ggtcttggaa tcttaaacgg aaagcaaatt attgataagc tgaattcttt taggaaaaaa 660

ggagccttac agtcagccta ccttctgtct caggcgacca gactggatgt tccgtctctt 720

ttccgcatcg tccgc 735

<210> 4

<211> 245

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis菌体ATCC 23857)

<400> 4

Met Ile Ile Val Ser Gly Gln Leu Leu Arg Pro Gln Asp Ile Glu Asn

1 5 10 15

Trp Gln Ile Asp Gln Asp Leu Asn Pro Leu Leu Lys Glu Met Ile Glu

20 25 30

Thr Pro Val Gln Phe Asp Tyr His Ser Ile Ala Glu Leu Met Phe Glu

35 40 45

Leu Lys Leu Arg Met Asn Ile Val Ala Ala Ala Lys Thr Leu His Lys

50 55 60

Ser Gly Ala Lys Phe Ala Thr Phe Leu Lys Thr Tyr Gly Asn Thr Thr

65 70 75 80

Tyr Trp Arg Val Ser Pro Glu Gly Ala Leu Glu Leu Lys Tyr Arg Met

85 90 95

Pro Pro Ser Lys Ala Ile Arg Asp Ile Ala Glu Asn Gly Pro Phe Tyr

100 105 110

Ala Phe Glu Cys Ala Thr Ala Ile Val Ile Ile Tyr Tyr Leu Ala Leu

115 120 125

Ile Asp Thr Ile Gly Glu Asp Lys Phe Asn Ala Ser Phe Asp Arg Ile

130 135 140

Ile Leu Tyr Asp Trp His Tyr Glu Lys Leu Pro Ile Tyr Thr Glu Thr

145 150 155 160

Gly His His Phe Phe Leu Gly Asp Cys Leu Tyr Phe Lys Asn Pro Glu

165 170 175

Phe Asp Pro Gln Lys Ala Gln Trp Arg Gly Glu Asn Val Ile Leu Leu

180 185 190

Gly Glu Asp Lys Tyr Phe Ala His Gly Leu Gly Ile Leu Asn Gly Lys

195 200 205

Gln Ile Ile Asp Lys Leu Asn Ser Phe Arg Lys Lys Gly Ala Leu Gln

210 215 220

Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Gln Ala Thr Arg Leu Asp Val Pro Ser Leu

225 230 235 240

Phe Arg Ile Val Arg

245

<210> 5

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

atgattattg tatcaggaca attgctccgt ccccaggata ttgaaaattg gcagattgat 60

caagatctga atccgctctt aaaagagatg attgagacgc ctgttcagtt tgattatcat 120

tcaattgctg aactgatgtt tgagcttaaa ctgcggatga atattgtagc agcggcaaag 180

acgctgcaca aaagcggggc gaagtttgcc acttttttaa aaacatacgg gaatacaacg 240

tattggaggg tttcaccgga gggcgccttg gagctgaaat acggaatgcc gccttcaaaa 300

gcgattcggg acattgcaga gaacggcccg ttttatgcgt ttgaatgcgc aaccgcaatc 360

gttatcattt attacttggc cttaatcgat acaatcggag aagataaatt caatgccagc 420

tttgacagaa ttattttata tgactggcat tatgagaaat tgccgatata tacggaaaca 480

ggacaccact ttttccttgg agattgtttg tattttaaga atcctgaatt tgatccgcaa 540

aaggcgcaat ggagaggcga aaatgtgata ctactggggg aagataaata ttttgcccat 600

ggtcttggaa tcttaaacgg aaagcaaatt attgataagc tgaattcttt taggaaaaaa 660

ggagccttac agtcagccta ccttctgtct caggcgacca gactggatgt tccgtctctt 720

ttccgcatcg tccgc 735

<210> 6

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 6

Met Ile Ile Val Ser Gly Gln Leu Leu Arg Pro Gln Asp Ile Glu Asn

1 5 10 15

Trp Gln Ile Asp Gln Asp Leu Asn Pro Leu Leu Lys Glu Met Ile Glu

20 25 30

Thr Pro Val Gln Phe Asp Tyr His Ser Ile Ala Glu Leu Met Phe Glu

35 40 45

Leu Lys Leu Arg Met Asn Ile Val Ala Ala Ala Lys Thr Leu His Lys

50 55 60

Ser Gly Ala Lys Phe Ala Thr Phe Leu Lys Thr Tyr Gly Asn Thr Thr

65 70 75 80

Tyr Trp Arg Val Ser Pro Glu Gly Ala Leu Glu Leu Lys Tyr Gly Met

85 90 95

Pro Pro Ser Lys Ala Ile Arg Asp Ile Ala Glu Asn Gly Pro Phe Tyr

100 105 110

Ala Phe Glu Cys Ala Thr Ala Ile Val Ile Ile Tyr Tyr Leu Ala Leu

115 120 125

Ile Asp Thr Ile Gly Glu Asp Lys Phe Asn Ala Ser Phe Asp Arg Ile

130 135 140

Ile Leu Tyr Asp Trp His Tyr Glu Lys Leu Pro Ile Tyr Thr Glu Thr

145 150 155 160

Gly His His Phe Phe Leu Gly Asp Cys Leu Tyr Phe Lys Asn Pro Glu

165 170 175

Phe Asp Pro Gln Lys Ala Gln Trp Arg Gly Glu Asn Val Ile Leu Leu

180 185 190

Gly Glu Asp Lys Tyr Phe Ala His Gly Leu Gly Ile Leu Asn Gly Lys

195 200 205

Gln Ile Ile Asp Lys Leu Asn Ser Phe Arg Lys Lys Gly Ala Leu Gln

210 215 220

Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Gln Ala Thr Arg Leu Asp Val Pro Ser Leu

225 230 235 240

Phe Arg Ile Val Arg

245

Claims (7)

1.一种谷氨酰胺转氨酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如序列表SEQID No.6所示。

2.权利要求1所述谷氨酰胺转氨酶突变体的编码基因。

3.权利要求2所述谷氨酰胺转氨酶突变体的编码基因，其特征在于，如序列表SEQ IDNo.5所示。

4.一种包含权利要求2所述基因的重组载体或重组菌株。

5.如权利要求4述的重组载体或重组菌株，其特征在于，表达载体为pBSA43；宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600、或者解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218。

6.权利要求4所述重组载体或重组菌株在生产谷氨酰胺转氨酶中的应用。

7.权利要求1所述谷氨酰胺转氨酶突变体在食品、纺织、制药中的应用。

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