KR101566672B1 - 티로시나아제를 이용하여 제조된 카테콜형 구조 물질, 그의 제조 방법 및 그의 응용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 티로시나아제를 이용한 카테콜형 구조 물질의 생합성 반응에 관한 기술로, 티로시나아제의 이차 산화 반응을 효과적으로 억제하여, 모노페놀형 구조 물질의 일차 수산화 반응만을 선택적으로 촉매화하는 기술이다. 본 발명은 이를 이용한 다양한 기능성 카테콜형 물질들을 높은 생산성과 수율로 생산하는 기술을 제공한다.

Description

티로시나아제를 이용하여 제조된 카테콜형 구조 물질, 그의 제조 방법 및 그의 응용{CATECHOL DERIVATIVES PREPARED BY USING TYROSINASE, METHOD FOR PREPARATION THEREOF, AND APPLICATION THEREOF}

본 발명은 넓은 기질 특이성을 가진 티로시나아제(tyrosinase)를 이용하여 다양한 모노페놀형 구조 물질(monophenolic compounds)에서부터 카테콜형 구조 물질만을 선별적으로 높은 생산성과 수율로 생성하는 방법에 관한 것이다. 이에 따라, 본 발명은 효소 반응을 이용한 기능성 카테콜형 구조 물질의 대량 생산이 가능하며, 원료화 및 의료용 제품 생산에 적용할 수 있다.

많은 카테콜형 구조 물질들(catechol derivatives)이 항산화, 항암, 항염증 또는 항바이러스 효과 등에 있어서 좋은 생리활성을 나타낸다고 보고되어 있으며, 모노페놀형 구조 물질(monophenolic compounds)보다 그 효과가 높은 것으로 보고되어 있다. 특히, 카테콜형 구조 물질은 티로시나아제(tyrosinase)의 억제제로 활용이 되고 있으며, 티로시나아제에 의한 멜라닌(melanin)의 생산을 줄이는 효과를 가지고 있다. 뿐만 아니라, 다이드제인(daidzein, 콩유래 이소플라본)에서 오르토 특이적으로 수산화된(ortho-hydroxylation) 3'-오르토하이드록시다이즈제인(3'-ODI, 3'-orthohydorxydaidzein)은 숙성된 된장에 일부 존재하며, 자외선에 의한 피부암을 예방하고, 암전이 관련 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다 (JBC, 2010, vol. 285, pp. 21458; JBC, 2011, vol. 286, pp. 14246). 아피제닌(apigenin)에서 유래된 카테콜형 물질로서, 수산화된 루테올린(luteolin)은 항산화성이 좋다는 아리초크(arichoke)에서 극소량 추출이 가능하고, 최근 유방암 치료에 사용될 수 있다고 보고되어 있다(Food Chemistry, 2013, "Luteolin sensitises drug-resistant human breast cancer cells to tamoxifen via the inhibition of cyclin E2 expression"). 이 밖에도 올리브오일 안의 수산화티로솔(hydroxytyrosol), 포도주 속 피스아타놀(piceatannol) 등의 카테콜형 물질 또한 강력한 항산화제로 알려져 있다. 고분자 물질 위의 카테콜 구조 물질은 홍합 단백질의 기능을 모사할 수 있으며, 그 응용처는 의료물질에서부터 표면 개질 나노 공학까지 폭넓게 연구되고 있다(Annu Rev Mater Res. 2011 1; 41: 99-132; Biofouling, 2012, 28:8, 865-877).

종래의 생촉매를 활용하여 카테콜형 구조 물질을 생산하는 경우, P450효소를 비롯한 다양한 모노옥시게나아제(mono-oxigenase)를 이용하고 있다. 그러나 대부분의 모노옥시게나아제의 경우, 조효소를 필요로 하며, 전자 전달을 위한 짝 환원효소(reductase)를 요구하게 된다. 이는 기질의 생변환 반응 속도에 영향을 주며, 낮은 수율과 생산성에 기인한다. 반면, 티로시나아제의 모노페놀 구조 물질 산화 반응은 상대적으로 빠르며 (참고로, 버섯류 유래 티로시나아제의 kcat/Km 값은 대략 1000 mM^-1s^{- 1} 이다), 조효소의 전자 전달반응을 위한 짝 효소를 수반하지 않는다.

하지만 티로시나아제의 문제점은 모노페놀형 구조 물질을 수산화시켜 카테콜형 구조 물질을 생산하는 일차 수산화 반응(monophenolase activity) 이후, 모노페놀형 구조 물질에서 생변환된 카테콜형 구조 물질이 티로시나아제의 이차 산화 반응(diphenolase activity)에 의해 퀴논형 물질(quinonic compounds)로 생변환되는 것에 있다. 보통 퀴논형 물질은 라디칼(radical)을 형성하여 빠르게 멜라닌(melanin)을 형성하고, 생성된 멜라닌 색소는 안정적인 구조체로 자외선 영역의 빛을 차단하는 기능을 가진다.

티로시나아제는 두 개의 구리 이온을 활성부위 주변 여섯 개의 히스티딘(Histidine) 아미노산으로 붙잡고 있으며, 그 두 개의 구리 이온 간의 거리는 구리를 포함하는 카테콜 옥시다제(catechol oxidase)와 다른 티로시나아제 군 안에서 일정하게 보존되어 있다. 티로시나제는 산소의 유무에 따라, 또한 두 개의 구리 사이에 결합한 산소 원자 개수에 따라, 디옥시 형태(deoxy-tyrosinase), 옥시 형태(oxy-tyrosinase) 및 메트 형태(met-tyrosinase)의 세 가지의 형태로 구분된다.

디옥시 형태(deoxy-tyrosinase)는 두 구리 이온 사이 산소를 포함하지 않은 형태이며, 산소가 공급되지 않으면, 수산화 반응 및 산화 반응을 할 수 없는 비활성체가 된다.

공기 중 산소가 용매에 해리되거나 과산화수소가 공급되면 디옥시 형태의 두 개의 구리 이온 사이에 산소 분자(O₂) 하나를 잡게 되고, 그 형태를 옥시 형태(oxy-tyrosinase)라 한다. 이 옥시 형태에 모노페놀의 산소원자가 구리 이온 한 개에 결합하면, 티로시나아제의 일차 수산화 반응이 시작된다.

상기 일차 수산화 반응(monophenolase activity)으로, 산소 분자 결합이 깨지며 하나의 산소 원자가 오르토 위치 탄소와 결합을 하며 수산화기가 삽입되고, 티로시나아제 두 구리 사이에는 하나의 산소 원자만이 남아있게 된다. 이 형태를 메트 형태(met-tyrosinase)라 한다. 이 때 카테콜형 구조 물질과 메트-티로시나아제는 분리 되고, 두 구리 사이의 산소 원자 하나는 이루고 있는 각도를 재배열하며, 이차 산화 반응(diphenolase activity)을 준비한다.

메트 형태는 카테콜형 구조 물질을 산화시킬 수 있지만, 모노페놀형의 수산화 반응에는 참여하지 않는다. 일차 수산화 반응 이후, 방향고리 위의 두 개의 수산화 잔기로부터 수소 이온을 제거하여, 남아있는 하나의 산소 원자와 결합하여 물을 생성하는 산화 반응이 연속적으로 발생한다. 결합하고 있는 두 산소 원자를 다 사용하고 나면, 두 구리이온 사이는 비어 있게 되며 다시 디옥시 형태로 돌아가게 된다. 모노페놀형 초기 기질에서 두 번의 생변환(수산화 반응 및 산화 반응)에 의해 생성된 산물은 오르토-벤조퀴논 형태의 구조 물질이다.

이차 산화 반응(diphenolase activity)에서는 카테콜형 구조 물질의 두 수산화기에서 수소가 떼어내지고, 두 구리와 결합할 수 있으며, 산소원자 하나는 두 전자를 카테콜형 물질에서 받아 물로 환원된다(diphenolase activity). 위에서 언급한 것처럼 메트 형태는 카테콜형 구조 물질을 산화 시킬 수 있지만, 모노페놀형의 수산화 반응에는 참여하지 않는다. 그러므로, 옥시-티로시나아제의 모노페놀형 구조 물질의 산화 반응 후, 생성된 카테콜형 구조 물질이 메트-티로시나아제에 의해 산화되지 못할 경우, 메트-티로시나아제는 디옥시-티로시나아제로 변환되지 못해 축적되게 되며 티로시나아제는 비활성화된다.

대개 일차 수산화 반응(monophenolase activity)의 반응 속도 상수(k1) 보다 이차 산화 반응(diphenolase activity)의 속도 상수(k2) 가 10 배 가량 크기 때문에 중간 생성물인 카테콜형 구조 물질을 축적하기에 어려움이 있다. 티로시나아제의 연구는 주로 멜라닌 형성반응과 그 억제제의 역할에 초점이 맞추어져 있으므로, 이를 응용한 다양한 카테콜형 구조 물질 형성 반응 최적화 기술은 본 연구가 최초라 할 수 있다.

한국 특허 공개 10-2012-0114072 한국 특허 등록 10-0878394

L-아스코르브산이 티로시나아제의 모노페놀라아제 활성에 미치는 영향, Biochem J. 1993 October 1; 295(Pt 1): 309-312. 모노페놀라아제/디페놀라아제 활성화 비율을 위한 티로시나아제의 방향진화, Enzyme and Microbial Technology, Volume 47, Issue 7, 8 December 2010, Pages 372-376.

생물학적인 방법을 적용한 카테콜형 구조 물질의 대표적인 생산방법은 첫째, 카테콜과 기타 구조의 결합 방법, 둘째, 모노페놀형 구조 물질의 수산화 반응으로 나눌 수 있다.

첫번째 경우에 해당하는 대표적인 반응은 일본 Ajinomoto 사의 도파 (DOPA) 생산 방법이다. 카테콜, 아세트산 및 암모니아를 티로신-페놀 리아제(tyrosin-phenol liase)를 이용하여 도파 (DOPA) 로 생변환시키며, 최대 100 g/L 수준으로 생산이 가능하다. 리아제를 사용하여 카테콜형 구조 물질을 생산하기 위해서는 카테콜과 탄소-탄소 결합을 형성할 수 있는 특이적인 기질과 상응하는 리아제의 스크리닝이 요구된다. 이에 따라, 다양한 카테콜형 구조 물질의 생산에는 한계가 있다.

두번째 경우에 해당하는 벤젠형 구조 물질 혹은 모노페놀형 구조 물질의 수산화 반응에는 모노옥시게나아제(monooxygenase)를 이용하는 방법이 있다. 모노옥시게나아제는 산화환원효소의 일종으로 전자전달계에 의한 전자의 공급이 요구된다. 대표적인 모노옥시게나아제 반응 효소는 시토크롬 P450 (cytochrome P450) 이며 효소의 중심에 자리하고 있는 헴 (heme) 구조의 철 이온의 산화 환원 작용으로부터 반응이 유도된다. 시토크롬 P450 의 기질 특이성을 변환시킴으로써 다양한 구조의 카테콜형 구조 물질의 생산에 적용하고 있다. 그러나 대부분의 모노옥시게나아제의 경우, 조효소를 필요로 하며, 전자 전달을 위한 짝 환원효소(reductase)를 요구하게 된다. 이는 기질의 생변환 반응 속도에 영향을 주며, 낮은 수율과 생산성에 기인한다.

그 외의 다른 생촉매 수산화 반응으로는 티로시나아제의 응용이 있다. 티로시나아제의 활성 부위는 주로 단백질 표면에 존재하며, 모노페놀형 구조 물질에 대한 티로시나아제의 기질 특이성이 넓은 것이 다양한 카테콜형 구조 물질의 생산에 있어서는 장점이 되겠다. 또한 티로시나아제의 모노페놀 구조 물질 산화 반응은 상대적으로 빠르며 (참고로, 버섯류 유래 티로시나아제의 kcat/Km 값은 대략1000 mM^-1s^{- 1} 이다), 조효소의 전자 전달반응을 위한 짝 효소를 수반하지 않는다. 하지만, 티로시나아제의 경우 다양한 종류의 모노페놀형 구조 물질을 기질로서 사용하여, 상기 언급한 두 가지 경우보다 빠르게 카테콜형 구조 물질로 변환할 수 있는 장점이 있으나, 동시에 카테콜형 구조 물질 또한 빠르게 산화시켜 퀴논 형태를 형성한다. 생성된 퀴논형 물질은 쉽게 라디칼을 형성하여, 멜라닌과 같은 고분자 물질을 형성하거나 주변 물질을 산화시킨다.

중간체인 카테콜형 구조 물질을 효과적으로 축적하기 위해서는, 첫째, 퀴논형 물질의 환원으로 의한 카테콜형 물질 축적과, 둘째, 축적된 카테콜형 물질의 산화 방지, 셋째, 카테콜형 물질이 축적됨에 따라 비활성화되는 티로시나아제의 재활성화가 연구되어야 한다.

본 발명은 상기 세가지 연구를 통해, 티로시나아제를 이용하여 높은 생산성과 수율로 기능성 카테콜형 구조 물질을 생산하는 방법을 제공하는 데에 목적이 있다.

티로시나아제의 이차 산화 반응을 억제하고, 카테콜형 구조 물질을 효과적으로 생산하기 위해, 본 기술의 전략은 크게 세가지 파트로 나뉘어 지며, 이는 첫째, 퀴논형 물질의 환원으로 의한 카테콜형 물질 축적; 둘째, 축적된 카테콜형 물질의 산화 방지; 및 셋째, 비활성화 티로시나아제의 재 활성화이다.

구체적으로, 첫째, 본 발명은 티로시나아제의 이차 산화 반응에 의해 생산된 퀴논형 물질을 효과적으로 카테콜형 구조 물질로 다시 환원시키는 방법을 제공한다.

둘째, 본 발명은 티로시나아제의 일차 수산화 반응으로 생성된 카테콜형 구조 물질을, 다른 원소와 배위 결합을 유도하여, 티로시나아제의 이차 산화 반응으로부터 보호하는 방법을 제공한다.

셋째, 본 발명은 티로시나아제의 세가지 활성 형태를 효과적으로 조절하여 효소 활성을 최적화하는 기술을 제공한다. 카테콜형 구조 물질이 산화되지 않을 시, 메트-티로시나아제의 산소 원자 하나는 쉽게 제거되지 못하기 때문에 티로시나아제는 비활성화된다. 이렇게 비활성화된 티로시나아제는 환원력에 의해 다시 활성화될 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 하기를 제공한다.

(1) 티로시나아제를 이용하여, 모노페놀형 구조 물질로부터 카테콜형 구조 물질을 제조하는 방법으로서, 하기 (a) 내지 (c) 단계 중 어느 하나의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법:

(a) 티로시나아제의 과산화반응에 의해 생성된 퀴논형 구조 물질을, 환원력을 도입하여, 카테콜형 구조 물질로 환원시키는 단계;

(b) 생성된 카테콜형 구조 물질을 전이금속이온이나 붕소이온으로 배위 결합시키는 단계;

(c) 환원력을 도입하여, 메트-티로시나아제를 활성화시키는 단계.

(2) (1) 에 있어서, (a) 또는 (c) 단계에 사용되는 환원력이 전기화학, NADH, NADPH, 아스코빅산, 시스테인, p-쿠마릭산, 히드록실아민, 카테콜, 피로갈롤 및 카페인산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것으로부터 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.

(3) (1) 에 있어서, 모노페놀형 구조 물질이 티로신 아미노산, 티로솔, 레스베라트롤, 다이드제인, 제니스테인, 아피제닌, 플로레틴, 페놀, 파라-쿠마릭산, 파라-니트로페놀, 파라-크레졸, 파라-비닐페놀 및 오르소-아미노페놀로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

(4) (1) 에 있어서, 카테콜형 구조 물질이 루테올린, 3-하이드록시프롤레틴, 3'-오르토하이드록시다이즈제인, 오로볼, 피스아타놀, 수산화 티로솔, 도파(dopa), 카페익산, 3,4-디하이드록시니트로벤젠, 3,4-디하이드록시톨루엔 및 3,4-디하이드록시스티렌으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

(5) (1) 에 있어서, 카테콜형 구조 물질을 분리 정제하는 단계인 하기의 (d) 단계를 추가로 포함하는 방법:

(d) 카테콜형 구조 물질이 포함된 생성물을 유기 용매에 용해하여 물층을 얻고, 얻어진 물층의 pH 를 낮춘 후, 추가로 유기 용매에 용해하여 유기층을 얻고, 얻어진 유기층을 증발시켜 카테콜형 구조 물질 얻는 단계.

(6) (1) 에 있어서, 모노페놀형 구조 물질이 고분자 위의 티로신 잔기인 것을 특징으로 하는 방법.

(7) (6) 에 따른 방법으로 제조된 카테콜형 구조 물질을 이용한 고분자 가교 반응 방법.

본 발명은 티로시나아제를 이용한 기능성 카테콜형 구조 물질의 제조 및 그의 응용에 관한 것으로, 다양한 유래의 티로시나아제에 적용될 수 있다. 이는 티로시나아제 기질 특이성에 따라, 다양한 모노페놀형 구조 물질에서 기능성 카테콜형 물질로의 수산화 반응을 총괄하는 것으로, 기존에 추출이나 유기화학적 합성이 어려웠던 카테콜형 구조 물질의 생산을 가능케 하여, 그 생리학적 효능 실험에 이바지할 수 있다. 최근 플라보노이드/이소플라보노이드 계열의 수산화물의 항암성에 대한 연구가 많이 보고되고 있다. 하지만, 위치 특이적인 유기 합성법은 어려우며, 자연적으로 극소 존재하는 수산화 플라본/이소플라본을 추출하는 것도 한계가 있다. 본 연구를 통하여, 기능성 카테콜 구조 물질의 생산이 용이해지며, 이에 관한 생리학적 연구 및 신소재/기능성 원료 개발이 많이 진행될 수 있다.

또한, 티로시나아제를 이용하여 단백질 상의 모노페놀형 아미노산 잔기인 티로신(tyrosine)을 도파로 수산화시킬 수 있으며, 이는 홍합 단백질의 접착 기능을 모사할 수 있는 단백질로 성질 개량될 수 있다. 이렇게 성질 개량 단백질은 조직 공학의 스캐폴드(scaffolds)로 발전 가능하며, 더 나아가 기능적 단백질 약물 전달체 (drug delivery system) 로 개발 가능하다 (Annu Rev Mater Res. 2011 1; 41: 99-132; Biofouling, 2012, 28:8, 865-877; Current Opinion in Biotechnology 2013, 24:1-7).

도 1 은 효율적인 카테콜형 구조 물질을 티로시나아제로 생성하기 위한 모식도로서, (a) 는 모노페놀형 구조 물질이고, (b) 는 카테콜형 구조 물질이며, (c) 는 퀴논형 구조 물질이고, (d) 는 카테콜형 구조 물질의 다른 원소와 배위 결합을 이루는 구조체이다. 또한, (1) 은 티로시나아제의 일차 수산화 반응이고, (2) 는 티로시나아제의 이차 산화 반응이며, (3) 은 디옥시-티로시나아제가 산소 분자 하나를 활성부위 안에 존재하는 두 개의 구리 사이에 넣고 옥시-티로시나아제가 되는 반응이고, (4) 는 메트-티로시나아제의 산소 원자 하나를 환원시키는 환원제에 의한 반응이며, (5) 는 수산화된 카테콜형 구조 물질이 배위 결합을 이루는 것이고, (6) 은 퀴논형 구조 물질을 환원시켜 다시 카테콜형 구조 물질로 축적하는 것이며, (7) 은 과산화된 퀴논형 물질이 멜라닌으로 고분자화 되는 반응이다.
도 2 는 티로시나아제 전세포 반응 중에 첨가한 환원제를 나열한 표로서, 각각의 환원제(NADH, L-아스코빅산, 글루타티온, 시스테인, 하이드로퀴논, 1-나프톨, p-쿠마릭산, 커큐민, 카테콜, 피로갈롤 또는 페룰릭산)를 첨가하는 경우 레스베라트롤(trans-resveratrol)에서 수산화된 피스아타놀(piceatannol)의 상대적 생산량을 나타낸다.
도 3 은 세가지 다른 유래의 티로시나아제(BMT_tyr:바실러스 메가테리움 티로시나아제, ABS_tys:아가리쿠스 비소포루스 티로시나아제, 및 SAV_tyr:스트렙토마이세스 아베르미틸리스 티로시나아제)의 티로신 아미노산(L-tyrosine)과 도파(L-dopa)에 대한 모노옥시게나아제 반응 속도와 디옥시게나아제 반응속도를 비교한 표이다.
도 4 는 모노페놀형 구조 물질로부터 티로시나아제의 수산화 반응으로 생성된 카테콜형 구조 물질들을 나타내는 반응식이다.
도 5 는 pH 조절을 통해, 수산화된 3'-오르토하이드록시다이즈제인(3'-ODI, 3'-orthohydorxydaidzein)의 배위 결합의 여부를 확인하는 고성능-액체크로마토그래피의 정량적 분석이다.
도 6 은 pH 조절을 통해, 수산화된 오로볼(orobol)과 루테올린(luteolin)의 배위 결합의 여부를 확인하는 고성능-액체크로마토그래피의 정량적 분석이다.
도 7a 는 pH 9 붕소산 완충액에서, 1mM 다이드제인 및 100nM 티로시나아제를 포함하는 5mL in vitro 반응 중 3'-ODI 의 생산성을 시간 단위로 관찰한 그래프이다.
도 7b 는 pH 9 트리스(tris-HCl) 완충액에서, 300μM 다이드제인 및 100nM 티로시나아제를 포함하는 5mL in vitro 반응 중 3'-ODI 의 생산성을 시간 단위로 관찰한 그래프이다.
도 8 은 히드록실아민이나 아스코빅산을 첨가한 1mM 제니스테인의 수산화 반응을 시간 단위로 관찰한 그래프이다.
도 9 는 히드록실아민이나 아스코빅산을 첨가한 1mM 레스베라트롤의 수산화 반응을 시간 단위로 관찰한 그래프이다.
도 10 은 생성된 카테콜혈 구조 물질을 분리/정제 하는 기술의 모식도이며, 실시예 5 에 그 방법이 자세히 명시되었다.
도 11a 는 다이드제인(daidzein)으로부터 생성된 3'-오르토하이드록시다이즈제인(3'-ODI)를 GC/MS로 분석한 결과를 나타내는 것으로서, (1) 로 나타내는 보존시간(retention time) 18.18 분은 GC로 분리된 3'-ODI 이며, (a) 로 나타내는 486.48, m/z 는 MW(TMS)의 m/z이며, (b)로 나타내는 471.50, m/z 는 MW(TMS)-15의 m/z 이며, (c) 로 나타내는 383.39, m/z 는 MW(TMS)-103의 m/z 이다.
도 11b 는 레스베라트롤(trans-resveratrol)으로부터 생성된 피스아타놀(piceatannol)을 GC/MS로 분석한 결과를 나타내는 것으로서, (1)로 나타내는 보존시간(retention time) 14.82 분은 GC로 분리된 피스아타놀이며, (a) 로 나타내는 532.53, m/z 는 MW(TMS)의 m/z이며, (b)로 나타내는 517.45, m/z 는 MW(TMS)-15의 m/z 이다.
도 12 는 pH 에 따른 카테콜형 구조 물질이 철이온과 배위결합을 이루는 모습을 보여주는 것이다.

이하에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 티로시나아제 혹은 티로시나아제가 발현된 미생물(전세포)를 이용하여, 카테콜형 구조 물질을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 티로시나아제의 과산화 반응에 의한 카테콜형 구조 물질의 생변환 반응을 억제하기 위해, 배위 결합을 이뤄 축적하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 과산화로 생성된 퀴논형 물질을 효과적으로 카테콜형 구조 물질로 환원시키는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 i) 퀴논형 물질의 환원으로 의한 카테콜형 물질 축적과, ii) 축적된 카테콜형 물질의 산화 방지 및 iii) 카테콜형 물질이 축적됨에 따라 비활성화되는 티로시나아제의 재활성화를 통해, 카테콜형 구조 물질을 효과적으로 축적할 수 있다.

첫째, 본 발명은 티로시나아제의 이차 산화 반응에 의해 생산된 퀴논형 물질을 효과적으로 카테콜형 구조 물질로 다시 환원시키는 방법을 제공한다. 이를 통하여 퀴논형 구조 물질이 멜라닌으로 고분자화되는 것을 지체할 수 있다. 이는 환원력에 의해 라디컬들이 안정화되기 때문이며, 또한, 퀴논형 물질이 전자를 받아 다시 카테콜형 구조 물질로 변환될 수 있기 때문이다. 효소 활성에 악영향 없이 사용될 수 있는 효과적인 환원력으로써 전기 화학적인 방법과 도 2 의 환원제 목록에 명시된 화합물과 같은 환원제가 있다. 목록에 있는 환원제를 산화 반응에 첨가하면, 어두운 멜라닌 형성이 지체되는 것을 확인할 수 있었다. 이 때 멜라닌 형성이 지체되기는 하나, 초기 기질인 모노페놀형 물질의 감소는 지속적으로 이루어지는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 위와 같은 환원력은 멜라닌 형성에만 영향을 미치며, 티로시나아제의 활성 저해와는 무관한 것으로 판단되었다. 상기 환원력은 전기화학, NADH, NADPH, 아스코빅산, 시스테인, p-쿠마릭산 및 히드록실아민, 카테콜, 피로갈롤 및 카페인산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것으로부터 제공될 수 있다. 바람직하게, 상기 환원력은 글루코스 탈수소효소(glucose dehydrogenase) 등과 같은 NAD(P)H 재생산 효소를 이용하여, 반응 중 지속적으로 제공될 수 있으며, 이는 in vivo 상에서 카테콜형 물질 생산 시 더 효율적으로 응용될 수 있다.

둘째, 본 발명은 티로시나아제의 일차 수산화 반응으로 생성된 카테콜형 구조 물질을 다른 원소와 배위 결합을 유도하여 티로시나아제의 이차 산화 반응으로부터 보호하는 방법을 제공한다. 카테콜형 구조 물질은 pH 에 따라 철이온과 배위 결합을 이루는 것으로 알려져 있다 (Proc Natl Acad Sci USA. 2011 15, 108(7),2651-2655). 이는 홍합 단백질이 유기물에 있는 금속 이온과 결합하여 접착력을 갖는 것과 같은 이치이다(Annu Rev Mater Res. 2011 41, 99-132). 이를 바탕으로 철 이온 이외에 티로시나아제의 활성에 무해하며, 카테콜형 구조 물질과 배위 결합을 이루는 물질을 선별하였고, 본 연구의 실시예를 위한 실험으로 진행하였다.

붕소(B)는 sp2 혼성궤도 함수를 가지지만, 루이스 염기(Lewis base) 존재시 sp3가 된다. 카테콜형 구조 물질이 루이스 염기로 작용하여, pH 에 따라 한 개 또는 두 개의 카테콜 물질과 배위결합을 이룬다고 보고되어 있다 (BBA, 2002, 1569, 35-44). 붕소산과 결합한 복합체는 친수성이 증가하게 되며, 이러한 기작으로 하여, 붕소산 이온은 다이올(diol)을 가진 당을 안정화시킬 때 사용되어지기도 하며, 커피콩이나 찻잎에서부터 카페인을 추출할 때에도 사용된다. 배위 결합을 이룬 카테콜형 물질은 수산화기가 모두 붕소산과 배위 결합을 이루고 있기 때문에, 티로시나아제에 의해 산화되지 않는다. 그러하기에 이차 산화 반응을 배제하고, 일차 수산화 반응만을 관찰할 때에도 이용된다(JACS, 2003, vol. 125, 43, 13034-13035).

셋째, 본 발명은 티로시나아제의 세가지 활성 형태 (디옥시 형태, 옥시 형태 및 메트 형태) 를 효과적으로 조절하여 효소 활성을 최적화하는 기술을 제공한다. 카테콜형 구조 물질이 산화되지 않을 시, 메트-티로시나아제의 산소 원자 하나는 쉽게 제거되지 못하기 때문에 티로시나아제는 비활성화된다. 이렇게 비활성화된 메트-티로시나아제의 산소 원자 하나는 다른 환원제나 전기 화학적 환원력에 의해 환원되어 물 분자로 빠지게 될 수 있으며, 티로시나아제는 다시 산소 분자 (O₂) 를 받아들일 수 있는 디옥시 형태로 전환된다. 이런 환원제로서는 도 2 의 환원제 리스트에 명시된 것처럼 카테콜형 물질 외에, 히드록실아민 (NH₂OH, hydroxylamine), NAD(P)H, 아스코빅산 (ascorbic acid) 등이 있다.

도 1 의 반응 4 에서 보이는 것과 같이 히드록실아민 (hydroxylamine)은 활성부위 안의 구리 사이에 남아 있는 산소원자를 환원시켜 물을 생성하고, 모노페놀형 물질을 기질로 받아들일 수 없던 티로시나아제를 디옥시 형태로 변환시켜 준다 (JACS, 2003, vol. 125, 43, 13034-13035). 디옥시-티로시나아제는 산소 분자 하나와 다시 구리-산소 복합체 (μ-η²:η² peroxo binuclear copper complex)를 이뤄 옥시-티로시나아제가 된다. 도 1 의 반응 4 는 히드록실아민 뿐만 아니라, 활성부위에 접근 가능한 환원제, 즉, NAD(P)H, 아스코빅산, 다른 카테콜형 물질 등에 의해서도 가능하다.

한편, 본 발명에서 사용되는 용어는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것으로 당업자라면 그 의미를 누구나 이해할 수 있을 것이나, 본 명세서에서 간략히 설명하면 다음과 같다:

(1) 티로시나아제 - 구리포함 단백질로서 멜라닌을 생산을 촉매화하는 효소를 의미한다.

(2) 모노페놀형 구조 물질 - 도 1 의 (a) 와 같은 구조를 가진 물질을 의미한다. 상기 모노페놀형 구조 물질로는, 티로신 아미노산(tyrosin)과 티로솔(tyrosol)과, 레스베라트롤(resveratrol)과 같은 스틸벤(stilbene) 계열, 다이드제인(daidzein), 제니스테인(genistein), 아피제닌(apigenine), 플로레틴(phloretin) 과 같은 플라본(flavonone)/이소플라본(isoflavone) 계열, 이 밖에 페놀(phenol), 파라-쿠마릭산(para-coumaric acid), 파라-니트로페놀(para-nitrophenol), 파라-크레졸(para-cresol), 파라-비닐페놀(para-vinylphenol), 오르소-아미노페놀(ortho-aminophenol) 이 있다. 바람직하게는, 레스베라트롤, 파라-쿠마릭산, 다이드제인, 제니스테인, 파라-니트로페놀, 파라-크레졸, 파라-비닐페놀, 아피제닌 또는 플로레틴 등을 사용할 수 있다.

또한, 모노페놀형 구조물질은 고분자 물질 위의 티로신 잔기일 수 있으며, 상기 고분자 물질은 단백질(폴리펩타이드)일 수 있다.

(3) 카테콜형 구조 물질 - 도 1 의 (b) 와 같은 구조를 가진 물질을 의미한다. 상기 카테콜형 구조 물질은 모노페놀형 구조티로신 물질에 오르토 특이적으로 수산화된 물질로서, 루테올린(luteolin), 3-하이드록시프롤레틴 (3-hydroxyphloretin, 3'-ODI), 오로볼(orobol) 과 같은 수산화 플라본(flavonone)/이소플라본(isoflavone) 계열, 피스아타놀(piceatannol) 과 같은 수산화 스틸벤(stilbene) 계열, 수산화 티로솔(hydroxyltyrosol), 도파(dopa), 카페익산(caffeic acid), 3,4-디하이드록시니트로벤젠(3,4-dihydroxynitrobenzene), 3,4-디하이드록시톨루엔(3,4-dihydroxytoluene), 3,4-디하이드록시스티렌(3,4-dihydroxystyrene) 등이 있다. 바람직하게는 위에 나열한 바람직한 모노페놀형 구조 물질들이 오르토 특이적 수산화된 형태로서, 차례대로, 피스아타놀, 카페익산, 3'-ODI, 오로볼, 3,4-디하이드록시니트로벤젠(3,4-dihydroxynitrobenzene), 3,4-디하이드록시톨루엔(3,4-dihydroxytoluene), 3,4-디하이드록시스티렌(3,4-dihydroxystyrene), 루테올린, 3-하이드록시프롤레틴(3-hydroxyphloretin) 등이 있다.

(4) 퀴논형 구조 물질 - 도 1 의 (c) 와 같은 구조를 가진 물질을 의미한다.

(5) 배위결합 복합물질 - 도 1 의 (d), 또는, 도 12 의 모노컴플렉스 (mono-complex), 비스컴플렉스 (bis-complex) 또는 트리스컴플렉스 (tris-complex) 와 같은 구조를 형성하는 복합체를 의미한다. 전이금속이온(transition metal ions)이나 붕소산 이온(boric acid, borate ion) 을 사용할 수 있다.

(6) 세포추출물 - 도움단백질과 티로시나아제가 발현된 본 발명의 미생물 추출물을 의미한다.

(7) 전세포 반응 - 특정 효소를 포함하는 세포를 파쇄하여 세포 내용물을 이용하거나 또는 효소를 분리정제하지 않고 온전한 세포 전체를 이용한 반응을 의미한다.

(8) 티로시나아제 일차 수산화 반응 (모노옥시게나아제 활성) - 탄소-수소 결합 내에 산소 원자를 도입하는데 촉매화하는 티로시나아제 효소반응을 의미하며 수산화 잔기를 생성한다.

(9) 티로시나아제 이차 산화 반응 (디옥시게나아제 활성) - 카테콜형 구조 물질에서 산소에 결합된 수소와 전자를 제거하여 벤조퀴논 형태로 촉매화하는 티로시나아제 효소반응을 의미한다.

(10) PCR - 중합 효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction)으로서, DNA의 어떤 영역을 특이적으로 증폭시키는 방법을 의미한다.

(11) 벡터 - 단일가닥, 이중가닥, 원형 또는 초나선 DNA 또는 RNA로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 벡터는 재조합 단백질을 생산할 수 있도록 적절한 거리에 작동적으로 연결되어 있는 구성요소들을 포함할 수 있다. 이러한 구성요소에는 복제 오리진, 프로모터, 인핸서, 5'mRNA 리더 서열, 리보솜 결합부위, 핵산 카세트, 종결 및 폴리아데닐화 부위, 및 선별가능한 표지 서식 등이 포함될 수 있으며, 상기 구성요소들은 특이적인 용도에 따라 하나 또는 그 이상이 빠질 수도 있다. 핵산 카세트는 발현할 재조합 단백질의 삽입을 위한 제한효소 부위를 포함할 수 있다. 기능적 벡터에 있어서, 핵산 카세트는 번역 개시 및 종결 부위를 포함하는 발현될 핵산 서열을 함유한다. 필요에 따라 벡터에 내에 두 종류의 카세트를 삽입할 수 있는 벡터를 사용하기도 하며 상기 언급한 기능들이 부가적으로 서열화 될 수 있다. 재조합 벡터에 삽입된 유전자는 발현용 대장균 균주 BL21(DE3) 등을 사용할 수 있으나, 삽입된 벡터의 종류에 따라 달라질 수 있다. 이러한 벡터 및 발현 균주는 당업자라면 용이하게 선택할 수 있다.

(12) 퀴논형 구조 물질이 멜라닌으로 고분자화 되는 것을 지체하고, 퀴논형 물질을 효과적으로 카테콜형 구조 물질로 환원시킬 수 있는 환원제로서, NAD(P)H, L-아스코빅산, 글루타티온(glutathione), 시스테인(cystein), 이종 카테콜형 구조 물질, 벤젠 또는 모노페놀형 구조 물질등을 사용할 수 있으며, 이종 카테콜형 구조 물질로는, 카테콜, 3-메틸카테콜, 4-메틸카테콜, 카페익산(caffeic acid), 피로갈롤 또는 카테콜 비올렛 등을 사용할 수 있다. 또한, 모노 페놀형구조 물질로는, 페놀, 다이드제인, 제니스테인, p-쿠마릭산 등을 사용할 수 있다.

(13) 티로시나아제를 다시 활성화 시키기 위한, 활성부위에 접근 가능한 환원제로서, 히드록실아민, NAD(P)H, 아스코빅산 또는 다른 카테콜형 물질 등을 사용할 수 있다.

발현법 1 : 티로시나아제의 발현

바실러스 메가테리움(BMT, Bacillus megaterium) 유래와 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(SAV, 방선균, Streptomyces avermitilis) 유래의 티로시나아제 DNA 서열을 PCR 을 통해 증폭시킨 후 pet28a 또는 petDuet 벡터에 각각 넣고, 이를 E. coli 에서 histag(6 histidine)과 같이 각각 발현하였다. 발현 방법은 아래와 같다. 티로시나아제 염기 서열이 삽입된 플라스미드를 BL21 반응능 세포(competent cell)에 형질전환 후, 각각 플라스미드에 맞는 항생제를 포함한 LB고체 배지에서 37℃ 배양기에서 배양하였다. 하나의 콜로니를 항생제를 포함한 5mL LB 액체 배지에 접종하고 8시간 37℃ 배양기에서 200rmp 속도로 배양하였다. 이를 다시 50mL의 항생제를 포함한 새로운 액체 배지에 1v%(500uL) 접종하였다. 세포 O.D 600nm 가 0.6 도달하면, 2mM IPTG 와 1mM CuSO₄ 를 넣고, 18℃ 배양기에서 200rpm 에서 17 시간 단백질 발현을 유도하였다. 17 시간 후 세포는 4000rpm 으로 원심 분리하고, 5mL PBS로 세척하여 준비하였다. 세척 이후 전세포 반응은 tris-HCl 완충액이나 붕소산 완충액에서 진행되었으며, 그 외 세포 추출물은 초음파 처리로 준비하였다. In vitro 전세포 반응은 세포 추출물 중 수용체 부분을 그대로 사용하거나, 상용적 히스택 (6-histag) 정제법으로 정제한 단백질을 이용하였으며, 각각의 실시예에 구체적으로 명시하였다.

반응법 1 : 티로시나아제와 환원물질를 이용한 카테콜형 구조 물질의 생산방법

상기 수득한 미생물 또는 생산된 티로시나아제 추출물 또는 정제된 티로시나아제와 도 1 의 (a) 와 같은 모노페놀형 구조 물질을 반응하여 (b) 와 같은 카테콜형 구조 물질을 생산한다. 반응에는 환원제를 첨가하여 (c) 물질 이후의 생산과정을 억제한다.

첨가한 환원제의 농도는 모노페놀형 구조 물질의 농도 대비 1 내지 100 배가 바람직하며, 5 내지 30 배가 더 바람직하고, 7 내지 13 배가 더욱 바람직하다. 반응에는 생성된 카테콜과 배위 결합을 이룰 수 있는 물질을 첨가하여 티로시나아제의 이차 산화 반응으로부터 보호한다.

첨가한 배위결합 전구체의 농도는 모노페놀형 구조 물질의 농도 대비 1 내지 10000 배가 바람직하며, 50 내지 600 배가 더 바람직하고, 100 내지 500 배가 더욱 바람직하다.

본 발명의 반응온도는 2 내지 80 ℃ 가 바람직하며, 20 내지 70 ℃ 가 더 바람직하고, 20 내지 40 ℃ 가 더욱 바람직하다.

반응액의 pH 는 5 내지 11 이 바람직하며, 5 내지 11 이 더 바람직하고, 7 내지 9 가 더욱 바람직하다. 도 3 에서 보이듯이 티로시나아제마다 반응속도는 다르며, 그 기질특이성에 따라 티로시나아제가 사용되었다.

본 발명의 구체적인 방법을 실시예로서 상세히 설명하나, 본 발명의 기술적 범위가 실시예에 한정되는 것은 아니다. 하기 실시예에서 특별한 언급이 없으면, 모든 퍼센트는 최종 조성물의 100 중량% 를 기준으로 한다.

pH 에 따른 초기 기질( 모노페놀형 구조 물질)의 용해도 변화

이소플라본 계열인 다이드제인(daidzein)은 물에 낮은 용해도를 가지고 있으므로, 상온 중성의 물이나 완충액에서 0.1% DMSO 존재 시 300uM 정도 녹일 수 있다. 하지만, 고농도의 붕소산 완충액을 이용할 시 pH 가 높아 짐에 따라 용해도가 증가하며, pH 9 에서는 5mM 수준으로 용해도가 열 배 이상 증가하고, pH 10 에서는 30mM 수준으로 용해도가 100배 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 티로시나아제는 다른 모노옥시게나제와 달리 폭넓은 pH 에서 활성을 가짐으로, 고농도의 초기 기질을 사용하여 반응 생산성을 높일 수 있었다.

티로시나아제 활성 범위인 pH 9에서, 300μM 다이드제인 및 100nM 티로시나아제를 포함하는 5mL in vitro 반응은 시간당 15 mg 의 3'-ODI 를 생산하는 반면, pH 9 붕소산 완충액에서의 1mM 다이드제인 및 100nM 티로시나아제를 포함하는 5mL in vitro 반응은 시간당 45 mg 의 3'-ODI 를 생산하여, 그 생산성을 3 개 가량 늘릴 수 있었다. 이는 도 7a 및 도 7b 에 명시하였다.

환원제에 따른 카테콜형 구조 물질 수율 비교 실험.

위에 명시된 발현법 1 에 따라 배양한, SAV 유래 티로시나아제가 발현된 세포를 파쇄하지 않고 세포만을 세척하여 0.1 mM 레스베라트롤, 1 mM 의 다양한 환원제 (NADH, L-아스코빅산, 글루타티온, 시스테인, 하이드로퀴논, 1-나프톨, p-쿠마릭산, 커큐민, 카테콜, 피로갈롤 또는 페룰릭산) 를 첨가하여 피세아타놀을 생산하였다. 반응 후 동량의 에틸아세테이트(ethylacetate, EA) 혹은 비극성 용매를 이용하여 추출한 후, 고성능-액체크로마토그래피로 정량분석하여 환원제 첨가에 의한 피세아테놀 생산 효율을 비교하였고 이를 도 2 에 명시하였다.

카테콜형 구조 물질의 배위 결합.

500uM 의 다이드제인을 200nM의 정제된 BMT 유래 티로시나아제를 이용하여 반응법 1 과 같이 수산화 반응을 진행하였으며, 이 때 붕소산을 넣어 배위 결합을 유도하였다. 도 5 의 (a) 에서 보이는 것과 같이, 알카리성 반응액에서 배위 결합을 이룬 3'-ODI 는 친수성이기에 유기용매로 추출되지 않는 것을 고성능-액체크로마토그래피를 통해 확인하였다. 또한, 도 5 의 (b) 에서는 2M 의 HCl 을 처리하자, 배위 결합이 풀어지면서 200 uM 의 3'-ODI 가 검출되는 것을 확인하였다.

또한, 1mM 의 제니스틴과 아피제닌도 정제된 300nM BMT 티로시나아제를 이용하여 수산화 반응을 진행하였으며, 도 6 에서 보이듯이 수산화된 오로볼과 루테올린 또한 알카리성 반응액에서 배위 결합을 이루어 유기용매에 추출되지 않고, 산성 반응액에서 배위 결합이 풀어지면 유기용매에 추출되는 것을 고성능-액체크로마토그래피를 통해 확인하였다.

티로시나아제의 비활성화 방지

발현법 1 에서 배양한 티로시나아제를 히스택 정제하여 100nM 을 반응에 첨가하였고, 티로시나아제의 비활성화를 방지하기 위해 히드록실아민이나 아스코빅산을 넣어 활성화시켰다. 이때 첨가된 히드록실아민이나 아스코빅산의 농도는 기질 대비 1 내지 100 배의 농도이며, 3 배 내지 50 배가 더 바람직하며, 10 배 내지 20 배가 더욱 바람직하다. 위와 같은 조성을 통해 1mM 다이드제인을 반응법 1 에 따라 반응을 진행시켰으며, 시간 별로 100uL의 반응물을 4배의 에틸아세테이트(ethylacetate, EA) 혹은 비극성 용매를 이용하여 추출한 후 고성능-액체크로마토그래피로 정량분석하였다. 정량 분석 결과 반응 6 시간에 100% 수율로 1mM 의 3'-ODI을 생산하였으며, 이는 도 7a 에 나타내었다.

같은 방법으로, 제니스틴(genistein) 및 레스베라트롤 (resveratrol) 의 위치 특이적 수산화 반응을 유도하였고, 이와 같은 모노페놀형 물질은 티로시나아제의 일차 수산화 반응을 통해, 기능성 카테콜형 구조 물질로 생변환될 수 있었다. 제니스틴은 반응 한 시간만에 95% 오로볼(orobol)로 생변환되었으며, 레스베라트롤은 반응 한 시간만에 100% 피스아타놀(piceatannol)로 생변환되었다. 이는 도 8 및 9 에 나타내었다.

생성된 카테콜형 구조 물질의 분리정제법

실시예 4 에서 생성된 카테콜형 구조 물질을 분리하기 위해, 생성물과 반응물의 용해도를 이용하였다. 알카리성 완충액에서 반응을 진행하여 생성된 카테콜형 물질이 배위 결합을 이루게 함으로써 친수성을 높였다(도 10 의 1). 배위결합체를 이루지 않는 모노페놀형 구조 물질은 반응 부피 4 배수의 에틸아세테이트(ethylacetate, EA) 에 추출되고 유기용매와 물층은 비중차이에 의해 도 10 의 2 처럼 층이 구분지어졌다. 뷰렛으로 이를 분리하여, 도 10 의 3-1 (물층)과 3-2 (유기층)을 분리하고, 분리된 유기층은 증발시켜, 그 안의 남아 있는 모노페놀형 구조 물질을 다시 반응에 쓰여질 수 있게 준비하였다. 물층은 1M HCl 을 이용하여 pH를 낮추고 카테콜형 구조 물질을 다시 4 배수의 에틸아세테이트(ethylacetate, EA) 로 추출하였다(도 10 의 4). 추출 후, 산성 반응액 층은 뷰렛으로 분리하였다. 에틸아세테이트(ethylacetate, EA) 층은 진공 증발기(vacuum evaporator)를 통해 에틸아세테이트(ethylacetate, EA) 를 제거하고, 정제된 가루 형태의 카테콜형 구조 물질을 얻을 수 있었다.

티로시나아제를 이용한 수산화 반응 생성물의 질량 분석

실시예 5 에서 생성한 기능성 카테콜형 구조 물질들을 가스크로마토그래피-질량분석기(GC-MS)를 통해 정성분석하였으며, 그 결과는 도 11 에 명시하였다.

구체적으로, 도 11a 는 다이드제인(daidzein)으로부터 생성된 3'-오르토하이드록시다이즈제인(3'-ODI)를 GC/MS로 분석한 결과를 나타내는 것으로서, (1) 로 나타내는 보존시간(retention time) 18.18분은 GC로 분리된 3'-ODI 이며, (a) 로 나타내는 486.48, m/z 는 MW(TMS)의 m/z이며, (b)로 나타내는 471.50, m/z 는 MW(TMS)-15의 m/z 이며, (c) 로 나타내는 383.39, m/z 는 MW(TMS)-103의 m/z 이며, 위 결과는 선행 논문 (Hydroxylation of daidzein by CYP107H1 from Baciilus subtilis 168, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, Vol 59, issue 4, August 2009, Pages 248-253)을 참조하여 3'-ODI임을 확인할 수 있다.

도 11b 는 레스베라트롤(trans-resveratrol)으로부터 생성된 피스아타놀(piceatannol)을 GC/MS로 분석한 결과를 나타내는 것으로서, (1) 로 나타내는 보존시간(retention time) 14.82분은 GC로 분리된 피스아타놀이며, (a) 로 나타내는 532.53, m/z 는 MW(TMS)의 m/z이며, (b)로 나타내는 517.45, m/z 는 MW(TMS)-15 의 m/z 이며, 위 결과는 선행 논문 (The cancer preventative agent resveratrol is converted to the anticancer agent piceatannol by the cytochrome P450 enzyme CYP1B1, British Journal of Cancer (2002) 86, 774-778)을 참조하여 피스아타놀임을 확인할 수 있다.

고분자위 모노페놀형 물질의 카테콜형 구조 물질로의 생변환 : 홍합단백질로의 모사

고분자 위의 티로신 잔기를 효과적으로 도파 잔기로 생변환하기 위해 SAV 티로시나아제를 이용하였다. (VPGYG)12(VPGVG)24 의 총 180개의 아미노산 서열을 가진 ELP (elastin like-polypeptide), 이하 ELP_Y, 를 0.5 w%로 300uL pH 9 50mM tris-HCl 완충액에 녹인 후 2mM FeCl₃ 과 아스코빅산, 500nM의 SAV 티로시나아제를 넣고 두 시간 반응을 보낸 뒤, 1M NaOH와 1M HCl을 이용하여 pH의 변화를 주었다. pH 5에서는 녹아 있던 ELP_Y가 pH 7에서는 가루 형식으로 침전되었다. pH를 11으로 조절하였을 시에는 ELP_Y가 젤화(gelation)되는 것을 확인하였다. 다시 pH를 낮출 시에는 형성된 하이드로젤(hydrogel)이 풀어져 가역성이 있는 반응임을 확인하였다. 이는 홍합단백질의 기능을 모사한 이전 논문과 일치하는 결과이다 (Proc Natl Acad Sci USA. 2011 15, 108(7), 2651-2655).

Claims (7)

1. 티로시나아제를 이용하여, 모노페놀형 구조 물질로부터 오르토 수산화 반응 물질을 제조하는 방법으로서,
   상기 오르토 수산화 반응 물질이 루테올린, 3-하이드록시프롤레틴, 3'-오르토하이드록시다이즈제인 또는 오로볼이고,
   하기 (a) 및 (b) 단계 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법:
   (a) 아스코빅산을 도입하여, 메트-티로시나아제 두 구리이온 사이의 수산화기를 제거함으로써 티로시나아제를 재활성화시키는 단계; 및
   (b) 생성된 카테콜형 구조 물질이 포함된 반응물을 유기용매에 용해하여, 유기용매에 녹는 기질과 물층에 남아 있는 오르토 수산화 반응 물질을 분리하고, 얻어진 물층의 pH 를 낮추어 생성물에 붙어 있는 붕소이온 또는 전이금속이온을 제거하고, 추가로 유기 용매에 용해하여 유기층을 얻고, 얻어진 유기층을 증발시켜 오르토 수산화 반응 물질을 얻는 단계.
2. 제 1 항에 있어서, 모노페놀형 구조 물질이 다이드제인, 제니스테인, 아피제닌 및 플로레틴으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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