CN109971743A - 来源于无色杆菌属ccm4824的青霉素g酰化酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及来源于无色杆菌属(Achromobacter sp.)CCM 4824的青霉素G酰化酶突变体及其应用，更具体地涉及一种在包含SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ ID NO.2所示的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白质序列中，包含选自A65αV、A102αE、A106αT、D74βQ、R120βC、T176βS、Y180βS、T193βI、Y248βF、F254βY、T292βS、F343βY、E366βV及T485βS组合的群中的至少一种突变为特征的突变青霉素G酰化酶及利用该突变青霉素G酰化酶的β‑内酰胺抗生素的制备(合成)方法。本发明中公开的具有特定突变形式的来源于无色杆菌属(Achromobacter sp.)CCM 4824的青霉素G酰化酶突变体，其特征为，对多种半合成β‑内酰胺抗生素具有高效率的多重合成性能。

Description

来源于无色杆菌属CCM4824的青霉素G酰化酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及来源于无色杆菌属(Achromobacter sp.)CCM 4824的青霉素G酰化酶突变体及其应用，更具体地涉及一种在包含SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ ID NO.2所示的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白质序列中，包含选自A65αV、A102αE、A106αT、D74βQ、R120βC、T176βS、Y180βS、T193βI、Y248βF、F254βY、T292βS、F343βY、E366βV及T485βS组合的群中的至少一种突变为特征的突变青霉素G酰化酶及利用该突变青霉素G酰化酶的β-内酰胺抗生素的制备(合成)方法。
背景技术
β-内酰胺类抗生素是临床应用中最重要的一类抗菌化合物。已知β-内酰胺的抗菌机制通过作用于催化细菌细胞壁材料即肽聚糖(peptidoglycan)合成的转肽酶(transpeptidase)和D-丙氨酸羧肽酶(D-alanine carboxypeptidase)，抑制肽聚糖(peptidoglycan)的合成，从而抑制微生物的生长。
然而，青霉素、头孢菌素等天然β-内酰胺类抗生素存在杀菌谱较窄，酸稳定性低和耐受性增加等问题，这促使半合成青霉素(SSP)、半合成头孢菌素(SSC)等半合成抗生素(SSA)被开发使用。
β-内酰胺抗生素已通过传统的化学方法投入工业化生产。通常，半合成β-内酰胺抗生素的化学合成在低温下使用活性中间体和有机溶剂的严格条件下进行，这导致下游工艺成本高以及工艺对环境有害。也就是说，它存在各种缺点，例如在化学工艺中使用有机溶剂或因合成温度非常低而需要大量的能量等。根据最近的环境法规，正在努力用酶促转化工艺代替传统化学工艺，以更可持续地生产(半)合成β-内酰胺抗生素。与常规化学方法相比，酶的使用具有几个优点：(1)避免使用有毒试剂或溶剂；(2)由于酶的特异性，不需要保护抗生素核的羧基；(3)在很大程度上可以避免包括外消旋化的副反应(side reaction)。
已发现青霉素G酰化酶(PenG酰化酶)可用于合成半合成β-内酰胺抗生素。在该过程中，PenG酰化酶促进活化的侧链和脱酰化形式的β-内酰胺中间体(例如6-APA、7-ADCA、7-ACA等)的缩合。酶催化的β-内酰胺抗生素合成可以在平衡控制或动力学控制的转化过程中进行。在平衡控制的转化条件下，可以达到的产物积累水平取决于反应的热力学平衡，当合成半合成抗生素时，特别是当反应在含水介质中进行时，这是不利的。在动力学控制的转化中，酶促进酰基从活化的侧链即酰基供体转移到β-内酰胺核即亲核受体。在制备半合成β-内酰胺抗生素时，活化的侧链可以是芳族羧酸的酰胺衍生物或甲酯。在这种情况下，产物积累水平取决于酶的催化性，并且可以瞬时实现酰基转移产物较高的非平衡浓度。
充当酰基转移酶的PenG酰化酶不仅把用作酰基供体的底物化合物(活化的侧链化合物)分解为游离化合物形式，而且还促进合成β-内酰胺抗生素的水解反应。该水解反应导致活化的侧链消失，这降低了酰基转移反应的效率。合成速率(S)与水解速率(H)之比是评价PenG酰化酶合成性能的重要参数。S/H比等于在酶促酰化反应过程中指定的条件下合成产物与水解产物的摩尔比。在此，合成产物被定义为由活化侧链和β-内酰胺核产生的β-内酰胺抗生素。其中水解产物被定义为与活化侧链对应的酸(游离侧链)。
通常，与酶促反应中作为底物的β-内酰胺核衍生物相比，酰基供体化合物的量越多，最终化合物的合成产率越高。然而，从工业和经济角度来看，上述基材在1:1的比例下进行合成反应时，对生产过程和生产效率有利。为此，优选地，应在所述合成反应过程中降低酶引起的分解反应，特别是降低对底物的分解反应，使得更多底物可用于合成反应。即，为了采用对工业和经济角度有利的工艺，优选S/H比较高，并且酶活性也要足够高。
发明内容
因此，本发明的发明人一直在研究有效地提高β-内酰胺类抗生素的合成效率的方法，并且发现本发明中公开的具有特定突变青霉素G酰化酶突变体与野生型(来源于无色杆菌属CCM 4824菌株)相比，酶活性显著增加，从而不仅使半合成β-内酰胺类抗生素的合成量显著增加，还改善了S/H比，使其显著提高，确认对多种半合成β-内酰胺类抗生素显示出高效率的多重合成性能，并完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种突变青霉素G酰化酶，其特征为，在包含SEQ IDNO.1所示的α亚基和SEQ ID NO.2所示的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白质序列中，包含选自A65αV、A102αE、A106αT、D74βQ、R120βC、T176βS、Y180βS、T193βI、Y248βF、F254βY、T292βS、F343βY、E366βV及T485βS组合的群中的至少一种突变。
本发明的另一个目的是提供对所述突变青霉素G酰化酶进行编码的多核苷酸。
本发明的另一个目的是提供包含所述多核苷酸的重组表达载体。
本发明的另一个目的是提供通过所述表达载体性质转化的宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供一种制备β-内酰胺抗生素的方法，其特征为，在包括活化的侧链和β-内酰胺核的酶促耦合的β-内酰胺抗生素制备方法中，使用所述突变青霉素G酰化酶。
本发明的另一个目的是提供包含所述突变青霉素G酰化酶的用于制备β-内酰胺抗生素的组合物。
为了达到所述目的，本发明提供一种突变青霉素G酰化酶，其特征为，在包含SEQID NO.1所示的α亚基和SEQ ID NO.2所示的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白质序列中，包含选自A65αV、A102αE、A106αT、D74βQ、R120βC、T176βS、Y180βS、T193βI、Y248βF、F254βY、T292βS、F343βY、E366βV及T485βS组合的群中的至少一种突变。
为了达到本发明的另一个目的，本发明提供对所述突变青霉素G酰化酶进行编码的多核苷酸。
为了达到本发明的另一个目的，本发明提供包含所述多核苷酸的重组表达载体。
为了达到本发明的另一个目的，本发明提供通过所述表达载体性质转化的宿主细胞。
为了达到本发明的另一个目的，本发明提供一种制备(半合成)β-内酰胺抗生素的方法，其特征为，包括活化的侧链和β-内酰胺核的酶促耦合的(半合成)β-内酰胺抗生素制备方法中，使用所述突变青霉素G酰化酶。
为了达到本发明的另一个目的，本发明提供包含所述突变青霉素G酰化酶的用于制备(半合成)β-内酰胺抗生素的组合物。
下面将对本发明进行详细说明。
在本说明书中，术语“蛋白质”可与“多肽(polypeptide)”或“肽(peptide)”互换使用，例如，指天然状态蛋白质中常见的氨基酸残基聚合物。
在本说明书中，“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。除非另有限制，否则还包括以类似于天然生成的核苷酸的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。
在本说明书中，术语“表达(expression)”是指在细胞中产生蛋白质或核酸。
在本说明书中使用的氨基酸密码子(三联体)指根据生物化学中的标准缩写规定的以下氨基酸：A(Ala)：丙氨酸；C(Cys)：半胱氨酸；D(Asp)：天冬氨酸；E(Glu)：谷氨酸；F(Phe)：苯丙氨酸；G(Gly)：甘氨酸；H(His)：组氨酸；I(IIe)：异亮氨酸；K(Lys)：赖氨酸；L(Leu)：亮氨酸；M(Met)：蛋氨酸；N(Asn)：天冬酰胺；O(Ply)吡咯酸；P(Pro)：脯氨酸；Q(Gln)：谷氨酸；R(Arg)：精氨酸；S(Ser)：丝氨酸；T(Thr)：苏氨酸；U(Sec)：硒代半胱氨酸，V(Val)：缬氨酸；W(Trp)：色氨酸；Y(Tyr)：酪氨酸。
本说明书中的“(氨基酸密码子)(氨基酸位置)(氨基酸密码子)”是指在天然(野生型)多肽的对应氨基酸位置上，前面标记的氨基酸被后面标记的氨基酸所置换。例如，A106αT表示对应于野生型多肽α亚基(本发明中，SEQ ID NO.1的野生型APA的α亚基)的106位的丙氨酸被苏氨酸置换，D74βQ是指用谷氨酰胺代替天然多肽β亚基(在本发明中，SEQ ID NO.2的野生型APA的β亚基)的第74位天冬氨酸。
半合成β-内酰胺化合物的的合成过程中，使用具有β-内酰胺核结构的化合物和将与此结合形成侧链的化合物(酰基供体)作为底物。在所述底物混合物中添加青霉素G酰化酶，发生活化的侧链和β-内酰胺核的酶促耦合(coupling)反应，青霉素G酰化酶促进酰基从活化的侧链(即酰基供体)转移到β-内酰胺核(即酰化)。在另一方面，所述酶具有水解活化的侧链(即酰基供体)及合成的β-内酰胺化合物的活性，这影响半合成β-内酰胺化合物的生产率。特别是，考虑到从工业和经济角度底物按照1：1的比例进行合成反应对生产工艺及生产效率有利，因此通过降低底物的分解反应，使更多的底物用于合成反应是重要的、有待解决的课题。
具体而言，通过酶促反应合成(S)头孢氨苄(cephalexin)的底物可以使用包括作为β-内酰胺核的7-ADCA(7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸，7-amino-deacetoxy-cephalosporanic acid)和作为酰基供体的PGM(苯甘氨酸甲酯，phenylglycine methylester)或PGA(苯甘氨酸酰胺，phenylglycine amide)。图2中显示了头孢氨苄合成反应和这些底物(前体)分解反应的具体过程的一个实例。如图2所示，底物PGM可以被酶水解而转化为PG(苯甘氨酸，phenylglycine)(H1)，合成的头孢氨苄也可以被酶水解形成PG(H2)。因此，为了提高头孢氨苄的生产率，增加合成反应(S)和降低分解反应(H1、H2)是重要的。
通过酶促反应合成(S)头孢丙烯(cefprozil)的底物可使用包括作为β-内酰胺核的7-APRA(7-氨基-3-丙烯基-头孢烷酸,7-amine-3-propenyl-cephalosopranic acid)和作为酰基供体的HPGM(对羟基苯甘氨酸甲酯，P-hydroxyphenylglycine methyl ester)或HPGHE(4-羟基-D-苯基甘氨酸羟乙基酯,4-hydroxy-D-phenylglycine hydroxyethylester)。图4显示了头孢丙烯合成反应和这些底物(前体)分解反应的具体过程的一个实例。如图4所示，底物HPGM可以被酶水解而转化为HPG(对羟苯甘氨酸,P-hydroxyphenylglycine)(H1)，合成的头孢丙烯也可以被酶水解形成HPG(H2)。因此，为了提高头孢丙烯的生产率，增加合成反应(S)和降低分解反应(H1、H2)是重要的。
通过酶促反应合成(S)头孢克洛(cefaclor)的底物可使用包括作为β-内酰胺核的7-ACCA(3-氯-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸，7-aminodeacetoxymethyl-3-chloro-cephalosporanic acid)和作为酰基供体的PGM(苯甘氨酸甲酯，phenylglycine methylester)。图6显示了头孢克洛合成反应和这些底物(前体)分解反应的具体过程的一个实例。如图6所示，底物PGM可以被酶水解而转化为PG(苯甘氨酸，phenylglycine)(H1)，合成的头孢克洛也可以被酶水解形成PG(H2)。因此，为了提高头孢克洛的生产率，增加合成反应(S)和降低分解反应(H1、H2)是重要的。
通过酶促反应合成(S)头孢拉定(Cephradine)的底物可使用包括作为β-内酰胺核的7-ADCA(7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸，7-amino-deacetoxy-cephalosporanic acid)和作为酰基供体的DHME(D-二氢苯基甘氨酸甲酯，D-dihydrophenylglycine methyl ester)。图8显示了头孢拉定合成反应和这些底物(前体)分解反应的具体过程的一个实例。如图8所示，底物DHME可以被酶水解而转化为DHPG(D-二氢苯基甘氨酸,D-dihydrophenylglycine)(H)。因此，为了提高头孢拉定的生产率，增加合成反应(S)和降低分解反应(H)是重要的。
通过酶促反应合成(S)头孢羟氨苄(cefadroxil)的底物可以使用包括作为β-内酰胺核的7-ADCA(7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸，7-amino-deacetoxy-cephalosporanic acid)和作为酰基供体的HPGM(对羟基苯甘氨酸甲酯，P-hydroxyphenylglycine methyl ester)或HPGA(D-对羟基苯基甘氨酸酰胺,D-p-hydroxyphenylglycine amide)。图10中显示了头孢羟氨苄合成反应和这些底物(前体)分解反应的具体过程的一个实例。如图10所示，底物HPGM可以被酶水解而转化为HPG(对羟苯甘氨酸,P-hydroxyphenylglycine)(H1)，合成的头孢羟氨苄也可以被酶水解形成HPG(H2)。因此，为了提高头孢羟氨苄的生产率，增加合成反应(S)和降低分解反应(H1、H2)是重要的。
通过酶促反应合成(S)阿莫西林(Amoxicillin)的底物可以使用包括作为β-内酰胺核的6-APA(6-氨基青霉烷酸，6-aminopenicilanic acid)和作为酰基供体的HPGM(对羟基苯甘氨酸甲酯，hydroxyphenylglycine methyl ester)或HPGA(D-对羟基苯基甘氨酸酰胺,D-p-hydroxyphenylglycine amide)。图12中显示了阿莫西林合成反应和这些底物(前体)分解反应的具体过程的一个实例。如图12所示，底物HPGM可以被酶水解而转化为HPG(对羟苯甘氨酸,P-hydroxyphenylglycine)(H1)，合成的阿莫西林也可以被酶水解形成HPG(H2)。因此，为了提高阿莫西林的生产率，增加合成反应(S)和降低分解反应(H1、H2)是重要的。
另外，作为追加的具体实例，酶促合成氨苄青霉素(Ampicillin)的底物可以使用作为β-内酰胺核的6-APA(6-氨基青霉烷酸，6-aminopenicilanic acid)和作为酰基供体的PGM(苯甘氨酸甲酯，phenylglycine methyl ester)或PGA(苯甘氨酸酰胺，phenylglycineamide)。酶促合成头孢孟多(Cefamandole)的底物可以使用作为β-内酰胺核的7-TACA(7-氨基-3-(1-甲基-1,2,3,4-四唑-5-基)硫代甲基头孢烷酸，7-amino-3-(1-methyl-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)thiomethyl cephalosporanic acid)和作为酰基供体的和MAME(扁桃酸甲酯，mandelic acid methyl ester)。酶促合成头孢唑啉(Cefazolin)的底物可以使用作为β-内酰胺核的7-ZACA(7-氨基-3-(5-甲基-1,2,3,4-噻唑-2-基)硫代甲基头孢烷酸，7-amino-3-(5-methyl-1,2,3,4-thiazol-2-yl)thiomethyl cephalosporanic acid)和作为酰基供体的TzAA-OMe(四唑乙酸甲酯，tetrazolylacetic acid methyl ester)。酶促合成头孢尼西(Cefonicid)的底物可以使用作为β-内酰胺核的7-SACA(7-氨基-3-(1-磺基甲基-1,2,3,4-四唑-5-基)硫代甲基头孢烷酸，7-amino-3-(1-sulphomethyl-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)thiomethyl cephalosporanic acid)和作为酰基供体的MAME(扁桃酸甲酯，mandelic acid methyl ester)。酶促合成头孢噻吩(cephalothin)的底物可以使用作为β-内酰胺核的7-ACA(7-氨基头孢烷酸，7-aminocephalosporanic acid)和作为酰基供体的2-TAA(2-噻吩乙酰胺，2-thienylacetamide)。酶促合成头孢甘酸(cephaloglycin)的底物可以使用作为β-内酰胺核的7-ACA(7-氨基头孢烷酸，7-aminocephalosporanic acid)和作为酰基供体的PGM(苯甘氨酸甲酯，phenylglycine methyl ester)。酶促合成匹氨青霉素(Pivampicillin)的底物可以使用作为β-内酰胺核的POM-6-APA(6-氨基青霉烷酸叔戊酰氧甲酯，pivaloyloxymethyl 6-aminopenicillanic acid)和作为酰基供体的PGM(苯甘氨酸甲酯，phenylglycine methyl ester)。相同地，各个反应中使用的底物可以被酶水解，因此，为了提高这些抗生素的生产率，增加合成反应和降低分解反应是很有必要的。
因此，本发明提供一种可以使多种(半合成)β-内酰胺抗生素的生产率提高的来源于无色杆菌属(Achromobacter sp.)CCM 4824的青霉素G酰化酶突变体。
在本说明书中，来源于无色杆菌属(Achromobacter sp.)CCM 4824的青霉素G酰化酶蛋白质被命名为“APA”，编码它的多核苷酸或基因序列被标记为“apa”。
来源于无色杆菌属(Achromobacter sp.)CCM 4824的青霉素G酰化酶(APA)野生型包含SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ ID NO.2所示的β亚基。具体而言，野生型APA具有前体(precursor)形式，通过SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ ID NO.2所示的β亚基由间隔肽(spacer peptide，例如SEQ ID NO.3)连接和构成的单链多肽(例如SEQ ID NO.4)来表达，随后在细胞中进行自催化处理(autocatalytic processing)以去除间隔肽从而形成由所述α亚基和β亚基构成的成熟(mature)的活性二聚体形式。例如，由SEQ ID NO.4表示的前体形式的野生型APA可以被已知为NCBI genbank AY919310.1的核苷酸序列的多核苷酸编码，但不限于此。
来源于无色杆菌属(Achromobacter sp.)CCM 4824菌株的青霉素G酰化酶青霉素G酰化酶(APA野生型)具有优于先前已知的源自其他生物的同种酶的优点。例如，与来源于木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)的酶相比，它具有优异的热稳定性，并且与来源于大肠杆菌(E.coli)的酶相比，在低底物浓度下对于合成β-内酰胺抗生素(特别是氨苄青霉素和阿莫西林)具有更好的催化活性(Stanislav Becka et al.,Penicillin Gacylase from Achromobacter sp.CCM 4824,Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-013-4945-3)。但来源于无色杆菌属(Achromobacter sp.)CCM 4824菌株的青霉素G酰化酶(APA)野生型蛋白质如本说明书的实施例所记载，与合成活性相比，同样具有相当高的底物及产物分解活性。另外，以往曾试图利用来源于各种微生物的青霉素G酰化酶制备其突变体用于工业生产，但这些突变体仅对特定的一种或少数几种抗生素产生反应，或仅报告转换率而未考虑分解反应及S/H，或开发仅集中于合成反应，由于开发仅集中于各个特定的反应，具有一定限制。例如CN105483105A专利揭示的部分氨基酸突变体，对阿莫西林、氨苄青霉素、头孢氨苄等少数抗生素的底物转化率被揭示为90～120分钟后99％，但实际上所述突变体与野生型相比，其合成能力仅改善到约2倍的水平，并且该合成能力的S/H值仅为约3.9倍(基于阿莫西林)。这种改良程度，当应用于实际工业单位时，在工艺效率方面受到限制。即，对于改良的酶，为了确定其相对优势，不仅要先评价合成活性的增加，还应评价分解活性的减少及S/H值的增加情况。
与此相反，作为本发明的突变体中具有代表性的一个示例，CEP1-s53突变体，基于头孢氨苄、头孢丙烯、头孢克洛、头孢拉定、头孢羟氨苄和阿莫西林，其合成活性与野生型相比分别显著增加到21.2倍、38.1倍、52.1倍、12.8倍、14.3倍和146.6倍，在所述合成活性的基础上，其S/H比与野生型相比分别显示为2.0倍、1.4倍、3.5倍、10.9倍、8.2倍、12.3倍。不仅如此，作为另外一个示例，CEP2-s4突变体(基于CEP1-s53突变体开发)，基于头孢氨苄、头孢丙烯、头孢克洛、头孢拉定、头孢羟氨苄和阿莫西林，其合成活性分别显著增加到61.8倍、87.1倍、100.5倍、69.5倍、30.9倍、270.0倍，在所述合成活性的基础上，其S/H比与野生型相比分别增加到5.8倍、6.9倍、12.3倍、15.5倍、19.0倍、24.0倍。尤其，通过无数步骤生成的多种突变体中，被最终选***的CEP3-s28突变体(基于CEP2-s4突变体开发)，基于头孢氨苄、头孢丙烯、头孢克洛、头孢拉定、头孢羟氨苄和阿莫西林，其生产性与野生型相比分别显著增加到165.4倍、121.6倍、154.4倍、153.6倍、36.8倍、853.3倍，在所述合成活性的基础上，其S/H比分别增加到20.2倍、21.3倍、33.4倍、27.3倍、35倍、68倍。因此，根据本发明的突变APA，可以通过重组青霉素G酰化酶高效率地生产β-内酰胺抗生素。这是对生产工艺的重大改进，与现有技术相比，这代表了相当大的技术进步。
如上所述，本发明中揭示的具有特定突变(尤其置换)形态的来源于无色杆菌属(Achromobacter sp.)CCM 4824的青霉素G酰化酶突变体的特征在于对多种半合成β-内酰胺抗生素具有高效率的多重合成性能。本发明中的术语“高效率”不仅意味着合成产物的产量和速率的增加，而且还意味着高S/H比。即，与野生型酶相比，本发明的突变APA的特征在于，对多种半合成β-内酰胺抗生素的合成活性(生产量)非常高(尤其对头孢菌素和青霉素抗生素)，并且抗生素合成活性与对用于合成这些抗生素的底物的分解活性之比(S/H比)也非常高，从而使半合成β-内酰胺抗生素的生产率显著增加。本发明的突变APA的特征为，可以用于多种半合成β-内酰胺类抗生素的制备，其中尤其对头孢氨苄、头孢丙烯、头孢克洛、头孢拉定、头孢羟氨苄和阿莫西林的生产率较高，具有特异性。
另外，本发明的突变体酶的特征在于，在相同条件下，底物向抗生素的转化率达到80％至90％(或更高)水平(优选为99％至100％)的速率，不仅明显比野生型而且比现有已知的突变体更快(参见实施例和示意图)。
在转化反应期间观察到的S/H比取决于反应物、反应条件和转化反应的进程。Youshko等人已经表明，S/H比的初始值取决于酶的动力学性质和亲核受体(例如6-APA)的浓度两种因素(参见文献[Youshko,M.I.and Svedas,V.K.,Biochemistry(Moscow),65,1367-1375(2000)and Youshko,M.I.et al.Biochimica et Biophysica Acta-蛋白质sand Proteomics,1599,134-140(2002)])。在固定的条件和亲核体浓度下，可以使用最初的S/H比来比较多种PenG酰化酶和/或多种PenG酰化酶突变体的性能。此外，多种PenG酰化酶的性能可以通过在转化反应过程中以时间的函数测量合成和水解来进行比较，由此可以在转化反应的各个不同阶段计算S/H比。酰化反应中的PenG酰化酶的合成活性(＝合成产物产生速率＝合成速率＝生成速率)是指在规定条件下每单位时间在酰化反应中产生的β-内酰胺抗生素的量。优选地，测量初始活性。可以通过绘制酰化反应后合成的产物的量与反应时间的曲线即所谓的进展曲线来测量初始酶活性。通常，转化反应开始时的产物生成速率是相对稳定的，并且活性可以直接从进展曲线的斜率推导。如果合成活性在转化反应早期开始降低，则应通过外推进度曲线和计算t＝0时的斜率来获得初始速率。为了比较多种PenG酰化酶的活性，应将合成活性标准化为相同量的蛋白质。以与初始合成速率相同的方式，可以根据水解的活化侧链的量对反应时间的曲线来测量初始的水解速率。
因此，本发明首次公开的APA突变形式如下。本发明的突变青霉素G酰化酶(以下在本说明书中混用“突变APA”来标记)的特征在于，在包含所述SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ ID NO.2所示的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白质序列中，包含选自A65a、A102a、A106a、D74β、R120β、T176β、Y180β、T193β、Y248β、F254β、T292β、F343β、E366β和T485β组合的群中的至少一个氨基酸残基被另一个氨基酸置换的变异。
具体而言，所述变异的特征为，在包含所述SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ IDNO.2所示的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白质序列中，包含选自A65αV、A102αE、A106αT、D74βQ、R120βC、T176βS、Y180βS、T193βI、Y248βF、F254βY、T292βS、F343βY、E366βV及T485βS组合的群中的至少一种突变。
例如，在包含所述SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ ID NO.2所示的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白质序列中，可以具有一个突变位点(site)，如包含A106αT置换的多肽、包含D74βQ置换的多肽、包含T176βS置换的多肽、包含T193βI置换的多肽、包含T292βS置换的多肽、包含E366βV置换的多肽、包含T485βS置换的多肽等，或者
例如，在包含所述SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ ID NO.2所示的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白质序列中，可以具有多重突变位点如包含任意选自A65αV,A102αE,A106αT,D74βQ,R120βC,T176βS,Y180βS,T193βI,Y248βF,F254βY,T292βS,F343βY,E366βV及T485βS组合的群中的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或14个突变位点的多肽，但不限于此。
优选地，本发明的突变青霉素G酰化酶(突变APA),可以在所述野生型青霉素G酰化酶蛋白质序列中，包含D74βQ、T176βS、T193βI、E366βV及T485βS的5个突变位点(参见CEP1-s53)。更优选地，本发明地突变青霉素G酰化酶可以包含SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ IDNO.5所示的β亚基。作为其优选的提供形式，可以是ⅰ)SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ IDNO.5所示的β亚基由间隔肽(例如SEQ ID NO.3)连接和构成的单链多肽(例如SEQ ID NO.6)形式的前体(precursor)型蛋白质，或ⅱ)SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ ID NO.5所示的β亚基构成的成熟(mature)型蛋白质，但不限于此。
本发明还可以在所述突变APA中包括追加的氨基酸残基的修饰。术语“修饰”是指氨基酸残基的缺失、置换或添加。所述氨基酸残基的进一步的修饰是为了实现本发明的目的即使突变APA的对半合成β-内酰胺抗生素的合成活性增加及对用于所述抗生素合成的底物的分解活性减少，在可以达成所述目的的前提下，对氨基酸残基的修饰形态(种类)及位点无特别限制。
优选地，与所述野生型相比，可在包含D74βQ、T176βS、T193βI、E366βV及T485βS的5个突变位点的突变APA序列中，追加包含选自A102αE、A168αV、Y180βS、F254βY及S428βA组合的群中的至少一种突变。更优选地，可在包含所述SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ ID NO.5所示的β亚基的突变APA序列中，追加包含选自A102αE、A168αV、Y180βS、F254βY及S428βA组合的群中的至少一种突变。
例如，可以在包含所述SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ ID NO.5所示的β亚基的突变APA序列中，追加包含1个突变位点，如包含A102αE置换的多肽、包含A168αV置换的多肽、包含Y180βS置换的多肽、包含F254βY置换的多肽及包含S428βA置换的多肽，或
例如，可以在包含所述SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ ID NO.5所示的β亚基的突变APA序列中，追加包含多重突变位点，如包含选自A102αE、A168αV、Y180βS、F254βY及S428βA组合的群中的任意2个突变、3个突变、4个突变或5个突变，但不限于此。
最优选地，本发明的突变APA,在包含所述SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ IDNO.5所示的β亚基的突变APA中，可以追加包含A102αE、Y180βS、F254βY的3个突变(置换)位点(与野生型相比，包含共8个置换位点，参见CEP2-s4)。更优选地，本发明的突变APA可以包含所述SEQ ID NO.7所示的α亚基和SEQ ID NO.8所示的β亚基。作为其优选的提供形式，可以是ⅰ)SEQ ID NO.7所示的α亚基和SEQ ID NO.8所示的β亚基由间隔肽(例如SEQ ID NO.3)连接和构成的单链多肽(例如SEQ ID NO.9)形式的前体(precursor)型蛋白质，或ⅱ)SEQID NO.7所示的α亚基和SEQ ID NO.8所示的β亚基构成的成熟(mature)型蛋白质，但不限于此。
同时，本发明中，对所述突变APA，提供包括进一步的追加突变的多肽。优选地，与野生型相比，可在包含A102αE、D74βQ、T176βS、Y180βS、T193βI、F254βY、E366βV及T485βS的8个突变位点的突变APA序列中，追加包含选自Q10αK、A65αV、I5βV、R120βC、R185βC、Y248βF及F343βY组合的群中的至少一种突变。更优选地，可在包含所述SEQ ID NO.7所示的α亚基和SEQ ID NO.8所示的β亚基的突变APA序列中，追加包含选自Q10αK、A65αV、I5βV、R120βC、R185βC、Y248βF及F343βY组合的群中的至少一种突变。
例如，可以在包含所述SEQ ID NO.7所示的α亚基和SEQ ID NO.8所示的β亚基的突变APA序列中，追加包含1个突变位点，如包含Q10αK置换的多肽、包含A65αV置换的多肽、包含I5βV置换的多肽、包含R120βC置换的多肽、包含R185βC置换的多肽、包含Y248βF置换的多肽、及包含F343βY置换的多肽，或
例如，可以在包含所述SEQ ID NO.7所示的α亚基和SEQ ID NO.8所示的β亚基的突变APA序列中，追加包含多重突变位点，如包含选自Q10αK、A65αV、I5βV、R120βC、R185βC、Y248βF及F343βY组合的群中的任意2个突变、3个突变、4个突变、5个突变、6个突变或7个突变，但不限于此。
最优选地，本发明的突变APA,在包含所述SEQ ID NO.7所示的α亚基和SEQ IDNO.8所示的β亚基的突变APA中，可以追加包含A65αV、R120βC、Y248βF及F343βY的4个突变(置换)位点(与野生型相比，包含共12个置换位点，参见CEP3-s28)。更优选地，本发明的突变APA可以包含所述SEQ ID NO.10所示的α亚基和SEQ ID NO.11所示的β亚基。作为其优选的提供形式，可以是ⅰ)SEQ ID NO.10所示的α亚基和SEQ ID NO.11所示的β亚基由间隔肽(例如SEQ ID NO.3)连接和构成的单链多肽(例如SEQ ID NO.12)形式的前体(precursor)型蛋白质，或ⅱ)SEQ ID NO.10所示的α亚基和SEQ ID NO.11所示的β亚基构成的成熟(mature)型蛋白质，但不限于此。
另外，本发明提供对所述突变青霉素G酰化酶(突变APA)进行编码的多核苷酸。
对于构成多核苷酸的碱基组合没有特别限制，只要它可以编码本发明的突变APA多肽即可。当已知氨基酸序列时，根据本领域已知的密码子信息，制备编码所述氨基酸序列的多核苷酸的技术是已知的。所述多核苷酸包括DNA，cDNA和RNA序列，可以作为单链或双链形式的核酸分子来提供。
本发明的另一个目的是提供包含所述多核苷酸的重组表达载体。
本发明中的术语“重组表达载体”是指能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白或靶核酸(RNA)的载体，为表达***的多核苷酸(基因)而可操作地连接的包含必要控制要素的基因构建物。
本发明中的术语“可操作地连接”(operably linked)是指为了执行一般功能，核酸表达控制序列与编码靶蛋白质或RNA的核酸序列的功能性连接。即，指编码蛋白质或RNA的核酸序列(如编码本发明的突变APA的多核苷酸序列)由表达控制序列，按照基因可表达的方式连接，例如启动子和编码蛋白质或RNA的核酸序列必须可操作地连接，才能影响进行编码的核酸序列的表达。与重组载体的可操作性连接，可通过本技术领域已知的基因重组技术来制备，位点特异性DNA切割和连接可使用本领域通常已知的酶等进行。
本发明的重组表达载体，其特征为，包含编码所述突变APA的多核苷酸。根据本发明克隆到载体中的所述多核苷酸序列可以可操作地连接到合适的表达控制序列，其中可操作地连接的多核苷酸(基因)序列和表达控制序列可以包含在同时含有用于选择包括载体的宿主细胞的选择标记和/或复制起点(replication origin)的一个表达载体内。此外，所述表达载体可以根据表达控制序列或需要，包含用于膜定向或分泌的信号序列或前导序列，并且可以根据目的不同地制备。所述表达控制序列(expression control sequence)是指在特定宿主细胞中控制可操作地连接的多核苷酸序列的表达的DNA序列。这种调节序列包括但不限于用于进行转录的启动子、用于调节转录的任何操纵序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、调节转录和翻译终止的序列、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号和增强子等。所述载体的启动子可以是组成型或诱导型的。
信号序列当宿主是大肠杆菌属时可以使用PhoA信号序列、OmpA信号序列等，当宿主是芽孢杆菌属时可以使用α-淀粉酶信号序列和枯草杆菌蛋白酶信号序列等，当宿主是酵母时可以使用MFα信号序列、SUC2信号序列等。当宿主是动物细胞时可以使用胰岛素信号序列、α-干扰素信号序列、抗体分子信号序列等，但不限于此。
本发明的表达载体只要是通常用于克隆领域的载体即可，没有特别限制，例如可以包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、病毒载体等，但不限于此。具体而言，所述质粒可以是来源于大肠杆菌的质粒(pBR322、pBR325、pUC118和pUC119、pET-22b(+))、来源于枯草芽孢杆菌的质粒(pUB110和pTP5)和来源于酵母的质粒(YEp13、YEp24和YCp50)等，病毒可以是逆转录病毒、腺病毒或牛痘病毒等的动物病毒，或者杆状病毒等的昆虫病毒，但不限于此。在本发明的一个实施例中，使用了pBC-KS(+)。
本发明提供通过所述表达载体性质转化的宿主细胞或微生物。
所述性质转化包括将核酸(编码本发明的突变APA的多核苷酸)引入有机体、细胞、组织或器官中的任何方法，并可以根据本领域已知的知识，根据宿主细胞选择合适的标准技术来进行。这些方法包括电穿孔(electroporation)、原生质体融合、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀，碳化硅晶须(Silicon carbide whiskers)、超声处理(sonication)、农杆菌介导的转化、用PEG(聚乙二醇，polyethylenglycol)沉淀、硫酸葡聚糖转染、脂质体转染、热休克法(heat shock)、粒子枪轰击法(particle gun bombardment)等，但不限于此。
所述宿主细胞(host cell)指通过任何方式(例如电泳、钙磷酸酶沉淀法、显微注射法、性质转化法、病毒感染等)导入到细胞中的包含异源DNA的原核或真核细胞。
在本发明中，克隆领域中常用的任何种类的单细胞有机体，如来源于各种细菌(例如梭菌(Clostridia)属，大肠杆菌等)的原核细胞微生物，来源于酵母等低等真核细胞微生物和来源于包含昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物等高等真核生物的细胞可以用作宿主细胞，但不限于此。由于蛋白质的表达量和修饰等根据宿主细胞而不同，因此可以选择和使用最适合于本领域技术人员的目的的宿主细胞。
在本发明中，所述宿主细胞可选自梭菌属(Clostridia spp.，例如，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、糖多丁醇乙酸梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)或糖丁酸梭菌(Clostridiumsaccharobutylicum)等)、大肠杆菌属(Escherichia spp.)、醋酸菌属(Acetobacter spp.，例如，醋酸杆菌混浊(Acetobacter turbidans)、巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)等)、气单胞菌属(Aeromonas spp.)、产碱杆菌属(Alcaligenes spp.)、丝枝霉属(Aphanocladium spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、头孢菌属(Cephalosporium spp.)、黄杆菌属(Flavobacterium spp.)、克吕沃尔菌属(Kluyvera spp.)、枝动菌属(Mycoplanaspp.)、精蛋白杆菌属(Protaminobacter spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、无色杆菌属(Achromobacter spp.)和黄单胞菌属(Xanthomonas spp.,如柑桔黄单胞菌(Xanthomonas citri)等)组合的群中的任意一个属(genus)的微生物，但并不限于此。
所述大肠杆菌属微生物，可优选为大肠杆菌(Escherichia coli)，在本发明的一个实施例中，提供大肠杆菌MC1061/pBC-CEP3-s28(Escherichia coli MC1061/pBC-CEP3-s28,寄存号KCTC 13390BP)的菌株作为用作表达所述突变APA而被性质转化的微生物。所述大肠杆菌MC1061/pBC-CEP3-s28表达包含SEQ ID NO.10所示的α亚基和SEQ ID NO.11所示的β亚基的多肽或所述亚基构成的多肽。即，所述大肠杆菌MC1061/pBC-CEP3-s28，是通过包含编码SEQ ID NO.10及SEQ ID NO.11的氨基酸序列的多核苷酸的重组表达载体性质转化的。
另外，本发明提供包含前述的本发明的突变青霉素G酰化酶的制备β-内酰胺抗生素的组合物。
如前所述，本发明的突变APA，对于合成β-内酰胺抗生素具有显著的优点。因此，本发明提供所述突变APA的用途，用于合成β-内酰胺抗生素。
本发明中对所述β-内酰胺抗生素的种类没有特别的限制，但优选通过本技术领域已知能够合成的青霉素G酰化酶，包括半合成青霉素和半合成头孢菌素等。它们的具体种类在本领域中是众所周知的，如所述半合成青霉素群包括阿莫西林(amoxicillin)、氨苄青霉素(ampicillin)或匹氨青霉素(Pivampicillin)。此外，所述半合成头孢菌素群包括头孢氨苄(cephalexin)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢克洛(cefaclor)、头孢拉定(cephradine)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢孟多(cefamandole)、头孢唑林(cefazolin)、头孢尼西克(cefonicid)、头孢噻吩(cephalothin)或头孢甘酸(cephaloglycin)等。
本发明的突变APA的特征为，对头孢氨苄、头孢丙烯、头孢克洛、头孢拉定、头孢羟氨苄和阿莫西林的生产率较高，具有特异性。
本发明中的突变APA可参照前述的序列信息，根据所属技术领域已知的蛋白质制备方法来构建，举例来说可以通过遗传工程方法构建，但不限于此。例如，根据常规的方法制备编码所述突变APA多肽的核酸。所述核酸通过使用适当的引物进行PCR放大来制备。另外一个方法可以是，根据所属技术领域已知的方法，如通过使用自动DNA合成仪(Biosearch或Applied Biosystems公司制作销售)合成DNA序列。构建的核酸可操作地连接(operatively linked)并***到含有控制核酸表达的一个或多个表达控制序列(expression control sequence，例如启动子，增强子等)的载体中，由此形成的重组表达载体对宿主细胞进行转化。将得到的转化体在适于表达所述核酸的培养基和条件下培养，以从培养物中回收由所述核酸表达的实质上纯的多肽。回收可以使用本领域已知的方法(例如色谱法)进行。用上述方法制备的本发明的突变APA，可以原样使用或纯化后用于制备所需产物。突变的APA酶可以通过已知的利用APA性质使用各种色谱法来分离蛋白质的方法或根据实验的目的对其进行轻微修饰的方法来分离和纯化。另外，使用特异性结合力特性如组氨酸肽与镍柱组分的结合力、纤维素结合结构域(cellulose binding domain，CBD)之间的结合力、纤维素结合力等亲和层析法(affinity chromatography)纯化突变APA，也是可能的。
在本说明书中，所述术语“实质上纯的多肽(substally pure polypeptide)”是指根据本发明的多肽实质上不含来源于宿主细胞的任何其他蛋白质。用于合成本发明多肽的遗传工程方法可以在以下参考文献中找到。Maniatis et al.,Molecular Cloning；Alaboratory Manual,Cold Spring Harbor laboratory,1982；Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,Second(1998)and Third(2000)Editions；Gene Expression Technology,Method inEnzymology,Genetics and Molecular Biology,Method in Enzymology,Guthrie&Fink(eds.),Academic Press,San Diego,Calif,1991；及Hitzeman et al.,J.Biol.Chem.,255:12073-12080,1990.
另外，本发明的突变APA可根据本行业已知的化学合成方法(Creighton,蛋白质s；Structures and Molecular Principles,W.H.Freeman and Co.,NY,1983)容易地制备。代表性的方法包括但不限于液相或固相合成、片段缩合、F-MOC或T-BOC化学法(ChemicalApproaches to the Synthesis of Peptides and蛋白质s,Williams et al.,Eds.,CRCPress,Boca Raton Florida,1997；A Practical Approach,Athert on&Sheppard,Eds.,IRL Press,Oxford,England,1989)。
本发明的突变APA可以以自由(free)状态以及固定状态使用。可通过本领域已知的常规蛋白质固定方法将APA固定化。载体可使用天然聚合物如纤维素、淀粉、葡聚糖和琼脂糖(agarose)等；合成聚合物如聚丙烯酰胺(polyacrylamide)、聚丙烯酸酯(polyacrylate)、聚甲基丙烯酸酯(polymethacylate)和Eupergit C等；或矿物如硅石(silica)、膨润土(bentonite)和金属等。另外，可以通过共价键合、离子键合、疏水键合、物理吸附、微胶囊化(microencapsulation)等将突变的APA结合到这些载体上。这些载体-酶结合物也可以通过戊二醛(glutaraldehyde)、溴化氰(cyanogen bromide)等的作用形成共价键结合，从而固定突变APA。另外，作为更优选的方法，不需要另外纯化突变APA，也可以直接固定含有突变APA的微生物细胞。为了提高微生物中所含的突变APA在全细胞固定化(whole cell immobilization)时的反应性，可以在细胞中形成孔或使用表面表达等技术。
本发明中的用于制备所述β-内酰胺抗生素的组合物中，所述术语“含有突变APA”，不仅包括直接方法即最初在组合物中已包含突变APA多肽本身，还包括间接方法即在组合物中包含选自包含对所述突变APA进行密码化(编码)的多核苷酸、含有所述多核苷酸的表达载体及用所述表达载体转化的宿主细胞(微生物)组合的群中的一个以上，以最终诱导突变APA。
具体来说，本发明提供一种制备(合成)β-内酰胺抗生素的方法，其特征为，在包括活化的侧链和β-内酰胺核的酶促耦合的β-内酰胺抗生素制备方法中，使用所述突变青霉素G酰化酶。
所述“β-内酰胺核(β-lactam nucleus)”是指在β-内酰胺抗菌素结构中含有β-内酰胺环的核心结构(core structure)，是指脱酰基(deacylation)形式，在本说明书中,被描述为亲核体或亲核受体，包括但不限于具有青霉烷(penam)、青霉烯(penem)、碳青霉烯(carbapenem)、头孢烯(cephem)、氧(碳)头孢烯(oxacephem)或克拉维烷(clavam)等结构的化合物(即具有所述核心结构的衍生物或取代基)群中的任意一个。优选地，本发明的β-内酰胺核可以是属于具有青霉烷(penam)或头孢烯(cephem)结构的化合物群中的任意一个，更优选可以是属于6-氨基青霉烷衍生物或7-氨基头孢烯衍生物(包括在3-碳素位置上有置换基或无置换基的形态)群中的任意一个。具体而言，6-氨基青霉烷酸(6-APA)是6-氨基青霉烷衍生物的实例，但不限于此。另外，7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)、7-氨基-3-丙烯基-头孢烷酸(7-APRA)，7-氨基头孢烷酸(7-ACA)或3-氯-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ACCA)是7-氨基头孢烯衍生物衍生物的实例，但不限于此。
本说明书中，“侧链(side chain)”是指与β-内酰胺核结合的酰基供体(Acyldonor)残基，用于合成所需的β-内酰胺化合物。优选地，表示在6-氨基位置或7-氨基位置键合的酰基供体(Acyl donor)残基。取决于半合成β-内酰胺化合物的具体类型的侧链化合物在本领域中是已知的，并且可以参考上文。作为例子，在氨苄青霉素、头孢氨苄和头孢克洛的情况下，侧链是苯基甘氨酸；头孢拉定的情况下，侧链是二氢苯甘氨酸；在头孢丙烯、头孢羟氨苄和阿莫西林的情况下，侧链是羟苯甘氨酸。
在抗生素合成反应中，侧链化合物通常以“活化”的形式提供，所述“活化”是指在实际的抗生素合成反应中以可以发生酰基转移反应的形式或容易发生的形式(衍生物形式)来提供。用于酶促耦合反应的“活化侧链”化合物(衍生物)是本领域已知的，包括但不限于芳族羧酸的酰胺或酯(包括但不限于甲酯或乙酯)。具体来说，可使用苯甘氨酸酰胺(PGA)、苯甘氨酸甲酯(PGM)、对羟基苯甘氨酸甲酯(HPGM)、D-对羟基苯基甘氨酸酰胺(HPGA)，扁桃酸甲酯(mandelic acid methyl ester，MAME)、四唑乙酸甲酯(tetrazolylacetic acid methyl ester，TzAA-OMe)、2-噻吩乙酰胺(2-TAA)、4-羟基-D-苯基甘氨酸羟乙基酯(HPGHE)、D-二氢苯基甘氨酸甲酯(DHME)或苯乙酰胺(PAA)，但本发明不限于此。
所述“耦合”意味着它们通过酰基转移(acyl transfer)反应从侧链残基(酰基供体)结合到β-内酰胺核上。酶促耦合意味着所述结合(酰基转移反应)由本发明的突变APA酶催化。
在制备(合成)β-内酰胺抗生素期间提供的本发明的突变APA酶可以以含有所述突变APA多肽的组合物或产生所述突变APA的菌株培养物的形式提供，所述APA可以以自由(free)状态或固定状态提供。
在不损失本发明的突变APA酶的活性的前提下，上述合成过程中各个底物的反应条件不受特别限制，但优选为可在水溶液(水或缓冲溶液)中进行的条件，优选的反应混合液可以在pH5～pH9的范围内选择，优选的反应时间在0.1～24小时的范围内，优选的反应温度在4～40℃的范围内选择。所述条件可以由本领域技术人员根据一次反应中使用的反应底物和酶的量以及期望的处理速度和效率来适当调整。
在制备(合成)各β-内酰胺抗生素过程中，作为底物提供的β-内酰胺核和酰基供体(侧链，优选活化的侧链)被添加到反应混合物的浓度和比例没有特别限制，例如β-内酰胺核与酰基供体(侧链)的比例可以从1:1到2，当考虑到本发明在生产性和经济性方面的优点时，优选以1:1的比例使用。
所述反应混合物中，本发明的突变APA的添加量没有特别限定，例如可以为0.1～100U/ml的范围，优选在反应混合物中以α-内酰胺核和酰基供体化合物的总量为准，包含10至50％(w/w)比例的突变APA。
在每个反应过程中最终产生的β-内酰胺抗生素可以通过本领域已知的常规化合物纯化方法(例如色谱法等)从反应溶液中分离和纯化。
发明的效果：
本发明中公开的具有特定突变形式的来源于无色杆菌属(Achromobacter sp.)CCM4824的青霉素G酰化酶突变体，其特征为，对多种半合成β-内酰胺抗生素具有高效率的多重合成性能。本发明的突变APA的特征在于，与其野生型酶相比，对多种半合成β-内酰胺抗生素的合成活性(生产量)非常高(尤其对头孢菌素和青霉素抗生素)，并且抗生素合成活性与对用于合成这些抗生素的底物的分解活性之比(S/H比)也非常高，从而使半合成β-内酰胺抗生素的生产率显著增加。
附图说明
图1表示本发明中的代表性突变体CEP1-s53突变体、CEP2-s4突变体和CEP3-s28突变体的氨基酸置换位点；
图2表示通过前体(底物)PGM和7-ADCA的酶促反应合成头孢氨苄的反应(S)、所述前体中PGM形成PG的水解反应(H1)、所述头孢氨苄形成PG和7-ADCA的水解反应(H2)；
图3是显示使用CEP3-s28突变体进行头孢氨苄合成反应中随时间变化的头孢氨苄转化率、PGM残留量和PG产生量的数据；
图4表示通过前体(底物)HPGM和7-APRA的酶促反应合成头孢丙烯的反应(S)、所述前体中HPGM形成HPG的水解反应(H1)、所述头孢丙烯形成HPG和7-APRA的水解反应(H2)；
图5是显示使用CEP3-s28突变体进行头孢丙烯合成反应中随时间变化的头孢丙烯转化率、HPGM残留量和HPG产生量的数据；
图6表示通过前体(底物)PGM和7-ACCA的酶促反应合成头孢克洛的反应(S)、所述前体中PGM形成PG的水解反应(H1)、所述头孢克洛形成PG和7-ACCA的水解反应(H2)；
图7是显示使用CEP3-s28突变体进行头孢克洛合成反应中随时间变化的头孢克洛转化率、PGM残留量和PG产生量的数据；
图8表示通过前体(底物)DHME和7-ADCA的酶促反应合成头孢拉定的反应(S)、所述前体中DHME形成DHPG的水解反应(H)；
图9是显示使用CEP3-s28突变体进行头孢拉定合成反应中随时间变化的头孢拉定转化率、DHME残留量和DHPG产生量的数据；
图10表示通过前体(底物)7-ADCA和HPGM的酶促反应合成头孢羟氨苄的反应(S)、所述前体中HPGM形成HPG的水解反应(H1)、所述头孢羟氨苄形成HPG和7-ADCA的水解反应(H2)；
图11是显示使用CEP3-s28突变体进行头孢羟氨苄合成反应中随时间变化的头孢羟氨苄转化率、HPGM残留量和HPG产生量的数据；
图12表示通过前体(底物)HPGM和6-APA的酶促反应合成阿莫西林的反应(S)、所述前体中HPGM形成HPG的水解反应(H1)、所述阿莫西林形成HPG和6-APA的水解反应(H2)；
图13是显示使用CEP3-s28突变体进行阿莫西林合成反应中随时间变化的阿莫西林转化率、HPGM残留量和HPG产生量的数据。
具体实施方式
下面将对本发明进行详细说明。
但下面说明的实施例，是为了帮助理解本发明的示例性说明，本发明的内容不限于所述实施例。
<实施例1>制备来源于无色杆菌属(Achromobacter sp.)CCM 4824的野生型青霉 素G酰化酶(Penicillin G acylase,APA)
<1-1>合成表达来源于无色杆菌属(Achromobacter sp.)CCM 4824的野生型青霉素G酰化酶的基因
野生型APA(来源于无色杆菌属(Achromobacter sp.)CCM 4824的青霉素G酰化酶)为前体(precursor)型，通过SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ ID NO.2所示的β亚基由SEQID NO.3所示的间隔(spacer)肽连接和构成的单链多肽(SEQ ID NO.4)来表达，然后通过细胞中的自催化处理(autocatalytic processing)，以形成由所述α亚基和β亚基构成的成熟型(mature)活性二聚体形式。表达野生型APA前体SEQ ID NO.4的基因(缩写为“apa基因”)由Bioneer公司(大田，韩国)合成。
<1-2>制备表达野生型APA的重组载体(pBC-APA)
将<1-1>中获得的apa基因***到pBC-KS(+)载体(Stratagene公司，美国)的XbaI和NotI限制酶识别位点中以制备用于表达野生型APA的pBC-APA质粒。具体的制备方法如下。
用限制性内切酶XbaI和NotI酶切所述apa基因DNA产物(大小约2.6kb)，用纯化试剂(QIAquick凝胶提取试剂盒，QIAGEN公司，德国)纯化并用作***DNA。通过限制性内切酶XbaI和NotI酶切pBC KS(+)载体(Stratagene公司，美国)并用CIP去磷酸化的DNA片段用作载体DNA。使用T4DNA连接酶(New England Biolabs，瑞典)将所述***DNA和载体DNA在16℃连接(ligation)12至16小时，然后使用连接溶液进行电穿孔(electroporation)，对大肠杆菌(E.coli)MC1061菌株进行转化。将所述菌株涂布在含有浓度为20μg/mL的氯霉素抗生素的LB琼脂培养基上，并在30℃下培养过夜以筛选转化体。从转化体中分离质粒以确定***的DNA的碱基序列，从而最终获得含有apa基因的pBC-APA质粒。所述pBC-APA质粒表达野生型APA蛋白。下面制备的突变体显示出α亚基和β亚基各自的氨基酸位置的特定突变位置。
<实施例2>制备和筛选对多种β-内酰胺抗生素具有高水平的多重合成性能的突变 体
<2-1>通过易错聚合酶链反应(error prone PCR)制备1次突变体文库
通过人工随机诱变所述<实施例1>中合成的apa基因的碱基序列，为此进行易错聚合酶链反应(error prone PCR)来制备突变文库。制备特定突变文库的过程如下。
具体而言，使用多样性PCR随机诱变试剂盒(Diversity PCR Random Mutagenesiskit,Clontech,美国)进行易错聚合酶链反应，每1,000bp产生一个突变。PCR反应溶液，由使用1ng/μL的pBC-APA质粒的模板DNA、各10pmol的T3引物(SEQ ID NO.13)和T7引物(SEQ IDNO.14)、2mM dGTP、50X多样性dNTP混合物、10X钛Taq缓冲溶液和钛Taq聚合酶组成，终体积为50μL。PCR反应条件为，将反应混合物在96℃预变性2分钟，在96℃变性30秒，在52℃退火30秒，并在68℃聚合2分钟反复进行18次后，在68℃下后聚合5分钟。进行上述条件的易错聚合酶链反应，扩增约2.7kb大小的突变DNA片段。
用限制性内切酶XbaI和NotI酶切通过所述PCR获得的突变基因即2.7kb的PCR产物，用纯化试剂(QIAquick凝胶提取试剂盒，QIAGEN公司，德国)纯化并用作***DNA。通过限制性内切酶XbaI和NotI酶切pBC-KS(+)载体并用CIP去磷酸化的DNA片段用作载体DNA。使用T4DNA连接酶(New England Biolabs，瑞典)将所述***DNA和载体DNA在16℃连接16小时，然后使用连接溶液进行电穿孔，对大肠杆菌(E.coli)MC1061菌株进行转化。将所述菌株涂布在含有浓度为20μg/mL的氯霉素抗生素的LB琼脂培养基上，并在30℃下培养过夜以制备随机突变文库。
如下述<实施例4>至<实施例9>所述，评价对多种β-内酰胺抗生素的合成性能，代表性地用以下方法，从所述突变文库中搜索对头孢氨苄(Cephalexin)合成的反应性增加的突变APA。用于合成头孢氨苄(Cephalexin)的反应底物和特定的化学反应过程如图2所示。将含有被诱导突变的突变apa基因的大肠杆菌(E.coli)MC1061转化体接种到每孔各含有氯霉素抗生素的LB液体培养基150μl的96孔板中，并在25℃和165rpm下震动培养60-70小时。然后，在所述96孔板中各取25μl培养液并转移到新的96孔板中。将所述培养液与含有100μL细胞裂解液(1.25mg/mL溶菌酶(lysozyme)，1.25mM EDTA，0.375％曲通X-100)的0.1M磷酸钾(pH6.1)缓冲溶液混合，并在25℃放置3小时。随后，向其中加入通过在0.1M磷酸钾(pH6.1)缓冲溶液中溶解30mM的7-ADCA并以此为基准以1：1.2底物比例溶解36mM的PGM而制备的底物溶液，并在15℃进行14～16小时的合成反应。合成反应结束后，将反应液中的上清液70μL转移到新的96孔板中。通过向其中加入70μL的反应停止液1N NaOH停止酶反应后，通过HPLC筛选头孢氨苄合成活性增加的突变体。HPLC分析条件为，使用0.01M磷酸钾(pH5.5)和甲醇(93:7)作为溶剂，柱为ZORBAX CN5μm，4.6×200mm，以1.2mL/分钟注入10μL并分析了35分钟。
用所述方法，证实了7个突变体使头孢氨苄合成活性增加。7个突变体通过氨基酸序列分析被鉴定为T193βI(改良菌株名称为CEP1-2)、D74βQ(CEP1-5)、A106αT(CEP1-19)、T176βS(CEP1-24)、T485βS(CEP1-25)、E366βV(CEP1-46)或T292βS(CEP1-51)发生了突变。
<2-2>使用定位突变(DNA shuffling)制备2次突变文库_筛选CEP1-s53改良菌株
为了进一步改善具有增加的抗生素合成活性的突变青霉素G酰化酶，在通过易错聚合酶链反应获得的改良菌株的活性的基础上，制备对七个氨基酸残基(A106αT、D74βQ、T176βS、T193βI、T292βS、E366βV、T485βS)的定位突变文库。
具体而言，为了制备A106α和D74β氨基酸突变文库，使用野生型APA和CEP1-19作为模板，使用M13R引物(SEQ ID NO.16)和CEP1-74b-R引物(SEQ ID NO.18)进行PCR，回收约1260bp大小的PCR产物；为了制备D74β、T176β、T193β氨基酸突变文库，使用野生型APA和CEP1-24作为模板，使用CEP1-74b-F引物(SEQ ID NO.17)和CEP1-193b-R引物(SEQ IDNO.20)进行PCR，回收约390bp大小的PCR产物；为了制备T193β、T292β、E366β氨基酸突变文库，使用野生型APA和CEP1-51作为模板，使用CEP1-193b-F引物(SEQ ID NO.19)和CEP1-366b-R引物(SEQ ID NO.22)进行PCR，回收约560bp大小的PCR产物。为了制备E366β、T485β氨基酸突变文库，使用野生型APA和CEP1-25作为模板，使用CEP1-366b-F引物(SEQ IDNO.21)和M13F引物(SEQ ID NO.15)进行PCR，回收约690bp大小的PCR产物。
PCR反应溶液以各个模板DNA、引物、pfu-x缓冲溶液、dNTPs混合物、pfu-x聚合酶组成，终体积调整为100μL。PCR反应条件为，将反应混合物在96℃预变性2分钟，在96℃变性30秒，在52℃退火30秒，并在68℃聚合2分钟反复进行18次后，在68℃下后聚合5分钟。
在所述条件下获得的约1260bp的PCR产物、390bp的PCR产物、560bp的PCR产物和约690bp和T3引物的PCR产物进行混合，使用T3引物(SEQ ID NO.13)和T7引物(SEQ ID NO.14)进行PCR，扩增为约2.7kb大小的多重突变体DNA片段。将获得的2.7kb的PCR产物，以与实施例<2-1>在相同的方式，***到PBC KS(+)载体DNA，并对大肠杆菌(E.coli)MC1061菌株进行转化，制备定位突变体文库。通过与与实施例<2-1>在相同的方式，从所述定位突变文库中搜索对头孢氨苄(Cephalexin)合成的反应性增加的突变体，筛选出与野生型APA相比对头孢氨苄(Cephalexin)合成活性增加到最高水平的5重突变体(D74βQ、T176βS、T193βI、E366βV和T485βS)，并将其命名为CEP1-s53(图1)。CEP1-s53表达SEQ ID NO.1的α亚基和SEQ IDNO.5的β亚基。
<2-3>通过易错聚合酶链反应(error prone PCR)制备3次突变体文库
为了进一步提高所述实施例<2-2>制备的CEP1-s53突变体的抗生素(特别是头孢菌素合成)活性，使用CEP1-s53的DNA作为模板DNA，以与所述实施例<2-1>相同的方式，制备错误诱发突变文库。
随后，代表性地对头孢氨苄(Cephalexin)合成活性进行研究，添加通过在0.1M磷酸钾(pH 6.1)缓冲溶液中溶解80mM的7-ADCA并以此为基准以1：1底物比例溶解80mM的PGM而制备的底物溶液，并降低反应温度，在6℃进行14～16小时的合成反应。除所述底物浓度和比例、底物反应温度外，其他均按照与实施例<2-1>相同的方式进行。
搜索制备的所述错误诱发突变文库，确认6个突变体与CEP1-s53相比，对头孢氨苄(Cephalexin)的合成活性增加。通过氨基酸SEQ ID NO.分析，确认6个突变体对所述CEP1-s53分别包含Q74βE(CEP2-8)、A168αV(CEP2-13)、A102αE(CEP2-15)、Y180βS(CEP2-22)、F254βY(CEP2-30)或S428βA(CEP2-35)的追加突变。
<2-4>使用定位突变制备4次突变体文库筛选CEP2-s4改良菌株
为了进一步改善具有增加的抗生素合成活性的突变体，在通过所述实施例<2-3>获得的改良菌株的活性的基础上，使用CEP1-s53的质粒DNA作为模板DNA，制备对6个氨基酸残基(A102αE、A168αV、Q74βE、Y180βS、F254βY、S428βA)的定位突变文库。本实施例中的PCR反应条件与所述实施例<2-2>中所述的方法相同。
具体而言，为了制备A102α氨基酸突变文库，使用CEP1-s53的质粒作为模板，使用M13R引物(SEQ ID NO.16)和CEP2-102a-R引物(SEQ ID NO.24)进行PCR，回收约510bp大小的PCR产物；为了制备A102α、A168α、Q74β氨基酸突变文库，使用CEP1-s53、CEP2-13的质粒作为模板，使用CEP2-102a-F引物(SEQ ID NO.23)和CEP2-74b-R引物(SEQ ID NO.26)进行PCR，回收约780bp大小的PCR产物；为了制备Q74β、Y180β、F254β氨基酸突变文库，使用CEP1-s53、CEP2-22的质粒作为模板，使用CEP2-74b-F引物(SEQ ID NO.25)和EP2-254b-R引物(SEQ ID NO.28)进行PCR，回收约570bp大小的PCR产物；为了制备F254β、S428β氨基酸突变文库，使用CEP1-s53、CEP2-35的质粒作为模板，使用CEP2-254b-F引物(SEQ ID NO.27)和M13F引物(SEQ ID NO.15)进行PCR，回收约1,030bp大小的PCR产物。
将所述510bp大小的PCR产物、780bp大小的PCR产物、570bp大小的PCR产物1,030bp大小的PCR产物进行混合，使用T3引物(SEQ ID NO.13)和T7引物(SEQ ID NO.14)进行PCR，获得约2.7kb大小的产物。
随后，通过与所述实施例<2-3>相同的方式，从文库中搜索活性增加的突变体，筛选出与CEP1-s53相比对抗生素尤其对头孢氨苄(Cephalexin)合成活性显著增加的突变体，即对CEP1-s53产生A102αE、Y180βS及F254βY的追加突变的菌株，并将其命名为CEP2-s4(图1)。所述CEP2-s4表达SEQ ID NO.7所示的α亚基和SEQ ID NO.8所示的β亚基。
<实施例3>制备和筛选底物分解活性减少的高效率的抗生素多重合成突变体
为了制备对多种β-内酰胺抗生素具有高水平的合成性能，而对其反应底物的水解活性显著减少的突变体，进行以下过程。
<3-1>通过易错聚合酶链反应(error prone PCR)制备5次突变体文库
为了增加所述实施例<2-4>制备的CEP2-s4突变体的抗生素(以头孢菌素为代表)合成活性，以及减少对反应底物(以PGM为代表)的水解活性，使用CEP2-s4的质粒作为模板DNA，以与所述实施例<2-1>相同的方式，制备错误诱发突变文库。
为了代表性地研究对头孢菌素的合成能力，按照与实施例<2-3>相同的方式进行试验。另外，为了研究对底物PGM的分解活性的反应性，将25μl酶溶液转移到96孔板中，添加通过在0.1M磷酸钾(pH 6.1)缓冲溶液中溶解15mM的7-ADCA并以此为基准以1：1底物比例溶解15mM的PGM而制备的底物溶液100μL，并将反应温度提高，在25℃进行14～16小时的合成反应。除所述底物浓度和比例、底物反应温度外，其他均按照与实施例<2-1>相同的方式进行。
研究制备的所述错误诱发突变文库的抗生素合成活性及底物分解活性，确认7个突变体与CEP2-s4相比，对抗生素(尤其头孢氨苄(Cephalexin))合成活性增加且PGM分解活性减少。通过氨基酸序列分析，确认7个突变体对所述CEP2-s4分别包含R120βC(CEP3-11)、Y248βF(CEP3-12)、F343βY(CEP3-19)、Q10αK(CEP3-28)、A65αV(CEP3-34)、I5βV(CEP3-42)或R185βC(CEP3-48)的追加突变。
<3-2>使用定位突变制备6次突变文库筛选CEP3-s28改良菌株
在所述实施例<3-1>获得的改良菌株的活性的基础上，使用CEP2-s4的质粒作为模板DNA，制备对7个氨基酸残基(Q10αK、A65αV、I5βV、R120βC、R185βC、Y248βF、F343βY)的定位突变文库。本实施例中的PCR反应条件与所述实施例<2-2>中所述的方法相同。
具体而言，为了制备Q10α,A65α氨基酸突变文库，使用CEP2-s4、CEP3-28质粒作为模板，使用M13R引物(SEQ ID NO.16)和CEP3-65a-R引物(SEQ ID NO.30)进行PCR，回收约380bp大小的PCR产物；为了制备A65α,I5β,R120β氨基酸突变文库，使用CEP2-s4,CEP3-42质粒作为模板，使用CEP3-65a-F引物(SEQ ID NO.29)和CEP3-120b-R引物(SEQ ID NO.32)进行PCR，回收约1,060bp大小的PCR产物；为了制备R120β,R185β,Y248β氨基酸突变文库，使用CEP2-s4,CEP3-48质粒作为模板，使用CEP3-120b-F引物(SEQ ID NO.31)和CEP3-248b-R引物(SEQ ID NO.34)进行PCR，回收约420bp大小的PCR产物；为了制备Y248β,F343β氨基酸突变文库，使用CEP2-s4,CEP3-19质粒作为模板，使用CEP3-248b-F引物(SEQ ID NO.33)和M13F引物(SEQ ID NO.15)进行PCR，回收约1,040bp大小的PCR产物。将所述380bp大小的PCR产物、1,060bp大小的PCR产物、420bp大小的PCR产物1,040bp大小的PCR产物进行混合，使用T3引物(SEQ ID NO.7)和T7引物(SEQ ID NO.8)进行PCR，获得约2.7kb大小的产物。
随后，通过与所述实施例<3-1>相同的方式，从文库中搜索活性增加的突变体，筛选出与CEP2-s4相比对抗生素(以头孢氨苄为代表)合成活性显著增加、并对底物(PGM)的分解活性减少的突变体，即对CEP2-s4产生A65αV、R120βC、Y248βF及F343βY的追加突变的菌株，并将其命名为CEP3-s28(图1)。CEP3-s28表达SEQ ID NO.10所示的α亚基和SEQ IDNO.11所示的β亚基。
<3-3>菌株寄存
转化为含有编码CEP3-s28突变酶即在制备的突变酶中具有最佳活性的突变酶基因的pBC-CEP3-s28质粒的大肠杆菌(E.coli)MC1061菌株，被命名为“大肠杆菌(Escherichia coli)MC1061/pBC-CEP3-s28”并于2017年11月10日寄存到韩国生命工学研究院基因银行(寄存号：KCTC 13390BP)。
所述<实施例2>至<实施例3>记载的各个突变体的抗生素合成效率的比较和评价，将通过以下实施例进行说明。
<实施例4>APA突变体的头孢氨苄(Cephalexin)合成效率的比较
<4-1>制备酶溶液
为了比较制备的APA突变体的活性，按照以下方法制备每种酶溶液。编码所述<实施例2>至<实施例3>制备的各个APA突变体的基因，按照与实施例<1-2>中记载的相同的方法，***到PBC-KS(+)载体，将每种表达载体转化到大肠杆菌(E.coli)MC1061的大肠杆菌菌株中。大肠杆菌的转化体分别接种到3mL的含有20μg/mL氯霉素的LB培养基(1％细菌用胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl)中在28℃，200rpm下条件振荡培养16小时。其后，将350μL的培养液接种到35mL含有20μg/mL氯霉素的新的LB培养基中，在23℃，190rpm条件振荡培养48小时。通过对培养液进行离心分离(4℃，8000rpm，10分钟)回收菌体，并用0.1M磷酸钾(pH8.0)缓冲溶液洗涤一次。将菌体在35mL的相同缓冲溶液中悬浮后,在4℃下通过超声波发生器(Vibra细胞VC750，超音速&材料公司，美国)破碎5分钟，然后在4℃，13,500rpm条件下离心分离30分钟，取上清液制备每种APA突变体酶溶液。
<4-2>测量头孢氨苄(Cephalexin)合成活性
为了测量头孢氨苄合成活性，通过在0.1M磷酸钾(pH 6.1)缓冲溶液中分别溶解80mM的7-ADCA和PGM制备底物溶液。向500μL底物溶液中加入500μL所述实施例<4-1>的各APA突变体酶溶液并进行酶反应10分钟，取500μL反应溶液，加入500μL的0.2N HCl溶液以终止反应。之后进行过滤(filtration)，在与实施例<2-1>相同的条件下进行HPLC分析，并通过与标准物质的定量曲线进行比较来定量。在本说明书中，1单位(unit,U)被定义为能够每分钟产生1μmole的头孢氨苄的酶的量。另一方面，通过考马斯亮蓝法(Bradford，M.，Anal.Biochem.72：248-254,1976)测量酶溶液中蛋白质的量来测定底物的非活性，按照每1mg蛋白质的活性单位表示。
表1
＊头孢氨苄的合成活性/PGM的水解活性
表1显示了本发明的突变体中代表性的CEP1-s53突变体、CEP2-s4突变体和CEP3-s28突变体与野生型APA的头孢氨苄合成活性的相对比较。如表1所示，与野生型APA相比，本发明的突变体通过持续改良，对头孢氨苄合成产率增加。与野生型APA相比，CEP1-s53的合成产率增加到21.2倍，CEP2-s4的合成产率增加到61.8倍，最终突变体CEP3-s28的合成产率增加到约165.4倍，显示出很高的头孢氨苄的产量率。
<4-3>测量反应底物PGM水解活性及S/H比
类似地，为了测量APA突变体对PGM分解活性的程度，将40mM的PGM溶于0.1M磷酸钾(pH8.0)缓冲溶液中制备底物溶液。向100μl的底物溶液中分别加入100μl的每种突变体的酶溶液，使酶反应进行10分钟，然后向所述反应溶液中加入100μ的0.2N HCl溶液以终止反应。之后，按照与实施例<4-2>相同的方式进行过滤(filtration)和HPLC分析，计算水解的PGM(hydrolyzed PGM，即PG)的量，并将水解的PGM的量与标准物质的定量曲线进行比较来定量。在这种情况下，1单位(unit,U)被定义为每分钟能够产生1μmol的PG的酶的量。S/H比由上述方法得到的PGM分解活性和实施例<4-2>中得到的头孢氨苄合成活性的值来测定。
如表1所示，与野生型APA相比，本发明的突变体对PGM分解活性相对减少，并且头孢氨苄合成活性与PGM分解活性的比率(S/H比)显着增加。尤其是，S/H比按照CEP1-S53、CEP2-S4和CEP3-S28的顺序增加，并且最终变体CEP3-s28的S/H比与野生型APA相比增加到了约20.2倍。
<4-4>通过7-ADCA和PGM测量头孢氨苄转化率
为了测量头孢氨苄转化率(Cephalexin)随时间的转化，通过测量前体7-ADCA转化率来推断头孢氨苄的合成产率。使用最终的突变体CEP3-s28来测量7-ADCA转化率。具体而言，除了将含有氯霉素的LB培养基的量变更为1L以外，与实施例<4-1>同样地进行菌株的培养。将培养的细胞悬浮液在4℃以7,000rpm离心10分钟，除去上清液以获得细胞沉淀(cellpellet)。将其悬浮在90mL的0.1M磷酸钾缓冲溶液中，然后用超声波发生器(Vibra细胞VC750，超音速&材料公司，美国)进行细胞破碎20分钟。为了分离和纯化酶溶液，将破裂的菌体在10℃静置2小时，然后离心(4℃，10,000rpm，30分钟)以获得上清液。将该溶液用于7-ADCA转化反应。
分离纯化的溶液(上清液)以10U/mL的浓度使用，将其与分别把280mM的7-ADCA和294mM的PGM添加至0.1M磷酸钾(pH 6.1)缓冲溶液即以1：1.05的底物比例制备的共50mL的的底物溶液反应。在10℃下进行头孢氨苄合成反应3小时，以与实施例<4-2>相同的方式，通过HPLC分析7-ADCA转化率，PGM残留量和PG产生量。
结果，如图3所示，确认本发明的CEP3-s28突变酶随时间表现出高的7-ADCA转化率，并且PG量保持与头孢氨苄合成反应的初始阶段相似的程度即几乎没有产生。结果证实，本发明的CEP3-s28突变酶不仅高效地合成了头孢氨苄，而且还显著降低了PGM到PG的分解率和头孢氨苄的分解率，从而使头孢氨苄的生产率很优异。
<实施例5>APA突变体的头孢丙烯(Cefprozil)合成效率的比较
<5-1>测量头孢丙烯(Cefprozil)合成活性
为了合成头孢丙烯使用的底物及具体化学反应过程如图4所示。为了测量头孢丙烯合成活性，通过在0.1M磷酸钾(pH 8.0)缓冲溶液中分别溶解30mM的7-APRA和HPGM制备底物溶液。向500μL底物溶液中加入500μL所述实施例<4-1>的各APA突变体酶溶液并进行酶反应10分钟，取500μL反应溶液，加入500μL的1N NaOH溶液以终止反应。之后，进行过滤(filtration)和HPLC分析，并通过与标准物质的定量曲线进行比较来定量。HPLC分析条件为，使用0.05M磷酸钾(pH4.3)和乙腈(95:5)作为溶剂，柱为TSKgel ODS-80Ts,150*4.6mm，以0.8mL/分钟注入10μL并分析了30分钟。在本说明书中，1单位(unit,U)被定义为能够每分钟产生1μmole的头孢丙烯的酶的量。
表2
＊头孢丙烯的合成活性/PGM的水解活性
表2显示了本发明的突变体中代表性的CEP1-s53突变体、CEP2-s4突变体和CEP3-s28突变体与野生型APA的头孢丙烯合成活性的相对比较。如表2所示，与野生型APA相比，本发明的突变体通过持续改良，对头孢丙烯合成产率增加。与野生型APA相比，CEP1-s53的合成产率增加约38.1倍，CEP2-s4的合成产率增加87.1倍，最终突变体CEP3-s28的合成产率增加约121.6倍，显示出很高的头孢丙烯的生产率。
<5-2>测量反应底物HPGM水解活性及S/H比
类似地，为了测量APA突变体对HPGM分解活性的程度，将40mM的HPGM溶于0.1M磷酸钾(pH8.0)缓冲溶液中制备底物溶液。除所述底物溶液外，其他均按照实施例<4-3>相同的方式进行。按照所述实施例<5-1>相同的方式进行HPLC分析，计算水解的HPGM(hydrolyzedHPGM，即HPG)的量，并将水解的PGM的量与标准物质的定量曲线进行比较来定量。在这种情况下，1单位(unit,U)被定义为每分钟能够产生1μmol的HPG的酶的量。S/H比由上述方法得到的HPGM分解活性和实施例<5-1>中得到的头孢丙烯合成活性的值来测定。
如表2所示，与野生型APA相比，本发明的突变体对HPGM分解活性相对减少，并且头孢丙烯合成活性与HPGM分解活性的比率(S/H比)增加。尤其是，S/H比按照CEP1-S53、CEP2-S4和CEP3-S28的顺序增加，并且最终变体CEP3-s28的S/H比与野生型APA相比增加到了约21.3倍。
<5-3>通过7-APRA和HPGM测量头孢丙烯转化率
所述实施例<4-4>中制备的CEP3-s28酶分离纯化的溶液(上清液)以10U/mL的浓度使用，将其与分别把280mM的7-APRA和336mM的HPGM添加至0.1M磷酸钾(pH 8.0)缓冲溶液即以1：1.2的底物比例制备的共50mL的的底物溶液反应。在10℃下进行头孢丙烯合成反应3小时，以与所述实施例<5-1>相同的方式，通过HPLC分析7-APRA转化率，HPGM残留量和HPG产生量。
结果，如图5所示，确认本发明的CEP3-s28突变酶随时间表现出高的7-APRA转化率，并且HPG量保持与头孢丙烯合成反应的初始阶段相似的程度即几乎没有产生。结果证实，本发明的CEP3-s28突变酶不仅高效地合成了头孢丙烯，而且还显著降低了HPGM到HPG的分解率和头孢丙烯的分解率，从而使头孢丙烯的生产率很优异。
<实施例6>APA突变体的头孢克洛(Cefaclor)合成效率的比较
<6-1>测量头孢克洛(Cefaclor)合成活性
为了合成头孢克洛使用的底物及具体化学反应过程如图6所示。为了测量头孢克洛合成活性，通过在0.1M磷酸钾(pH 8.0)缓冲溶液中分别溶解80mM的7-ACCA和PGM制备底物溶液。向500μL底物溶液中加入500μL所述实施例<4-1>的各APA突变体酶溶液并进行酶反应10分钟，取500μL反应溶液，加入500μL的0.5N NaOH溶液以终止反应。之后，进行过滤(filtration)和HPLC分析，并通过与标准物质的定量曲线进行比较来定量。HPLC分析条件为，使用0.01M磷酸钠(pH6.8)和甲醇(95:5)作为溶剂，柱为Agilent Zorbox CN，250×4.6mm，以1.0mL/分钟注入10μL并分析了20分钟。在本说明书中，1单位(unit,U)被定义为能够每分钟产生1μmole的头孢克洛的酶的量。
表3
＊头孢克洛的合成活性/PGM的水解活性
表3显示了本发明的突变体中代表性的CEP1-s53突变体、CEP2-s4突变体和CEP3-s28突变体与野生型APA的头孢克洛合成活性的相对比较。如表3所示，与野生型APA相比，本发明的突变体通过持续改良，对头孢克洛合成产率增加。与野生型APA相比，CEP1-s53的合成产率增加约52.1倍，CEP2-s4的合成产率增加100.5倍，最终突变体CEP3-s28的合成产率增加约154.4倍，显示出很高的头孢克洛的生产率。
<6-2>测量反应底物PGM水解活性及S/H比
类似地，为了测量APA突变体对PGM分解活性的程度，将80mM的PGM溶于0.1M磷酸钾(pH8.0)缓冲溶液中制备底物溶液。除所述底物溶液外，其他均按照实施例<4-3>相同的方式进行。按照所述实施例<6-1>相同的方式进行HPLC分析，计算水解的PGM(hydrolyzedPGM，即PG)的量，并与标准物质的定量曲线进行比较来定量。在这种情况下，1单位(unit,U)被定义为每分钟能够产生1μmol的PG的酶的量。S/H比由上述方法得到的PGM分解活性和实施例<6-1>中得到的头孢克洛合成活性的值来测定。
如表3所示，与野生型APA相比，本发明的突变体对PGM分解活性相对减少，并且头孢克洛合成活性与PGM分解活性的比率(S/H比)显著增加。尤其是，S/H比按照CEP1-S53、CEP2-S4和CEP3-S28的顺序增加，并且最终变体CEP3-s28的S/H比与野生型APA相比增加了约33.4倍。
<6-3>通过7-ACCA和PGM测量头孢克洛转化率
所述实施例<4-4>中制备的CEP3-s28酶分离纯化的溶液(上清液)以10U/mL的浓度使用，将其与分别把200mM的7-ACCA和220mM的PGM添加至0.1M磷酸钾(pH 8.0)缓冲溶液即以1：1.1的底物比例制备的共50mL的的底物溶液反应。在10℃下进行头孢克洛合成反应3小时，以与所述实施例<6-1>相同的方式，通过HPLC分析7-ACCA转化率，PGM残留量和PG产生量。
结果，如图7所示，确认本发明的CEP3-s28突变酶随时间表现出高的7-ACCA转化率，并且PG量保持与头孢克洛合成反应的初始阶段相似的程度即几乎没有产生。结果证实，本发明的CEP3-s28突变酶不仅高效地合成了头孢克洛，而且还显著降低了PGM到PG的分解率和头孢克洛的分解率，从而使头孢克洛的生产率很优异。
<实施例7>APA突变体的头孢拉定(Cephradine)合成效率的比较
<7-1>测量头孢拉定(Cephradine)合成活性
为了合成头孢拉定使用的底物及具体化学反应过程如图8所示。为了测量头孢拉定合成活性，通过在0.1M磷酸钾(pH 8.0)缓冲溶液中分别溶解30mM的7-ADCA和DHME制备底物溶液。向500μL底物溶液中加入500μL所述实施例<4-1>的各APA突变体酶溶液并进行酶反应10分钟，取500μL反应溶液，加入500μL的1N NaOH溶液以终止反应。之后，进行过滤(filtration)和HPLC分析，并通过与标准物质的定量曲线进行比较来定量。HPLC分析条件为，使用0.01M磷酸钠(pH5.5)和甲醇(93:7)作为溶剂，柱为ZORBAX CN 5um,4.6*200mm，以1.2mL/分钟注入10μL样品并分析了35分钟。在本说明书中，1单位(unit,U)被定义为能够每分钟产生1μmole的头孢拉定的酶的量。
表4
＊头孢拉定的合成活性/DHME的水解活性
表4显示了本发明的突变体中代表性的CEP1-s53突变体、CEP2-s4突变体和CEP3-s28突变体与野生型APA的头孢拉定合成活性的相对比较。如表4所示，与野生型APA相比，本发明的突变体通过持续改良，对头孢拉定合成产率增加。与野生型APA相比，CEP1-s53的合成产率增加约12.8倍，CEP2-s4的合成产率增加69.5倍，最终突变体CEP3-s28的合成产率增加约153.6倍，显示出很高的头孢拉定的生产率。
<7-2>测量反应底物DHME水解活性及S/H比
类似地，为了测量APA突变体对DHME分解活性的程度，将40mM的DHME溶于0.1M磷酸钾(pH8.0)缓冲溶液中制备底物溶液。除所述底物溶液外，其他均按照实施例<4-3>相同的方式进行。按照所述实施例<7-1>相同的方式进行HPLC分析，计算水解的DHME(hydrolyzedDHME，即PG)的量，并与标准物质的定量曲线进行比较来定量。在这种情况下，1单位(unit,U)被定义为每分钟能够产生1μmol的DHPG的酶的量。S/H比由上述方法得到的DHME分解活性和实施例<7-1>中得到的头孢拉定合成活性的值来测定。
如表4所示，与野生型APA相比，本发明的突变体对DHME分解活性相对减少，并且头孢拉定合成活性与DHME分解活性的比率(S/H比)显著增加。尤其是，S/H比按照CEP1-S53、CEP2-S4和CEP3-S28的顺序增加，并且最终变体CEP3-s28的S/H比与野生型APA相比增加了约27.3倍。
<7-3>通过7-ADCA和DHME测量头孢拉定转化率
所述实施例<4-4>中制备的CEP3-s28酶分离纯化的溶液(上清液)以10U/mL的浓度使用，将其与分别把300mM的7-ADCA和345mM的DHME添加至0.1M磷酸钾(pH 8.0)缓冲溶液即以1：1.15的底物比例制备的共50mL的底物溶液反应。在10℃下进行头孢拉定合成反应3小时，以与所述实施例<7-1>相同的方式，通过HPLC分析7-ADCA转化率，DHME残留量和DHPG产生量。
结果，如图9所示，确认本发明的CEP3-s28突变酶随时间表现出高的7-ADCA转化率，并且DHPG量保持与头孢拉定合成反应的初始阶段相似的程度即几乎没有产生。结果证实，本发明的CEP3-s28突变酶不仅高效地合成了头孢拉定，而且还显著降低了DHME到DHPG的分解率和头孢拉定的分解率，从而使头孢拉定的生产率很优异。
<实施例8>APA突变体的头孢羟氨苄(Cefadroxil)合成效率的比较
<8-1>测量头孢羟氨苄(Cefadroxil)合成活性
为了合成头孢羟氨苄使用的底物及具体化学反应过程如图10所示。为了测量头孢羟氨苄合成活性，通过在0.05M磷酸钾(pH 7.0)缓冲溶液中分别溶解40mM的7-ADCA和HPGM制备底物溶液。向500μL底物溶液中加入500μL所述实施例<4-1>的各APA突变体酶溶液并进行酶反应10分钟，取500μL反应溶液，加入500μL的0.2N HCL溶液以终止反应。之后，进行过滤(filtration)和HPLC分析，并通过与标准物质的定量曲线进行比较来定量。HPLC分析条件为，使用0.01M磷酸钠(pH4.8)和乙腈(95:5)作为溶剂，柱为YMC,C185um,4.6*200mm，以1.2mL/分钟注入10μL样品并分析了35分钟。在本说明书中，1单位(unit,U)被定义为能够每分钟产生1μmole的头孢羟氨苄的酶的量。
表5
＊头孢羟氨苄的合成活性/HPGM的水解活性
表5显示了本发明的突变体中代表性的CEP1-s53突变体、CEP2-s4突变体和CEP3-s28突变体与野生型APA的头孢羟氨苄合成活性的相对比较。如表5所示，与野生型APA相比，本发明的突变体通过持续改良，对头孢羟氨苄合成产率增加。与野生型APA相比，CEP1-s53的合成产率增加约14.3倍，CEP2-s4的合成产率增加30.9倍，最终突变体CEP3-s28的合成产率增加约36.8倍，显示出很高的头孢羟氨苄的生产率。
<8-2>测量反应底物HPGM水解活性及S/H比
类似地，为了测量APA突变体对HPGM分解活性的程度，将20mM的HPGM溶于0.1M磷酸钾(pH7.0)缓冲溶液中制备底物溶液。除所述底物溶液外，其他均按照实施例<4-3>相同的方式进行。按照所述实施例<8-1>相同的方式进行HPLC分析，计算水解的HPGM(hydrolyzedHPGM，即HPG)的量，并与标准物质的定量曲线进行比较来定量。在这种情况下，1单位(unit,U)被定义为每分钟能够产生1μmol的HPG的酶的量。S/H比由上述方法得到的HPGM分解活性和实施例<8-1>中得到的头孢羟氨苄合成活性的值来测定。
如表5所示，与野生型APA相比，本发明的突变体对HPGM分解活性相对减少，并且头孢羟氨苄合成活性与HPGM分解活性的比率(S/H比)显著增加。尤其是，S/H比按照CEP1-S53、CEP2-S4和CEP3-S28的顺序增加，并且最终变体CEP3-s28的S/H比与野生型APA相比增加了约35倍。
<8-3>通过7-ADCA和HPGM测量头孢羟氨苄转化率
所述实施例<4-4>中制备的CEP3-s28酶分离纯化的溶液(上清液)以10U/mL的浓度使用，将其与分别把200mM的7-ADCA和210mM的HPGM添加至0.1M磷酸钾(pH 8.0)缓冲溶液即以1：1.05的底物比例制备的共50mL的底物溶液反应。在10℃下进行头孢羟氨苄合成反应3小时，以与所述实施例<8-1>相同的方式，通过HPLC分析7-ADCA转化率，HPGM残留量和HPG产生量。
结果，如图11所示，确认本发明的CEP3-s28突变酶随时间表现出高的7-ADCA转化率，并且HPG量保持与头孢羟氨苄合成反应的初始阶段相似的程度即几乎没有产生。结果证实，本发明的CEP3-s28突变酶不仅高效地合成了头孢羟氨苄，而且还显著降低了HPGM到HPG的分解率和头孢羟氨苄的分解率，从而使头孢羟氨苄的生产率很优异。
<实施例9>APA突变体的阿莫西林(Amoxicillin)合成效率的比较
<9-1>测量阿莫西林(Amoxicillin)合成活性
为了合成阿莫西林使用的底物及具体化学反应过程如图12所示。为了测量阿莫西林合成活性，通过在0.1M磷酸钾(pH 6.1)缓冲溶液中分别溶解30mM的6-APA和HPGM制备底物溶液。向500μL底物溶液中加入500μL所述实施例<4-1>的各APA突变体酶溶液并进行酶反应10分钟，取500μL反应溶液，加入500μL的1N NaOH溶液以终止反应。之后，进行过滤(filtration)和HPLC分析，并通过与标准物质的定量曲线进行比较来定量。HPLC分析条件为，使用0.01M磷酸钠(pH6.4)和乙腈(95:5)作为溶剂，柱为YMC-Triart C18,250*4.6mm,以0.8mL/分钟注入10μL样品并分析了14分钟。在本说明书中，1单位(unit,U)被定义为能够每分钟产生1μmole的阿莫西林的酶的量。
表6
＊阿莫西林的合成活性/HPGM的水解活性
表6显示了本发明的突变体中代表性的CEP1-s53突变体、CEP2-s4突变体和CEP3-s28突变体与野生型APA的阿莫西林合成活性的相对比较。如表6所示，与野生型APA相比，本发明的突变体通过持续改良，对阿莫西林合成产率增加。与野生型APA相比，CEP1-s53的合成产率增加约146.6倍，CEP2-s4的合成产率增加270.0倍，最终突变体CEP3-s28的合成产率增加约853.3倍，显示出很高的阿莫西林的生产率。
<9-2>测量反应底物HPGM水解活性及S/H比
类似地，为了测量APA突变体对HPGM分解活性的程度，将40mM的HPGM溶于0.1M磷酸钾(pH8.0)缓冲溶液中制备底物溶液。除所述底物溶液外，其他均按照实施例<4-3>相同的方式进行。按照所述实施例<9-1>相同的方式进行HPLC分析，计算水解的HPGM(hydrolyzedHPGM，即HPG)的量，并与标准物质的定量曲线进行比较来定量。在这种情况下，1单位(unit,U)被定义为每分钟能够产生1μmol的HPG的酶的量。S/H比由上述方法得到的HPGM分解活性和实施例<9-1>中得到的阿莫西林合成活性的值来测定。
如表6所示，与野生型APA相比，本发明的突变体对HPGM分解活性相对减少，并且阿莫西林合成活性与HPGM分解活性的比率(S/H比)显著增加。尤其是，S/H比按照CEP1-S53、CEP2-S4和CEP3-S28的顺序增加，并且最终变体CEP3-s28的S/H比与野生型APA相比增加了约68倍。
<9-3>通过6-APA和HPGM测量阿莫西林转化率
所述实施例<4-4>中制备的CEP3-s28酶分离纯化的溶液(上清液)以10U/mL的浓度使用，将其与分别把280mM的6-APA和294mM的HPGM添加至0.1M磷酸钾(pH 6.1)缓冲溶液即以1：1.05的底物比例制备的共50mL的底物溶液反应。在10℃下进行阿莫西林合成反应3小时，以与所述实施例<9-1>相同的方式，通过HPLC分析6-APA转化率，HPGM残留量和HPG产生量。
结果，如图13所示，确认本发明的CEP3-s28突变酶随时间表现出高的6-APA转化率，并且HPG量保持与阿莫西林合成反应的初始阶段相似的程度即几乎没有产生。结果证实，本发明的CEP3-s28突变酶不仅高效地合成了阿莫西林，而且还显著降低了HPGM到HPG的分解率和阿莫西林的分解率，从而使阿莫西林的生产率很优异。
产业利用可能性
如以上所述，本发明涉及来源于无色杆菌属(Achromobacter sp.)CCM 4824的青霉素G酰化酶突变体及其应用，更具体地涉及一种在包含SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQID NO.2所示的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白质序列中，包含选自A65αV、A102αE、A106αT、D74βQ、R120βC、T176βS、Y180βS、T193βI、Y248βF、F254βY、T292βS、F343βY、E366βV及T485βS组合的群中的至少一种突变为特征的突变青霉素G酰化酶及利用该突变青霉素G酰化酶的β-内酰胺抗生素的制备(合成)方法。
本发明中公开的具有特定突变形式的、来源于无色杆菌属(Achromobacter sp.)CCM 4824的青霉素G酰化酶突变体，其特征为，对多种半合成β-内酰胺抗生素具有高效率的多重合成性能。本发明的突变APA，与其野生型酶相比，对多种半合成β-内酰胺抗生素的合成活性(生产量)非常高(尤其对头孢菌素和青霉素抗生素)，并且抗生素合成活性与对用于合成这些抗生素的底物的分解活性之比(S/H比)也非常高，从而使半合成β-内酰胺抗生素的生产率显著增加，因此产业利用可能性高。
序列表
<110> 艾美科健株式会社
<120> 来源于无色杆菌属CCM 4824的青霉素G酰化酶突变体及其应用
<130> DAG35439
<150> 10-2017-0183218
<151> 2017-12-28
<160> 34
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 194
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Alpha-subunit of wild-type APA(Penicillin G acylase proteinfromAchromobacter sp. 4824)
<400> 1
Ala Gln Pro Val Ala Pro Ala Ala Gly Gln Thr Ser Glu Ala Val Ala
1 5 10 15
Ala Arg Pro Gln Thr Ala Asp Gly Lys Val Thr Ile Arg Arg Asp Ala
20 25 30
Tyr Gly Met Pro His Val Tyr Ala Asp Thr Val Tyr Gly Ile Phe Tyr
35 40 45
Gly Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Gln Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu Met
50 55 60
Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Arg Val Ala Glu Val Leu Gly Ala Ser
65 70 75 80
Met Val Gly Phe Asp Lys Ser Ile Arg Ala Asn Phe Ser Pro Glu Arg
85 90 95
Ile Gln Arg Gln Leu Ala Ala Leu Pro Ala Ala Asp Arg Gln Val Leu
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Ala Ala Arg Pro Gln Thr Ala Asp Gly Lys Val Thr Ile Arg Arg Asp
20 25 30
Ala Tyr Gly Met Pro His Val Tyr Ala Asp Thr Val Tyr Gly Ile Phe
35 40 45
Tyr Gly Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Gln Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu
50 55 60
Met Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Arg Val Ala Glu Val Leu Gly Ala
65 70 75 80
Ser Met Val Gly Phe Asp Lys Ser Ile Arg Ala Asn Phe Ser Pro Glu
85 90 95
Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ala Leu Pro Ala Ala Asp Arg Gln Val
100 105 110
Leu Asp Gly Tyr Ala Ala Gly Met Asn Ala Trp Leu Ala Arg Val Arg
115 120 125
Ala Gln Pro Gly Gln Leu Met Pro Lys Glu Phe Asn Asp Leu Gly Phe
130 135 140
Ala Pro Ala Asp Trp Thr Ala Tyr Asp Val Ala Met Ile Phe Val Gly
145 150 155 160
Thr Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ala Asn Ser Glu Ile Asp Asn Leu
165 170 175
Ala Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Arg His Gly Ala Ala Asp Ala Met
180 185 190
Arg Ile Phe Asn Gln Leu Arg Trp Leu Thr Asp Ser Arg Ala Pro Thr
195 200 205
Thr Val Pro Ala Glu Ala Gly Ser Tyr Gln Pro Pro Val Phe Gln Pro
210 215 220
Asp Gly Ala Asp Pro Leu Ala Tyr Ala Leu Pro Arg Tyr Asp Gly Thr
225 230 235 240
Pro Pro Met Leu Glu Arg Val Val Arg Asp Pro Ala Thr Arg Gly Val
245 250 255
Val Asp Gly Ala Pro Ala Thr Leu Arg Ala Gln Leu Ala Ala Gln Tyr
260 265 270
Ala Gln Ser Gly Gln Pro Gly Ile Ala Gly Phe Pro Thr Thr Ser Asn
275 280 285
Met Trp Ile Val Gly Arg Asp His Ala Lys Asp Ala Arg Ser Ile Leu
290 295 300
Leu Asn Gly Pro Gln Phe Gly Trp Trp Asn Pro Ala Tyr Thr Tyr Gly
305 310 315 320
Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Phe Asp Val Val Gly Asn Thr Pro Phe
325 330 335
Ala Tyr Pro Ser Ile Leu Phe Gly His Asn Ala His Val Thr Trp Gly
340 345 350
Ser Thr Ala Gly Phe Gly Asp Gln Val Asp Ile Phe Ala Glu Lys Leu
355 360 365
Asp Pro Ala Asp Arg Thr Arg Tyr Phe His Asp Gly Gln Trp Lys Thr
370 375 380
Leu Glu Lys Arg Thr Asp Leu Ile Leu Val Lys Asp Ala Ala Pro Val
385 390 395 400
Thr Leu Asp Val Tyr Arg Ser Val His Gly Leu Ile Val Lys Phe Asp
405 410 415
Asp Ala Gln His Val Ala Tyr Ala Lys Ala Arg Ala Trp Glu Gly Tyr
420 425 430
Glu Leu Gln Ser Leu Met Ala Trp Thr Arg Lys Thr Gln Ser Ala Asn
435 440 445
Trp Glu Gln Trp Lys Ala Gln Ala Ala Arg His Ala Leu Ser Ile Asn
450 455 460
Trp Ser Tyr Ala Asp Asp Arg Gly Asn Ile Gly Tyr Ala His Ile Gly
465 470 475 480
Phe Tyr Pro Arg Arg Arg Pro Gly His Asp Pro Arg Leu Pro Val Pro
485 490 495
Gly Thr Gly Glu Met Asp Trp Leu Gly Leu Leu Pro Phe Ser Thr Asn
500 505 510
Pro Gln Val Tyr Asn Pro Arg Gln Gly Phe Ile Ala Asn Trp Asn Asn
515 520 525
Gln Pro Met Arg Gly Tyr Pro Ser Thr Asp Leu Tyr Ala Ile Val Trp
530 535 540
Gly Gln Ala Asp Arg Tyr Ala Glu Ile Glu Thr Arg Leu Lys Ala Met
545 550 555 560
Thr Ala Asn Gly Gly Lys Val Ser Ala Gln Gln Met Trp Asp Leu Ile
565 570 575
Arg Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Val Asn Arg Arg His Phe Leu Pro Phe
580 585 590
Leu Gln Arg Ala Val Gln Gly Leu Pro Ala Asp Asp Pro Arg Val Arg
595 600 605
Leu Val Ala Gly Leu Ala Ala Trp Asp Gly Met Met Thr Ser Glu Arg
610 615 620
Gln Pro Gly Tyr Phe Asp Asn Ala Gly Pro Ala Val Met Asp Ala Trp
625 630 635 640
Leu Arg Ala Met Leu Arg Arg Thr Leu Ala Asp Val Met Pro Ala Asp
645 650 655
Phe Phe Lys Trp Tyr Ser Ala Thr Gly Tyr Pro Thr Pro Gln Ala Pro
660 665 670
Ala Thr Gly Ser Leu Asn Leu Thr Thr Gly Val Lys Val Leu Phe Asn
675 680 685
Ala Leu Ala Gly Pro Glu Ala Gly Val Pro Gln Arg Tyr Asp Phe Phe
690 695 700
Asn Gly Ala Arg Ala Asp Asp Val Ile Leu Ala Ala Leu Asp Asp Ala
705 710 715 720
Leu Ala Ala Leu Arg Gln Ala Tyr Gly Gln Asp Pro Ala Ala Trp Lys
725 730 735
Ile Pro Ala Pro Pro Met Val Phe Ala Pro Lys Asn Phe Leu Gly Val
740 745 750
Pro Gln Ala Asp Ala Lys Ala Val Leu Cys Tyr Arg Ala Thr Gln Asn
755 760 765
Arg Gly Ser Glu Asn Asn Met Thr Val Phe Asp Gly Lys Ser Val Arg
770 775 780
Ala Val Asp Val Val Ala Pro Gly Gln Ser Gly Phe Val Ala Pro Asp
785 790 795 800
Gly Thr Pro Ser Pro His Thr Arg Asp Gln Phe Asp Leu Tyr Asn Thr
805 810 815
Phe Gly Ser Lys Arg Val Trp Phe Thr Ala Asp Glu Val Arg Arg Asn
820 825 830
Ala Thr Ser Glu Glu Thr Leu Arg Tyr Pro Arg
835 840
<210> 10
<211> 194
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Alpha-subunit of CEP3-s28 mutant
<400> 10
Ala Gln Pro Val Ala Pro Ala Ala Gly Gln Thr Ser Glu Ala Val Ala
1 5 10 15
Ala Arg Pro Gln Thr Ala Asp Gly Lys Val Thr Ile Arg Arg Asp Ala
20 25 30
Tyr Gly Met Pro His Val Tyr Ala Asp Thr Val Tyr Gly Ile Phe Tyr
35 40 45
Gly Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Gln Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu Met
50 55 60
Val Arg Arg Ser Thr Gln Gly Arg Val Ala Glu Val Leu Gly Ala Ser
65 70 75 80
Met Val Gly Phe Asp Lys Ser Ile Arg Ala Asn Phe Ser Pro Glu Arg
85 90 95
Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ala Leu Pro Ala Ala Asp Arg Gln Val Leu
100 105 110
Asp Gly Tyr Ala Ala Gly Met Asn Ala Trp Leu Ala Arg Val Arg Ala
115 120 125
Gln Pro Gly Gln Leu Met Pro Lys Glu Phe Asn Asp Leu Gly Phe Ala
130 135 140
Pro Ala Asp Trp Thr Ala Tyr Asp Val Ala Met Ile Phe Val Gly Thr
145 150 155 160
Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ala Asn Ser Glu Ile Asp Asn Leu Ala
165 170 175
Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Arg His Gly Ala Ala Asp Ala Met Arg
180 185 190
Ile Phe
<210> 11
<211> 557
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Beta-subunit of CEP3-s28 mutant
<400> 11
Ser Asn Met Trp Ile Val Gly Arg Asp His Ala Lys Asp Ala Arg Ser
1 5 10 15
Ile Leu Leu Asn Gly Pro Gln Phe Gly Trp Trp Asn Pro Ala Tyr Thr
20 25 30
Tyr Gly Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Phe Asp Val Val Gly Asn Thr
35 40 45
Pro Phe Ala Tyr Pro Ser Ile Leu Phe Gly His Asn Ala His Val Thr
50 55 60
Trp Gly Ser Thr Ala Gly Phe Gly Asp Gln Val Asp Ile Phe Ala Glu
65 70 75 80
Lys Leu Asp Pro Ala Asp Arg Thr Arg Tyr Phe His Asp Gly Gln Trp
85 90 95
Lys Thr Leu Glu Lys Arg Thr Asp Leu Ile Leu Val Lys Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Val Thr Leu Asp Val Tyr Cys Ser Val His Gly Leu Ile Val Lys
115 120 125
Phe Asp Asp Ala Gln His Val Ala Tyr Ala Lys Ala Arg Ala Trp Glu
130 135 140
Gly Tyr Glu Leu Gln Ser Leu Met Ala Trp Thr Arg Lys Thr Gln Ser
145 150 155 160
Ala Asn Trp Glu Gln Trp Lys Ala Gln Ala Ala Arg His Ala Leu Ser
165 170 175
Ile Asn Trp Ser Tyr Ala Asp Asp Arg Gly Asn Ile Gly Tyr Ala His
180 185 190
Ile Gly Phe Tyr Pro Arg Arg Arg Pro Gly His Asp Pro Arg Leu Pro
195 200 205
Val Pro Gly Thr Gly Glu Met Asp Trp Leu Gly Leu Leu Pro Phe Ser
210 215 220
Thr Asn Pro Gln Val Tyr Asn Pro Arg Gln Gly Phe Ile Ala Asn Trp
225 230 235 240
Asn Asn Gln Pro Met Arg Gly Phe Pro Ser Thr Asp Leu Tyr Ala Ile
245 250 255
Val Trp Gly Gln Ala Asp Arg Tyr Ala Glu Ile Glu Thr Arg Leu Lys
260 265 270
Ala Met Thr Ala Asn Gly Gly Lys Val Ser Ala Gln Gln Met Trp Asp
275 280 285
Leu Ile Arg Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Val Asn Arg Arg His Phe Leu
290 295 300
Pro Phe Leu Gln Arg Ala Val Gln Gly Leu Pro Ala Asp Asp Pro Arg
305 310 315 320
Val Arg Leu Val Ala Gly Leu Ala Ala Trp Asp Gly Met Met Thr Ser
325 330 335
Glu Arg Gln Pro Gly Tyr Tyr Asp Asn Ala Gly Pro Ala Val Met Asp
340 345 350
Ala Trp Leu Arg Ala Met Leu Arg Arg Thr Leu Ala Asp Val Met Pro
355 360 365
Ala Asp Phe Phe Lys Trp Tyr Ser Ala Thr Gly Tyr Pro Thr Pro Gln
370 375 380
Ala Pro Ala Thr Gly Ser Leu Asn Leu Thr Thr Gly Val Lys Val Leu
385 390 395 400
Phe Asn Ala Leu Ala Gly Pro Glu Ala Gly Val Pro Gln Arg Tyr Asp
405 410 415
Phe Phe Asn Gly Ala Arg Ala Asp Asp Val Ile Leu Ala Ala Leu Asp
420 425 430
Asp Ala Leu Ala Ala Leu Arg Gln Ala Tyr Gly Gln Asp Pro Ala Ala
435 440 445
Trp Lys Ile Pro Ala Pro Pro Met Val Phe Ala Pro Lys Asn Phe Leu
450 455 460
Gly Val Pro Gln Ala Asp Ala Lys Ala Val Leu Cys Tyr Arg Ala Thr
465 470 475 480
Gln Asn Arg Gly Ser Glu Asn Asn Met Thr Val Phe Asp Gly Lys Ser
485 490 495
Val Arg Ala Val Asp Val Val Ala Pro Gly Gln Ser Gly Phe Val Ala
500 505 510
Pro Asp Gly Thr Pro Ser Pro His Thr Arg Asp Gln Phe Asp Leu Tyr
515 520 525
Asn Thr Phe Gly Ser Lys Arg Val Trp Phe Thr Ala Asp Glu Val Arg
530 535 540
Arg Asn Ala Thr Ser Glu Glu Thr Leu Arg Tyr Pro Arg
545 550 555
<210> 12
<211> 843
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP3-s28 mutant
<400> 12
Met Ala Gln Pro Val Ala Pro Ala Ala Gly Gln Thr Ser Glu Ala Val
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro Gln Thr Ala Asp Gly Lys Val Thr Ile Arg Arg Asp
20 25 30
Ala Tyr Gly Met Pro His Val Tyr Ala Asp Thr Val Tyr Gly Ile Phe
35 40 45
Tyr Gly Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Gln Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu
50 55 60
Met Val Arg Arg Ser Thr Gln Gly Arg Val Ala Glu Val Leu Gly Ala
65 70 75 80
Ser Met Val Gly Phe Asp Lys Ser Ile Arg Ala Asn Phe Ser Pro Glu
85 90 95
Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ala Leu Pro Ala Ala Asp Arg Gln Val
100 105 110
Leu Asp Gly Tyr Ala Ala Gly Met Asn Ala Trp Leu Ala Arg Val Arg
115 120 125
Ala Gln Pro Gly Gln Leu Met Pro Lys Glu Phe Asn Asp Leu Gly Phe
130 135 140
Ala Pro Ala Asp Trp Thr Ala Tyr Asp Val Ala Met Ile Phe Val Gly
145 150 155 160
Thr Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ala Asn Ser Glu Ile Asp Asn Leu
165 170 175
Ala Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Arg His Gly Ala Ala Asp Ala Met
180 185 190
Arg Ile Phe Asn Gln Leu Arg Trp Leu Thr Asp Ser Arg Ala Pro Thr
195 200 205
Thr Val Pro Ala Glu Ala Gly Ser Tyr Gln Pro Pro Val Phe Gln Pro
210 215 220
Asp Gly Ala Asp Pro Leu Ala Tyr Ala Leu Pro Arg Tyr Asp Gly Thr
225 230 235 240
Pro Pro Met Leu Glu Arg Val Val Arg Asp Pro Ala Thr Arg Gly Val
245 250 255
Val Asp Gly Ala Pro Ala Thr Leu Arg Ala Gln Leu Ala Ala Gln Tyr
260 265 270
Ala Gln Ser Gly Gln Pro Gly Ile Ala Gly Phe Pro Thr Thr Ser Asn
275 280 285
Met Trp Ile Val Gly Arg Asp His Ala Lys Asp Ala Arg Ser Ile Leu
290 295 300
Leu Asn Gly Pro Gln Phe Gly Trp Trp Asn Pro Ala Tyr Thr Tyr Gly
305 310 315 320
Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Phe Asp Val Val Gly Asn Thr Pro Phe
325 330 335
Ala Tyr Pro Ser Ile Leu Phe Gly His Asn Ala His Val Thr Trp Gly
340 345 350
Ser Thr Ala Gly Phe Gly Asp Gln Val Asp Ile Phe Ala Glu Lys Leu
355 360 365
Asp Pro Ala Asp Arg Thr Arg Tyr Phe His Asp Gly Gln Trp Lys Thr
370 375 380
Leu Glu Lys Arg Thr Asp Leu Ile Leu Val Lys Asp Ala Ala Pro Val
385 390 395 400
Thr Leu Asp Val Tyr Cys Ser Val His Gly Leu Ile Val Lys Phe Asp
405 410 415
Asp Ala Gln His Val Ala Tyr Ala Lys Ala Arg Ala Trp Glu Gly Tyr
420 425 430
Glu Leu Gln Ser Leu Met Ala Trp Thr Arg Lys Thr Gln Ser Ala Asn
435 440 445
Trp Glu Gln Trp Lys Ala Gln Ala Ala Arg His Ala Leu Ser Ile Asn
450 455 460
Trp Ser Tyr Ala Asp Asp Arg Gly Asn Ile Gly Tyr Ala His Ile Gly
465 470 475 480
Phe Tyr Pro Arg Arg Arg Pro Gly His Asp Pro Arg Leu Pro Val Pro
485 490 495
Gly Thr Gly Glu Met Asp Trp Leu Gly Leu Leu Pro Phe Ser Thr Asn
500 505 510
Pro Gln Val Tyr Asn Pro Arg Gln Gly Phe Ile Ala Asn Trp Asn Asn
515 520 525
Gln Pro Met Arg Gly Phe Pro Ser Thr Asp Leu Tyr Ala Ile Val Trp
530 535 540
Gly Gln Ala Asp Arg Tyr Ala Glu Ile Glu Thr Arg Leu Lys Ala Met
545 550 555 560
Thr Ala Asn Gly Gly Lys Val Ser Ala Gln Gln Met Trp Asp Leu Ile
565 570 575
Arg Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Val Asn Arg Arg His Phe Leu Pro Phe
580 585 590
Leu Gln Arg Ala Val Gln Gly Leu Pro Ala Asp Asp Pro Arg Val Arg
595 600 605
Leu Val Ala Gly Leu Ala Ala Trp Asp Gly Met Met Thr Ser Glu Arg
610 615 620
Gln Pro Gly Tyr Tyr Asp Asn Ala Gly Pro Ala Val Met Asp Ala Trp
625 630 635 640
Leu Arg Ala Met Leu Arg Arg Thr Leu Ala Asp Val Met Pro Ala Asp
645 650 655
Phe Phe Lys Trp Tyr Ser Ala Thr Gly Tyr Pro Thr Pro Gln Ala Pro
660 665 670
Ala Thr Gly Ser Leu Asn Leu Thr Thr Gly Val Lys Val Leu Phe Asn
675 680 685
Ala Leu Ala Gly Pro Glu Ala Gly Val Pro Gln Arg Tyr Asp Phe Phe
690 695 700
Asn Gly Ala Arg Ala Asp Asp Val Ile Leu Ala Ala Leu Asp Asp Ala
705 710 715 720
Leu Ala Ala Leu Arg Gln Ala Tyr Gly Gln Asp Pro Ala Ala Trp Lys
725 730 735
Ile Pro Ala Pro Pro Met Val Phe Ala Pro Lys Asn Phe Leu Gly Val
740 745 750
Pro Gln Ala Asp Ala Lys Ala Val Leu Cys Tyr Arg Ala Thr Gln Asn
755 760 765
Arg Gly Ser Glu Asn Asn Met Thr Val Phe Asp Gly Lys Ser Val Arg
770 775 780
Ala Val Asp Val Val Ala Pro Gly Gln Ser Gly Phe Val Ala Pro Asp
785 790 795 800
Gly Thr Pro Ser Pro His Thr Arg Asp Gln Phe Asp Leu Tyr Asn Thr
805 810 815
Phe Gly Ser Lys Arg Val Trp Phe Thr Ala Asp Glu Val Arg Arg Asn
820 825 830
Ala Thr Ser Glu Glu Thr Leu Arg Tyr Pro Arg
835 840
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T3 primer
<400> 13
aattaaccct cactaaaggg a 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7 primer
<400> 14
taatacgact cactataggg 20
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M13F primer
<400> 15
cgccagggtt ttcccagtca cga 23
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M13R primer
<400> 16
agcggataac aatttcacac agga 24
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP1-74b-F
<400> 17
caggtttcgg cgatsakgtt gacatttttg cgg 33
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP1-74b-R
<400> 18
ccgcaaaaat gtcaacmtsa tcgccgaaac ctg 33
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP1-193b-F
<400> 19
cggctatgca cacatyggct tctatccgcg 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP1-193b-R
<400> 20
cgcggataga agccratgtg tgcatagccg 30
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP1-366b-F
<400> 21
gtaccctggc ggatgwaatg cctgcagact tc 32
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP1-366b-R
<400> 22
gaagtctgca ggcattwcat ccgccagggt ac 32
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP2-102a-F
<400> 23
cagcgtcagc tggmagctct gccagcc 27
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP2-102a-R
<400> 24
ggctggcaga gctkccagct gacgctg 27
<210> 25
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP2-74b-F
<400> 25
caggtttcgg cgatsaggtt gacatttttg cg 32
<210> 26
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP2-74b-R
<400> 26
cgcaaaaatg tcaacctsat cgccgaaacc tg 32
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP2-254b-F
<400> 27
cccaagcact gatctgtwcg cgatcgtatg ggg 33
<210> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP2-254b-R
<400> 28
ccccatacga tcgcgwacag atcagtgctt ggg 33
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP3-65a-F
<400> 29
ctgtttcaga tggaaatggy gcgtcgtagc acc 33
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP3-65a-R
<400> 30
ggtgctacga cgcrccattt ccatctgaaa cag 33
<210> 31
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP3-120b-F
<400> 31
gtgaccctgg atgtctacyg ttctgtccac ggcc 34
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP3-120b-R
<400> 32
ggccgtggac agaacrgtag acatccaggg tcac 34
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP3-248b-F
<400> 33
ccgatgcgcg gttwcccaag cactgatctg tac 33
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP3-248b-R
<400> 34
gtacagatca gtgcttgggw aaccgcgcat cgg 33

Claims (19)

1.一种突变青霉素G酰化酶，其特征为，在包含SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ IDNO.2所示的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白质序列中，包含选自A65αV、A102αE、A106αT、D74βQ、R120βC、T176βS、Y180βS、T193βI、Y248βF、F254βY、T292βS、F343βY、E366βV及T485βS组合的群中的至少一种突变。
2.根据权利请求第1项所述的突变青霉素G酰化酶，其特征为，在所述野生型青霉素G酰化酶蛋白质序列中，包含D74βQ、T176βS、T193βI、E366βV及T485βS的突变。
3.根据权利请求第2项所述的突变青霉素G酰化酶，其特征为，
所述突变青霉素G酰化酶
包含SEQ ID NO.1所示的α亚基；
及SEQ ID NO.5所示的β亚基。
4.根据权利请求第2项所述的突变青霉素G酰化酶，其特征为，所述突变青霉素G酰化酶追加包含选自A102αE、A168αV、Y180βS、F254βY及S428βA组合的群中的至少一种突变。
5.根据权利请求第4项所述的突变青霉素G酰化酶，其特征为，所述突变青霉素G酰化酶包含A102αE、Y180βS及F254βY的突变。
6.根据权利请求第5项所述的突变青霉素G酰化酶，其特征为，
所述突变青霉素G酰化酶
包含SEQ ID NO.7所示的α亚基；
及SEQ ID NO.8所示的β亚基。
7.根据权利请求第4项所述的突变青霉素G酰化酶，其特征为，所述突变青霉素G酰化酶追加包含选自Q10αK、A65αV、I5βV、R120βC、R185βC、Y248βF及F343βY组合的群中的至少一种突变。
8.根据权利请求第7项所述的突变青霉素G酰化酶，其特征为，所述突变青霉素G酰化酶包含A65αV、R120βC、Y248βF及F343βY的突变。
9.根据权利请求第8项所述的突变青霉素G酰化酶，其特征为，
所述突变青霉素G酰化酶
包含SEQ ID NO.10所示的α亚基；
及SEQ ID NO.11所示的β亚基。
10.一种编码权利请求第1项至第9项中任何一项的突变青霉素G酰化酶的多核苷酸。
11.一种包含权利请求第10项的多核苷酸的重组表达载体。
12.一种通过权利请求第11项的表达载体性质转化的宿主细胞。
13.根据权利请求第12项所述的性质转化的宿主细胞，其特征为，
所述宿主细胞选自梭菌属、大肠杆菌属、醋酸菌属、气单胞菌属、产碱杆菌属、丝枝霉属、芽孢杆菌属、头孢菌属、黄杆菌属、克吕沃尔菌属、枝动菌属、精蛋白杆菌属、假单胞菌属、无色杆菌属和黄单胞菌属组合的群中的任意一个属的微生物。
14.根据权利请求第13项所述的性质转化的宿主细胞，其特征为，所述大肠杆菌属微生物是被重组表达载体即包含编码SEQ ID NO.10所示的α亚基和SEQ ID NO.11所示的β亚基的多核苷酸的重组表达载体性质转化的大肠杆菌MC1061/pBC-CEP3-s28,寄存号KCTC13390BP。
15.一种制备β-内酰胺抗生素的方法，其特征为，在包括活化的侧链和β-内酰胺核的酶促耦合的β-内酰胺抗生素制备方法中，使用第1项至第9项中任意一项的突变青霉素G酰化酶。
16.根据权利请求第15项所述的方法，其特征为，所述β-内酰胺抗生素选自包括半合成青霉素和半合成头孢菌素组合的群。
17.根据权利请求第16项所述的方法，其特征为，所述半合成青霉素为阿莫西林、氨苄青霉素或匹氨青霉素。
18.根据权利请求第16项所述的方法，其特征为，所述半合成头孢菌素为头孢氨苄、头孢丙烯、头孢克洛、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢唑林、头孢尼西克、头孢噻吩或头孢甘酸。
19.一种包含权利请求第1项至第9项中任何一项所述突变青霉素G酰化酶的用于制备β-内酰胺抗生素的组合物。
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