CN105274082A - 一种合成用青霉素g酰化酶突变体及其在制备阿莫西林中的应用 - Google Patents

一种合成用青霉素g酰化酶突变体及其在制备阿莫西林中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105274082A
CN105274082A CN201510736957.7A CN201510736957A CN105274082A CN 105274082 A CN105274082 A CN 105274082A CN 201510736957 A CN201510736957 A CN 201510736957A CN 105274082 A CN105274082 A CN 105274082A
Authority
CN
China
Prior art keywords
penicillin
acylase
mutant
subunit
spga
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510736957.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105274082B (zh
Inventor
许岗
黄斌
郭宁
周晶辉
赵强
曾红宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hu'nan Fulaige Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Hu'nan Fulaige Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hu'nan Fulaige Biological Technology Co Ltd filed Critical Hu'nan Fulaige Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201510736957.7A priority Critical patent/CN105274082B/zh
Publication of CN105274082A publication Critical patent/CN105274082A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105274082B publication Critical patent/CN105274082B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01011—Penicillin amidase (3.5.1.11), i.e. penicillin-amidohydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/84—Penicillin amidase (3.5.1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P37/00—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin
    • C12P37/04—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin by acylation of the substituent in the 6 position

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种合成用青霉素G酰化酶突变体及其在制备阿莫西林中的应用。通过计算机辅助设计结合定点饱和突变技术的半理性设计及定向进化的酶工程改造技术对木糖氧化无色杆菌来源的青霉素G酰化酶进行突变，获得了水解活力更低，合成活力更好，合成水解比值(S/H)更高、耐酸性更强和稳定性更好的青霉素G酰化酶突变体，可以更有效，快速地催化合成阿莫西林。本发明获得的突变体SPGA-4固定化酶水解活力下降了8.7倍，合成活力提高了5.6倍，S/H值提高了8倍，在pH2.0条件下60min保持79％的活力，采用10℃或20℃固体法催化合成阿莫西林，其中底物6-APA和D-HPM直接固体投料无需溶解，反应pH无需控制，底物转化率在99％以上，可连续使用300批次以上，具有很好的操作稳定性。

Description

一种合成用青霉素G酰化酶突变体及其在制备阿莫西林中的应用
技术领域
本发明属于基因工程及酶工程领域，具体内容涉及一种合成用青霉素G酰化酶突变体以及该突变体固定化酶在制备阿莫西林生产中的应用。
背景技术
阿莫西林(Amoxicillin)，是一种最常用的青霉素类广谱β-内酰胺类抗生素。目前，工业上生产阿莫西林的方法有化学合成法和酶法两种方法，酶法具有成本较低、工艺简单、绿色无污染及反应条件温和等优点，因此，日益受到重视。
青霉素G酰化酶(penicillinGacylase，PGA，EC3.5.1.11)，在酸性条件下催化母核(6-APA或者7-ADCA)和侧链合成β-内酰胺类抗生素(如：阿莫西林、氨苄西林、头孢氨苄和头孢羟氨苄等)；在碱性条件下水解青霉素G制备6-APA或水解头孢菌素G制备7-ADCA。
野生型的青霉素G酰化酶的来源十分广泛，目前，已经筛选出众多产青霉素G酰化酶的微生物并将其编码基因克隆出来，如大肠埃希氏菌(EscherichiacoliATCC11105)、黄杆菌(Flavobacteriumsp.650)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)、木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)、无色杆菌属(Achromobactersp.CCM4824)、嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌(Kluyveracitrophila)、雷氏普罗威登斯菌(Providenciarettgeri)等。
目前，在酶法生产阿莫西林的过程中发现，野生型青霉素G酰化酶水解活性高、合成活性低、合成水解比(S/H)小、侧链消耗高、尤其是酶的耐酸性弱、稳定性差等缺点，导致酶法制备阿莫西林的成本较高。
随着基因工程和蛋白工程技术的发展，国内外科研工作者运用理性设计、半理性设计以及非理性设计等手段对青霉素G酰化酶的合成性能进行突变改造的报道有很多，如中国专利CN101177688中，黄鹤、张磐等运用同源建模及定点突变技术对巨大芽孢杆菌PGA的α144位点上的酪氨酸突变为精氨酸以及β24位点的缬氨酸突变为苯丙氨酸，获得突变体酶的合成性能、S/H比以及7-ADCA转化率都有很大的提高；中国专利CN103275960中，赖红星，肖拥军等对无色杆菌青霉素G酰化酶酶原进行人工设计并表达，获得了一种可以合成阿莫西林的PGA，其酶活力达到了28000U/L(组成型)或35000U/L(诱导型)；程天凡(浙江大学硕士学位论文，2005)对5种野生型PGA基因进行DNA家族混组同时结合抑菌圈筛选技术，获得了合成性能和S/H值都显著提高的PGA突变体；SenwenDeng,ErzhengSu等(Journalof Biotechnology，Volume199，10April2015，Pages62–68)利用蛋白改造技术对粪产碱杆菌PGA进行改造，将其β24位点上的苯丙氨酸突变为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或脯氨酸，其中Fβ24G合成氨苄西林的效果最好；国际专利申请WO2010/072765报道了对大肠杆菌ATCC11105来源的PGA进行改造，对其A3、A77、A90、A144、A192、B24、B109、B148、B313、B460和B488进行单点或组合突变，得到合成性能和S/H值大大提高的多个突变体；欧洲专利EP0961825报道了运用蛋白工程技术对大肠杆菌PGA的β24位点上的苯丙氨酸突变为丙氨酸或亮氨酸，其合成氨苄青霉素和头孢氨苄的能力大大提升。
虽然，国内外利用基因工程及蛋白工程技术对青霉素G酰化酶进行改造，使其合成性能及合成活力有了很大的提高，但是，突变酶的耐酸性还很弱、合成活性还偏低、及固定化酶的操作稳定性还需进一步提高。因此，开发一种耐酸性强、合成活性高及操作稳定性好的酶具有重要意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种耐酸性强、水解活性低、合成活性高、S/H值高及操作稳定性好青霉素G酰化酶突变体。其在木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上有如下六个位点中的一个点突变或多点组合突变：α亚基上第162位氨基酸由M突变为L、β亚基上第24位氨基酸由F突变为G、β亚基上第241位氨基酸由N突变为Q、β亚基上第71位氨基酸由F突变为Y、β亚基上第64位氨基酸由A突变为T、β亚基上第310位氨基酸由A突变为V；
所述的木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列由232个氨基酸组成的α亚基、54个氨基酸组成的中间连接肽和557个氨基酸组成的β亚基三部分构成，序列如SEQIDNO.1所示。
所述的青霉素G酰化酶突变体逐步优选的序列如下：
1、是在SEQIDNO.1的野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上有如下四个位点中的一个点突变或多点组合突变：α亚基上第162位氨基酸由M突变为L、β亚基上第24位氨基酸由F突变为G、β亚基上第241位氨基酸由N突变为Q、β亚基上第71位氨基酸由F突变为Y。
2、是在SEQIDNO.1的野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上对β亚基上第241位氨基酸由N突变为Q，即为SPGA-1突变体。
3、是在SPGA-1的氨基酸序列基础上有如下一个点突变或两个点突变或三个点组合突变：α亚基上第162位氨基酸由M突变为L、β亚基上第24位氨基酸由F突变为G、β亚基上第71位氨基酸由F突变为Y，其中优选在SPGA-1的氨基酸序列基础上进行三个点组合突变，得到野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列的四点组合突变体SPGA-2。
4、是在SPGA-2的氨基酸序列基础上对β亚基上第64位氨基酸由A突变为T，该突变体即为SPGA-3A突变体。或者是在SPGA-2的氨基酸序列基础上对β亚基上第310位氨基酸由A突变为V，该突变体即为SPGA-3B突变体。
5、最优选是在SPGA-2的氨基酸序列基础上对β亚基上第64位氨基酸由A突变为T，对β亚基上第310位氨基酸由A突变为V得到野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列的六点组合突变体，即为SPGA-4，序列如SEQIDNO:3所示。
本发明的第二个目的是提供上述的青霉素G酰化酶突变体的核苷酸序列，为以下的任一种：
1)上述青霉素G酰化酶突变体中的任一种的核苷酸序列；
2)在严格条件下与1)中任一项限定的核苷酸序列杂交且编码具有青霉素G酰化酶活性的蛋白质的核苷酸序列；
3)与1)或2)中任一项限定的基因序列具有90％以上的同源性且编码具有青霉素G酰化酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
本发明的突变型青霉素G酰化酶的制备方法，包括以下步骤：
a)将具有序列表中SEQIDNO.2的木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)野生型青霉素G酰化酶进行饱和突变、迭代饱和突变和随机突变等步骤得到编码上述任一种青霉素G酰化酶的突变体的基因序列；
b)将突变体基因序列***到质粒中得到表达载体；
c)将表达载体转化进入菌株中得到重组基因工程菌；
d)将重组基因工程菌用乳糖诱导进行发酵得到青霉素G酰化酶。
本发明涉及的突变型青霉素G酰化酶的制备方法，进一步地，还包括纯化步骤，纯化步骤为将产青霉素G酰化酶重组菌破碎、离心、收集后通过固定化金属螯合亲和层析法进行纯化得到青霉素G酰化酶纯酶。
进一步地，还包括酶的固定化步骤，固定化步骤为将上述纯化后的酶液，用磷酸盐缓冲液(pH8.0、0.1mol/L)溶解，然后加入50g经活化处理后的载体，于25℃、120rpm条件下低速搅拌固定化48h，将所得固定化酶用去离子水反复清洗3～5遍，真空滤干后即得固定化酶终产品。
进一步地，固定化载体为环氧基载体ECEP或氨基载体ECHA/S。
进一步地，质粒为pET28b(+)，菌株为E.coliBL21(DE3)。
本发明的第三个目的是提供上述的青霉素G酰化酶的突变体固定化酶在制备阿莫西林中的应用。
所述的应用具体为：以本发明的青霉素G酰化酶突变体固定化酶为催化剂，采用10℃或20℃固体法催化合成阿莫西林，其中底物6-APA和D-HPM直接固体投料无需溶解，过程反应控制中，反应pH无需控制，仅需控制反应温度10℃或20℃。
本发明优势：
本发明通过计算机辅助设计结合定点饱和突变技术的半理性设计及定向进化的酶工程改造技术对木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)来源的青霉素G酰化酶进行突变，获得了水解活力更低，合成活力更好，合成水解比值(S/H)更高、耐酸性更强和稳定性更好的青霉素G酰化酶突变体，可以更有效，快速地催化合成阿莫西林。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明实施例中的SPGA催化合成阿莫西林原理图；
图2是本发明实施例中的SPGA蛋白三维结构图；
图3是本发明实施例中的SPGA—Amoxicillin复合体结构图；
图4是本发明优选实施例的SDS-PAGE图谱；
图5是本发明实施例4中的SPGA催化合成阿莫西林的HPLC图，具体为突变体SPGA-4固定化酶催化6-APA和D-HPM合成阿莫西林的HPLC图。
具体实施方式
实施例
1、下述实施例中所使用的方法如无特殊说明均为常规方法，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译。第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。突变引物以及序列测序均为泰和永昌(长沙)生物技术有限公司完成。大肠杆菌宿主菌为E.coliBL21(DE3)购于Merck公司，大肠杆菌宿主菌还可以是E.coliBL21(DE3)plys，购于天根公司，原核表达载体pET28b(+)购于Merck公司。DNA内切酶DpnI购于Fermentas公司。全自动电位滴定仪购于瑞士万通公司，型号为8系列购于梅特勒-托利多公司，其余材料均为市售。同时，本发明中的氨基酸无特别说明外均用其缩写或代号标明(氨基酸中英文名称及其缩写和代号见表1)。
表1氨基酸中英文名称及其缩写和代号
中文名称 英文名称 缩写 代号 中文名称 英文名称 缩写 代号
丙氨酸 Alanine Ala A 脯氨酸 Proline Pro P
精氨酸 Arginine Arg R 亮氨酸 Leucine Leu L
天冬酰胺 Asparagine Asn N 异亮氨酸 Isoleucine Ile I
天冬氨酸 Aspartic acid Asp D 甘氨酸 Glycine Gly G
半胱氨酸 Cysteine Cys C 苯丙氨酸 Phenylalanine Phe F
谷氨酰胺 Glutamine Gln Q 蛋氨酸 Methionine Met M
谷氨酸 Glutamicacid Glu E 赖氨酸 Lysine Lys K
苏氨酸 Threonine Thr T 组氨酸 Histidine His H
色氨酸 Tryptophan Trp W 缬氨酸 Valine Val V
丝氨酸 Serine Ser S 酪氨酸 Tyrosine Tyr Y
为了得到水解活性低、合成活性高、耐酸性强及操作稳定性好的突变型青霉素G酰化酶，本发明采用的野生型青霉素G酰化酶是来源于木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)，根据蔡刚(博士论文，中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所)研究发现该野生型PGA具有很好的酸性耐受性(pH5.0，保持85％的活力)、具有很好的热稳定性(60℃保持稳定)和较好的合成性能，同时该野生型PGA编码基因序列已经被成功克隆到pET28b(+)原核表达载体中并转入E.coliBL21(DE3)形成重组表达基因工程菌(本发明人将其命名为SPGA-WT)，该重组基因工程菌由中科院上海生命科学院友情赠送。
木糖氧化无色杆菌野生型青霉素G酰化酶的氨基酸序列及核苷酸序列见SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。
木糖氧化无色杆菌野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列说明：
MAQPVAQAAGQESAAVAAPAQGAAGKVTIRRDAHGMPHVYADTVYGIFYGYGYAVAQDRLFQMEMARRSTQGRVAEVLGASMVAFDKSIRGNFSPERIQRQLAALPAADRQVLDGYAAGMNAWLARIRAQPGQLMPKEFNDLGFAPADWTAYDVAMIFIGTMANRFSDANSEIDNLALLTALKDRHGEAEAMRIFNQLRWLTDSRAPTTVPPQEGSYQPAVFQPEGAEQLAY SNMWIVGRDHAKDARSILLNGPQFGWWNPAYTYGIGLHGAGFDVVGNTPFAYPSILFGHNAHVAWGSTAGFGDDVDIYAEKLDPADRNRYFHDGQWKTLEKRTDLILVKDAAPVTLDVYRSVHGLIVKFDDAQHVAYAKARAWEGFELQSLMAWTRKTQSANWEQWKTQAARHALTINWYYADDRGNIGYAHTGFYPRRRPGHDPRLPVPGTGEMDWLGLLPFSTNPQVYNPGQGFIANWNNQPMRGYPSTDLFAIVWGQADRYAEIETRLKAMTANGGKVSPQQMWDLIRTTSYADVNRRHFLPFLQRAVQGLPADDPRVRLVAGLGGWDGMMTSEREPGYYDNAGPAVMDAWLRAMLKRTLADEMPADFFKWYSATGYPTPQAPATGSLNLTTGVKVLFNALAGPAAGVPQRYDFFNGARADDVILAALDDALAALRQAYGKDPAAWKIPAPPMVFAPKNFLGVPQADAKAVLSYPATQNRGTENNMTVFDGKSVRAVDVVAPGQSGFVAPDGTPSPHTRDQFDLYNSFGSKRVWFTADEVRRNATSEETLRYRR
所述基因编码的完整多肽链由α亚基(232个氨基酸)、中间连接肽(54个氨基酸——加粗下划线部分)和β亚基(557个氨基酸)三部分组成。中间连接肽在蛋白翻译后加工期间自动去除，得到由α亚基和β亚基组成的具有酶活性的青霉素G酰基转移酶。在α亚基中氨基酸被编号为A1—A232，在β亚基中氨基酸被编号为B1到B557。
2、青霉素G酰化酶酶活力及S/H值的检测
(1)青霉素G酰化酶水解活力测定方法(滴定法)
原理：青霉素G在青霉素G酰化酶作用下转化成6-APA和苯乙酸，用NaOH溶液中和苯乙酸，根据NaOH的消耗量计算青霉素G酰化酶活力。
具体操作方法：在1.5ml离心管中预先加入玻璃珠，当玻璃珠达到离心管刻度1.0ml处停止，精确量取0.5ml实施例1～4中的青霉素G酰化酶于离心管中，在振荡频率为1500/min的MS3振荡器上振荡10min后，将样品连同玻璃珠一起(固定化酶为0.05g)，加至已装有预热至25℃的30ml的1％青霉素G钾盐底物溶液的反应器中，调节水浴恒温25℃，用0.1mol/L的氢氧化钠滴定液调pH至8.00时开始计时，保持pH为8.00的条件搅拌反应5分钟，用全自动电位滴定仪检测氢氧化钠滴定液的消耗量。
酶活力单位(U)定义为：在25℃，pH8.0条件下，在1min内催化底物青霉素G生成1μmol苯乙酸时所需的酶量为1U。
(2)青霉素G酰化酶合成活力测定方法(HPLC法)
精确称取0.25g固定化酶或量取0.5ml的液态酶，加入含有1g6-APA和1.25gD-HPM的50ml磷酸盐缓冲液中(0.1mol/L、pH6.30)，调解pH到6.3并用上述磷酸盐缓冲液定容至100ml，于25℃下，用0.1mol/l氢氧化钠滴定液恒pH6.3反应20min，记录NaOH溶液消耗体积，反应完毕马上过滤，取0.5mL滤液用流动相定容至100mL进行HPLC检测。
柱子：DiamosilC185μm4.6×250mm
流动相：称取6.8g磷酸二氢钾，加956ml超纯水溶解后，用1mol/L的NaOH溶液液调pH至5.8，用孔径0.22μm的水系滤膜过滤后，加44ml色谱级乙腈，脱气20min左右。
检测：UV225nm
进样量：20μL
标准液：精密称取40mg阿莫西林标准品用流动相溶解并定容至200ml，取样进行HPLC检测。
酶活力计算
酶活力单位(U)定义为：在一定反应条件下，单位酶量每分钟生成1μmol的阿莫西林为1U。
W标：阿莫西林标准品称量，mg；
p标：阿莫西林标准品含量，％；
A样：样品HPLC检测中阿莫西林面积；
M：阿莫西林分子量；
T：反应时间，min；
V：液态酶取样量，ml；
W：固定化酶称样量，g；
m：固定化酶水分，％。
(3)合成水解比值(S/H值)的检测方法
试剂配置、反应条件及方法如上述青霉素G酰化酶合成活力测定方法中所示，反应完毕马上过滤，取0.5mL滤液用流动相定容至100mL进行HPLC检测，记录6-APA的摩尔消耗量和D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)摩尔生成量。
S/H值＝6-APA的消耗量(μmol)/D-HPG的生成量(μmol)
实施例1：低水解活力、高合成活力SPGA突变体的制备
由图1反应式可知，SPGA既能够催化母核6-氨基青霉烷酸(6-APA)与侧链D-对羟基苯甘氨酸甲酯(D-HPM)合成产物阿莫西林，又能水解产物生成母核与侧链，该反应的可逆性大小决定于该反应的平衡常数；同时，对羟基苯甘氨酸甲酯又能被SPGA水解成对羟基苯甘氨酸，因此，降低SPGA的水解活力，提高其合成活力具有重要的意义。
1-1利用计算机模拟的方法确定突变位点
1-1-1SPGA三维结构建模
利用已测定三维结构的大肠杆菌(E.coli)和粪产碱杆菌(A.faecalis)来源的青霉素G酰化酶为模板，通过SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org)在线同源建模软件对木糖氧化无色杆菌来源的青霉素G酰化酶进行建模、能量优化、打分和评估，建模完成后的木糖氧化无色杆菌来源的青霉素G酰化酶蛋白三维结构如图2所示。
1-1-2SPGA—Amoxicillin复合体结构的建立及突变位点的确定
利用分子对接软件Autodock4.0对SPGA蛋白三维结构模型和Amoxicillin进行分子对接，同时进行能量最小化得到SPGA—Amoxicillin复合体，优化后的复合体结构见图3。
通过图3的结果，我们选择底物结合口袋附近的A162点、B24点、B71点和B241点为定点饱和突变位点。
1-2SPGA突变体定点饱和突变文库的构建
为了降低野生型SPGA的水解活力，提高其合成阿莫西林的活力，本发明人以SPGA-WT为模板，选择其底物结合口袋附近的α亚基上第162位(A162点)、β亚基上第24位(B24点)、β亚基上第71位(B71点)和β亚基上第241位(B241点)为定点饱和突变位点，通过全质粒PCR的方法构建定点饱和突变文库。其中各定点饱和突变引物如下所示：
A162点饱和突变引物
P1：ATCGGCACCGCGAACCGCTTCTCTGACG(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T或C或G，K为G或T)
P2：GCGGTTCGCGGTGCCGATGAAGATCAT(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T或C或G，M为A或C)
B24点饱和突变引物
P3：GGCCCGCAGGGCTGGTGGAATCCGGCC(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T或C或G，K为G或T)
P4：CCACCAGCCCTGCGGGCCGTTCAGCAG(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T或C或G，M为A或C)
B71点饱和突变引物
P5：ACCGCGGGCGGCGACGATGTCGACATC(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T或C或G，K为G或T)
P6：ATCGTCGCCGCCCGCGGTCGAGCCCCA(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T或C或G，M为A或C)
B241点饱和突变引物
P7：GCCAACTGGAACCAGCCGATGCGCGGC(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T或C或G，K为G或T)
P8：CGGCTGGTTCCAGTTGGCGATGAACCC(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T或C或G，M为A或C)
具体定点饱和突变文库构建方法如下所示：
以SPGA-WT为模板，以上述P1/P2、P3/P4、P5/P6和P7/P8为突变引物，运用全质粒PCR技术对这4个点分别进行定点饱和突变，其中PCR所用的KOD-Plus-Neo高保真DNA聚合酶及相应PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs溶液均购买于TOYOBO公司，并参照其说明书进行PCR反应体系的配置及PCR反应条件的设定。
1-3SPGA突变体定点饱和突变文库的筛选
对上述各突变体文库分别挑选96个突变克隆子进行初步筛选，具体为：将所有突变子接种于含20mlLB培养基的150ml摇瓶中进行发酵及诱导培养，24小时后离心收集细胞、超声破碎、并离心收集上清得到粗酶液，通过滴定法测定其水解活力，通过HPLC法测定其合成活力；将水解活力低，合成活力高的突变子进行复筛选，具体为：将上述突变子接种于含100mlLB培养基的500ml摇瓶中(每个突变子接种3个摇瓶)进行发酵及诱导培养，并测定其水解活力及合成活力，将效果好的突变子进行测序备用，具体的各SPGA突变体活力及突变氨基酸如表2所示。
表2SPGA突变体活力及突变氨基酸
酶 水解活力(U/ml) 合成活力(U/ml)
SPGA-WT 26 4
Mα162L 22 7.3
Fβ24G 16 6
Fβ71Y 20 7
Nβ241Q 16 7.5
1-4低水解活力、高合成活力SPGA多点突变体的制备
由表2结果可知，Nβ241Q突变体相对于野生型及其他突变体具有更低的水解活力和更高的合成活力，将其命名为SPGA-1，为了得到效果更好的SPGA突变体，本发明人以SPGA-1为模板，分别将Mα162L、Fβ24G和Fβ71Y运用全质粒PCR技术进行定点饱和突变叠加进SPGA-1上，形成双点突变、三点突变及四点突变，通过测定各突变体的水解活力和合成活力，选取效果最佳的进行下步实验，具体各SPGA突变体活力及突变氨基酸如表3所示。
表3SPGA突变体活力及突变氨基酸
由表3可知，其中四点突变体(Mα162L、Fβ24G、Nβ241Q和Fβ71Y)效果最好，并将其命名为SPGA-2。
实施例2：耐酸性SPGA突变体的制备
由于酶法合成阿莫西林是在酸性pH条件下进行的，同时由于工业生产过程中，青霉素G酰化酶需要连续使用5到10天，这就要求该酶在酸性pH条件下保持稳定且不易失活，而野生型青霉素G酰化酶的耐酸性较差，因此急需开发一种耐受酸性pH的新型PGA。为了解决工业生产中的这一难题，本发明人设定新的开发路线，对上述效果最好的SPGA-2突变体进行更进一步改造。
2-1耐酸性SPGA随机突变体文库的构建
为了提高SPGA的耐酸性，本发明人以SPGA-2模板，其中引物为T7通用引物(SEQIDNO：13和14)，通过易错PCR的方法构建一个随机突变体文库，并通过调整易错PCR反应体系中Mg2+和Mn2+浓度以及dCTP和dTTP寡核苷酸浓度，使该突变体文库的碱基错配率仅为千分之二，即保证一个突变体仅有1到2个氨基酸发生突变。构建突变体文库的具体过程如下。
易错PCR反应体系：
易错PCR反应条件是：先95℃预变性5min；然后94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，共25个循环；最后72℃延伸10min。
将上述得到的易错PCR产物进行电泳并切胶回收纯化，将纯化后的产物与原核表达载体pET28b(+)分别进行NdeI和XhoI双酶切，酶切3小时分别进行切胶回收，将回收产物按照产物：载体为3：1的摩尔比例进行混合，加入T4DNAligase于16℃过夜连接。第二天，通过化学转化的方法转入大肠杆菌BL21(DE3)中构建工程菌，即可得到一个库容量大的随机突变体文库。
2-2耐酸性SPGA突变体文库的高通量筛选及突变体制备
用高温灭菌后的牙签，小心挑取突变体文库中的单菌落接种于装有LB培养基的96孔细胞培养板中，其中LB培养基体积为200μL/孔且含有50μg/ml的卡那霉素，于37℃，250rmp的恒温摇床中培养8个小时，1％的乳糖，25℃，250rmp的恒温摇床中诱导培养8小时。诱导完毕后，将96孔细胞培养板放入-86℃的超低温冰箱中冻融2个小时，取出放置于室温中半个小时，后置于96孔细胞培养板离心机中于4,000rmp，4℃离心20分钟。在上述酶液中，按1：2体积比加入0.05mol/L，pH3.0的磷酸缓冲液，于25℃温育1个小时。
根据中国专利申请CN103667418A中的高通量筛选方法，从上述突变体文库中筛选了约20000个克隆，得到10个颜色变化明显且数值比SPGA-2高的突变子。接着对这10个突变子进行复筛，具体过程为：将这10个突变子接种于含100mlLB培养基的500ml摇瓶中进行发酵及诱导，并通过滴定法和HPLC法测定其水解和合成活力，得到2个比对照效果好的突变子，分别命名为PGA-3A和PGA-3B，经过测序结果显示PGA-3A在β亚基第64位点氨基酸发生了改变，由A突变成了T，而PGA-3B在β亚基第310位点氨基酸发生了改变，由A突变成了V。
为了更进一步获得耐酸性pH更好的SPGA突变，本发明人将上述Aβ64T和Aβ310V突变体进行叠加，并测定其水解活力和合成活力，将该六点突变体(Mα162L、Fβ24G、Nβ241Q、Fβ71Y、Aβ64T和Aβ310V)命名为SPGA-4。具体的各耐酸性SPGA氨基酸突变点及突变体活力如表4所示。
表4耐酸性SPGA氨基酸突变点及突变体活力
实施例3重组SPGA蛋白的分离纯化及固定化
3-1重组SPGA蛋白的分离纯化
由于在表达载体构建过程中引入了原核表达载体pET28b(+)中的N端和C端的2个His-tag，因此，本发明人利用该组氨酸标签进行固定化金属螯合亲和层析(IMAC)来纯化重组蛋白，具体方法如下。
取100mL过夜诱导后的SPGA发酵液，离心后弃上清收集菌体(10000rpm、4℃、10min)，用磷酸盐缓冲液(pH8.0、0.1mol/L)反复洗涤菌体两次，离心收集菌体，浓缩5倍重悬于20ml磷酸盐缓冲液(pH8.0、0.1mol/L)中。将上述处理后的菌液置于冰水中进行超声破碎直至澄清，其中的超声破碎条件为：工作2s，间隔5s。将上述破碎后的裂解液置于低温高速离心机中离心(12,000rpm、4℃、20min)，收集上清，得到重组SPGA蛋白，将该粗重组蛋白进样到已活化并结合Ni+的IDA树脂上，用梯度浓度的咪唑进行梯度洗脱，利用蛋白层析***(Bio-Rad)进行实时监控，当计算机中出现稳定的蛋白峰时，开始收集直到该峰消失为止。
重组酶蛋白经过分离纯化后密封于无菌袋中放置于4℃冰箱以备后续实验，同时对该纯化后酶蛋白用SDS-PAGE蛋白电泳进行纯度分析，结果见图4。由图可知，该重组SPGA由α、β两个亚基组成，大小分别约为28kD和63kD。
3-2重组SPGA蛋白的固定化
A、固定化载体的活化
准确量取60％的戊二醛30ml、磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)4.76g溶解于600ml去离子水中，最后用去离子水定容至1000ml，同时用磷酸溶液调节其PH为8.0，灭菌后备用；将环氧基载体ECEP或氨基载体ECHA/S(意大利ResindionS.r.l公司)250g投入到上述溶液中，并于25℃低速搅拌活化2h，过滤收集载体，并用无菌去离子水反复冲洗2～3次后真空滤干备用。
B、酶的固定化
取一定量上述纯化后的酶液，用磷酸盐缓冲液(pH8.0、0.1mol/L)溶解，然后加入50g经活化处理后的载体，于25℃、120rpm条件下低速搅拌固定化48h，将所得固定化酶用去离子水反复清洗3～5遍，真空滤干后即得固定化酶终产品。精确称取1g上述固定化酶(以SPGA-WT为例)进行水解活力及合成活性测定，以ECEP和ECHA/S为载体的固定化酶水解酶活分别为262U/g和239U/g，合成活性分别为45U/g和34U/g，环氧基载体ECEP固定化酶活力明显高于氨基载体ECHA/S固定化酶，因此选择环氧基载体ECEP作为SPGA的固定化载体。
实施例4突变体SPGA-4固定化酶的性质及其制备阿莫西林的应用
4-1突变体SPGA-4固定化酶的性质
按照实施例4的方法对上述野生型及突变型SPGA进行蛋白纯化、固定化，同时，分别测定固定化酶的水解和合成活力及S/H值，突变体SPGA-4固定化酶与其他突变子固定化酶的性质比较见表5。
表5野生型及突变型SPGA固定化酶性质比较
酶 水解活力(U/g) 合成活力(U/g) S/H值
SPGA-WT 262 45 2.1
SPGA-1 169 73 4.3
SPGA-2 101 142 10.8
SPGA-3A 79 153 13.4
SPGA-3B 68 169 14.7
SPGA-4 30 212 16.8
由表5可知，突变体SPGA-4固定化酶相对于野生型SPGA固定化酶，其水解活力下降了8.7倍，合成活力提高了5.6倍，S/H值提高了8倍，说明该突变体固定化酶相对于野生型SPGA固定化酶具有更好的阿莫西林合成性能，不易水解侧链及产物阿莫西林。
4-2突变体SPGA-4固定化酶耐酸性实验
将上述野生型及突变型SPGA固定化酶，以相同酶量(200U合成活力)分别置于pH2.0、pH3.0、pH4.0、pH5.0、pH6.0和pH7.0的缓冲液中，于25℃温育1个小时，后取出固定化酶用无菌去离子水反复冲洗4～5遍，以确保固定化酶中不存在缓冲液残留，将处理后的固定化酶用HPLC法测定其残余活力，具体结果如表6所示。
表6野生型及突变型SPGA固定化酶酸性pH耐受性比较
根据表6结果可知，SPGA-4固定化酶在pH2.0条件下还保持约80％的活力，在pH3.0条件下保持86％的活力，在pH4.0—7.0条件下活性基本没有变化，表明该酶在酸性条件下保持稳定。
4-3突变体SPGA-4固定化酶制备阿莫西林的应用
(1)10℃固体法
将210ml事先预热至10℃的纯水倒入装有2000U突变体SPGA-4固定化酶(以野生型SPGA固定化酶为对照)的烧杯中，直接加入精确称量的21.0g6-APA和18.3gD-HPM固体(摩尔比为1：1.04)至反应体系，开启搅拌，维持在10℃反应；转化过程中，控制反应温度10℃，pH不需进行调控。
终点判断：当pH值达到最高点后下降0.02时，即可终止反应。
(2)20℃固体法
将230ml事先预热至20℃的纯水倒入装有1800U突变体SPGA-4固定化酶(以野生型SPGA固定化酶为对照)的烧杯中，加入精确称量的20.0g6-APA和17.09gD-HPM固体无需溶解(摩尔比为1：1.02)至反应体系，开启搅拌，维持在20℃反应；转化过程中，控制反应温度20℃，pH不需进行调控。
终点判断：当pH值达到最高点后下降0.02时，即可终止反应。
(3)阿莫西林结晶反应
反应终止后，洗涤滤除固定化酶并用反应母液反复洗涤过滤收集到全部的阿莫西林粗粉，用6mol/L盐酸调pH快速溶解阿莫西林，过滤除去不溶性杂质，养晶约5分钟，缓慢加入6mol/L氨水调pH值到5.0±0.1，降温至1～4℃，养晶约20min，过滤收集结晶粉。用真空抽干后置于干燥器中过夜干燥，称重装袋后，检测阿莫西林水分、含量以及6-APA和D-HPM转化率，使用突变体SPGA-4固定化酶制备阿莫西林合成的HPLC图谱参见图5，具体实验对比数据见表7。
表7野生型SPGA与突变型SPGA-4固定化酶转化应用实验对比
酶 反应温度(℃) 反应时间(min) 转化率
SPGA-WT 10 120 87.3％
SPGA-4 10 80 99.2％
SPGA-WT 20 105 89.2％
SPGA-4 20 60 99.3％
由表7可知，突变体SPGA-4固定化酶反应的6-APA和D-HPM的转化率均可达99％以上，同样反应条件下以野生型SPGA固定化酶催化合成阿莫西林的反应，其6-APA和D-HPM的转化率达不到90％。
4-4突变体SPGA-4固定化酶操作稳定性批次实验
为了更好地反映该突变体的稳定性，本发明人在实验过程中将其反应条件设定如下：SPGA-4固定化酶(212U/g)总投量为8000U，底物6-APA和D-HPM固体摩尔比为1：1.02，反应pH不需进行调控，反应温度为20℃，反应体积为1000ml，具体实验结果如表8所示。
表8突变体SPGA-4固定化酶操作稳定性批次实验
通过SPGA-4固定化酶操作稳定性批次实验可知，本发明制备的SPGA-4固定化酶经过连续300批次转化实验，其反应时间没有明显延长，固定化酶活力没有明显下降，显示出本发明制备的突变体SPGA-4固定化酶具有良好的操作稳定性。
本发明的各突变体SPGA除了可应用于合成阿莫西林外，还可以应用于制备氨苄西林、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢克洛和头孢拉丁等半合成β-内酰胺类抗生素；同时本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可以在权利要求书所概述的范围内根据本发明的精神做各种改变。这些改变均在本发明的范围之内。

Claims (10)

1.合成用青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，其在木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上有如下六个位点中的一个点突变或多点组合突变：α亚基上第162位氨基酸由M突变为L、β亚基上第24位氨基酸由F突变为G、β亚基上第241位氨基酸由N突变为Q、β亚基上第71位氨基酸由F突变为Y、β亚基上第64位氨基酸由A突变为T、β亚基上第310位氨基酸由A突变为V；
所述的木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列由232个氨基酸组成的α亚基、54个氨基酸组成的中间连接肽和557个氨基酸组成的β亚基三部分构成，序列如SEQIDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的合成用青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，
所述的合成用青霉素G酰化酶突变体是在SEQIDNO.1的野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上有如下四个位点中的一个点突变或多点组合突变：α亚基上第162位氨基酸由M突变为L、β亚基上第24位氨基酸由F突变为G、β亚基上第241位氨基酸由N突变为Q、β亚基上第71位氨基酸由F突变为Y。
3.根据权利要求2所述的合成用青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述的合成用青霉素G酰化酶突变体是在SEQIDNO.1的野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上对β亚基上第241位氨基酸由N突变为Q，即为SPGA-1突变体。
4.根据权利要求3所述的合成用青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述的合成用青霉素G酰化酶突变体是在SPGA-1的氨基酸序列基础上有如下一个点突变或两个点突变或三个点组合突变：α亚基上第162位氨基酸由M突变为L、β亚基上第24位氨基酸由F突变为G、β亚基上第71位氨基酸由F突变为Y，其中优选在SPGA-1的氨基酸序列基础上进行三个点组合突变，得到野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列的四点组合突变体SPGA-2。
5.根据权利要求4所述的合成用青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，
所述的合成用青霉素G酰化酶突变体是在SPGA-2的氨基酸序列基础上对β亚基上第64位氨基酸由A突变为T，该突变体即为SPGA-3A突变体。
6.根据权利要求4所述的合成用青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，
所述的合成用青霉素G酰化酶突变体是在SPGA-2的氨基酸序列基础上对β亚基上第310位氨基酸由A突变为V，该突变体即为SPGA-3B突变体。
7.根据权利要求4所述的合成用青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，
所述的合成用青霉素G酰化酶突变体是在SPGA-2的氨基酸序列基础上对β亚基上第64位氨基酸由A突变为T，对β亚基上第310位氨基酸由A突变为V得到野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列的六点组合突变体，即为SPGA-4，序列如SEQIDNO:3所示。
8.合成用青霉素G酰化酶突变体的核苷酸序列，其特征在于，为以下的任一种：
1)权利要求1-7任一项所述的合成用青霉素G酰化酶突变体中的任一种的核苷酸序列；
2)在严格条件下与1)中任一项限定的核苷酸序列杂交且编码具有青霉素G酰化酶活性的蛋白质的核苷酸序列；
3)与1)或2)中任一项限定的基因序列具有90％以上的同源性且编码具有青霉素G酰化酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
9.权利要求1-7任一项所述的合成用青霉素G酰化酶的突变体用于制备阿莫西林。
10.根据权利要求9所述的合成用青霉素G酰化酶的突变体用于制备阿莫西林，其特征在于，具体是以合成用青霉素G酰化酶突变体固定化酶为催化剂，采用10℃或20℃固体法催化合成阿莫西林，其中底物6-APA和D-HPM直接固体投料，反应过程中pH无需控制，仅需控制反应温度为10℃或20℃。
CN201510736957.7A 2015-11-03 2015-11-03 一种合成用青霉素g酰化酶突变体及其在制备阿莫西林中的应用 Active CN105274082B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510736957.7A CN105274082B (zh) 2015-11-03 2015-11-03 一种合成用青霉素g酰化酶突变体及其在制备阿莫西林中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510736957.7A CN105274082B (zh) 2015-11-03 2015-11-03 一种合成用青霉素g酰化酶突变体及其在制备阿莫西林中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105274082A true CN105274082A (zh) 2016-01-27
CN105274082B CN105274082B (zh) 2018-08-31

Family

ID=55143916

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510736957.7A Active CN105274082B (zh) 2015-11-03 2015-11-03 一种合成用青霉素g酰化酶突变体及其在制备阿莫西林中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105274082B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105567777A (zh) * 2016-03-07 2016-05-11 内蒙古常盛制药有限公司 一种循环利用阿莫西林母液的方法
WO2017143944A1 (zh) * 2016-02-23 2017-08-31 上海星维生物技术有限公司 一种青霉素g酰化酶突变体
CN109161540A (zh) * 2018-09-28 2019-01-08 湖南福来格生物技术有限公司 一种青霉素v酰化酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用
CN109971742A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 艾美科健株式会社 来源于无色杆菌属ccm 4824的青霉素g酰化酶突变体及其应用
CN111500564A (zh) * 2020-06-02 2020-08-07 南京工业大学 青霉素g酰化酶突变体及其在酶法合成头孢孟多中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103184182A (zh) * 2013-04-11 2013-07-03 南京工业大学 青霉素酰化酶、其高产菌株及应用
CN104789510A (zh) * 2015-05-06 2015-07-22 南京工业大学 一种青霉素酰化酶、编码基因、产生菌株及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103184182A (zh) * 2013-04-11 2013-07-03 南京工业大学 青霉素酰化酶、其高产菌株及应用
CN104789510A (zh) * 2015-05-06 2015-07-22 南京工业大学 一种青霉素酰化酶、编码基因、产生菌株及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAREN M. POLIZZI ET AL.: "Structure-guided consensus approach to create a more thermostable penicillin G acylase", 《BIOTECHNOL.J.》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017143944A1 (zh) * 2016-02-23 2017-08-31 上海星维生物技术有限公司 一种青霉素g酰化酶突变体
CN105567777A (zh) * 2016-03-07 2016-05-11 内蒙古常盛制药有限公司 一种循环利用阿莫西林母液的方法
CN109971742A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 艾美科健株式会社 来源于无色杆菌属ccm 4824的青霉素g酰化酶突变体及其应用
CN109971743A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 艾美科健株式会社 来源于无色杆菌属ccm4824的青霉素g酰化酶突变体及其应用
CN109971743B (zh) * 2017-12-28 2022-09-06 艾美科健株式会社 来源于无色杆菌属ccm 4824的青霉素g酰化酶突变体及其应用
CN109161540A (zh) * 2018-09-28 2019-01-08 湖南福来格生物技术有限公司 一种青霉素v酰化酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用
CN109161540B (zh) * 2018-09-28 2021-03-19 湖南福来格生物技术有限公司 一种青霉素v酰化酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用
CN111500564A (zh) * 2020-06-02 2020-08-07 南京工业大学 青霉素g酰化酶突变体及其在酶法合成头孢孟多中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105274082B (zh) 2018-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11535839B2 (en) Encoding genes of nitrilase mutants and application thereof
CN105274082A (zh) 一种合成用青霉素g酰化酶突变体及其在制备阿莫西林中的应用
CN111172140B (zh) 一种腈水解酶突变体及其在制备抗癫痫药物中间体中的应用
CN109750009A (zh) 一种草铵膦脱氢酶突变体及其应用
CN109593750A (zh) 一种腈水合酶突变体、含该突变体的基因工程菌及其应用
CN104152505A (zh) 一种利用重组菌株转化制备4-羟基-l-异亮氨酸的方法
CN104120120B (zh) 固定化重组青霉素g酰化酶及其应用
CN110724675B (zh) 转氨酶催化剂和酶法合成(r)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的方法
CN105624128B (zh) 一种固定化单胺氧化酶及其在合成手性氮杂双环化合物中的应用
CN105176955A (zh) 来源于高山南芥的腈水解酶、基因、载体、工程菌及其应用
CN111235126B (zh) 一种s-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及利用其的制备方法
CN105087533B (zh) 一种青霉素g酰化酶的突变体及其制备方法和应用
CN113462677B (zh) 一种α亚基突变的腈水合酶突变体及其应用
CN102978192B (zh) 突变型头孢菌素c酰化酶及其制备方法和转化7-aca的方法
CN112358530B (zh) 多肽标签、高度可溶性的重组腈水解酶及其在医药化学品合成中的应用
CN112852789B (zh) 腈水解酶突变体及其应用
CN109486780A (zh) 一种催化效率提高的ω-转氨酶突变体
CN109161540B (zh) 一种青霉素v酰化酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用
CN110923223B (zh) 一种新型腈水解酶及其应用
CN110804602B (zh) 一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用
CN103695447B (zh) 一种新型内酰胺类抗生素合成酶及其编码基因和应用
CN111057698B (zh) L-***糖异构酶、突变体及其应用
CN110904087B (zh) L-***糖差向异构酶突变体及其应用
CN111500564B (zh) 青霉素g酰化酶突变体及其在酶法合成头孢孟多中的应用
CN110468115B (zh) 一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶基因及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: A synthetic penicillin G acylase mutant and its application in the preparation of amoxicillin

Granted publication date: 20180831

Pledgee: Changsha Bank city branch of Limited by Share Ltd.

Pledgor: HUNAN FLAG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Registration number: Y2024980012003

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right