CN101802212A - 从大肠杆菌BL21CCM7394中无色菌CCM4824制备固定重组青霉素酰化酶催化剂的方法及其在合成β-内酰胺抗生素中的应用 - Google Patents

从大肠杆菌BL21CCM7394中无色菌CCM4824制备固定重组青霉素酰化酶催化剂的方法及其在合成β-内酰胺抗生素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种从大肠杆菌BL21CCM7394重组菌株表达的无色菌CCM4824所得的独立青霉素酰化酶(PA)，关系到pKXIPl的重组质体，以及青霉素酰化酶作为生物催化剂用于工业合成抗生素的过程。更具体的，本发明公开一种用反应混合物合成半合成β-内酰胺抗生素的方法，反应混合物由活性酰基原料(用于阿莫西林和头孢羟氨苄的D-对羟基苯甘酸甲酯或氨基化合物；用于氨比西林的头孢氨苄的D-苯甘氨酸甲酯或氨基化合物)和亲核试剂(6-APA或7-ADCD)组成，由从重组大肠杆菌BL21CCM7394所得的青霉素酰化酶作为生物催化剂催化。

Description

从大肠杆菌BL21CCM7394中无色菌CCM4824制备固定重组青霉素酰化酶催化剂的方法及其在合成β-内酰胺抗生素中的应用
【技术领域】
本发明涉及从重组大肠杆菌BL21CCM7394中无色菌CCM4824制备的青霉素酰化酶，关系到重组质粒pKXIP1和青霉素酰化酶的制备在工业合成抗生素中的生物催化作用。尤其涉及从反应混合物合成的半合成β-内酰胺抗生素，这种反应混合物由被青霉素酰化酶催化所得的头孢羟氨苄(制备阿莫西林和头孢羟氨苄的羟苯基甲基酯或氨基化合物；制备氨比西林和头孢氨苄的苯基甘氨酸或氨基化合物)和亲核试剂(6-APA或7-ADCA)组成，青霉素酰化酶是以重组大肠杆菌BL21CCM7394作为生物催化剂所得。
【背景技术】
几十年来，青霉素G酰化酶已投入商业使用，以水解青霉素G酰基小组及其六种不同成分的乙酰环氧基头孢菌素G，分别用于生产6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基脱乙氧基头孢菌素，是制备β-内酰胺抗生素的关键障碍。
由大肠杆菌ATCC11105合成青霉素酰化酶的条件是适度的，从而导致产品的转换速率不完全。据报道，类似的青霉素酰化酶是从栖冷克沃尔菌和雷氏普落威登斯菌而得，但是，这些没的合成潜力没有很好的记载下来。最近几年，用动力学性质改变的突变异种，特别是用改进的S/H比率已经由站点控制的突变形成构造形成。然而，这些变种大肠杆菌青霉素酰化酶并没有起到预期的效果。有生物体被发现可以生产青霉素酰化酶，例如醋酸杆菌、气单胞菌、产碱杆菌、白色不显枝菌、强碱杆菌、黄单胞菌、雷氏普罗威登斯菌、带黄色素的单细胞、巨大芽孢杆菌、大肠杆菌，其中大肠杆菌是最常用的。
正如大多数情况大肠杆菌的表达***，蛋白质被输送到周质空间经过翻译后修饰成为一个全功能的酶。这使利用选择性方法破坏细胞成为可能，这样就没有太大的能量消耗，各自的酶可以从细胞中高纯度释放。破坏细胞可以采取传统的机械方法，如高压均质或在水磨机中瓦解，其中同质化经常是在工业水平。另外，有机溶剂和用于破坏细胞和提取产品。
目前有报道称使用溶剂组合以提升细胞裂解酶的产量和纯度。德莱昂等在(2003年)，报告了使用各种有机溶剂从重组大肠杆菌中提取青霉素G酰化酶(德莱昂、加西亚、丹麦马巴尔巴德保险业监督罗莎、比利亚塞尼奥尔、埃斯塔达、洛佩兹-维利，生物化学过程，39：301-305，2003)。然而，化学裂解方法必须根据定制开发的微生物和酶对有机溶剂的敏感性。
青霉素酰化酶可用于合成β-内酰胺抗生素时的热力学以及动力学控制。青霉素酰化酶通过带有各自β-内酰胺核子的活性酰基原料的浓缩用于合成β-内酰胺抗生素的动力学控制。这些酶催化过程，虽然表面上与传统化学合成具有竞争力，事实上，它所面对的一大难题决定了抗生素的总收率，即活动酰基原料的水解以及抗生素的形成。(MA.Wegman，U.Heinemann，A.Stloz，F.Van Rantwijk and RΛ.Sheldon，有机过程杂志，4：318-322，2000)β-内酰胺抗生素酶的合成可直接从酰基原料，或从酯或酰胺衍生物开始。(微生物酶技术，18：4-16，1986)。
在第一种控制合成热力学中，主要的问题是改变产品的反应平衡，虽然目前这可能不会成功，这将是一个理想和上流的解决方法。
在第二种控制合成动力学中，一个激活的先导酰基原料，无论是与β-内酰胺核子反应的D-酰胺形式抗生素酰基侧链的酯形式或氨基化合物形式，释放除了酒精或加铵之外的抗生素，未反应的反应物和抗生素。通常动力学控制方法，酰基原料的摩尔过剩以推动反应向合成方向进行，使得该进程没有吸引力。(Luciana R.B.Goncalves，Ruy Sousa，Jr.Roberto，Fernandez-Lafuente，Jose M.Gui san，Raquel L.C.Giordano，Roberto C.Giordano，生物技术与生物工程，8：6，622-631，2002)。
这种酶动力学控制方法的主要问题是产量，可量测性和经济学过程导致酰基原料的过度使用。许多研究的目的在于改进这种情况，其中包括流程优化，此外还有助溶剂或高浓度培养基的使用或改善固定化的生物催化剂活性。酶的固定化在酶稳定性和选择性中起着至关重要的作用，它决定着酶发展的未来。酶进程总体上与发展已久的化学过程竞争，如果经济学进程中没有吸引人的地方将最终被淘汰。总体上说，工业酶固定化已相当成功，因为青霉素G酰化酶已成功应用到制药工业中数年。
通常的共价固定型，酶的靶象必须充分净化，从而增加了时间和成本。另外，载体材料的具体特征需要加以研究，来预测是否适合特定的蛋白，因为这些载体倾向于改变蛋白质的二级、三级或四级结构，阻碍其后的具体用途。
这也导致探测其他非共价固定型的可能。包埋和封装已成为非共价固定型的首选方法。
包埋特别有利，因为它需要蛋白质较低的纯化形式，甚至整个细胞都被各种载体适当的包埋。在酶中提取的蛋白质可通过加成聚合盐、有机或非离子型聚合物，包括蛋白质形成超分子形式和使他们在水溶液中不溶解和同样适当的给交联酶聚合体交联。(A.M.van derWeilen，M.Ottens和A.J.J.Straathof et al，Straathof，A.J.J.Panke，S.and Schmid，A.Current Opin Biotechnol，13：548-556，2002和Cao，L，Van Langen，L，M，VanRantwijk F et al，酶微生物技术，11：665-670，2001)。基于上述的启示和从经济角度来看，我们不得不选择包埋作为从无色菌CCM4824制备固定重组青霉素酰化酶的方法。
包埋作为一种发明的固定方法，既没有用于整个细胞也没有用于蛋白质的纯化，这对表达活性的产量或酶纯化的成本造成妥协。发明中使用的酶是通过沉淀饱和溶液中的蛋白质部分纯化的，这种饱和溶液时通过缓慢添加像固体硫酸铵沉淀而成的。(蛋白质纯化及工艺工程，主编罗杰摹哈里森，马塞尔德克公司出版，141-183，1993)
酶固定化的对象包括较高的催化活性、较高的机械和运行稳定性、循环使用和较高的S/H比，使这种酶被用于合成反应和制造成本。
除了上述方法，一种提高质量的更加基本的方法是使用新的生物催化剂改进动力学性能，既然已经令人信服的证明动力学控制的反应对酶的动力学参数有很大的影响。
因此，目前的研究趋势导致大量用于化学/制药工业中的新生物催化剂/新的酶种类的发展。这些新的酶(生物催化剂)可通过传统微生物产品从大自然中隔离和从环境基因库重组DNA技术获得，或者通过酶的直接进化产生一个具有改进合成潜能的青霉素酰化酶家族的方法获得。
因此，具有显著合成能力的青霉素酰化酶的实用性对β-内酰胺合成酶的发展进程是一个至关重要的因素。其中一个主要动力学参数是抗生素的合成与活性酰基原料的水解比率(缩写为S/H)。这个比率是生物催化的关键性能参数。
谢尔登的研究等(Sheldon，Van Rantwijk，Van Langen，Wegman，CAO和Janssen，合成内酰胺类抗生素，由Alle Bruggink主编，Kluwer Academic出版：126-129，2003)发现在水解过程中有一个很大的变化，并且合成活性在大肠杆菌所得不同制剂青霉素酰化酶之间有很大的变化。
  酶   载体   水解活性(U/g)
  Poly-XDA-GA-PA   Poly-XDA-GA   200
  Assemblase 7500   明胶壳聚糖   260
  PGA 450   特殊的聚合物   210
  PcA   Eupergit C   310
在上述例子中，Poly-XDA-GA-PA从1，4-二(氨基甲基)苯(对二甲苯二胺，由戊二醛活化)所得微球，被证明在β-内酰胺的合成中是一种有效的催化剂。在氨比西林的合成中，用此种酶制剂的S/H比在转化85％时是2.0，它与游离酶的效果相当，比Assemblase(S/H比在转化80％时是1.22)的效果好。在合成阿莫西林的情况时，此种酶的效果同样良好，在转化75％时S/H比为4.5略高于其他自由青霉素酰化酶。从无色菌CCM4824(原始***甲单胞菌CCM4824；Plhackova等.(K.Plhackova等.应用微生物技术，32：507-516，2001)，Skrob等，酶微生物技术，32：738-744，2003)所得的青霉素酰化酶(PA；E.G.3.5.1.11，青霉素酰化水解酶)当与从外源所得的青霉素酰化酶相比时显示出更好的性能，因而被用于合成氨比西林、阿莫西林、头孢氨苄和头孢羟氨苄。
Kysklik等(捷克专利申请PV2007-82)对上述从质粒载体上重组大肠杆菌BL21(PKXIPI)CCM7394中无色菌CCM4824所得青霉素酰化酶的克隆和表达所作的进一步工作。这种基因的克隆和表达方法以及它的发酵条件在捷克专利申请(PV-2007-82)中有描述，在印度申请号为PCT/TN07/00193的PCT申请中也有描述。本发明涉及上述青霉素酰化酶在工业合成β-内酰胺抗生素中的应用申请。
因此本发明主要涉及从大肠杆菌BL21(PKXIPI)中提取的青霉素酰化酶以及随后在合成β-内酰胺抗生素中所用青霉素酰化酶、新的生物催化剂，以改进最终产品的质量。
【发明内容】
发明目的：
本发明的主要目的是提供从与重组质粒PKXIPI(CCM 7394)有关的重组菌株大肠杆菌BL21中表达的无色菌CCM4824所得的青霉素酰化酶，作为一种生物催化剂。
本发明的另一个目的是提供一种使用固定化酶工业合成β-内酰胺类抗生素的方法。发明摘要：
本发明显示，从无色菌CCM4824中所得青霉素酰化酶(PA)与重组菌株大肠杆菌BL21CCM7394关联的重组质粒PKXIPI和青霉素酰化酶在作为生物催化剂在工业合成抗生素中的应用是相互独立的。
因此，一种利用青霉素酰化酶作为生物催化剂合成β-内酰胺抗生素的方法，其中所述的青霉素酰化酶生物催化剂是来自于在大肠杆菌BL21CCM7394中表达的无色菌CCM4824，其过程包括：
a、利用溶剂和化学清洁剂或金属螯合物来增加细胞通的透性，从而以化学方法提取青霉素酰化酶；
b、用分级沉淀和层析对可溶性酶进行纯化；
c、在-2到2℃的温度下，利用比率范围为15∶1到20∶1的丙烯酰胺和N，N’-二甲基乙二胺对上述酶进行固定化；
d、通过与戊二醛交联稳定固定化酶，以获得粒子尺寸在100到300微米的粗粒子，优选的粒子尺寸为150到250微米之间；
e、利用上述固定青霉素酰化酶催化酰化带有活性酰基原料的亲核试剂，以获得具有较高产量和纯度的β-内酰胺抗生素。
上述萃取所用溶剂选自甲苯、乙酸乙酯、氯仿和丁酯，化学清洁剂或金属螯合剂选自EDTA、溴棕三甲胺、尿素和十二烷基硫酸钠。化学提取过程是利用1到3％w/v的氯仿和0.1到0.2％w/v的十二烷基硫酸盐的混合物。
提取时的温度为15到35℃，优选是在28到30℃的温度下提取6到12小时，PH值保持在5.5到9.0之间，优选的为6.5到7.5之间，以获得可溶解的酶。
酶的纯化是使用硫酸铵处理或使用离子交换层析。
酶的固定化包括聚合形式的酶，酶蛋白的聚合是使用相当于饱和度为30到70％的硫酸铵完成的。这种聚合是在使用比例范围为15∶1到20∶1的丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺实现的。酶的固定化进程是在硫酸钠或钾盐缓冲溶液中进行，固定化还包括与戊二醛的交联，所使用的戊二醛的浓度为2mM到8mM，优选在4mM到6mM之间。
酶的固定化还包括与浓度范围为0.3到0.5％(w/v)的戊二醛的二次交联。
为制备β-内酰胺抗生素所准备的酶的酰基化过程包括带有活性酰基原料的亲核试剂和上面固定青霉素酰化酶组成的混合物，适宜的PH值为5.2到7.2之间。反应混合物PH的调节通过添加酸实现，优选盐酸。
酰基原料选自D-对羟基苯甘氨酸甲酯或D-对羟基苯甘氨酸氨基化合物，或是D-苯甘氨酸甲酯或D-苯甘氨酸氨基化合物，亲核试剂选自6-氨基青霉烷酸或7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸。
抗生素的合成还包括通过降低上述反应混合物的PH值，将一部分β-内酰胺抗生素从反应混合物中去除。
所述β-内酰胺抗生素是阿莫西林，该抗生素由6-氨基青霉烷酸与D-羟苯甘氨酸甲酯酰化合成，其中6-氨基青霉烷酸与D-羟苯甘氨酸甲酯的摩尔比率范围为1.2到4.5，更优的在1.5到1.8之间。
所述的β-内酰胺抗生素是氨比西林，该抗生素由6-氨基青霉烷酸与D-苯甘氨酸甲酯酰化合成，其中6-氨基青霉烷酸与D-羟苯甘氨酸甲酯的摩尔比率范围为1.2到4.5，更优的在1.3到1.7之间。
所述的β-内酰胺抗生素是头孢氨苄，该抗生素由7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸和D-苯甘氨酸甲酯酰化合成，其中7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸与D-羟苯甘氨酸甲酯的摩尔比率范围为1.2到4.5，更优的在1.5到1.7之间。
本发明进一步显示以补料模式从无色菌CCM4824中培养含有青霉素酰化酶的转基因大肠杆菌BL21CCM7394，这项发明主要包括细胞裂解、酶分离、通过稳定酶制备生物催化剂和为从利用无色菌CCM4824作为生物催化剂分离的固定重组青霉素酰化酶作为生物催化剂所得的阿莫西林、氨比西林、头孢羟氨苄和头孢氨苄设计有效的综合参数。
青霉素酰化酶的固定化过程也适当的提升固定酶的合成能力和增加酶的活性时间，以保证生物催化剂的稳定性。
【附图说明】
图1a(IA/VI)显示用FERMASE NATM 150从6-氨基青霉烷酸(亲核试剂)和HPGMeHCl(酰基原料)中合成阿莫西林三水酸(AMOX)的转化过程(例8)。
图1b(IB/VI)显示用FERMASE PATM 1500从6-氨基青霉烷酸(亲核试剂)和HPGMeHCl(酰基原料)中合成阿莫西林三水酸(AMOX)的转化过程(例8)。
图2a(IIA/VI)显示用FERMASE NATM 150从6-氨基青霉烷酸和HPGMeHCl合成阿莫西林三水酸的转化过程以及阿莫西林三水酸的净化(例9)。
图2b(IIB/VI)用FERMASE NA 150，在酰基原料/亲核试剂比为1.49时，从6-氨基青霉烷酸和HPGMeHCl在控制PH情况下合成阿莫西林三水酸的转化过程(例10)。
图3(III/VI)显示用FERMASE NATM 150从6-氨基青霉烷酸和HPGMeHCl合成阿莫西林三水酸的转化时间过程以及阿莫西林三水酸的净化(例11)。
图4(IV/VI)显示用FERMASE NATM 150从6-氨基青霉烷酸和HPGMeHCl通过延迟酰基原料的加入合成阿莫西林三水酸的间歇反应过程(例13)。
图5a(VB/VI)显示用FERMASE NA 150从6-氨基青霉烷酸和PGMeHCl合成氨比西林三水酸(AMP)的转化过程，酰基原料/亲核试剂的比率为1.5(例19)。
图5b(VB/VI)显示酰基原料/亲核试剂的比率为1.35，在PH值为5.9、20℃的条件下用FERMASE NA 150从6-氨基青霉烷酸和PGMeHCl合成氨比西林三水酸的间歇反应过程(例20)。
图6a(VIA/VI)显示酰基原料/亲核试剂的比率为1.5，在PH值为6.3、25℃的条件下用FERMASE NA 150从7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸和PGMeHCl合成头孢氨苄水合物(CEX)的间歇转化反应过程(例21)。
图6b(VIB/VI)显示酰基原料/亲核试剂的比率为1.34，在PH值为6.3、25℃的条件下用FERMASE NA 150从7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸和PGMeHCl合成头孢氨苄水合物的间歇转化反应过程(例22)。
【具体实施方式】
本发明涉及酶进程领域中具有重要商业价值的半合成β-内酰胺的制备。这些抗生素是最常用的医药品，其中半合成青霉素和头孢菌素(例如氨比西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢羟氨苄)和其他一些在全球销售中超过60％。
本发明提供的重组分离青霉素酰化酶，是从转基因大肠杆菌BL21CCM7394所表达的无色菌CCM4824中所得到的，这项发明主要包括细胞裂解、酶分离、通过稳定酶制备生物催化剂和为从利用大肠杆菌CCM7394中分离所得固定重组青霉素酰化酶作为生物催化剂所得的阿莫西林、氨比西林和头孢氨苄设计有效的综合参数。这种培养重组菌株CCM7394的方法在捷克专利PV-2007-82中有描述。
本发明β-内酰胺抗生素是从活性酰基原料(用于阿莫西林和头孢羟氨苄的D-对羟基苯甘酸甲酯或氨基化合物；用于氨比西林的头孢氨苄的D-苯甘氨酸甲酯或氨基化合物)和亲核试剂(6-氨基青霉烷酸或7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸)组成的反应混合物，在从无色菌CCM4824所得的重组青霉素酰化酶的催化作用下合成的。
具体的，本发明提供一种从无色菌CCM4824中包含青霉素酰化酶的大肠杆菌BL21CCM7394的细胞裂解方法，使用例如高压均质的各种方法；利用各种诸如醋酸乙酯、甲苯、醋酸丁酯和氯仿的温和化学提取；用不同溶剂细胞裂解的程度通过在反应介质中周期性的采样绘图所测得。因为溶剂导致细胞裂解的程度通过实验分析样品表面的AH PenG和与细胞悬浮液初始活性的对比测得(％细胞裂解)。这种培养重组菌株CCM的方法在捷克专利PV-2007-82中有描述。
实验结果证明产量为60％中氯仿是最适合的溶剂，因此进一步的实验是优化酶使其有更高的AH PenG，结果如表1所示。
按照上面的程序，不同浓度的氯仿被添加到初始的化学裂解中，随后对酶进行提取。在氯仿浓度为2％v/v时，与其他浓度相比观察到的细胞裂解为80％。结果如表2所示。
更进一步地，为提高细胞裂解的程度，将化学清洁剂和选自EDTA(乙二胺四乙酸)、溴棕三甲胺、尿素和十二烷基硫酸钠的金属螯合物添加到氯仿，观察到用十二烷基硫酸钠作为补充时增加了细胞裂解的程度。结果如表3所示。这个反应可在温度为15到35℃条件下方便的进行。
更进一步地，该细胞溶解生物量在温度为5℃条件下保存12小时，使来自裂解细胞的蛋白质分离。悬浮液的温度提高到28到30℃并用蒸馏水稀释；PH值用2M乙酸调节到5.0。在40℃下，向悬浮液中添加聚乙烯亚胺，一个小时后酸性蛋白凝结。絮凝材料是通过离心和溶液分离的。浮在表面的液体用4N氢氧化钠调节其PH到7.5，所获得的溶液被认为是可溶解酶(SE)。
上述部分可溶解酶溶液在温度为5℃、PH调节到7.5时搅拌。因此，固体硫酸铵，390克每公升，相当于60％饱和度(w/v)缓慢加入20分钟。经过进一步的搅拌在同样的温度下保持60分钟。饱和溶液冷却12个小时，沉淀下的酶在50℃下被分离。沉淀物每克包含700单位AH PenG of并且2个单位每毫克蛋白质有显著的活性。
在另一个首选的实例中，本发明描述了在30分钟内通过向冷却的可溶解酶(0-VC)中添加每公升283.6克的固体硫酸铵制备酶的过程。降水进行2个小时候进行离心以获得酶浆。酶的产量是74％。上述所得的酶浆将用于聚丙烯酰胺凝胶的固定化或下述青霉素酰化酶的进一步净化。
在另外一个具体实例中，该发明提供了一种用离子交换色谱法净化青霉素酰化酶的步骤。在带有羧基组功能的CATEX色谱板中，弱阳离子交换，已用于从酶浆中所得青霉素酰化酶的纯化，用于如Sepabeads and DILBEADSTM的大孔聚丙烯树脂的固定化。青霉素酰化酶有选择的绑定在离子交换器上，大多数低等电点蛋白质经历排列。绑定的青霉素酰化酶用氯化钾梯度从排列中收回。纯化酶的溶液包括两种相同的AH PenG呈现的重量比率为1∶2.7。纯化后总的活性产量达到45％。
青霉素酰化酶的固定化过程也可适当的提高固定酶的合成能力，增加更长的反应活性时间，可确保生物催化剂有更好的稳定性。固定化过程涉及一种酶包埋的方法。聚丙烯酰胺是酶包埋中最常用的聚合物，因为他们的相似程度与自由酶接近。在蛋白质绑定时期，固定化可以达到接近90％，在活性表达阶段达到近60-70％。聚丙烯酰胺使用的限制是来源于非活性聚合物的酶的缺乏、物理稳定性和遭遇大基质分子所遇到的扩散问题。这些限制都被利用交联的优化所克服。所有其他交联剂，戊二醛、双功能交联剂是为基于包埋凝胶体的聚丙烯酰胺的选择(蛋白质固定化的基础和应用，由查理德泰勒主编，马塞尔德克尔公司出版，40：1991)。
这种优化的主要标准是保留合成酶的活性，尽管一定程度的失活是不可避免的，也向聚合体凝胶传达机械强度，以限制来源于聚合体的酶的缺乏。凝胶包埋酶进一步再次交联，以确保作为最终产品的生物催化剂的稳定性。
该方法更适合具有相当数量的非特异性蛋白质与戊二醛更好的交联。这也有助于加快聚合过程。使用活性低的酶使得过程更加经济，在产品和活性方面具有更高的收益。
如上述获得的100克酶酶浆经过磷酸钠缓冲液的稀释以获得一种均质溶液。从包含丙烯酰胺单体溶液(10％w/v)和N，N-亚甲基双丙烯酰胺(0.5％w/v)的原液中取14.5ml，在5℃温度下加入到上述搅拌的酶溶液中，再继续搅拌5分钟。这种反应质量，将25％(w/v)的戊二醛5ml加入其中，再准确搅拌8分钟。然后将0.5％(w/v)的四甲基二乙胺溶液和1.0％(w/v)的饱和过硫酸铵溶液添加到溶液中。在2分钟内开始聚合。
对为实现完全聚合所加入的过硫酸铵和四甲基二乙胺的数量进行研究，结果如表6所示。已经证实过硫酸铵和四甲基二乙胺的比率为1∶0.6时，最好实现完全聚合。
获得一层厚厚的、不透明的聚合体，将它导入预先冷冻盘中，并充分聚合孵育30分钟。所形成的凝胶被切断，并用30目(500微米)的滤网过滤。所得到的凝胶用水在50目(300微米)的滤网中清洗，以除去细颗粒、没有反应的单体颗粒和其他试剂。
用1.2M的氯化钠对包埋酶进行进一步的清洗，以除去未绑定的蛋白质颗粒。
为了加固交联，将聚合体在0.5％(w/v)的戊二醛溶液中在25℃下搅拌30分钟。再次交联后，用5体积水将戊二醛颗粒清洗除去。
最后催化剂进行真空过滤除去多余的水分，储存在50mM磷酸钠缓冲液，PH7.8含有500ppm的对羟基苯甲酸乙酯中。最终产品的干重(％)在12-15％之间，98％的粒子尺寸在100-300微米之间。
重量范围介于88到92％之间。表达活性产量(AH PenG＝110U/g ww；AH PenG＝750U/g dw)相当于采用固定化活性的47％。
活性由使用的25mM青霉素G，50MmPH为8.0的磷酸钠缓冲液在37℃进行的碱量滴定所决定。阿莫西林的合成活性(AS Amox＝150U/g dw)是由使用的40mmoles的6-APA和60mmoles的HPGMeHCL，PH为6.3，温度为40℃的反应条件所决定。该反应进行了30分钟，然后用高效液相色谱分析其活性。
上述过程用可变浓度的丙烯酰胺和N，N-亚甲基双丙烯酰胺重复操作，以确定相同包埋酶的最好可行比例。丙烯酰胺和N，N-亚甲基双丙烯酰胺的最佳可行浓度比例发现时19∶1，这时酶活性的产量为92％。这个范围的实验结果如表5所示。
上述实验继续选择从1到5mmole每毫克蛋白质的戊二醛可变浓度用于交联。所得结果表明，随着戊二醛浓度的增加，生物催化剂的活性也增加，但是活性的产量是与戊二醛的浓度呈反比的。结果如表6所示。
在另一个具体实施例中，本发明描述了在25℃和37℃时水解活性和凝胶聚合体(FERMASE NATM 150和FERMASE NATM 1500)的测量，观察到在较高的温度下，酶的活性可达到近2倍。
在另外一项更优的实施例中，本发明被用FERMASE NATM 150和FERMASE NATM 1500从6-APA(亲核试剂)和HPGMeHCL(酰基原料)所得的阿莫西林三水化合物的合成所控制。
本发明过程中，酰基原料的摩尔过剩使得开始反应向生产产品，一种抗生素的方向移动。这两种反应物(酰基原料，亲核试剂)在反应的刚开始就加入到间歇反应中，这样可形成厚厚的悬浮液使得酰基原料的溶解性较低，或者酰基原料以逐步的方式加入到反应中以防止悬浮液的形成。在后来的情况下，反应溶液一直是澄清的，直到不溶产品(抗生素)的形成，酰基原料初始的水解比率较低，这个过程可以在连续模式下进行。两种添加酰基原料的方法可以结合使用。
在反应过程中，PH值有下降的趋势，因此有必要调整反应过程中的PH值。最终PH值为6.3是实现6-APA最大程度转化为阿莫西林三水化合物的必需条件。PH值使用磷酸或氢氧化钠或氨水调节。
类似的用FERMASE PA TM1500在控制PH条件下从6-APA(亲核试剂)和HPGMeHCl(酰基原料)合成阿莫西林的实验被进行。
随着6-APA的转化(％)和阿莫西林的增加，反应终止。这种酶从反应物中消除，用水清洗并作为以后的应用。
类似的方式，其他β-内酰胺抗生素的合成可利用重组青霉素酰化酶作为生物催化剂从无色菌CCM4824获得。用6-APA(亲核试剂)和PGMeHCl(作为酰基原料)的浓缩液合成氨比西林；7-ADCA(亲核试剂)和HPGMeHCl酯或酰胺(酰基原料)合成头孢羟氨苄；7-ADCA(亲核试剂)和HPGMeHCl酯或酰胺(酰基原料)合成头孢氨苄。
缩写：
AH penG代表PenG的水解活性
SAH penG代表每毫克蛋白质的表达活性
SE代表通过例5所制备的可溶解酶
PA代表青霉素酰化酶
PGA代表青霉素G酰化酶
rPAAS代表从无色菌所得的重组青霉素酰化酶
rPGAAS代表从大肠杆菌所得的重组青霉素G酰化酶
HPGMeHCl代表D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐
PGMeHCl代表D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐
HPG代表D-羟苯基甘氨酸
PG代表D-苯基甘氨酸
AAD代表活性酰基原料
Wn代表与初始亲核试剂的转化百分数
AMOX代表阿莫西林三水合物
AMP代表氨比西林三水合物
CEX代表头孢氨苄水合物
AH AAD代表活性酰基原料的水解活性
AS Amox代表阿莫西林三水合物的合成能力
AS Amp代表氨比西林三水合物的合成能力
AS Cex代表头孢氨苄水合物的合成能力
S/Hinit代表AS Amox、AS Amp或AS Cex/AH AAD
RM代表反应混合物
cdw代表细胞干重
dw代表干重
ww代表湿重
TEMED代表N’，N’，N’，N’-四甲基二乙胺
Cell paste代表含有从无色菌所得青霉素酰化酶的大肠杆菌BL21细胞
FERMASE PA TM1500代表被从大肠杆菌所得重组青霉素G酰化酶包埋的聚丙烯酰胺凝胶
FERMASE NA TM150代表被从无色菌所得重组青霉素酰化酶包埋的聚丙烯酰胺凝胶
RPM代表每分钟转速
U代表活性单位(U)：定义为在37℃，PH为8，在53Mm青霉素G钾盐，周围用50mM硫酸钠缓冲在零级动力学范围内每分钟催化形成1微摩尔6-APA所需要的酶的量。
下面的例子，其中包括较优例子，将更好的有助于说明本发明的实行，可以通过举例对其有详细的理解，并可实现对本发明更优实施例说明讨论的目的。
实施例
实施例1
细胞在高压均质下的分解
大肠杆菌BL21CCM7394随着从无色菌CCM4824所得青霉素酰化酶的活性通过离心过滤以细胞浆的方式(卷式离心机)或者以细胞悬浮液的方式(阿尔法离心机)从培养基中获得。获得的微生物悬浮在0.02M磷酸钠得到5％(cdw/v)，悬浮液的pH调整为7，并且用20％w/v氢氧化钠使其保持不变。冷却到8-13℃的细胞悬浮液(2350ml，4.9％cdw/v，AHPenGof 86.5U/ml)开始破裂。(均匀，压力40-50MPA，三个连续的周期)。每个周期后，均匀的细胞溶液温度降到8-13℃，pH调整到7.0。细胞碎片和一小部分蛋白质碎片通过热凝被清除，它包括：用50％乙酸调整PH值到5.0，加入Sedipur CL 930絮凝剂(2-4g/L)并且保持温度在40℃一个小时。细胞溶液经过快速冷却至8-13℃，匀浆与700毫升水稀释，pH值调整为8.0(20％氢氧化钠溶液)和混合离心(贝克曼离心机，角转子，4×350毫升，10,000rpm)20分钟。澄清酶溶液的pH值(2580毫升，8.7mg蛋白/ml，AHpenG为64.8U/ml)调整为7.0，酶溶液在-16℃冷却，酶的产量(S AHpenG＝8.4U/mg蛋白质)为82％(细胞悬浮液的活性在***前等于100％)。
实施例2
A.通过温和化学提取对酶的提取
在发明的另一项具体实施例中，细胞悬浮液(1050ml，5％cdw/v，AHpenG为10.2U/ml)用0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.5)在20℃条件下稀释。温和的化学裂解在带pH电极，温度探头和可变搅拌设备的三颈玻璃反应器中进行。用稀释的氨水溶液把pH值调整为7.0后，温度达到28℃。为了稀释生物数量，将1％的溶剂如甲苯，乙酸乙酯，氯仿，醋酸丁酯加入到初始细胞裂解的反应中，在恒温条件下监测该反应pH值的变化。样本周期性的取出以估测细胞溶解的程度。该反应在pH7.0和28℃下持续了2小时。由溶解度导致的裂解程度通过分析样品表面AHpenG测定并与细胞悬浮液的初始活性比较(％细胞裂解，表1)。
表1
  实验   溶剂   细胞裂解％
  1   甲苯   7.4％
  2   乙酸乙酯   25％
  3   氯仿   60％
  4   醋酸丁酯   33％
结果表明，氯仿达到最好的产量为60％，从而，进一步要做通过高SAHpenG优化酶产量的实验。
B.用氯仿通过温和化学提取对酶的提取。
遵循上述相同的步骤，将不同浓度的氯仿添加到初始化学裂解中以及后来的酶提取。
表2
  实验   氯仿浓度(in％v/v)   细胞裂解％
  A   1   62
  B   2   80
  C   2.5   74
  D   3   45
很明显，使用2％浓度的氯仿能有效地实现最大程度的裂解如上述表2所示。较高浓度的氯仿导致较低的产量的情况是由于溶解时使酶产生了变性。
C.用氯仿和不同补充剂的混合物对酶的提取。
遵循上述相同的步骤，将不同浓度的化学清洁剂和金属螯合剂与氯仿一起加入，以提高化学裂解和酶的产量。如乙二胺四乙酸(乙二胺四乙酸)，铵，尿素是众所周知的有助于细胞裂解的物质，无论是单独形式或混合。十二烷基硫酸钠的添加提高了裂解的程度。结果如下表3所示。
表3
  实验   氯仿浓缩物(in％v/v)   添加物   细胞溶解量
  A   2   乙二胺四乙酸   95
  B   2   铵   45
  C   2   尿素   33
  D   2   十二烷基硫酸钠   92
实施例3
浓缩酶的制备
准备如实施例1的350gm细胞浆，用蒸馏水稀释至最终浓度在20-25℃下为5％(cdw/v)。细胞悬液的pH值用2％(v/v)的冰三氯甲烷调整为7.0，并将0.2％(w/v)十二烷基硫酸钠添加初始裂解中。样品总时间为5小时过程中定期抽取。裂解的物质在将蛋白质从裂解的细胞中分离过程之前储存在5℃的环境中12小时。悬浮液的温度提高到28-30℃和用蒸馏水稀释2倍。pH值用2M的乙酸调整到5.0。酸性蛋白凝结物通过在40℃添加一个小时1％的聚乙烯亚胺从悬浮液中分离。絮凝物在转速为7000rmp的离心分离中从溶液中分离。上清液pH值用四氢氧化钠溶液调整为7.5，所得的溶液被称为可溶性酶(SE)。酶的产量与初始细胞浆的活性有关，为90％。表4分离过程中活性青霉素酰化酶的产量可溶性酶(SE)进一步用于催化剂的分离。
表4
  萃取时间   总AHpenG(U)   活性产量(％)
  细胞浆悬浮液   5670   100
  一小时   4535   80
  二小时   5330   94
  三小时   5500   97
  萃取时间   总AHpenG(U)   活性产量(％)
  五小时   6297   111
  十二小时   6237   110
  可溶性酶   5106   90
实施例4
用硫酸铵对酶浆进行纯化。
方法A
像实施例1一样(2580毫升，8.7mg蛋白/ml，AHpenG of 64，8U/ml，pH值7.0)对酶溶液进行分离，进一步通过硫酸铵进行纯化。再冷却30分钟过程中，将固体硫酸铵(283.6克/升)加入到冷酶溶液(0-1℃)中。沉淀2小时，沉淀物通过离心过滤清除。这种酶浆被用于聚丙烯酰胺凝胶的固定化或青霉素酰化酶的进一步纯化。酶的产率为74％(细胞悬浮液裂解前的活性等于100％)。
方法B
实施例3中的部分可溶性酶在5℃进行搅拌并将pH调整到7.5。固体硫酸铵，390克每公升，相当于60％饱和度(w/v)，在20分钟内缓慢的加入。在5℃下经过进一步的搅拌60分钟；饱和酶溶液冷却12小时。酶沉淀通过转速为7000rmp的离心过滤(雷米离心机)30分钟被分离。沉淀物包括AHPenG 700单位每克和具有显著活性的2单位每毫克蛋白质。
方法C
通过离子交换色谱对青霉素酰化酶的纯化：
带功能羧基群体CATEX的色谱，弱阳离子交换，用于从酶浆所得青霉素酰化酶的纯化，适合诸如SePAbeads和DILBEADSTM的大孔聚丙烯树脂的固定化。作为一个弱阳离子交换，Fractogel COO“(Merck)与0.02M磷酸钠缓冲液(pH7.0)被使用。细胞浆(实施例6中准备的)被溶解在0.1M磷酸钠缓冲液(pH值7.0，400毫升)，对0.02M磷酸钠缓冲液(pH7.0)彻底透析，使样品的电导率和缓冲区是相同的。溶液离心，颗粒被丢弃。悬浮液中的AHpenG达到259U/ml和SAHpenG＝16.8U/mg蛋白质。这种溶液被应用到柱，青霉素酰化酶有选择性的绑定到离子交换器和大量较低等电点蛋白质通过柱。绑定的青霉素酰化酶用氯化钾梯度(0.0-0.14米氯化钾梯度在0.02米磷酸钠缓冲液，pH值7.0)从柱中除去。从0.41透析溶液组织中分离出青霉素酰化酶，一个体积为11的玻璃柱被使用。纯化的酶溶液(体积为1.251，AHpenG为43.4U/ml)载有相同的两种异构体SAHPen6(38.1和42.6U/mg蛋白)的重量比为1∶2.7。经过这种纯化，总收益等于45％。
实施例5
聚丙烯酰胺凝胶-FERMASE NATM150的再次制备
方法A
从实施例3A中获得的酶浆，用0.3M的磷酸钠缓冲液(pH7.5)稀释，以获得75毫升青霉素酰化酶溶液(AHPenG为250U/ml)。溶液在5℃搅拌。将14.5毫升10％的丙烯酰胺单体和0.5％(w/v)的N’，N’的亚甲基丙烯酰胺添加到酶溶液中，并搅拌5分钟。加入5ml25％(v/v)的戊二醛，并准确搅拌8分钟。然后，将0.5％(v/v)四甲基溶液和新鲜的1.0％(w/v)过硫酸铵溶液添加到溶液中。在2分钟内开始聚合。
在这一阶段，有一个厚厚的、不透明的聚合块注入到预先冷冻盘，并允许充分聚合和孵育30分钟。所形成的聚合凝胶切割，并通过30目(500微米)筛过滤。由此产生的聚合凝胶用水通过50目筛(300微米水)清洗以除去细颗粒、未反应的单体和其他试剂。进一步用120M氯化钠清洗包埋酶5次，以除去游离蛋白质。为了提高交联，聚合体在温度为25℃的0.5％戊二醛中搅拌30分钟。再次交联后，用5体积的水清洗以除去戊二醛。
最后，催化剂用真空过滤以除去多余的水份并储存在50mM pH值7.8的磷酸钠缓冲液内，含有500ppm的对羟基苯甲酸乙酯。
最后制备的干重在12-15％之间，98％的颗粒粒径分布在100-300微米之间。
产量范围为88到92％。表达活性的产量(AHpenG＝110U/g ww；AHpenG＝750U/g dw)相当于47％，其为固定化所得的活性。
这些活性由碱滴定法测定，在37℃下，使用25mM青霉素G钾、50mM pH值为8.0磷酸钠缓冲液。阿莫西林的合成活性(ASAmox＝150U/g dw)在使用40mmol 6-APA和60HPGMe.HCl mmol的情况、pH值为6.3和温度为40℃的条件下而定。反应进行了30分钟，用高效液相色谱法测定活性。
方法B
如实施例5方法A所描述的过程，但是使用可变浓度的丙烯酰胺和N，N’-二亚甲基丙烯酰胺(表5)。报告表明了在从2∶1到20∶1的比例不等的两个单体的使用的变化导致了不同孔径将包埋不同程度凝胶基质蛋白质分子。同样，不同比率的丙烯酰胺和N’N-亚甲基丙烯酰胺也对孔径尺寸和所得作为生物催化剂的酶活性有影响。
表5
  实验   丙烯酰胺的浓度   N，N’-二亚甲基的浓度   丙烯酰胺和N，N’-二亚甲基的比例   活性结果
  1   10   0.55   18∶1   4.2
  2   9.5   0.5   19∶1   54.4
  3   9.5   0.5   18∶1   6
  4   9   0.47   19∶1   54
  5   8.6   0.57   15∶1   36
依据上述结果，为了得到更好地酶活性，丙烯酰胺和N’N-亚甲基用于催化剂制备的浓度分别为8.35％(w/v)和0.43％(w/v)，比率相当于19∶1(实施例6)。
方法C
改性聚合聚丙烯酰胺凝胶的制备：Fermase NATM150。
如实施例5所述的程序，方法B是用8.35％(w/v)丙烯酰胺和0.43％(w/v)N’，N’-二亚甲基进行重复，希望不同浓度的戊二醛可用于交联。从1到5毫摩尔每毫克选择不同的浓度的蛋白质。最佳浓度戊二醛的选择是基于生物催化剂的强度。生物催化剂的强度由生物催化剂的屈服机械应力决定。为此，在水中准备10％的生物催化剂悬浮液准备并在250℃转速为70rpm轨道振动筛受到玻璃珠(5毫米直径)的被迫震动12小时。压力处理后，生物催化剂用于检测残余酶的活性和重力沉降时间。结果总结如表6。
表6
  实验   丙烯酰胺的浓度   PA活   机械压迫后的   压缩前沉   压缩后沉降时
  性   剩余活性   降时间   间
  1   1.0   885   60   24   65
  2   1.5   880   63   24   40
  3   2.5   840   86   21   28
  4   3.0   650   97   21   23
  5   3.5   425   80   22   29
  6   4.0   400   76   22   35
  7   4.5   260   70   22   36
  8   5.0   245   55   23   40
由于这些细颗粒的浮力，相对较少的机械强度的生物催化剂容易打成细颗粒，稳定时间增加。所以，沉淀时间被作为机械稳定性的测量。虽然实施例4的活性与其配对物相比较低，因此其稳定性也被选定为进一步实验的最佳组合。
方法D
(由Ichiro Chibata编制的固定化酶的制备，78-92，1978)建议使用0.75％-1.0％(w/v)过硫酸铵和0.5％(v/v)TEMED用于聚合。完全聚合所需的时间在每次实验斗检测。讨论的结果如下表7。
表7
  实验   APS   TEMED   聚合时间
  9   0.75   0.5   50
  10   0.75   0.6   45
  11   1.0   0.5   45
  12   1.0   0.6   35
实施例6
聚丙烯酰胺凝胶聚合的评测(FERMASE NATM 150)
通过从在大肠杆菌BL21CCM7394中表达的无色菌CCM4824(rPAAs)所得重组青霉素酰化酶包埋制备催化剂。聚丙烯酰胺凝胶包埋被用在如实施例5所述的情况。
方法A
催化剂的水解活性测定采用碱滴定法(15mM青霉素G钾，0.1M的磷酸钠，pH值在25℃时8.0)。催化剂与27.5U/g ww的AHPenG(13.5％dw，204U/g dw的AHPenG)用在合成实验。此外，同一催化剂的水解活性测定在较高温度下使用碱滴定法(15mM青霉素G钾，0.1M的磷酸钠，pH值在37℃是8.0)：催化剂的活性近2倍(AHPen＝58U/g ww，AHpenG＝430U/g dw)。
方法B
合成阿莫西林的水解活性ASAmox 192U/g dw在反应条件：300mmol 6-APA，700mmolHPGMe.HCl，pH值6.3，25℃下测定。
在合成阿莫西林的过程中反应物是在恒温28℃由高效液相色谱法用column Luna 5μCl 8，150×2mm(Phenomenex)测定的，色谱分析的流动相用pH值3.1的0.05M磷酸钠缓冲液，含括流速0.2毫升/分钟的7.5％甲醇。顶峰是215nm.
样品制备：反应混合物样品用含有0.05％十二烷基硫酸钠的流动相稀释200倍，离心(14000rmp，10分钟)并注入(体积为10微升)。HPG，6-APA，HPGMe和AMOX在高效液相色谱仲停留时间分别为2.3，3.2，5.5和7.6分钟。阿莫西林合成的单位是在反应的条件每分钟合成一微克阿莫西林。
实施例7
聚合聚丙烯酰胺凝胶的制备(FERMASE PATM 1500).
为了比较从大肠杆菌BL21CCM7394所表达的雾色菌CCM4824所得重组青霉素酰化酶的合成效率，(FERMASE NATM 150)，从重组大肠杆菌E.coli PGA(rPGAEC)制备类似的固定化。催化剂用与实施例6类似的合成物的变化和酶的装填的方法包埋rPGAEC制备。催化剂(15.7％dw)水解活性用碱滴定法(15mM青霉素G钾，0.1M的磷酸钠，25℃下pH值8.0)测定。带43.6U/g dw AHPenG的催化剂被用于阿莫西林合成。此外，同一催化剂的水解活性测定在较高温度下使用碱滴定法(15mM青霉素G钾，0.1M的磷酸钠，pH值在37℃是8.0)：催化剂的活性接近两倍(AHpen＝81U/g ww，或516U/g dw)。54U/g dw的阿莫西林合成活性测定的反应条件：300mmol 6-APA，700mmol HPGMcHCl，pH值6.3，25℃，如实施例6所述。
实施例8
用FERMASE NATM 150和FERMASE PATM 1500从6-APA(亲核试剂)和HPGMeHCl(酰基原料)合成阿莫西林三水合物(AMOX)-间歇反应。
一个夹套反应器(体积25毫升)底部装有滤网(125微米，尼龙)和搅拌装置，用9.4ml软化水(25℃)和376毫克6-APA(纯度92％，1.6mmol的亲核试剂)装满并用40％的氢氧化钠将pH值调整至7.5。然后，加入766mgHPGMe-HCl(99％纯度，3.48mmol酰基原料)并用40％的氢氧化钠将pH值调整到6.3。在此之后，HPGMe.HCl晶体悬浮液形成。随后，总量为0.6g(ww)的FERMASE NATM150)转入到反应器，开始搅拌(t＝0分钟)，温度保持在25℃。大约60分钟后，悬浮液的粘度缓慢下降(HPGMe.HCl晶体溶解和AMOX晶体形成)。PH值由6.3缓慢增加到6.4，在第180分钟，用20％磷酸将pH值重新调整为6.3。
200分钟后，pH值为6.17，转化率达到96.9％Wn。
270分钟后，pH值下降到5.85，转化率为99.1％Wn。AMOX的初始合成速率(AsAmox)等于85U/g dw的催化剂，HPG的形成速率为27U/g dw的催化剂。比值S/Hinit为3.15。转化的过程如图1.a.(IA/VI)所示。
同样的实验是在装有FERMASEPATM1500的反应器(如上)装满9.4ml的软化水(25℃)，和376mg的6-APA(92％纯度，1.6mmol亲核试剂)并用40％氢氧化钠将pH值调整到7.5。然后，加入766mg的HPGMeHCl(99％纯度，3.52mmol酰基原料)并用40％氢氧化钠将pH值调整到6.3。随后，总量为0.6g(湿重)的FERMASE PATM1500转入反应器，开始搅拌(t＝0分钟)，温度保持在25℃。pH值，从6.3缓慢增加至6.4，在第160分钟用20％磷酸将pH值调整为6.3。
200分钟后，pH值为6.2和转化率达到65.1％Wn。270分钟后，pH值下降到6.2，转化率为75.6％Wn。AMOX的初始合成速率(AsAmox)相当于53.7U/g dw的催化剂，HPG形成的速率为62.3U/g dw的催化剂。比值S/Hinit为0.86。转化的过程如图1.b.(IB/VI)所示。
最后剩余反应物的浓度如表8所示。
实施例9
用FERMASE NATM150从6-APA和HPGMeHCl合成AMOX以及AMOX的纯化。
一个底部装有滤网(125微米，尼龙)和搅拌装置的夹套反应器(体积25毫升)，用94ml软化水(25℃)和3.028mg的6-APA(纯度92％，1.6mmol的亲核试剂)装满并用40％的氢氧化钠将pH值调整至7.5。然后，加入6.964mg的HPGMeHCl(99％纯度，32mmole的酰基原料)，用40％的氢氧化钠将pH值调整到6.3。随后，将总量为0.6g(ww)的FERMASE NATM150转入到反应器，开始搅拌(t＝0分钟)，温度保持在25℃。pH值开始增加缓慢，在第60分众、第80分钟和第100分钟，用磷酸(20％)将pH值调整到6.3。140分钟后，pH值为6.01和转化率达到96.8％Wn，反应停止。ASAmox相当于167.2U/g dw的催化剂，HPG形成的速率为55.9U/g dw的催化剂。比值S/Hinit为2.99。转化的过程如图2.a.(IIA/VI)所示。最后剩余反应物的浓度见表8。
反应混合物酸化至pH值为1.8，溶液在温和的真空过滤下从催化剂中分离。催化剂用少量的水清洗。溶液通过纤维滤网在真空条件下过滤变得澄清，并用冰水浴使其冷却。澄清溶液的PH值调整至4.2，将溶液放置在冰箱中16个小时，形成的阿莫西林三水合物晶体被留下。晶体通过尼龙过滤网(125微米)过滤分离，迅速用冰丙酮(-18℃)清洗并干燥。分离所得的5.0g阿莫西林三水合物代表其产量为92.5％。
实施例10
通过pH值控制用FERMASE NA 150从6-APA和HPGMeHCl合成AMOX，酰基原料/亲核试剂的比率为1.49。
一个与实施例8类似的反应器，用82ml软化d水(25℃)和5.64g的6-APA(纯度92％，24.0mmole亲核试剂)装满，并用40％氢氧化钠将pH值调整为7.5。然后，加入7.84g的HPGMeHCl(纯度99％，35.66mmole酰基原料)，并用40％氢氧化钠将pH值调整为6.3。随后，将总量为18.0g(ww)的FERMASE NATM 150转入到反应器，开始搅拌(t＝0分钟)，温度保持为25℃。在反应过程中的第30分钟和第80分钟，用磷酸(20％)将pH值重新调整到6.3。
240分钟后，pH值为5.65和转化率达到91.3％Wn。ASAmox(0-20分钟)相当于75.6U/g dw的催化剂，而HPG的形成速率为17.8U/g dw的催化剂。比值S/Hinit是4.25。最后剩余反应物的浓度见表8。转化的过程如图2.b.(IIB/VI)所示。
实施例11
用FERMASE NATM 150从6-APA和HPGMeHCl合成AMOX以及AMOX的纯化-联合间歇反应。
一个像实施例8中的反应器，用188ml的软化水(25℃)和6.92g的6-APA(纯度为92％，29.44mmole亲核试剂装满，并用40％的氢氧化钠调整其PH值为7.5。然后，加入6.964g(第一部分)的HPGMeHCl(纯度为99％，31.68mmole酰基原料)并用40％的氢氧化钠将其PH值调整到6.3。培养溶液澄清，HPGMeHCl完全溶解。随后，总量为12.0g(ww)的FERMASE NATM 150加入到反应器中，开始搅拌(t＝0分钟)，温度保持在25℃。反应20分钟后，加入6.964g(第二部分)HPGMeHCl(31.68mmole)并用40％的氢氧化钠将PH值调整到6.3。在反应过程中的第40分钟，加入第三部分(6.964g)HPGMeHCl(31.68mmoles)。在反应过程中PH值有降低的趋势，所以在第60分钟、第80分钟和第110分钟需要用40％的氢氧化钠将PH值重新调整到6.3。
140分钟后，PH值降低到5.67，转化率达到98.7％Wn。在反应过程中的第40分钟，AMOX开始结晶。AS Amox(0-20分钟)相当于123.0U/g dw的催化剂，HGP形成的速率为20.5U/g dw的催化剂。加入第二次剂量的HPGMeHCl之后，合成速率提高到190.0U/g dw催化剂，加入第三剂量之后相当于143.0U/g dw。S/Hinit的比值为6.0(0-20分钟)，加入第二次剂量和第三次剂量的酰基原料后比值分别降低到2.28和0.96。反应过程的时间如图3(III/VI)所示。最终剩余反应物的浓度见表8。在反应过程中的第40分钟，AMOX开始结晶并且悬浮液的粘度变得更大。
将反应混合物稀释两倍并将AMOX悬浮液在真空和搅拌的条件下除去。最后，将催化剂用少量体积的水反复清洗。体积量可以参考(465ml)，在冰水淋浴中冷却并用10％的盐酸酸化使其PH为1.8。AMOX溶液(497ml)的PH值重新调整到2.2。溶液通过纤维滤网过滤在真空条件下过滤澄清并用水清洗过滤器。澄清溶液(522ml)的PH值调整到4.2，AMOX晶体在冰箱中保存16小时。晶体通过尼龙滤布(125μm)过滤被分离，快速用冰丙酮(-18℃)清洗并干燥。所得到的10.5gAMOX代表摩尔产量为85％。在母液、催化剂和丙酮中所分离的剩余阿莫西林产品的浓度分别为9.9、3.1和0.6％。
实施例12
用FERMASE NATM 150从6-APA和HPGMeHCl合成AMOX以及AMOX的纯化-联合间歇反应。
一个与实施例11相似的反应器，用78ml的软化水(25℃)和3.46g的6-APA(纯度为92％，14.2mmole亲核试剂装满，并用40％的氢氧化钠调整其PH值为7.5。然后，加入3.482g的HPGMeHCl(纯度为99％，15.84mmole酰基原料)并用40％的氢氧化钠将其PH值调整到6.3。培养溶液澄清，HPGMeHCl完全溶解。随后，总量为22.0g(ww)的FERMASE NATM 150加入到反应器中，开始搅拌(t＝0分钟)，温度保持在25℃。反应20分钟后，加入3.482g(第二部分)HPGMeHCl(15.84mmole)并用40％的氢氧化钠将PH值调整到6.3。在反应过程中的第40分钟，加入第三部分(1.738g)HPGMeHCl(7.92mmoles)。在反应过程中PH值有降低的趋势，所以在第50分钟和第80分钟需要用40％的氢氧化钠将PH值重新调整到6.3。最终剩余反应物的浓度见表8。70分钟后，PH值降低到5.67，转化达到98.1％Wn。AS Amox(0-20分钟)相当于71.3U/gdw的催化剂，HGP形成的速率为23.5U/g dw的催化剂。加入第二次剂量的HPGMeHCl之后，合成速率提高到121.2U/g dw催化剂，加入第三剂量之后降低到37.2U/g dw。S/Hinit的比值为3.0(0-20分钟)，加入第二次剂量和第三次剂量的酰基原料后比值分别降低到2.8和0.47。反应20分钟后，AMOX开始结晶并且悬浮液的粘度变得更大。将产品稀释两倍，并将AMOX用与实施例11相类似的方法分离。可得到5.1gAMOX，其代表产量为82.6％。
实施例13
用FERMASE NATM150从6-APA和HPGMeHCl合成AMOX-酰基原料缓慢加入的间歇反应。
一个与实施例9类似的反应器，用94ml软化水(25℃)和3.46g的6-APA(纯度为92％，14.72mmole的亲核试剂)装满，并用40％的氢氧化钠将其PH值调节到7.5。然后，加入6.094gHPGMeHCl(纯度为99％，27.72mmole的酰基原料)并用40％的氢氧化钠调节其PH值到6.3。因为HPGMe.HCl结晶的形成使得混合物变得浑浊。随后，将总量为6.0g(ww)的FERMASE NATM150加入到反应器中，开始搅拌(t＝0分钟)，并将温度保持在25℃。反应60分钟后，加入1.567g(第二部分)HPGMe.HCl(纯度为99％，7.13mmole)并用40％的氢氧化钠将PH值调整到6.3。在反应过程中PH值有降低的趋势，所以在第90分钟需要用40％的氢氧化钠将PH值重新调整到6.3。
160分钟后，PH值为6.32，转化达到96.6％w.r.n。AS Amox(0-20分钟)相当于124.8U/g dw的催化剂，HGP形成的速率为30.2U/g dw。加入第二次剂量的HPGMeHCl之后，合成速率提高到190.0U/g dw催化剂。S/Hinit的比值为6.0(0-20分钟)，加入第二次剂量的酰基原料后比值为2.28。转化过程的时间如图4(IV/VI)所示。最后剩余的反应物浓度见表8。将产品稀释两倍，并将AMOX用与实施例11相类似的方法分离。可得到5.2gAMOX，其代表产量为84.2％。
表8阿莫西林合成结果汇总
Figure GPA00001009006800231
1)AH PenG＝110U/g dw；750U/g dw；PH8，37℃
实施例14
用FERMASE NATM150从6-APA和HPGMeHCl合成AMOX的放大以及AMOX的纯化：400ml规模。
酶的耦合是使用一个1000ml、工作体积为400ml、底部有三个出口的圆柱形夹套玻璃反应器进行。混合是通过具有可变速控制的三叶浆式叶轮完成。反应是在恒定转速为300+/-5的搅拌下进行。
6.9克的6-APA、相当于80mmoles和27.84克的HPGMeHCl、相当于320mmoles加入到反应器中，分散开以后，用1∶1摩尔的氨水调整PH值在6.4到7.4之间。最终调整PH值到6.3、体积到400ml后，将FERMASE NATM150加入到初始合成反应中。装满的酶相当于装填的644UAH penG如本文其他地方提到的每克β-内酰胺核子。
酶耦合是在28℃和通过反应监控的PH条件下进行。样品在固定的时间间隔抽取并用高效液相色谱分析。反应随着6-APA的转化百分数和随之AMOX的增加而终止。将酶从反应体系中撤离并用50ml的水清洗三次，直到所有的沉淀都从酶上清洗下来。酶将一直保存在5℃环境中直到下次使用。固定化酶撤离后将溶液的PH值调整到2并将澄清的溶液通过滤纸过滤，然后将溶液冷却到5℃并将PH调整到6.3。出现的沉淀经过过滤并将剩余母液的PH值调整到8到9。第二次所得的沉淀也经过过滤。所得的沉淀均进行真空干燥。6-APA转化为AMOX的转化率大约为92％。高效液相色谱分析显示AMOX的纯度达到98.50％，AMOX的摩尔产量为57.6％。
实施例15
用FERMASE NATM 150从6-APA和HPGMeHCl合成AMOX的放大以及AMOX的纯化：50ml规模。
酶的耦合是使用一个250ml、工作体积为50ml、底部有三个出口的圆柱形夹套玻璃反应器进行。混合是通过具有可变速控制的三叶浆式叶轮完成。反应是在恒定转速为300+/-5的搅拌下进行。
1.296克的6-APA、相当于120mmoles和3.48克的HPGMeHCl、相当于320mmoles加入到反应器中，分散开以后，用1∶1M的氨水调整PH值在6.4到7.4之间。最终调整PH值到6.3、体积到50ml后，将FERMASE NATM150加入到初始合成反应中。装满的酶相当于装填的178UAH penG如本文其他地方提到的每克β-内酰胺核子。
酶耦合是在28℃和通过反应监控的PH条件下进行。样品在固定的时间间隔抽取并用高效液相色谱分析。反应随着6-APA的转化百分数和随之AMOX的增加而终止。将酶从反应体系中撤离并用20ml的水清洗三次，直到所有的沉淀都从酶上清洗下来。酶将一直保存在5℃环境中直到下次使用。固定化酶撤离后溶液冷却到5℃并将PH调整到6.3。出现的沉淀经过过滤并将剩余母液的PH值调整到8到9。出现的沉淀也经过过滤。所得的沉淀均进行真空干燥。6-APA转化为AMOX的转化率大约为91.8％。高效液相色谱分析显示AMOX的纯度达到98.2％，通过6-APA转化的AMOX的摩尔产量为57％。
实施例16
用FERMASE NATM 150从6-APA和HPGMeHCl合成AMOX的放大以及AMOX的纯化：50ml规模。
酶的耦合是使用一个250ml、工作体积为50ml、底部有三个出口的圆柱形夹套玻璃反应器进行。混合是通过具有可变速控制的三叶浆式叶轮完成。反应是在恒定转速为300+/-5的搅拌下进行。
1.51克的6-APA、相当于140mmoles和3.48克的HPGMeHCl、相当于320mmoles加入到反应器中，分散开以后，用1∶1M的氨水调整PH值在6.4到7.4之间。最终调整PH值到6.3、体积到50ml后，将FERMASE NATM150加入到初始合成反应中。装满的酶相当于装填的178UAH penG如本文其他地方提到的每克β-内酰胺核子。
酶耦合是在28℃和通过反应监控的PH条件下进行。样品在固定的时间间隔抽取并用高效液相色谱分析。反应随着6-APA的转化百分数和随之AMOX的增加而终止。将酶从反应体系中撤离并用20ml的水清洗三次，直到所有的沉淀都从酶上清洗下来。酶将一直保存在5℃环境中直到下次使用。固定化酶撤离后溶液冷却到5℃并将PH调整到6.3。出现的沉淀经过过滤并将剩余母液的PH值调整到8到9。第二次出现的沉淀也经过过滤。所得的沉淀均进行真空干燥。6-APA转化为AMOX的转化率大约为94％。高效液相色谱分析显示AMOX的纯度达到98.54％，AMOX的摩尔产量为70％。
实施例17
用FERMASE NATM 150从6-APA和HPGMeHCl合成AMOX的放大以及AMOX的纯化：100ml规模。
酶的耦合是使用一个250ml、工作体积为100ml、底部有三个出口的圆柱形夹套玻璃反应器进行。混合是通过具有可变速控制的三叶浆式叶轮完成。反应是在恒定转速为300+/-5的搅拌下进行。2.16克的6-APA、相当于100mmoles和6.96克的HPGMeHCl、相当于320mmoles加入到反应器中，分散开以后，用1∶1M的氨水调整PH值在6.4到7.4之间。最终调整PH值到6.3、体积到100ml后，将FERMASE NATM150加入到初始合成反应中。装满的酶相当于装填的178UAH penG如本文其他地方提到的每克β-内酰胺核子。酶耦合是在28℃和通过反应监控的PH条件下进行。样品在固定的时间间隔抽取并用高效液相色谱分析。反应随着6-APA的转化百分数和随之阿莫西林的增加而终止。将酶从反应体系中撤离并用20ml的水清洗三次，直到所有的沉淀都从酶上清洗下来。酶将一直保存在5℃环境中直到下次使用。固定化酶撤离后溶液冷却到5℃并将PH调整到6.3。出现的沉淀经过过滤并将剩余母液的PH值调整到8到9。沉淀出现并过滤。所得的沉淀均进行真空干燥。6-APA转化为AMOX的转化率大约为95％。高效液相色谱分析显示AMOX的纯度达到98.48％，AMOX的摩尔产量为74.9％。
实施例18
用FERMASE NATM 150从6-APA和HPGMeHCl重复合成AMOX，以及AMOX的纯化：酶循环。
反应的进行是使用一个250ml、工作体积为100ml、底部有三个出口的圆柱形夹套玻璃反应器。混合是通过具有可变速控制的三叶浆式叶轮完成。3.88克的6-APA、相当于180mmoles和6.96克的HPGMeHCl、相当于320mmoles加入到反应器中，分散开以后，用40％的氢氧化钠调整PH值在6.4到7.4之间。最终调整PH值到6.3、体积到100ml后，将15克ww的FERMASE NATM150(AH penG为146IU/g湿重，724IU/干重，AS Amox：45.7U每克湿重，221U/g干重)加入到初始合成反应中。装满的酶相当于装填的576UAH penG如本文其他地方提到的每克β-内酰胺核子。
酶耦合式在28℃和通过反应监控的PH条件下进行。样品在固定的时间间隔抽取并用高效液相色谱分析。反应随着6-APA的转化百分数和随之AMOX的增加而终止。将酶从反应体系中撤离并用50ml的水清洗三次，直到所有的沉淀都从酶上清洗下来。酶将一直保存在5℃环境中直到下次使用。固定酶撤离以后，AMOX通过在实施例16中描述的下游过程分离。酶可循环使用多个周期(如表9所示的25个循环次数)。
表9
  循环数   AMOX   ％HPLC   摩尔百分数   转化百分数
  序号   克数   纯度   产量   (6-APA)
  1   6.31   100.25   85   94.73
  2   6.36   98.83   85.5   92.20
  循环数   AMOX   ％HPLC   摩尔百分数   转化百分数
  3   6.27   100.51   83.88   89.76
  4   6.29   102.03   84.6   94.56
  5   6.12   101.5   82.32   90.28
  6   6.3   101.44   84.74   87.40
  7   6.3   100.43   84.74   85.16
  8   6.13   101.57   82.45   91.97
  9   6.15   97.86   82.73   92.41
  10   6.26   98.23   84.21   85.08
  11   6.21   99.45   83.53   83.10
  12   6.19   98.26   83.26   93.92
  13   6   101.27   80.71   81.10
  14   5.89   102.81   79.23   71.18
  15   5.63   95.4   75.73   83.35
  16   5.84   103.5   78.55   87.31
  17   5.84   95.57   78.55   86.35
  18   5.8   98.55   78   88.45
  19   5.8   99.98   78   86.99
  20   6.45   99.52   86.76   87.16
  21   5.79   100.75   77.8   85.8
  22   6.58   99.93   88.51   86.22
  23   5.68   100.55   76.4   84.56
  24   5.98   100   80.44   67.63
  循环数   AMOX   ％HPLC   摩尔百分数   转化百分数
  25   6.06   97.78   81.5   64.77
6-APA的平均转化率为85.66，平均摩尔产量为82.02。
实施例19
使用FERMASE NA 150从6-APA和PGMeHCl合成氨比西林三水合物。酰基原料/亲核试剂比率为1.5。间歇反应在PH为5.9、20℃下进行。
一个夹套反应器(体积为250ml)，底部装有滤网(125μm，尼龙)和搅拌器，用94ml软化水(25℃)、8.827g6-APA(纯度为98％，40.0mmoles的亲核试剂)装满，并用40％的氢氧化钠将PH值调整到7.5。然后，加入12.473gPGMeHCl(纯度为97％、60.0mmoles的酰基原料)，并用40％的氢氧化钠将PH值调整到5.9。随后，将重量为6g(w/w)的FERMASE NATM150转入反应器中，开始搅拌(t＝0分钟)，温度保持在20℃。大约70分钟后，形成AMP结晶，悬浮液的粘度在增强。在反应过程中PH值保持在5.9不变。360分钟后转化率达到了94.6％Wn。合成AMP的初始速率(AS Amp)相当于351.1U/g dw催化剂，形成PG的速率相当于56.4U/g dw催化剂。S/Hinit的比值为6.0。最后剩余反应物浓度见表9。转化的过程如图5.a(VA/VI)所示。合成氨比西林的过程中的反应物通过高效液相色谱的方法测定，用Tessek柱5μC8，250×4mm(Tessek，捷克共和国)在恒温28℃下，流动相为0.05M、PH值为6.0每升含有0.5ml三乙胺和40％甲醇的磷酸钠缓冲液，流速为0.5ml/分钟。监测到的高峰在215nm。
样品制备：反应混合物用含有0.05％十二烷基硫酸钠的流动相稀释400倍，离心分离(14000rmp，10分钟)并注入(体积为10μl)。6-APA、PG、AMP和PGMeHCl在高效液相色谱中保留的时间分别为5.9、6.85、8.6和15.3。
反应混合物用30ml水稀释，催化剂在真空过滤下从AMP悬浮液中分离。晶体通过离心过滤从母液中分离。酶催化剂用母液清洗三次，最后一次用20ml的水清洗。晶体悬浮在母液(清洗液)中，用20％的盐酸调节PH为1.5呈酸性使其溶解，通过纤维滤网在真空下过滤使溶液澄清，并在冰水浴中冷却。将溶液的PH值调整到4.2，并将悬浮液在冰箱中存储16小时。然后晶体通过离心分离，用冰丙酮(-18℃)清洗并干燥。分离所得的13.2gAMP占总产量的76％。
实施例20
使用FERMASE NA 150从6-APA和PGMeHCl合成AMP。酰基原料/亲核试剂比率为1.35。间歇反应在PH为5.9、20℃下进行。
一个与例19类似的反应器，用90ml软化水(25℃)、8.827g6-APA(纯度为98％，40mmoles的亲核试剂)装满，并用40％的氢氧化钠将PH值调整到5.9。然后，加入11.226gPGMeHCl(纯度为97％、54mmoles的酰基原料)，并用40％的氢氧化钠将PH值调整到6.3。随后，将重量为10g(w/w)的FERMASE NATM150转入反应器中，开始搅拌(t＝0分钟)，温度保持在20℃。大约50分钟后，形成CMP结晶，悬浮液的粘度在增强。在反应过程中PH值保持在5.9不变。360分钟后转化率达到了94.6％Wn。合成AMP的初始速率(AS Amp)相当于272.2U/g dw催化剂，形成PG的速率相当于25.8U/g dw催化剂。S/Hinit的比值为10.55。最后剩余反应物浓度见表9。转化的过程如图5.b(VB/VI)所示。产品像例19一样同样分离。分离所得的13.3g的AMP(纯度为95.7％)占产量的82.5％。
表9氨比西林合成结果总表
Figure GPA00001009006800281
1)AH PenG＝110U/g ww；
750U/g dw；PH8，37℃
实施例21
使用FERMASE NA 150从7-ADCA和PGMeHCL合成头孢氨苄水合物(CEX)。酰基原料/亲核试剂比率为1.5。间歇反应在PH为6.3、25℃下进行。
一个与例19类似的反应器，用91ml软化水(25℃)、5.18g7-ADCA(重结晶、纯度为99％，24.0mmoles的亲核试剂)装满，并用40％的氢氧化钠将PH值调整到7.5。然后，加入7.49gPGMeHCl(纯度为97％、40.5mmoles的酰基原料)，并用40％的氢氧化钠将PH值调整到6.3。随后，将重量为9g(w/w)的FERMASE NA TM150转入反应器中，开始搅拌(t＝0分钟)，温度保持在25℃。大约50分钟后，形成CEX结晶，悬浮液的粘度在增强。PH值缓慢降低到6.3时保持不变。210分钟后转化率达到了88.5％Wn。合成CEX的初始速率(AS Cpx)相当于139U/g dw催化剂，形成PG的速率相当于21.5U/g dw催化剂。S/Hinit的比值为6.5。最后剩余反应物浓度见表10。转化的过程如图6.a(VI/VI)所示。合成头孢氨苄的过程中的反应物通过高效液相色谱的方法测定，用Tessek柱5μC8，250×4mm(Tessek，捷克共和国)在恒温28℃下，流动相为0.05M、PH值为6.0每升含有0.5ml三乙胺和40％甲醇的磷酸钠缓冲液，流速为0.5ml/分钟。监测到的高峰在215nm。
样品制备：反应混合物用含有0.05％十二烷基硫酸钠的流动相稀释200倍，离心分离(14000rmp，10分钟)并注入(体积为5-10μl)。7-ADCA、PG、CEX和PGMeHCl在高效液相色谱分析中保留的时间分别为5.85、6.85、8.2和15.3。
实施例22
用FERMASE NA 150从7-ADCA和PGMeHCl合成CEX，酰基原料/亲核试剂的比率为1.34，间歇反应在PH为6.3、温度为25℃下进行。
一个与例19类似的反应器，用94ml软化水(25℃)、6.56g7-ADCA(重结晶、纯度为99％，30.3mmoles的亲核试剂)装满，并用40％的氢氧化钠将PH值调整到7.5。然后，加入8.41gPGMeHCl(纯度为97％、40.5mmoles的酰基原料)，并用40％的氢氧化钠将PH值调整到6.3。随后，将重量为6g(w/w)的FERMASE NATM 150转入反应器中，开始搅拌(t＝0分钟)，温度保持在25℃。大约70分钟后，形成CEX结晶，悬浮液的粘度在增强。PH值缓慢降低到6.3时保持不变。300分钟后转化率达到了88.5％Wn。合成CEX的初始速率(AS Cpx)相当于208U/g dw催化剂，形成PG的速率相当于18.5U/g dw催化剂。S/Hinit的比值为11.3。最后剩余反应物浓度见表10。转化的过程如图6.b(VI/VI)所示。
表10头孢氨苄合成结果总表
Figure GPA00001009006800291
Figure GPA00001009006800301
1)AH PenG＝110U/g ww；750U/g dw；PH8，37℃

Claims (22)

1.一种利用青霉素酰化酶作为生物催化剂合成β-内酰胺抗生素的方法，其中所述的青霉素酰化酶生物催化剂是来自于在大肠杆菌BL21CCM7394中表达的无色菌CCM4824，在其特征在于包括：
f、利用溶剂和化学清洁剂或金属螯合物来增加细胞通的透性，从而以化学方法提取青霉素酰化酶；
g、用分级沉淀和层析对可溶性酶进行纯化；
h、在-2到2℃的温度下，利用比率范围为15∶1到20∶1的丙烯酰胺和N，N’-二甲基乙二胺对上述酶进行固定化；
i、通过与戊二醛交联稳定固定化酶，以获得粒子尺寸在100到300微米的粗粒子，优选的粒子尺寸为150到250微米之间；
j、利用上述固定青霉素酰化酶催化酰化带有活性酰基原料的亲核试剂，以获得具有较高产量和纯度的β-内酰胺抗生素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的溶剂选自甲苯、乙酸乙酯、氯仿和丁酯。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的化学清洁剂或金属螯合物选自EDTA、溴棕三甲铵、尿素和十二烷基硫酸钠。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的化学提取是利用1到3％w/v氯仿和0.1到0.2％w/v十二烷基硫酸钠的混合物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的提取时的温度为15到35℃、优选是在28到30℃的温度下提取6到12小时。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述提取过程中的PH值保持在5.5到9.0的范围内，优选为6.5到7.5之间。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的纯化过程是使用硫酸铵进行处理。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的纯化是使用离子交换层析。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酶的固定化包括聚合形式的酶。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述酶蛋白的聚合是使用相当于饱和度为30到70％的硫酸铵完成的。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述酶的固定化过程是在硫酸钠或钾盐缓冲溶液中进行。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的固定化还包括与戊二醛的交联。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于所使用的戊二醛的浓度为2mM到8mM，优选在4mM到6mM之间。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的固定化还包括与浓度范围为0.3到0.5％(w/v)的戊二醛的二次交联。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的亲核试剂选自6-氨基青霉烷酸或7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酰基原料选自D-对羟基苯甘氨酸甲酯或D-对羟基苯甘氨酸氨基化合物，或是D-苯甘氨酸甲酯或D-苯甘氨酸氨基化合物。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述抗生素的合成时，适宜的PH值为5.2到7.2之间。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述抗生素的合成还包括通过降低上述反应混合物的PH值，将一部分β-内酰胺抗生素从反应混合物中去除。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于所述反应混合物的PH值通过增加酸，优选为浓盐酸来调节。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述β-内酰胺抗生素是阿莫西林，该抗生素由6-氨基青霉烷酸与D-羟苯甘氨酸甲酯酰化合成，其中6-氨基青霉烷酸与D-羟苯甘氨酸甲酯的摩尔比率范围为1.2到4.5，更优的在1.5到1.8之间。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的β-内酰胺抗生素是氨比西林，该抗生素由6-氨基青霉烷酸与D-苯甘氨酸甲酯酰化合成，其中6-氨基青霉烷酸与D-羟苯甘氨酸甲酯的摩尔比率范围为1.2到4.5，更优的在1.3到1.7之间。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的β-内酰胺抗生素是头孢氨苄，该抗生素由7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸和D-苯甘氨酸甲酯酰化合成，其中7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸与D-羟苯甘氨酸甲酯的摩尔比率范围为1.2到4.5，更优的在1.5到1.7之间。
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