CN117247927A - 一种头孢菌素c酰化酶的人工合成及其突变体应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人工合成的头孢菌素C酰化酶及突变体的基因及其编码蛋白和应用。所述头孢菌素C酰化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本人工合成头孢菌素C酰化酶用于催化头孢菌素C合成头孢类药物中间体，经过理性设计进行蛋白质改造获得突变体。本头孢菌素C酰化酶及其突变体可催化头孢菌素类似物生成头孢类药物关键中间体母核，为生物酶法制备头孢类药物提供了新型的酰化酶。

Description

一种头孢菌素C酰化酶的人工合成及其突变体应用

技术领域

本发明涉及了一种人工合成的头孢菌素C酰化酶及其突变体在合成头孢菌素母核中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanicacid,7-ACA)是头孢菌素(β-内酰胺类)类药物的重要中间体之一。由于头孢菌素类抗生素具有抗菌谱广、疗效好、毒性低、同其他抗生素无交叉耐药性、且与青霉素较少产交叉过敏反应等优点，近年来已经成为抗感染治疗中最重要的有效药物。头孢菌素C(Cephalosporin C,CPC)可经生物发酵、化学提炼制取，再经化学催化或酶催化水解获得7-ACA。头孢羟氨、头孢拉定、头孢克罗等国外具有较高市场价值的抗生素目前均采用7-ACA作为中间体合成。7-ACA的化学合成法过程长、步骤多、反应条件苛刻、产生大量的三废，目前已较少应用。目前，酶法合成7-ACA主要利用头孢菌素C酰化酶，但其合成技术仍有待改善，产量、质量上有待提高。随着头孢菌素C酰化酶在工业应用中价值的不断提高,如何提高酶活和产量成为研究者日益关注的问题。作为酶法生产7-ACA过程的关键酶，对头孢菌素C酰化酶基因工程菌发酵方法的深入研究具有重要的理论意义和重大的社会价值。

酶法催化CPC生产7-ACA主要包括两步酶法和一步酶法。其中，两步酶法是通过D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase，DAAO)将CPC转化为戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(glutaryl-7-aminocephalosporanicacid，GL-7-ACA)；然后通过GL-7-ACA酰化酶将GL-7-ACA转化为7-ACA。该过程中存在酶解路线长、氧化条件控制难度大、副产物多、产率低于化学裂解法等缺点。因此目前更多地采用一步酶法，即利用CPC酰化酶催化CPC酰胺键的水解反应。但是，目前自然界中发现的可水解CPC的头孢菌素C酰化酶菌株活力较低。因此，亟需挖掘或开发新的活力高、稳定性好的头孢菌素C酰化酶供产业化应用。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种人工合成的头孢菌素C酰化酶及其突变体。所述头孢菌素C酰化酶的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

所述头孢菌素C酰化酶突变体是在所述SEQ ID NO：1所示序列上进行在第L161、H296、H309、E320、A421位进行突变得到的蛋白质。

所述头孢菌素C酰化酶突变体进行的选自如下六种的任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、或全部突变得到的蛋白质：

(1)将头孢菌素C酰化酶第161的亮氨酸突变为丙氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸；

(2)将头孢菌素C酰化酶第296位的组氨酸突变为亮氨酸、丝氨酸、谷氨酸、苏氨酸；

(3)将头孢菌素C酰化酶第309位的组氨酸突变为丙氨酸、半胱氨酸；

(4)将头孢菌素C酰化酶第320位的谷氨酸突变为苏氨酸；

(5)将头孢菌素C酰化酶第421位的丙氨酸突变为缬氨酸、苯丙氨酸；

优选地，其为下述组合突变的突变体：L161A/E320T、L161Q/A421F、L161S/A421V、H296T/A421V、H296S/A421F、H296E/H309A、H296L/H309C、E320T/A421F、L161A/E320T/A421F、L161Q/H296L/H309C/A421F。

本发明公开了一种所述头孢菌素C酰化酶及其突变体的编码基因与应用。

本发明相应提供上述突变头孢菌素C酰化酶的编码核酸分子，其表达盒，含有所述编码基因或其表达盒的重组载体、含有所述基因或所述表达盒或所述重组载体的重组微生物。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

所述的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述突变头孢菌素C酰化酶的DNA，该DNA不但可包括启动突变头孢菌素C酰化酶编码基因转录的启动子，还可包括突变头孢菌素C酰化酶转录的终止子。更进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。

所述的核酸分子的重组载体可为携带有所述突变头孢菌素C酰化酶编码基因的细菌质粒(如在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，具体如pET-28a等)、噬菌体、酵母质粒(如YEp系列载体等)或逆转录病毒包装质粒。

所述重组载体为将所述核酸分子***表达载体中得到的载体。

所述的含有编码所述突变头孢菌素C酰化酶的核酸分子的重组微生物可为携带有头孢菌素或所述头孢菌素突变蛋白质编码基因的酵母、细菌、藻或真菌，如大肠杆菌等。

本发明还提供了一种制备头孢菌素母核的方法，所述方法包括：以头孢菌素类似为底物，利用所述头孢菌素C酰化酶，或所述头孢菌素C酰化酶突变体，或其重组细胞或所述重组细胞的裂解产物进行催化反应，得到头孢菌素母核。具体的反应是催化化合物I生成化合物II：

其中R为-OCOCH₃、H。

优选地，本发明采用固定化酶的方式，例如树脂固定酰化酶的方式，更具体以环氧树脂，氨基树脂，大孔吸附树脂为载体，与酰化酶进行固定化，获得具有高转化活性的固定化酶。

上述方法中，所述重组细胞可通过向生物细胞中导入能表达所述突变头孢菌素C酰化酶的重组载体获得。所述生物细胞可为微生物。所述微生物可为大肠杆菌，也可以是其他菌。在本发明的一个实施例中，所述微生物为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述反应的温度可为10-40℃，具体可为20℃；所述反应的pH 6.5～9.5的磷酸盐缓冲液中进行的，具体为8.0。一般可为0.5-24小时，具体可为1小时。所述重组细胞的裂解产物可由裂解所述重组细胞得到。

本发明提供的人工合成的头孢菌素C酰化酶可用于催化头孢菌素合成头孢菌素母核，其所得突变体可催化头孢菌素类似物生产头孢菌素母核，为生物酶法制备头孢菌素母核提供了新的途径。

本发明公开的人工合成的头孢菌素C酰化酶是首次发现可用于催化头孢菌素合成头孢菌素母核，更进一步的，本发明经过理性设计对进行蛋白质改造和突变体构建获得突变体，可催化头孢菌素类似物生产头孢菌素母核，为生物酶法制备头孢菌素母核提供了新型的酰化酶。

附图说明

图1是本发明中酰化酶催化头孢菌素C水解反应路线图。

图2是本发明中7-ACA和CPC的HPLC检测结果。

图3是本发明中CPC酰化酶E742用于突变体构建相关残基位点。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1酰化酶序列挖掘及酶活表征

1.1酰化酶序列挖掘及人工合成

使用BLAST工具通过序列比对，从(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)数据库中挖掘潜在序列，根据不同的物种来源以及序列相似性(50％-85％)，共选取125序列，并基于此产生共有氨基酸序列(E742，SEQ ID NO.1)。利用全基因合成的方式合成E742氨基酸序列的核苷酸序列并将合成的核苷酸连接到到pET-28载体上，获得含有酰化酶基因的表达载体。

1.2.头孢菌素C酰化酶的诱导表达与纯化

将上述的表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，，菌液均匀的涂布在卡那霉素抗性(浓度为50μg/mL)的LB平板上，37℃恒温条件下培养14h后长出单菌落，即为含有头孢菌素C酰化酶核酸序列的转化子。将上述转化子转接到含5mL的LB培养基(卡那霉素浓度为50μg/mL)的试管中，37℃，220rpm振荡培养过夜，即为种子液；然后按1％的接种量接种到100mL的TB培养基(卡那霉素浓度为50μg/mL)中，37℃，220rpm振荡培养3h左右，当菌液的OD₆₀₀值达到0.6-0.8时加入IPTG(0.1mM)，25℃、220rpm培养16h；离心10min收集菌体(4℃，4000rpm)。磷酸盐缓冲液(50mM，pH8.0)洗菌，离心，随后加入磷酸盐缓冲液(10mL/g菌)重悬可得到菌悬液。使用超声破碎15min后，离心60min(4℃，12000rpm)，取上清获得粗酶液。

1.3酰化酶蛋白纯化

使用Ni⁺柱纯化：使用缓冲液A(100mM磷酸钾盐，500mMNaCl，30mM咪唑，pH 8.0)预平衡后，将1.2收集到的野生型粗酶液过滤加入Ni⁺柱，使用缓冲液B(100mM磷酸钾盐，500mM氯化钠，250mM咪唑，pH8.0)洗脱并收集目的蛋白，经超滤浓缩、脱盐获得纯化蛋白，于4℃冷藏。

通过Bradford法对纯化后得到的目的蛋白浓度进行测定。使用SDS-PAGE凝胶电泳对目的蛋白进行分析。

1.4头孢菌素C酰化酶催化CPC生成7-ACA

以艾美科健株式会社发明专利CN103937764B中报道的突变体PM2为对照，对酰化酶的酶活进行测试。

通过HPLC分析CPC转化产物，从而测定1.3中获得的纯酶酶活，所选用色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6*150mm 4um)。反应体系：纯酶0.1mg，底物CPC(40mM)，37℃，1000rpm反应30min，取100μL样品，使用甲醇稀释十倍后用HPLC检测酶活。

HPLC流动相配比为：96％磷酸盐缓冲液(pH7.0，50mM)，4％甲醇(v/v)，流速0.8mL/min，检测波长为254nm，柱温箱温度为25℃。

酶活定义：每分钟催化CPC产生1微摩尔(μmol)7-ACA所需要的酶量定义为1U。

表1.酰化酶酶活测试

实施例2构建酰化酶定点突变体

2.1单点突变构建

以酰化酶E742为模板，使用SWISS-MODEL进行建模，随后进行对接并建立底物置入模型，分析关键作用位点，构建以下单点突变体：L161A、L161S、L161Q、H296T、H296S、H296E、H296L、H309A、H309C、E320T、A421V、A421F。

针对突变位点设计引物进行定点突变，相应的引物如表2所示。

表2引物序列表

具体构建方法如下：

1)PCR

分别取2μL表2中引物L161Q-F、L161A-F、L161S-F作为上游引物，取表2中L161-R作为下游引物，扩增突变体L161Q、L161A、L161S；取2μL表2中引物H296T-F、H296S-F、H296E-F、H296L-F作为上游引物，取表2中H296-R作为下游引物，扩增突变体H296T、H296S、H296E、H296L；取2μL表2中引物H309A-F、H309C-F作为上游引物，取表2中H309-R作为下游引物，扩增突变体H309A、H309C；取2μL表2中引物E320T-F作为上游引物，取表2中E320T-R作为下游引物，扩增突变体E320T；取2μL表2中引物A421V-F、A421F-F作为上游引物，取表2中A421V-R作为下游引物，扩增突变体A421V。

PCR程序：94℃保温2min，(98℃保温15s，55℃保温30s，72℃保温5min)×28个循环，72℃保温10min。

2)基因突变体工程菌株构建

将获得的PCR产物进行如下操作：向PCR产物中加入1μL的Dpn I用于消化质粒模板，37℃恒温条件下放置3h。取2μL酶消化后的PCR产物电转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，随后将菌液均匀涂布在卡那霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，37℃恒温条件下培养14h后长出单菌落，即为酰化酶E742的基因突变体菌株。

2.2构建酰化酶组合突变体

在2.1构建的突变体的基础上，考虑到位点与底物以及位点之间的相互作用力，构建如下组合突变体：L161A/E320T、L161Q/A421F、L161S/A421V、H296T/A421V、H296S/A421F、H296E/H309A、H296L/H309C、E320T/A421F、L161A/E320T/A421F、L161Q/H296L/H309C/A421F，突变体构建所用引物，见表2。

具体构建方法如下：

1)PCR

分别以质粒L161S、H296T为模板，取2μL表2中A421V-F、A421-R作为上、下游引物，扩增突变体L161S/A421V、H296T/A421V；分别以质粒L161Q、H296S、E320T为模板，取2μL表2中A421F-F、A421-R作为上、下游引物，扩增突变体L161Q/A421F、H296S/A421F、E320T/A421F；以质粒L161A为模板，取2μL表2中引物E320T-F、E320T-R作为上、下游引物，扩增突变体L161A/E320T；以质粒H296E为模板，取2μL表2中引物H309A-F、H309-R作为上、下游引物，扩增突变体H296E/H309A；以质粒H296L为模板，取2μL表2中引物H309C-F、H309-R作为上、下游引物，扩增突变体H296L/H309C；以质粒L161A为模板，取2μL表2中引物E320T-F、A421F-R作为上、下游引物，扩增突变体L161A/E320T/A421F；以L161Q/A421F为模板，取2μL表2中引物H296L-F、H309-R作为上、下游引物，扩增突变体L161Q/H296L/H309C/A421F。

PCR程序：94℃保温2min，(98℃保温15s，55℃保温30s，72℃保温5min)×28个循环，72℃保温10min。

2)基因突变体工程菌株构建

将获得的PCR产物进行如下操作：向PCR的产物中加入1μL的Dpn I用于消化质粒模板，37℃恒温条件下处理3h。取2μL酶消化后的PCR产物并经电转化进大肠杆菌BL21(DE3)中，将电转后的大肠杆菌BL21(DE3)菌液均匀的涂布在卡那霉素抗性(浓度为50μg/mL)的LB平板上，37℃恒温条件下培养14h后长出单菌落，即为酰化酶E742的基因突变体菌株。

实施例3.头孢菌素C酰化酶突变体催化7-ACA的合成

3.1细胞培养

分别挑取实施例2中所构建的突变体的单克隆转接到含5mL的LB培养基(卡那霉素浓度为50μg/mL)的试管中，37℃、220rpm振荡培养过夜，即为种子液；

以1％的接种量接种到100mL的TB培养基(卡那霉素浓度为50μg/mL)中，37℃、220rpm振荡培养3h左右，当菌液的OD₆₀₀值达到0.6-0.8时加入IPTG(0.1mM)，25℃，220rpm继续振荡培养16h；

4℃，4000rpm，离心10min收集菌体。用50mM pH8.0的磷酸盐缓冲液洗菌体，离心后称湿菌重，随后加入磷酸盐缓冲液(10mL/g菌)重悬可得到菌悬液。

3.2全细胞反应

通过HPLC测定产物生成从而获得的全细胞转化率，所选用色谱柱为AgilentZORBAX SB-C18(4.6*150mm 4um)。反应为1mL体系：3.1中所得全细胞取800μL用于反应，添加底物CPC(40mM)，37℃，1000rpm，反应30min。取100μL样品，使用甲醇稀释十倍后用HPLC测定转化率。

HPLC流动相配比为：96％磷酸盐缓冲液(pH7.0，50mM)，4％甲醇(v/v)，流速0.8mL/min，检测波长为254nm，柱温箱恒定为25℃。

表3.突变体全细胞对CPC的转化率

3.3粗酶液催化CPC合成7-ACA

按照实施例1的方式制备粗酶液，对获得突变体的粗酶液进行转化率验证。

反应体系(1mL)：底物CPC(40mM)，0.1ml酰化酶粗酶液，补加磷酸缓冲液至1mL。反应条件：37℃，1000rpm，30min，取100μL样品，使用甲醇稀释十倍后用HPLC测定转化率。

检测条件：色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18(4.6*150mm 4um)；流动相配为96％磷酸盐缓冲液(pH7.0，50mM)添加4％甲醇(v/v)；流速0.8mL/min；检测波长为254nm，柱温箱恒定为25℃。

表4组合突变体粗酶对CPC的转化率

实施例4头孢菌素C酰化酶突变体全细胞催化DAOC水解合成7-ADCA

DAOC是CPC的类似物，其结构区别仅为母核六元环侧链取代基，其中，DAOC为氢(-H)，而CPC为乙酰氧基(-OCOCH3)。

通过HPLC分析DAOC转化产物，获得全细胞转化率。其反应为1mL体系，取800μL3.1所得全细胞用于反应，加入底物DAOC(1mg/mL)，37℃，1000rpm，反应30min。取100μL样品，使用乙腈稀释十倍后用HPLC测定转化率。

液相检测条件：色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18(4.6*150mm 4um)；流动相配为95％甲酸铵，5％乙腈，流速1ml/min，检测波长254nm，柱温箱恒定为25℃。

表5头孢菌素突变体对DAOC的转化率

实施例5.固定化酰化酶催化CPC水解合成7-ACA

(1)环氧树脂、大孔吸附树脂固定化酰化酶突变体(H294S/A421F)

载体平衡：用固定化缓冲液，按照载体/缓冲液1:5(质量/体积比)的比例反复清洗3次，清洗完成后抽干。

载体和酰化酶比例调节：用固定化缓冲液溶解酶，载体和酶缓冲液的比例为1:4(质量/体积比)，该比例可进一步的在1:1到1:4之间进行优化。

将含酶的缓冲液和载体加入到反应器中，25℃，800rpm转速下反应3h，之后停止搅拌静置2h。

固定化后过滤收集固定化酶，使用280nm吸收波长测定上清液中蛋白含量，计算固定化率及产率。用蒸馏水清洗，重复3次。随后使用HPLC检测环氧树脂固定化酶的反应活性。

(2)氨基树脂固定化酶

载体平衡：固定化缓冲液，按照载体/磷酸盐缓冲溶液(50mM，pH8.0)1:5(质量/体积比)的比例反复清洗3次，清洗完过滤抽干。

用固定化缓冲液配置2％戊二醛溶液，将载体和戊二醛缓冲液以比例1:4(质量/体积比)加入，22℃，180rpm条件下搅拌1h。后用缓冲液清洗载体3遍，然后抽滤备用，存放到4℃冰箱中。

(3)固定化酶催化反应转化率测试

反应条件(总体系4ml)：固定化酰化酶(400mg)加入反应瓶中，投入底物CPC(40mM)，补加缓冲液至4ml，，37℃，1000rpm，反应30min。取100μL样品，使用甲醇稀释十倍后用HPLC测定转化率。

流动相配为96％磷酸盐缓冲液(pH7.0，50mM)添加4％甲醇(v/v)；流速1.0mL/min；检测波长为254nm，柱温箱恒定为25℃。检测转化率可以达到69％。

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120>一种头孢菌素C酰化酶的人工合成及其突变体应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211>774

<212> PRT

<213>人工序列

<400>1

MTMAAKTDREALRAALPPLDGELRLPGLAAPVTVLRDAWGIPHIRAAGAADAFFALGFVHAQDRLFQMELTRRRALGRAAEWLGAAAAEADILARRLGMEAACRRDFAALGAEARAMLEAYAAGVNAFLASGAPLPVEYALLGATPEPWEGWHSIAVMRRLGLLMGSVWFKLWRAAALPVVGAENVAKLRYDDGGRDLLCIPPGAEAARWEADLAALAPAIAALLEAAGGDASDAAGGGSNNWAVGPARSATGRPVLAGDPHRVFEIPNMYAQHHLACDAFDMIGLTVPGVPGFPHFAHNGRVAYCVTHAFMDIHDLYLERFDAGAAHALFRGGWEPVRRRRERIAVRGGAPREFEVVETRHGPVIAGDPASGTALALRSVQFAETDLSFDCLPRMLRAGSVEALFEATRGWGLIDHNLVAADTAGHIGHLVRARVPRRPRENGWLPVPGWTGEHEWQGWIPHEEMPRVIDPPGGLIVTANNRVVADDHPDYLCTDCHPPYRARRIAERLRADPAFRVEDAAAIHADTLSPNALLLRARLAALPAPGEPAAAALRQRLLAWDGRMEAGSVAATAYIALRRALTRILAERSGLAALAGHPWLAVAPGVAPLNQLWWALPALLRADDAALLGGWSWDEALGAALAEAAAAPAARPWGEAHRPRFAHPLSALFPEAAALLDPPALPIGGDGDTVLANGLVASAGPAATYGALARYVFDVGNWENSRWAVFHGASGHPGSPHYADQHAAWAACRMVPMLYGWDAIEAEARARQELRPA 774

Claims (10)

1.一种人工合成的头孢菌素C酰化酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种头孢菌素C酰化酶突变体，其特征在于：选自下组至少一个氨基酸被另一个氨基酸替代：如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中的L161、H296、H309、E320、A421。

3.根据权利要求2所述的头孢菌素C酰化酶突变体，其特征在于：

L161为丙氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸所取代；

H296为亮氨酸、丝氨酸、谷氨酸、苏氨酸所取代；

H309为丙氨酸、半胱氨酸所取代；

E320为苏氨酸所取代；

A421为缬氨酸、苯丙氨酸所取代；

优选地，其为下述组合突变的突变体：L161A/E320T、L161Q/A421F、L161S/A421V、H296T/A421V、H296S/A421F、H296E/H309A、H296L/H309C、E320T/A421F、L161A/E320T/A421F、L161Q/H296L/H309C/A421F。

4.根据如权利要求1所述的头孢菌素C酰化酶或权利要求2或3所述的头孢菌素C酰化酶突变体的下述（1）至（4）中任一种的生物材料：

（1）编码权利要求1所述的头孢菌素C酰化酶或权利要求2或3所述的头孢菌素C酰化酶突变体的核酸分子；

（2）含有（1）所述核酸分子的表达盒；

（3）含有（1）所述核酸分子的重组载体、或含有（2）所述表达盒载体；

（4）含有（1）所述核酸分子的重组微生物、或含有（2）所述表达盒的重组微生物、或含有（3）所述重组载体的重组微生物。

5.一种制备化合物II的方法，其包括以化合物I为底物，利用如权利要求1所述的头孢菌素C酰化酶或权利要求2或3所述的头孢菌素C酰化酶突变体催化反应，得到化合物II：

I

II

其中R为-OCOCH₃、H。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述如权利要求1所述的头孢菌素C酰化酶或权利要求2或3所述的头孢菌素C酰化酶突变体通过重组细胞表达获得，具体是通过向生物细胞中导入能表达如权利要求1所述的头孢菌素C酰化酶或权利要求2或3所述的头孢菌素C酰化酶突变体的重组载体实现。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：如权利要求1所述的头孢菌素C酰化酶或权利要求2或3所述的头孢菌素C酰化酶突变体以全细胞、粗酶液、粗酶粉、固定化酶或纯酶的形式发生催化作用。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的全细胞为含有编码如权利要求1所述的头孢菌素C酰化酶或权利要求2或3所述的头孢菌素C酰化酶突变体的核酸分子的重组微生物，优选是酵母、细菌、藻或真菌，如大肠杆菌等；

更进一步优选，所述的大肠杆菌为BL21（DE3）。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：催化反应是在浓度为40 mmol/L~60 mmol/L，pH 6.5~9.5的磷酸盐缓冲液中进行的。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述催化反应的温度为20～40 ℃；所述催化反应的时间为0.5～28 h。