CN117947137A - 用于合成头孢克洛的青霉素酰胺酶 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种酶催化制备头孢克洛的方法，包括如下步骤：以7‑氨基‑3‑氯‑3‑头孢烯‑4‑酸和D‑苯甘氨酸甲酯盐酸盐为底物，使用Oceanobacillus iheyensis来源的青霉素酰胺酶SEQ ID NO:1或者其突变体SEQ ID NO:3催化合成反应，得到头孢克洛，可以明显提高头孢克洛的合成效率及底物转化率。

Description

用于合成头孢克洛的青霉素酰胺酶

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及一种青霉素酰胺酶及其用于合成头孢克洛的方法。

背景技术

青霉素酰胺酶，又称青霉素G酰化酶(Penicillin G Amidase，E.C.3.5.1.11，简称PGA)是制备半合成β-内酰胺类抗生素中的重要用酶，该酶主要用于水解合成6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)等；同时PGA还可用于催化母核6-APA、7-ADCA、7-ACCA等与各种D-氨基酸侧链反应生成新的半合成β-内酰胺抗生素。另外，青霉素酰胺酶在一些手性化合物合成过程中可以用于保护羟基和氨基、拆分手性化合物等。但目前针对PGA水解性能应用报道相对较多，研究焦点大部分集中在其酶活性的提升。在制药工业中，酶催化反应的实际工艺涉及到多个方面，包括比活力、选择性、底物/产物抑制性、pH、温度、稳定性等。

头孢克洛(Cefaclor)化学名为(6R,7R)-7-[(R)-2-氨基-2-苯基乙酰胺基]-3-氯-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸一水合物，1975年由美国礼来公司研发，1982年作为第二代头孢菌素在美国上市，其抗菌谱较宽，对肺炎球菌、化脓性链球菌、葡萄球菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌和肺炎杆菌、流感嗜血杆菌、淋病双球菌、厌氧菌等均具有良好的抗菌活性，是临床上常用的口服类头孢菌素，多年来一直是全球畅销口服头孢类抗生素。

头孢克洛目前有化学合成和酶法合成两种工艺，其中化学合成多采用酰氯法和混合酸酐法，反应步骤多，条件苛刻，且污染严重。酶法工艺则是利用青霉素酰化酶催化7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-酸(7-ACCA)和D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐(D-PGM.HCl)合成头孢克洛。

酶法工艺的反应步骤少，操作简单，无毒害，成本低、收率高，是一种具有良好应用前景的绿色合成技术，工业上已经逐步取代化学合成工艺。但目前工业上的PGA对底物7-ACCA的合成活力相对较低，反应时间长，底物侧链比相对比较高，开发针对7-ACCA底物高合成活力的青霉素酰化酶成为该工业开发的重要方向。

发明人曾在专利CN105483105B中报道了无色杆菌Achromobacter sp.CCM 4824来源的青霉素G酰化酶突变体具有催化7-ACCA和D-PGM.HCl合成头孢克洛的较好性能，合成活力较高。

发明内容

目前工业化实施的酶法合成头孢克洛工艺普遍存在如下缺陷：低pH时酶活力较低，反应时间长，底物苯甘氨酸酯盐不稳定自身水解严重；而高pH反应时头孢克洛和底物苯甘氨酸酯盐易水解。因此反应整体显示出底物转化率低，母核7-ACCA反应残留高、侧链苯甘氨酸酯盐的加量大等问题，因此需要开发对母核7-ACCA的底物亲和力(底物高浓度耐受性)更高、且在低pH(比如pH6.8或更低)条件下合成活力高的酶，用于改善酶法合成头孢克洛的工艺。我们对于更多微生物来源的青霉素酰胺酶种类进行了广泛筛选，比较它们的立体专一性、合成比活力、pH适用范围、S/H值(合成产物/水解产物比值、合成/水解比值)、热稳定性等工业生产工艺指标。通过对数十种微生物来源的野生型青霉素酰胺酶进行对比，发现一种来源于伊平屋海岭海洋芽孢杆菌(伊赫氏海洋芽孢杆菌，Oceanobacillus iheyensis)的青霉素酰胺酶(UniProt序列号Q8CX57)对催化底物7-ACCA与D-PGM.HCl反应生成头孢克洛时具有较好的促合成性能，合成/水解比值即S/H值(产物头孢克洛与副产品D型-苯甘氨酸(D-PG)的摩尔比)相对较高，立体专一性高，但是在低pH时的酶活力偏低，导致D-PGM和7-ACCA底物反应添加摩尔比一直较高。于是接着对该酶进行随机突变，还得到了一些酶活力进一步提高的突变体。基于该研究，本发明包括如下技术方案。

一种酶催化制备头孢克洛的方法，包括如下步骤：以7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-酸(7-ACCA)和D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐(D-PGM.HCl)为底物，使用Oceanobacillus iheyensis来源的青霉素酰胺酶(UniProt序列号Q8CX57)或者其酶活力提高的突变体催化合成反应，得到头孢克洛。

其中，Oceanobacillus iheyensis来源的野生型青霉素酰胺酶(UniProt序列号Q8CX57)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：

MGERQREQVSQPKKKRRIRTKKILLGGLGSIFLLALIAFLFVNGYINKSLPQTEGTMELPMLDNEVTVITDEDGVPHIQAETARDMYIAQGYIQADRRMFQMELSRRQASGTLSEVVGEDALNQDKYFRTLGLRRAAEKSYEVYSEESVEVLEWFSTGVNAYMEEAKANNSLPVEFTLMDFEPEEWTPVDSLTIGKFMAFDLGGHWQQQAFNYYLLDNYEQEKAYELFPSYPENKPTIIQDEEIDIAASFEHAVIPHPFNGSNNWVVSGDKTASGMPLLADDPHLGLATPSIWLQMHLESGDGLNVSGVIFAGVPGIILGHNEQIAWGVTNTGPDVQQLYIEQRNPDNPHEFLFEDEWEEATVMEEPIKVKDGETVDYEVVETRHGPIVSEFASESGKDTVLSLRWTALDASTELEAIMEMNRATGWEEFEQGLEKFLVPAQNFVFASNDGTIAYKANGKIPIYEDGQDALLPLNGWEAESEWQGYIPYDELPTVINPEKGFIATANNQIAPDSYPYHISNVWAQPYRYERIAEVLESGDNFTAEDMQDLQMDQTDLRAREFVPIFQKVLEDTELTEQEKEALDALSEWDFVADKDAPQPLIFEHWMQAIQSTIYQQEIPQVMRELFSTQSQSTENVLRKAASGQKSQWIEDKGGIEVVLHDALENTMEKLTETYGEDLSAWKWGDYHQVQFHHPLSSVSPLLAFFLNNEDAIPVGGSGVTPMATSYDKETGEVDHGASWRFVIDTSDMQSGYHIVGPGQDGHFRSDWYHDQMNDWVEGNFHETRLDGAEGEELVLEPGE(SEQ ID NO:1)。

优选地，所述突变体为选自下述的多肽：

(a)氨基酸序列为SEQ ID NO:3的多肽；

(b)氨基酸序列与SEQ ID NO:3有90％以上、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性、且酶活力相比SEQ ID NO:3提高的多肽；

(c)氨基酸序列与SEQ ID NO:3有90％以上、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性、且S/H值(合成产物/水解产物比值、合成/水解比值)相比SEQ ID NO:3提高的多肽。

所述突变体是野生型青霉素酰胺酶的Q208E、L285A、A411V、S698G突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3：

MGERQREQVSQPKKKRRIRTKKILLGGLGSIFLLALIAFLFVNGYINKSLPQTEGTMELPMLDNEVTVITDEDGVPHIQAETARDMYIAQGYIQADRRMFQMELSRRQASGTLSEVVGEDALNQDKYFRTLGLRRAAEKSYEVYSEESVEVLEWFSTGVNAYMEEAKANNSLPVEFTLMDFEPEEWTPVDSLTIGKFMAFDLGGHWQEQAFNYYLLDNYEQEKAYELFPSYPENKPTIIQDEEIDIAASFEHAVIPHPFNGSNNWVVSGDKTASGMPLLADDPHAGLATPSIWLQMHLESGDGLNVSGVIFAGVPGIILGHNEQIAWGVTNTGPDVQQLYIEQRNPDNPHEFLFEDEWEEATVMEEPIKVKDGETVDYEVVETRHGPIVSEFASESGKDTVLSLRWTALDVSTELEAIMEMNRATGWEEFEQGLEKFLVPAQNFVFASNDGTIAYKANGKIPIYEDGQDALLPLNGWEAESEWQGYIPYDELPTVINPEKGFIATANNQIAPDSYPYHISNVWAQPYRYERIAEVLESGDNFTAEDMQDLQMDQTDLRAREFVPIFQKVLEDTELTEQEKEALDALSEWDFVADKDAPQPLIFEHWMQAIQSTIYQQEIPQVMRELFSTQSQSTENVLRKAASGQKSQWIEDKGGIEVVLHDALENTMEKLTETYGEDLSAWKWGDYHQVQFHHPLSGVSPLLAFFLNNEDAIPVGGSGVTPMATSYDKETGEVDHGASWRFVIDTSDMQSGYHIVGPGQDGHFRSDWYHDQMNDWVEGNFHETRLDGAEGEELVLEPGE(SEQ ID NO:3)。

在一种优选的实施方式中，上述酶催化反应温度为10～20℃，优选12-18℃，更优选15℃左右；反应体系pH值为pH6.0-8.0，优选pH6.2-7.0，更优选pH6.5左右。

应理解，本文中在表述数值特征时，术语“左右”或者“大约”是指所表示的本数可以有±10％、±9％、±8％、±7％、±6％或±5％的误差范围或浮动范围。

进一步地，上述反应中，所述青霉素酰胺酶或者其突变体除了呈酶形式存在外，还可以呈其表达微生物菌体形式。

上述微生物选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母。优选地，所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明第二个方面提供了一种青霉素酰胺酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

进一步地，本发明还提供了一种编码上述青霉素酰胺酶突变体SEQ ID NO:3的基因。

例如，上述基因的核苷酸序列可以为SEQ ID NO:4。

相应地，本发明还提供了一种DNA分子，其包含上述的基因比如SEQ ID NO:4。

本发明另一个方面提供了一种质粒，其包含上述的DNA分子。

上述的质粒载体可以选自PET系列，比如载体是pET22b、pET24a、pET28a等，但并不受限于此。

本发明的另一个方面提供了一种微生物，其表达如上述的编码基因比如SEQ IDNO:4。优选是转化了上述质粒的转化子。

本发明提供的青霉素酰胺酶突变体SEQ ID NO:3具有较高的底物高浓度耐受性，即便在底物7-ACCA浓度高达15wt％时也没有底物抑制性，可以在pH6.5的体系下催化450mM的7-ACCA和468mM的D-PGM.HCl快速反应，有利于促进酶法生产头孢克洛的工业化。

附图说明

图1是表达野生型青霉素酰胺酶的质粒pET24a-OiPGA图谱。

图2是野生型和突变体不同pH条件下合成酶活力对比图谱。

图3是酶催化反应结束时的HPLC图谱。

具体实施方式

发明人筛选得到的来源于伊平屋海岭海洋芽孢杆菌(Oceanobacillusiheyensis)的野生型青霉素酰胺酶(UniProt序列号Q8CX57)在催化7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-酸(7-ACCA)和D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐(D-PGM.HCl)合成头孢克洛的反应中展示出较好的底物亲和力和低pH及低温下酶活力。为了提高该酶在工业上应用的可行性，增强其合成性能，我们继续对该酶进行突变。经过数轮易错PCR的随机突变库高通量筛选，最终获得了几个酶活力提高明显的突变体，包括一个(Q208E、L285A、A411V、S698G)突变体，其酶活力比野生型高出近3倍，并且S/H值(合成产物/水解产物比值)也有了提高。

在本文中，术语“合成性能”是指青霉素酰胺酶催化7-ACCA和D-PGM.HCl合成头孢克洛的能力(表示为合成活力、或者合成比活、酶活力)和合成产物/水解产物(S/H)比值的综合性能。为简要起见，本文中有时将“合成产物/水解产物”表示为“合成/水解”或“S/H”。

本文中，上述所用术语“(酶活力、S/H值)提高”、“提升”、“增强”或“增加”表示相较于参考水平提高至少50％以上，例如相较于参考水平的至少80％以上、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、或至少约5倍的提高。

在本文中，术语“野生(型)青霉素酰胺酶”、“野生(型)酶PGA”、“野生(型)酶”表示相同的意义，都是指氨基酸序列为SEQ ID NO:1的青霉素酰胺酶(UniProt序列号Q8CX57)。

相对应地，术语“青霉素酰胺酶突变体”、“突变青霉素酰胺酶”、“PGA突变体”和“突变酶”表示相同的意义，都是指青霉素酰胺酶的酶活力提高的突变体例如SEQ ID NO:3。为简要起见，有时为了表述方便起见，在本发明中可以将野生型青霉素酰胺酶与其突变体统称为“青霉素酰胺酶”，只要不与野生酶SEQ ID NO:1混淆即可。

所述的“突变”包括但不限于氨基酸残基的替换、删除、***、化学修饰，优选是正向突变即酶活力提高的突变。所述取代可以是非保守取代、保守取代或非保守取代和保守取代的组合。“保守的”氨基酸取代或突变是指具有相似侧链的残基的可互换性，并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。然而，如本文所用，如果保守的突变可以代替地为脂肪族至脂肪族、非极性至非极性、极性至极性、酸性至酸性、碱性至碱性、芳族至芳族、或限制残基至限制残基的取代，则保守的突变不包括亲水至亲水、疏水至疏水、含羟基至含羟基或小残基至小残基的取代。本技术领域公知，保守性置换的常见情况包括：芳香族氨基酸F、W、Y之间的相互置换；疏水性氨基酸L、I、V之间的相互置换，极性氨基酸Q、N之间的相互置换，碱性氨基酸K、R、H之间的相互置换，酸性氨基酸D、E之间的相互置换，羟基的氨基酸S、T之间的相互置换。此外，A、V、L或I可以保守地突变为另一脂肪族残基或另一非极性残基。

“非保守取代”是指用具有显著不同的侧链特性的氨基酸进行的多肽中氨基酸的取代或突变。非保守取代可以使用上面所列的定义组之间而不是之内的氨基酸。在一个实施方案中，非保守突变影响(a)取代区域中肽主链的结构(例如，脯氨酸取代甘氨酸)、(b)电荷或疏水性、或(c)侧链体积。

“缺失”是指通过从参考多肽移除一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。缺失可以包括移除1个或多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸、或20个或更多个氨基酸、多达构成参考酶的氨基酸总数的10％，同时保留酶活性和/或保留工程化醛缩酶的改良特性。缺失可以针对多肽的内部和/或端部。在多个实施方案中，缺失可以包含连续的区段或者可以是不连续的。

“***”是指通过从参考多肽添加一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。在一些实施方案中，改良的工程化醛缩酶包括将一个或多个氨基酸***天然存在的醛缩酶中以及将一个或多个氨基酸***其他改良的醛缩酶多肽中。***可以是在多肽的内部，或羧基端或氨基端。如本文所用的***包括如本领域中已知的融合蛋白。***可以是连续氨基酸区段或者被天然存在的多肽中的一个或多个氨基酸分隔开。

本发明的青霉素酰胺酶突变体的氨基酸数量有800个，序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒(DNA分子)和质粒、以及包含该质粒的转化体。

这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

为了在微生物宿主例如基因工程中最常用的大肠杆菌宿主中最佳地表达青霉素酰胺酶SEQ ID NO:1及其突变体SEQ ID NO:3，本发明对其表达基因进行了密码子优化。

密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。

经过密码子优化，野生型青霉素酰胺酶SEQ ID NO:1的编码基因可以是SEQ IDNO:2，而青霉素酰胺酶突变体SEQ ID NO:3的编码基因可以是SEQ ID NO:4。

当作为生物催化剂用于制备头孢克洛时，本发明的青霉素酰胺酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。

生物催化领域公知，与游离酶法相比，应用固定化酶技术具有生产过程简化、生产效率提高等优点。同时，由于酶可多次使用，且酶的稳定性提高，从而有效提高了单位酶的生产力；其次，固定化酶极易与底物、产物分开，简化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好。

本领域技术人员容易理解，菌体本身就是一种天然的酶固定化形式，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。

另一方面，相比分离出的酶的催化，本发明利用微生物的简单发酵就可以源源不断、取之不尽地提供酶或的供应，无需进一步提取、纯化分离酶等操作，经济性显而易见，为工业化应用创造条件。

在制备头孢克洛的反应体系中，底物7-ACCA的浓度可选择5～15wt％，优选大约10wt％。另一底物D-PGM.HCl的用量可以是7-ACCA摩尔量的1.02-1.05倍，优选1.05倍加量。反应温度选择10～20℃，优选15℃左右。反应pH选择6.0-8.0，优选6.5左右。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例

实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/LK₂HPO₄·3H₂O、2.31g/LKH₂PO₄、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

底物7-ACCA和D-PGM.HCl由国药威奇达药业有限公司赠送；头孢拉定标准品(Cefradine)标准品购自Sigma-Aldrich(St.Louis,USA)。

底物和产物HPLC检测方法：安捷伦Agilent 1260液相色谱仪，C18(4.6×250mm，5μm)；A流动相：50mM磷酸二氢钾(pH3.4)，B流动相：乙腈(92：8)，A：B＝90：10；流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；柱温：25℃。

需说明的是，为描述方便起见，在实施例中，可将菌株编号、质粒编号、酶编号、酶编码基因编号共用一个编号，这是本领域技术人员容易理解的，即同一个编号在不同环境中可以指代不同的生物形式。比如OiPGA既可以代表野生酶表达菌株，也可以代表质粒pET24a-OiPGA编号、野生酶SEQ ID NO:1编号、野生酶编码基因SEQ ID NO:2编号。

实施例1：构建表达野生型青霉素酰胺酶的重组大肠杆菌

根据Oceanobacillus iheyensis的青霉素酰胺酶来源的青霉素酰胺酶氨基酸序列SEQ ID NO:1(UniProt序列号Q8CX57)，进行适于大肠杆菌表达的密码子优化，优化后的基因序列为SEQ ID NO:2。全基因合成该基因序列，在两端设计酶切位点NdeI和XhoI，并亚克隆到载体pET24a(购自Novagen)上相应位点，从而获得重组质粒pET24a-OiPGA，如图1所示，长7634bp。

将构建好的重组质粒pET24a-OiPGA用电转化法或者氯化钙法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，得到表达野生型青霉素酰胺酶SEQ ID NO:1的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET24a-OiPGA，简称OiPGA。

实施例2：易错PCR和随机突变库的构建

以野生酶的基因SEQ ID NO:2为模板，进行易错PCR随机突变体库构建。

正向引物OiPGA-F为5’-GGTGAACGTCAGCGTGAACAG-3’，

反向引物OiPGA-R为5’-TTCACCCGGTTCCAGAACCAG-3’。

易错PCR反应体系：1-10ng质粒模板，10μM引物OiPGA-F，10μM引物OiPGA-R，1×Taqbuffer，1mMdGTP，0.5mMdATP，0.5mMdCTP，0.2mMdTTP，7mMMgCl₂，(0mM、0.1mM、0.2mM)MnCl₂，5个单位的Taq酶(Takara公司)。

PCR反应条件：95℃5min；95℃40s，58℃50s，72℃1min/kbp，25-30个循环；72℃10min。

用凝胶回收试剂盒切胶回收2.4kbp随机突变片段，回收后的片段作为大引物，用KOD-plusDNA聚合酶做MegaPrimerPCR：94℃5min，；98℃20s，60℃30s，68℃2min/kbp，25-30个循环；68℃10min。

DpnI限制性内切酶(Thermo公司)消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，得到超过10⁴个克隆的易错PCR随机突变体库。

实施例3：随机突变体库的高通量筛选

3.1高通量孔板发酵

选取突变体库中的转化子，接种到500μL含有50μg/mL卡那霉素LB液体培养基的96孔深孔培养板中，37℃培养过夜，然后取80μl过夜培养物，转接至800μl含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养3h后，加入终浓度0.5mMIPTG，降温至25℃，培养过夜。4000rpm离心15min，弃上清，加入200μL含无菌水重悬菌体用于酶活力测定。

3.2高通量菌种筛选

高pH反应条件：将25μL酶液加入25μL 50mM磷酸钠盐缓冲液(pH 7.5)，28℃温浴。再加入150μL NIPAB(6-硝基-3-苯乙酰胺基苯甲酸)溶液(NIPAB溶液配制方法：90mg溶于100ml 50mM磷酸钠盐缓冲液(pH7.5)，加热煮沸即可)，反应10分钟，加入1ml无水乙醇终止反应，4000rpm离心10min，取100μL上清到酶标板上测定405nm吸光度的变化。

低pH反应条件：将25μL酶液加入25μL 50mM磷酸钠盐缓冲液(pH 6.0)，28℃温浴。再加入150μL NIPAB(6-硝基-3-苯乙酰胺基苯甲酸)溶液(NIPAB溶液配制方法：90mg溶于100ml 50mM磷酸钠盐缓冲液(pH6.0)，加热煮沸即可)，反应10分钟，加入1ml无水乙醇终止反应，4000rpm离心10min，取100μL上清到酶标板上测定405nm吸光度的变化。

3.3菌种合成活力检测

上述步骤3.2中高pH和低pH反应条件下酶活力均提升50％以上的菌种，分别进行pH7.5和pH6.0条件下的合成活力检测，具体检测方法为：将100μL酶液加入100μL酶反应液(酶反应液配方：100mM磷酸钠盐缓冲液(pH 6.0或pH7.5)，100mM的7-ACCA和120mM的D-PGM.HCl)，在28℃条件下反应10-30min，HPLC检测头孢克洛和D型-苯甘氨酸(D-PG)生成量，选择头孢克洛产量高且D型苯甘氨酸产量低的菌种进行下一轮随机突变。

在每一轮随机突变库，通过对大约10⁴个突变体克隆筛选，筛选出低pH反应条件下酶活力均明显高出菌种OiPGA发酵液酶活性的克隆菌种，进行基因组DNA测序。将正向突变克隆作为下一轮出发菌种，再次按照易错PCR的流程进行新一轮的随机易错PCR突变库的构建及筛选。按照此流程，共进行两轮随机易错PCR突变库的构建及筛选，最终获得一株酶活力提高明显的突变克隆OiPGA-mut2-7103菌株。委托苏州金唯智生物科技有限公司对突变菌株OiPGA-mut2-7103进行基因组测序比对，该菌株基因组中的青霉素酰胺酶基因序列为SEQ ID NO:4，确认其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

表1、突变菌株与野生酶表达菌株的合成活力对比结果

备注：S/H值为反应产物中头孢克洛的摩尔数与副产品D苯甘氨酸(D-PG)的摩尔数的比值。

结果表明，在pH6.0条件下，突变酶SEQ ID NO:4酶合成活力较野生型提高了接近3倍，S/H值也有显著提升。

实施例4：两种酶的发酵提取

4.1菌株发酵

分别从青霉素酰胺酶野生型表达菌株OiPGA和青霉素酰胺酶突变体表达菌株OiPGA-mut2-7103的LB平板上挑取单菌落，分别接种至3mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜。分别按照1v/v％接种量分别转接至100mL LB培养基中，37℃，250rpm培养过夜，全部接种至含有2L发酵培养基的5L发酵罐中(发酵培养基配方：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L磷酸氢二钾、2.31g/L磷酸二氢钾、4g/L甘油，消泡剂2mL，pH7.0-7.2；补料培养基：60％甘油)，转速600rpm，37℃，DO 20～30％，通气量1.8vvm，控制pH7.0，当菌浓OD600nm达到20后，调整温度至28℃，同时加入终浓度0.2mM IPTG诱导培养16-24h后，4℃，8000rpm，离心10min，收集菌体，冻存备用。

4.2纯酶提取

分别取OiPGA和OiPGA-mut2-7103的冻融菌体，加入100mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)，重悬菌体至菌浓15-20(w/v)％，超声破壁(每个循环为工作3秒，间歇5秒，功率55W)，工作20-30分钟，细胞破碎混液4℃，12000rpm离心30分钟，收集上清。上清以1ml/min的速率加入含10ml Ni-NAT基质的亲和层析柱中，然后用含有30mM咪唑的平衡缓冲液冲洗柱料，洗杂。最后用含有500mM咪唑的平衡缓冲液冲洗脱目的蛋白，收集峰值。

洗脱液经截留分子量为10kDa的超滤管进行脱盐处理获得纯酶液。

实施例5：两种纯酶不同pH下的合成活力对比

在100mL烧杯中分别加入不同pH的100mM磷酸钠盐缓冲溶液50mL，然后每个反应加入60mM的D-PGM和50mM的7-ACCA，均匀搅拌，控制反应温度28℃；再加入等量的纯酶，反应5-10min取样；通过高效液相HPLC检测各样品中头孢克洛的微摩尔浓度(μmol/mL)。分别对比pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0下OiPGA和OiPGA-mut2-7103纯酶的合成比活力。OiPGA-mut2-7103纯酶较野生型在检测pH范围内，活力均有不同程度的提升，且在pH6.0-7.0条件下OiPGA-mut2-7103纯酶较野生型酶活更稳定，尤其是在pH6.5条件下，OiPGA-mut2-7103纯酶较野生型酶活提升了2.6倍。

实施例6：用OiPGA-mut2-7103纯酶催化合成头孢克洛

将包含450mM底物7-ACCA和468mM底物D-PGM.HCl(两者7-ACCA：D-PGM.HCl摩尔比1：1.04)的100mM磷酸钠盐缓冲溶液的pH值调至6.5±0.10，加入1800SU纯酶，在15℃下反应90min，底物7-ACCA转化率最高超过98％，该转化率体现出突变酶OiPGA-mut2-7103具有很高的合成性能，用于酶法催化合成头孢克洛的工业化前景良好。

Claims (10)

1.一种酶催化制备头孢克洛的方法，其特征在于，包括如下步骤：

以7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-酸和D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐为底物，使用Oceanobacillus iheyensis来源的青霉素酰胺酶(UniProt序列号Q8CX57)或者其酶活力提高的突变体催化合成反应，得到头孢克洛。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变体为选自下述的多肽：

(a)氨基酸序列为SEQ ID NO:3的多肽；

(b)氨基酸序列与SEQ ID NO:3有90％以上、且酶活力相比SEQ ID NO:3提高的多肽；

(c)氨基酸序列与SEQ ID NO:3有90％以上、且S/H值相比SEQ ID NO:3提高的多肽。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应温度为10～20℃；反应体系pH值为pH6.0-8.0。

4.一种青霉素酰胺酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

5.编码如权利要求4所述青霉素酰胺酶突变体SEQ ID NO:3的基因。

6.如权利要求5所述的基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

7.一种DNA分子，其特征在于，包含如权利要求6所述的基因。

8.一种质粒，其特征在于，包含如权利要求7所述的DNA分子。

9.如权利要求8所述的质粒，其特征在于，质粒载体选自PET系列。

10.一种微生物，其表达如权利要求5所述的基因。