CN104789510A - 一种青霉素酰化酶、编码基因、产生菌株及其应用 - Google Patents

一种青霉素酰化酶、编码基因、产生菌株及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104789510A
CN104789510A CN201510227863.7A CN201510227863A CN104789510A CN 104789510 A CN104789510 A CN 104789510A CN 201510227863 A CN201510227863 A CN 201510227863A CN 104789510 A CN104789510 A CN 104789510A
Authority
CN
China
Prior art keywords
penicillin acylase
ala
pgapx01
gly
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510227863.7A
Other languages
English (en)
Inventor
何冰芳
潘鑫
王莉
钦松
吴斌
柏中中
姜天玥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Tech University
Original Assignee
Nanjing Tech University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Tech University filed Critical Nanjing Tech University
Priority to CN201510227863.7A priority Critical patent/CN104789510A/zh
Publication of CN104789510A publication Critical patent/CN104789510A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/025—Achromobacter
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/84—Penicillin amidase (3.5.1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P37/00—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin
    • C12P37/04—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin by acylation of the substituent in the 6 position
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01011—Penicillin amidase (3.5.1.11), i.e. penicillin-amidohydrolase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种青霉素酰化酶、编码基因、产生菌株及其应用，属于生物制药技术领域。青霉素酰化酶产生菌，为木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans）PX01，保藏登记号为CCTCC NO：M 2015215。所述霉素酰化酶，具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或与该序列具有98%以上同源性的氨基酸序列。所述青霉素酰化酶编码基因具有如SEQ ID NO：1所示的序列或与该序列具有90%以上同源性的序列。本发明还要求保护含有所述编码基因的重组载体、表达盒或重组菌以及所述酶在合成β-内酰胺类抗生素中的应用。该青霉素酰化酶具有耐高温、pH稳定性好、有机溶剂耐受性强的优点。

Description

一种青霉素酰化酶、编码基因、产生菌株及其应用
技术领域
本发明本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种青霉素酰化酶、编码基因、产生菌株及其应用。
背景技术
青霉素酰化酶(penicillin acylase，EC3.5.1.11)又称为青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶，是一种N末端亲核丝氨酸水解酶。该酶具有良好的催化酰化/去酰化特性，是目前为数不多的已被大规模工业化应用的重要酶。
青霉素酰化酶主要应用于抗生素工业中β-内酰胺抗生素中间体6-APA的生产和半合成β-内酰胺抗生素的合成。此外，它作为一种生物催化剂，还有其他许多潜在的应用，比如手性拆分、手性肽的合成、酯类化合物的水解等。因此，青霉素酰化酶是工业上应用价值很高的酶。
Srirangan K等(Biotechnology advances，2013，31(8):1319-1332)分析了青霉素酰化酶的催化机理，在青霉素酰化酶水解青霉素G脱掉6APA后，苯乙酰基-酶中间体会受到H2O分子的亲核进攻，形成苯乙酸。由于整个过程是可逆的，所以在低水活度和pH下，可以用青霉素G酰化酶催化酰基供体和β-内酰胺母核合成半合成抗生素，在催化体系中引入有机溶剂可以很好的降低水活度，这就需要酶有良好的有机溶剂耐受性。
尽管青霉素酰化酶的研究已开展多年并取得重要进展，但基础性的深入研究和大规模工业生产应用所必需的优良酶类仍然缺乏，因此筛选有机溶剂耐受性强、表达量高的酶类对酶法催化半合成β-内酰胺类抗生素具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种青霉素酰化酶产生菌。
本发明的又一目的是提供所述菌产生的青霉素酰化酶，具有耐高温、pH稳定性好、有机溶剂耐受性强等优点。
本发明的再一目的是提供含有所述青霉素酰化酶编码基因的重组载体、表达盒或重组菌，能够用于高效表达青霉素酰化酶，达6000U/L。
本发明的另一目的是提供所述青霉素酰化酶在合成β-内酰胺类抗生素中的应用
为了实现本发明的目的，本发明首先从南京周边药厂土壤中筛选获得青霉素酰化酶产生菌，为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)PX01，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015215。该菌所产青霉素酰化酶命名为青霉素酰化酶PGApx01。
本发明分离克隆到Achromobacter xylosoxidans PX01菌株所产青霉素酰化酶PGApx01的编码基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，为此基因的改造并在各种外源基因表达***中高效表达提供了优良的基因材料。经DNA全序列分析，青霉素酰化酶PGApx01基因全长2589个核苷酸，编码863个氨基酸，与Achromobacter xylosoxidans A8产生的青霉素酰化酶编码基因的序列相似性89.1％，蛋白质一级结构同源性为89.5％。与Achromobacter xylosoxidansNH44784-1996青霉素酰化酶基因同源性为83.3％，蛋白质一级结构同源性为82.7％。青霉素酰化酶PGApx01的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。
本发明还要求保护与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码所述青霉素酰化酶的核苷酸序列。
根据本领域人员的公知常识可知，与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列，应当视为与本发明保护的青霉素酰化酶PGApx01等同的同种功能蛋白质。因此，本发明还保护SEQ ID NO：2所示氨基酸序列经过一个或者多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加后获得的与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列。
本发明还要求保护含有所述青霉素酰化酶编码基因的重组载体、表达盒或重组菌。所述重组菌是将所述基因***pET-28a后转化大肠杆菌BL21所得。本发明构建了青霉素酰化酶PGApx01基因及其突变体的重组表达载体，并将重组表达载体成功导入大肠杆菌表达菌BL21中，加入IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE验证在BL21中成功表达了青霉素酰化酶PGApx01及其突变体，经检测，青霉素酰化酶PGApx01的活力达到6000U/L。
本发明对青霉素酰化酶PGApx01进行了酶学性质的研究，实验证明青霉素酰化酶PGApx01最适反应pH为8.0，该酶在pH低于6.5或高于8.5时，酶活性损失严重，而在pH6.5–8.5酶活性较高(80％以上)，同时青霉素酰化酶PGApx01在pH6.5–8.5的磷酸盐缓冲液中处理2h后，都能保持较高的青霉素酰化酶活力，相对酶活性高于92％。青霉素酰化酶PGApx01在35-55℃反应时酶活性高于80％，45℃时酶活性最高；青霉素酰化酶PGApx01在25℃-45℃保温2h后都能保持较高的青霉素酰化酶活力，相对酶活性高于96％，但温度高于45℃后，酶活性快速下降。PGApx01在40％聚乙二醇、丙三醇中，于37℃处理24h，表现出良好的有机溶剂耐受性，且有一定的激活作用，相对酶活均超过100％，而在其他有机溶剂中，37℃处理24h后，酶活均低于20％。本发明也对突变青霉素酰化酶PGApx01进行了酶学性质的研究，发现与原未突变青霉素酰化酶PGApx01的酶学性质基本一致。
本发明还要求保护所述青霉素酰化酶在合成β-内酰胺类抗生素中的应用。优选的技术方案中，所述青霉素酰化酶可以用于合成以6-氨基青霉烷酸为母核或以7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸为母核的β-内酰胺类抗生素。本发明采用青霉素酰化酶PGApx01及其突变体催化合成阿莫西林和头孢羟氨苄。所述的酶催化反应分别以6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7ADCA)为母核，以对应的侧链为酰基供体，在青霉素酰化酶PGApx01及其突变体的催化作用下进行缩合反应，分别合成阿莫西林和头孢羟氨苄，阿莫西林和头孢羟氨苄的合成率分别达到58％和40％。所述的6-APA(或7ADCA)与酰基供体的摩尔比为1：1～1：3，其中6-APA(或7ADCA)的浓度为10～80mmol/L，酰基供体的浓度为10～240mmol/L。所述的体系为有机溶剂和水组成的混合溶剂，所述有机溶剂选自丙三醇、聚乙二醇中的任意一种，其体积百分含量为5～80％。所述的酰基供体为羧酸及其甲酯、酰胺、酸酐等，所述羧酸可以为脂肪酸或芳香酸。
本发明的有益效果在于：本发明青霉素酰化酶具有耐高温、pH稳定性好、有机溶剂耐受性强等优点。在大肠杆菌(E.coli)表达菌BL21中的异源表达，青霉素酰化酶及其突变体的产量可达6000U/L。该青霉素酰化酶及其突变体成功催化合成β-内酰胺类抗生素，进一步证明该酶在催化反应中的优良性质，为后续研究催化合成新型β-内酰胺类抗生素奠定了基础。
附图说明
图1显示了青霉素酰化酶在BL21/pET-pgapx01中的表达情况，其中1-Mark，2-诱导后BL21/pET裂解液，3、5-诱导后BL21/pET-pgapx01裂解液上清，4、6-诱导后BL21/pET-pgapx01裂解液沉淀。
图2显示青霉素酰化酶PGApx01的最适反应pH。
图3显示青霉素酰化酶PGApx01的pH稳定性(在各pH条件下放置2h后的相对酶活)。
图4显示青霉素酰化酶PGApx01的最适反应温度。
图5显示青霉素酰化酶PGApx01的温度稳定性(在各温度条件下放置2h后的相对酶活)。
图6显示40％有机溶剂对青霉素酰化酶PGApx01活力的影响。
图7显示20％有机溶剂对青霉素酰化酶PGApx01活力的影响。
木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)PX01，已经保藏。分类命名为Achromobacter xylosoxidans PX01，保藏日期为2015年4月9日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏单位地址：武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2015215。
具体实施方式
实施例一
本实施例说明产青霉素酰化酶天然菌株的筛选程序
初筛采用如下方法：以高浓度青霉素G为筛选压力从南京周边药厂土壤等样品中筛选获得耐高浓度青霉素微生物。具体筛选培养基的配方为：酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 2g/L，苯乙酸2g/L，青霉素105～107U/ml，pH 7.0，溶剂为水。培养温度为30℃，培养时间为24～48h，摇床转速为180rmp。此方法可筛选到大量耐高浓度青霉素G的微生物。
将初筛获得的菌株进行复筛，具体方法如下：用50mM磷酸缓冲液(pH7.5)配制浓度为2mg/ml的3-苯乙酰胺-6-硝基苯甲酸(缩写为NIPAB，下同)溶液，并加到透明的48孔板中。将初筛获得的菌株挑到48孔板中，以不加菌株的为空白对照，37℃反应，观察反应液的颜色变化。如果反应液变为黄色，说明孔中有青霉素酰化酶产生菌株。将青霉素酰化酶产生菌株接种到产酶发酵培养基，具体配方为：酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 2g/L，苯乙酸2g/L，pH 7.0，溶剂为水。培养温度为30℃，培养时间为48h，摇床转速为180rmp。发酵结束后，取发酵液于8000rpm、4℃离心10min，弃上清，取菌体用与发酵液相同体积的50mM磷酸缓冲液(pH7.5)重悬，超声破碎细胞后，于12000rpm、4℃离心10min，取上清为粗酶液。测定粗酶液的青霉素酰化酶活力，选取粗酶液活力最高的菌株作为产青霉素酰化酶菌株。
通过上述方法，发明人获得了一株青霉素酰化酶产生菌株PX01。经过16S rRNA序列分析，表明该菌株属于木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)菌属，并命名为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)PX01。对该菌株的革兰氏染色观察表明该菌株为革兰氏阴性菌株，无芽孢，菌落呈淡黄色，轻微***，圆形，边缘整齐，专性好氧，最适生长温度为28℃～37℃。木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)PX01产生的青霉素酰化酶命名为PGApx01。
青霉素酰化酶活力检测方法(以NIPAB为底物)为：用50mM磷酸缓冲液(pH7.5)配制浓度为2mg/ml的NIPAB底物溶液。反应体系中先加入100μL酶液，再加入100μL底物溶液，在酶标仪中进行反应，反应温度为37℃，反应时间为4min，在405nm波长下检测反应结束时生成的3-氨基-6-硝基苯甲酸(ANBA)的量。以煮沸灭活的酶液为空白对照。每1个单位(U)青霉素酰化酶定义为：在相应条件下，每分钟催化NIPAB水解产生1μmol ANBA所需的酶量。
实施例二
本实验说明青霉素酰化酶PGApx01编码基因的分离克隆程序。
采用酚－氯仿法抽提菌体总DNA。根据木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)A8(NCBI Reference Sequence：NC_014640.1)和木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)NH44784-1996(NCBI Reference Sequence：NC_021285.1)的全基因测序结果进行分析，获得两种编码无色杆菌来源的青霉素酰化酶的基因，根据该基因序列设计两组引物PX01-F1、PX01-R1和PX01-F2、PX01-R2。
PX01-F1(SEQ ID NO:3)序列为:ATGAAGCAGCACTTGTTGTCGGCCG，
PX01-R1(SEQ ID NO:4)序列为:TCAGTAGCGCAACGTCTCTACCGAC。
PX01-F2(SEQ ID NO:5)序列为:ATGAAGCAGCATGTGTTGTCGGCCG，
PX01-R2(SEQ ID NO:6)序列为:TTACCGCCGGTAGCGCAACGTCTCT。
以木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)PX01总DNA为模板，以两组引物PX01-F1、PX01-R1和PX01-F2、PX01-R2排列组合出4种组合扩增青霉素酰化酶PGApx01的CDS编码序列。将扩增到的2.5kb的PCR片段连接到pMD18-T载体，进行序列测定和分析，发现PX01-F1和PX01-R2这种组合扩增出青霉素酰化酶PGApx01的基因，该基因序列如SEQ ID NO：1所示。青霉素酰化酶PGApx01的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)PX01与Achromobacter xylosoxidans A8青霉素酰化酶基因同源性为89.1％，氨基酸序列同源性为89.5％，与Achromobacterxylosoxidans NH44784-1996青霉素酰化酶基因同源性为83.3％，氨基酸序列同源性为82.7％。青霉素酰化酶PGApx01与Achromobacter xylosoxidans A8和Achromobacter xylosoxidans NH44784-1996来源的青霉素酰化酶成熟肽(去除N端23个氨基酸)氨基酸同源性分别为89.4％和83.4％。SEQ ID NO：2所示的青霉素酰化酶PGApx01，经过信号肽和连接肽的剪切，得到包括α亚基和β亚基成熟肽，α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：2第24位至第247位所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：2第305位至第862位所示。
实施例三
本实验说明青霉素酰化酶PGApx01的表达载体的构建及其在大肠杆(E.coli)表达菌BL21中的表达。
以木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)PX01总DNA为模板，设计引物，如下：
F:ATAGCTAGCATGAAGCAGCACTTGTTGTCGGCCG
R:ATAT CTCGAGTTACCGCCGGTAGCGCAACGTCTCT
以F和R扩增青霉素酰化酶PGApx01基因，经纯化后用限制性内切酶Nhe I与Xho I进行双酶切，同时以相同限制性内切酶酶切载体pET28a，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收基因片段和载体，并将基因片段与载体连接，经酶切鉴定及PCR筛选出阳性克隆命名为重组质粒pET-pgapx01。
将构建的重组质粒pET-pgapx01通过热休克转化法转化大肠杆菌(E.coli)表达菌BL21感受态细胞，得到重组菌BL21/pET-pgapx01。同时将pET-28a质粒按照相同方法转化入BL21感受态细胞，命名为BL21/pET，用于青霉素酰化酶PGApx01表达时的对照菌株。将重组菌BL21/pET-pgapx01及BL21/pET分别接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、180rpm培养过夜后，按2％接种量接种至新鲜LB培养基中(含100μg/mL卡那霉素)，37℃、180rpm培养至OD600为0.6～1.0时，加入诱导剂IPTG(终浓度0.1mmol L-1)，诱导8h。将诱导后的重组菌BL21/pET-pgapx01破碎后离心，分别取裂解液上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，以同样条件下诱导的BL21/pET裂解液作为对照，电泳结果如图1所示。从图1可以看出，经诱导后的重组菌BL21/pET-pgapx01裂解液上清在27K和65K左右处均有一明显条带，分别对应α和β亚基。通过检测诱导后BL21/pET-pgapx01裂解液上清的酶活，计算出青霉素酰化酶PGApx01产量可达6000U/L。诱导后BL21/pET裂解液上清和沉淀均未检测到青霉素酰化酶活力。
实施例四
以实施例三中诱导表达后的重组菌BL21/pET-pgapx01裂解液上清作为青霉素酰化酶PGApx01，进行酶学性质检测。
青霉素酰化酶PGApx01最适反应pH值和pH稳定性的测定：
为了考察不同pH对青霉素酰化酶PGApx01活力的影响，确定反应的最适pH，分别配制4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0的缓冲液，将酶液与不同pH缓冲液溶解的NIPAB底物溶液进行反应，以pH8.0条件下的青霉素酰化酶活力为对照(100％)，分别检测青霉素酰化酶PGApx01活力，计算相对酶活，结果如图2所示。从图2可以看出，该酶在pH低于6.5或高于8.5时，酶活性损失严重，而在pH6.5–8.5酶活性较高(80％以上)，其酶活性的最适pH为8.0。为了考察青霉素酰化酶PGApx01的pH稳定性范围，将酶液分别与不同pH的缓冲混合(50/50＝V/V)，于37℃处理2h，分别检测青霉素酰化酶PGApx01的活力并计算相对酶活，结果如图3所示。该酶在pH6.5–8.5的磷酸盐缓冲液中处理2h后都能保持较高的青霉素酰化酶酶活力，相对酶活高于92％。
青霉素酰化酶PGApx01最适反应温度和热稳定性的测定：
青霉素酰化酶PGApx01的最适温度的测定是在50mM磷酸缓冲液(pH7.5)缓冲体系(pH 7.5)中进行，在不同的温度条件下以NIPAB为底物进行酶促反应，相对酶活如图4所示。热稳定测定：青霉素酰化酶PGApx01在25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃下处理2h以后，测定相对酶活。酶的最适反应温度检测结果表明，该酶在35-55℃相对酶活高于80％，45℃时酶活性最高，当温度低于25℃或高于65℃时，酶反应活性较低。在热稳定性实验中，青霉素酰化酶PGApx01在25℃-75℃保温2h，相对酶活如图5所示。从图5可以看出，该酶在25℃-45℃范围内都能保持较高的青霉素酰化酶活力，相对酶活高于96％。但温度高于45℃后，酶活快速下降。
青霉素酰化酶PGApx01的有机溶剂耐受性检测：
考察青霉素酰化酶PGApx01对9种有机溶剂的有机溶剂耐受性。分别将9种有机溶剂缓缓加入酶液中，有机溶剂与酶液的体积比为40：60。将酶液与有机溶剂的混合物置37℃、180rpm条件下振荡处理，定时取样，以NIPAB为底物检测青霉素酰化酶活力。以0h不添加有机溶剂的青霉素酰化酶酶活为对照(100％)，测定青霉素酰化酶PGApx01的相对酶活，结果如图6所示。图6显示，该酶在不添加有机溶剂时，24h后酶活只剩60％，而在聚乙二醇和丙三醇中，于37℃处理24h后，该酶相对酶活分别为99％和132％，说明这两种有机溶剂对酶有一定的激活作用。
另外，发明人采用相同方法检测有机溶剂与酶液体积比为20:80时，有机溶剂对青霉素酰化酶活力的影响，结果如图7所示。图7显示，该酶在不添加有机溶剂时，24h后酶活只剩80％；聚乙二醇和丙三醇对酶有一定的激活作用，37℃处理24h后，该酶相对酶活分别为113％和139％。值得注意的是，该酶在20％(V/V)的DMSO中也表现出一定的耐受性，24h后酶活为75％。
综上所述，青霉素酰化酶PGApx01具有良好的有机溶剂耐受性。
实施例五
本实验说明青霉素酰化酶PGApx01突变体的克隆表达及酶学性质。
选取青霉素酰化酶PGApx01氨基酸序列的18个位点突变，选取的位点分别为:Ala34，Gly45，Met109，Arg120，Ile145，Val176，Ile181，Asp209，Asp241，Phe291，Thr369，Leu420，Lys503，Ala626，Ala689，Val700，Ala822，Glu845，由于18个位点突变组合量大，采用定点突变技术将这18个位点的氨基酸进行饱和突变，获得的部分突变体示例如表1。
表1部分定点突变体
A34V G45A M109S R120K I145L V176I
I181L D209E D241E F291Y T369S L420T
K503R A626V A689V V700T A822V E845D
将获得的单点突变体进行随机组合，获得的部分组合突变体如下：PX01-3C(A34V,D209E,A822I)，PX01-4F(M109S,A689L,A822V,L420I)，PX01-7K(I181L，G45A，D241E，V700T,I145L,A822L,V176I)，PX01-13D(A34S，M109S，I145L，D209E,F291Y,T369S,L420T,K503R,A626V,A689V,V700T,A822I,E845D)。
上述突变体均可以采用本领域内普通技术人员都知晓、且能够实现的Overlap PCR制备，不需要付出创造性的劳动。
将各突变体编码基因***pET-28a，转化入BL21感受态细胞，挑取阳性重组菌。诱导重组菌表达各突变体(实施例三方法制备)。采用实施例五中的方法测定青霉素酰化酶PGApx01突变体的最适反应pH值和pH稳定性，最适反应温度和温度稳定性及有机溶剂耐受性的影响。结果发现突变体的酶学性质与青霉素酰化酶PGApx01的酶学性质基本一致。
实施例六
本实验说明青霉素酰化酶PGApx01及其突变体催化合成β-内酰胺类抗生素的应用。
分别以pH6.5磷酸缓冲液、丙三醇-磷酸缓冲液、聚乙二醇-磷酸缓冲液为反应介质。反应介质中丙三醇或聚乙二醇的体积百分含量为5～80％。反应底物溶液为2mL，含有30mM 6-APA(或30mM 7ADCA)和60mM D-HPGM(对羟基苯甘氨酸甲酯)，溶剂为上述反应介质。在反应底物溶液中加入青霉素酰化酶PGApx01或其突变体酶液(实施例三方法制备)1ml(6000U/L)，在20℃，转速180rpm条件下反应，定时取样。样品用溶剂(水︰甲醇︰乙酸＝60︰35︰5(V/V))稀释10倍，采用HPLC进行检测。结果表明丙三醇-磷酸缓冲液为最佳反应介质，反应8h，阿莫西林的合成产率可达58％(或头孢羟氨苄合成产率可达40％)。
结果表明青霉素酰化酶PGApx01及其突变体具有良好的合成阿莫西林和头孢羟氨苄的能力，表明该酶将来在合成新型β-内酰胺类抗生素中具有巨大的潜力，在生物制药工业中具有广阔的应用前景。
表2.青霉素酰化酶PGApx01及其突变体合成阿莫西林和头孢羟氨苄产率
酶 阿莫西林 头孢羟氨苄
PGApx01 58％ 40％
PGApx01-3c 50％ 35％
PGApx01-4f 42％ 37％
PGApx01-7k 45％ 30％
PGApx01-13d 40％ 32％
。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  南京工业大学
 
<120>  一种青霉素酰化酶、编码基因、产生菌株及其应用
 
<130>  201505051
 
<160>  8    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  2589
<212>  DNA
<213>  木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans）PX01
 
<400>  1
atgaagcagc acttgttgtc ggccgccatc ctggcggcct gcgcggccgt gggcgcccag     60
 
gcccaggccc aggacgtcca gcagcattcc cgccagcatg ccgaggcgcc ggcgcgtccg    120
 
gccggcgtcg ccggcggcca ggtcacgata cggcgcgacg gctatggcat gccgcatgtg    180
 
tacgccaata ccgtgtacgg gattttctat ggctacggct atgccgtggc gcaggaccgg    240
 
ctgttccaga tggagatggc ccggcgcagc acgcagggcc gagtggccga ggtgctgggg    300
 
gcgtccatgg tggctttcga catgtccatc cgcggcaatt tctcgcccga gcgcatccgg    360
 
cgccagctgg ccgcgctgcc ggcctcggaa cggcagatcc tggacggcca tgcggccggc    420
 
atgaacgcgt ggatcgcgaa ggtgcgcgcc gagccgggca gcctgatgcc caaggagttc    480
 
aacgacctgg gcttccagcc cggcgactgg accgcgtacg acgtggcgat ggtgttcgtg    540
 
ggtaccatag ccaaccgctt ttccgacgcc aatagcgaga tcgacaactt ggcgctgctg    600
 
accgcgttga aggataagca cggagacgag cgcgccatgc agatcttcaa ccagctgcgc    660
 
tggatgaacg acggccgtgc gcccaccacg gtgcccgagg aagacggcgt gtaccaaccc    720
 
gacgccgccc ggccggcggc caggctgtcc tatgccttgc cgcgctatga cggcacgccg    780
 
cccatgctgg agcgcgtggc gcgcgatccg cagacgcgcg gcgtggtgga cgagccgccc    840
 
gcggccgcgc gcgcgcagct gctggcgcag ttcgccgaga cgggccagcc gggcatcgcc    900
 
ggtttcccga ccaccagcaa tatgtggatc gtgggacgcg aacacgccaa ggacgcccgc    960
 
tccattctgt tgaacgggcc gcagttcggc tggtggaacc cggcctacac gtatggcatc   1020
 
ggcctgcacg gcgcgggctt cgacgtggtg ggcaatacgc cgttcgccta tcccagcatt   1080
 
ctgttcggcc acaacgcgca cgtgacctgg ggttcgaccg cgggcttcgg cgacgacgtg   1140
 
gacatctacg ccgaaaagct cgatcccggc gaccgcacgc gctatttcca cgacggcgcc   1200
 
tggaagacca tggaaaagcg cagcgagctc atccaggtca aggacggcca gccggtgctg   1260
 
atggatgtgt accggacggt gcacggcatc gtcaccaagt tcgacgagaa gaacaacgtg   1320
 
gcctacgcca aggcgcgcgc ctgggaaggc ttcgaactgc agtcgctgat ggcctggacc   1380
 
cacaagaccc aggcgcgcaa ctgggagcaa tggaaagcgc aggccgcgcg ccacgccctg   1440
 
accatcaact ggtattacgc ggacgaccgc ggcaatatcg gctacgcgca cacgggcttc   1500
 
tatcccaagc gccgcgccgg ccacgatccg cgcctgccgg tgcccggcac cggcgagatg   1560
 
gactgggacg gcatgctgcc gttctccacc aatccgcagg tctacaaccc gcgccagggc   1620
 
tttatcgcca actggaacaa ccagcccatg cgcggctacc cgtccacgga cctgttcgcc   1680
 
attgtgtggg gccaggccga ccgctacgcc gagatcgaga cccgcctgct ggccatgacg   1740
 
gccaacggcg gcaaggtcag cgcgcagcag atgtgggacc tgatccgcac caccagctac   1800
 
gccgacgtca atcgccgcca tttcctgccg ttcctgcagc aggcggtgca ggggctgccg   1860
 
gccgacgacg cccgggcgcg gatggtcgcg gcgctggcgt cgtgggacgg catggcgacc   1920
 
agcgacaggc agcccggcta ttacgacaat gccgggccgg ccgtgatgga cgcgtggctg   1980
 
cgcgccatgc tcaagcgtac gctggccgac gagatgccgg ccgacttctt caagtggtac   2040
 
agcgccaccg gctatcccac gccggccgcg cccgccaccg gttcgctcaa cctgacggtg   2100
 
ggctccaagg tgctgtacaa cgcgctggcc gggcgcgcgt ccgaggtgcc gcagcgctac   2160
 
gacttcttca acggccagcc gccgcaggcg gtgacgctgg ccgcgctgga cgacgcgctc   2220
 
gccgccctgc gcaagaccta tggcgacgac ccggccggct ggcggatccc ggcgccgccc   2280
 
atggtgttcg cgcccaagaa cttcctgggc gtgccgcagg ccgacgagaa ggcggtgctg   2340
 
agccattccg ccacccacaa ccgtggaacc gagaacaaca tgacggtgtt cgacgcccgc   2400
 
ggcgtgcggg cggtggacgt ggtggcgccg gggcagagcg gtttcgtggc cccggacggc   2460
 
acggcctcgc cccacacccg cgaccagttc gacctgtacg ccagcttcgg cagcaaacgg   2520
 
gtctggttca ccgaggccga agtccgcgcc aacgctaagt cggcagagac gttgcgctac   2580
 
cggcggtaa                                                           2589
 
 
<210>  2
<211>  862
<212>  PRT
<213>  木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans）PX01
 
<400>  2
 
Met Lys Gln His Leu Leu Ser Ala Ala Ile Leu Ala Ala Cys Ala Ala
1               5                   10                  15     
 
 
Val Gly Ala Gln Ala Gln Ala Gln Asp Val Gln Gln His Ser Arg Gln
            20                  25                  30         
 
 
His Ala Glu Ala Pro Ala Arg Pro Ala Gly Val Ala Gly Gly Gln Val
        35                  40                  45             
 
 
Thr Ile Arg Arg Asp Gly Tyr Gly Met Pro His Val Tyr Ala Asn Thr
    50                  55                  60                 
 
 
Val Tyr Gly Ile Phe Tyr Gly Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Gln Asp Arg
65                  70                  75                  80 
 
 
Leu Phe Gln Met Glu Met Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Arg Val Ala
                85                  90                  95     
 
 
Glu Val Leu Gly Ala Ser Met Val Ala Phe Asp Met Ser Ile Arg Gly
            100                 105                 110        
 
 
Asn Phe Ser Pro Glu Arg Ile Arg Arg Gln Leu Ala Ala Leu Pro Ala
        115                 120                 125            
 
 
Ser Glu Arg Gln Ile Leu Asp Gly His Ala Ala Gly Met Asn Ala Trp
    130                 135                 140                
 
 
Ile Ala Lys Val Arg Ala Glu Pro Gly Ser Leu Met Pro Lys Glu Phe
145                 150                 155                 160
 
 
Asn Asp Leu Gly Phe Gln Pro Gly Asp Trp Thr Ala Tyr Asp Val Ala
                165                 170                 175    
 
 
Met Val Phe Val Gly Thr Ile Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ala Asn Ser
            180                 185                 190        
 
 
Glu Ile Asp Asn Leu Ala Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Lys His Gly
        195                 200                 205            
 
 
Asp Glu Arg Ala Met Gln Ile Phe Asn Gln Leu Arg Trp Met Asn Asp
    210                 215                 220                
 
 
Gly Arg Ala Pro Thr Thr Val Pro Glu Glu Asp Gly Val Tyr Gln Pro
225                 230                 235                 240
 
 
Asp Ala Ala Arg Pro Ala Ala Arg Leu Ser Tyr Ala Leu Pro Arg Tyr
                245                 250                 255    
 
 
Asp Gly Thr Pro Pro Met Leu Glu Arg Val Ala Arg Asp Pro Gln Thr
            260                 265                 270        
 
 
Arg Gly Val Val Asp Glu Pro Pro Ala Ala Ala Arg Ala Gln Leu Leu
        275                 280                 285            
 
 
Ala Gln Phe Ala Glu Thr Gly Gln Pro Gly Ile Ala Gly Phe Pro Thr
    290                 295                 300                
 
 
Thr Ser Asn Met Trp Ile Val Gly Arg Glu His Ala Lys Asp Ala Arg
305                 310                 315                 320
 
 
Ser Ile Leu Leu Asn Gly Pro Gln Phe Gly Trp Trp Asn Pro Ala Tyr
                325                 330                 335    
 
 
Thr Tyr Gly Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Phe Asp Val Val Gly Asn
            340                 345                 350        
 
 
Thr Pro Phe Ala Tyr Pro Ser Ile Leu Phe Gly His Asn Ala His Val
        355                 360                 365             
 
 
Thr Trp Gly Ser Thr Ala Gly Phe Gly Asp Asp Val Asp Ile Tyr Ala
    370                 375                 380                
 
 
Glu Lys Leu Asp Pro Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe His Asp Gly Ala
385                 390                 395                 400
 
 
Trp Lys Thr Met Glu Lys Arg Ser Glu Leu Ile Gln Val Lys Asp Gly
                405                 410                 415    
 
 
Gln Pro Val Leu Met Asp Val Tyr Arg Thr Val His Gly Ile Val Thr
            420                 425                 430        
 
 
Lys Phe Asp Glu Lys Asn Asn Val Ala Tyr Ala Lys Ala Arg Ala Trp
        435                 440                 445            
 
 
Glu Gly Phe Glu Leu Gln Ser Leu Met Ala Trp Thr His Lys Thr Gln
    450                 455                 460                
 
 
Ala Arg Asn Trp Glu Gln Trp Lys Ala Gln Ala Ala Arg His Ala Leu
465                 470                 475                 480
 
 
Thr Ile Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp Asp Arg Gly Asn Ile Gly Tyr Ala
                485                 490                 495    
 
 
His Thr Gly Phe Tyr Pro Lys Arg Arg Ala Gly His Asp Pro Arg Leu
            500                 505                 510        
 
 
Pro Val Pro Gly Thr Gly Glu Met Asp Trp Asp Gly Met Leu Pro Phe
        515                 520                 525            
 
 
Ser Thr Asn Pro Gln Val Tyr Asn Pro Arg Gln Gly Phe Ile Ala Asn
    530                 535                 540                
 
 
Trp Asn Asn Gln Pro Met Arg Gly Tyr Pro Ser Thr Asp Leu Phe Ala
545                 550                 555                 560
 
 
Ile Val Trp Gly Gln Ala Asp Arg Tyr Ala Glu Ile Glu Thr Arg Leu
                565                 570                 575    
 
 
Leu Ala Met Thr Ala Asn Gly Gly Lys Val Ser Ala Gln Gln Met Trp
            580                 585                 590        
 
 
Asp Leu Ile Arg Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Val Asn Arg Arg His Phe
        595                 600                 605             
 
 
Leu Pro Phe Leu Gln Gln Ala Val Gln Gly Leu Pro Ala Asp Asp Ala
    610                 615                 620                
 
 
Arg Ala Arg Met Val Ala Ala Leu Ala Ser Trp Asp Gly Met Ala Thr
625                 630                 635                 640
 
 
Ser Asp Arg Gln Pro Gly Tyr Tyr Asp Asn Ala Gly Pro Ala Val Met
                645                 650                 655    
 
 
Asp Ala Trp Leu Arg Ala Met Leu Lys Arg Thr Leu Ala Asp Glu Met
            660                 665                 670        
 
 
Pro Ala Asp Phe Phe Lys Trp Tyr Ser Ala Thr Gly Tyr Pro Thr Pro
        675                 680                 685            
 
 
Ala Ala Pro Ala Thr Gly Ser Leu Asn Leu Thr Val Gly Ser Lys Val
    690                 695                 700                
 
 
Leu Tyr Asn Ala Leu Ala Gly Arg Ala Ser Glu Val Pro Gln Arg Tyr
705                 710                 715                 720
 
 
Asp Phe Phe Asn Gly Gln Pro Pro Gln Ala Val Thr Leu Ala Ala Leu
                725                 730                 735    
 
 
Asp Asp Ala Leu Ala Ala Leu Arg Lys Thr Tyr Gly Asp Asp Pro Ala
            740                 745                 750        
 
 
Gly Trp Arg Ile Pro Ala Pro Pro Met Val Phe Ala Pro Lys Asn Phe
        755                 760                 765            
 
 
Leu Gly Val Pro Gln Ala Asp Glu Lys Ala Val Leu Ser His Ser Ala
    770                 775                 780                
 
 
Thr His Asn Arg Gly Thr Glu Asn Asn Met Thr Val Phe Asp Ala Arg
785                 790                 795                 800
 
 
Gly Val Arg Ala Val Asp Val Val Ala Pro Gly Gln Ser Gly Phe Val
                805                 810                 815    
 
 
Ala Pro Asp Gly Thr Ala Ser Pro His Thr Arg Asp Gln Phe Asp Leu
            820                 825                 830        
 
 
Tyr Ala Ser Phe Gly Ser Lys Arg Val Trp Phe Thr Glu Ala Glu Val
        835                 840                 845             
 
 
Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Glu Thr Leu Arg Tyr Arg Arg
    850                 855                 860        
 
 
<210>  3
<211>  25
<212>  DNA
<213>  artificial
 
<220>
<223>  PX01-F1
 
<400>  3
atgaagcagc acttgttgtc ggccg                                           25
 
 
<210>  4
<211>  25
<212>  DNA
<213>  artificial
 
<220>
<223>  PX01-R1
 
<400>  4
tcagtagcgc aacgtctcta ccgac                                           25
 
 
<210>  5
<211>  25
<212>  DNA
<213>  artificial
 
<220>
<223>  PX01-F2
 
<400>  5
atgaagcagc atgtgttgtc ggccg                                           25
 
 
<210>  6
<211>  25
<212>  DNA
<213>  artificial
 
<220>
<223>  PX01-R2
 
<400>  6
ttaccgccgg tagcgcaacg tctct                                           25
 
 
<210>  7
<211>  34
<212>  DNA
<213>  artificial
 
<220>
<223>  F
 
<400>  7
atagctagca tgaagcagca cttgttgtcg gccg                                 34
 
 
<210>  8
<211>  35
<212>  DNA
<213>  artificial
 
<220>
<223>  R
 
<400>  8
atatctcgag ttaccgccgg tagcgcaacg tctct                                35
 
 

Claims (9)

1.青霉素酰化酶产生菌，其特征在于该菌为木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)PX01，保藏编号为CCTCC NO：M 2015215。
2.权利要求1所述菌产生的青霉素酰化酶，具有(1)或(2)所示氨基酸序列：
(1)如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列经过一个或者多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加后获得的与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列。
3.权利要求2所述青霉素酰化酶的编码基因。
4.根据权利要求3所述青霉素酰化酶的编码基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如(1)或(2)所示：
(1)SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；
(2)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码权利要求2所述青霉素酰化酶的核苷酸序列。
5.含有权利要求3或4所述编码基因的重组载体、表达盒或重组菌。
6.根据权利要求5所述重组菌，其特征在于所述重组菌是将权利要求3或4所述基因***pET-28a后转化大肠杆菌BL21所得。
7.权利要求2所述青霉素酰化酶在合成β-内酰胺类抗生素中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于所述青霉素酰化酶用于合成以6-氨基青霉烷酸为母核的β-内酰胺类抗生素。
9.根据权利要求7所述青霉素酰化酶在合成β-内酰胺类抗生素中的应用，其特征在于所述青霉素酰化酶用于合成以7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸为母核的β-内酰胺类抗生素。
CN201510227863.7A 2015-05-06 2015-05-06 一种青霉素酰化酶、编码基因、产生菌株及其应用 Pending CN104789510A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510227863.7A CN104789510A (zh) 2015-05-06 2015-05-06 一种青霉素酰化酶、编码基因、产生菌株及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510227863.7A CN104789510A (zh) 2015-05-06 2015-05-06 一种青霉素酰化酶、编码基因、产生菌株及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104789510A true CN104789510A (zh) 2015-07-22

Family

ID=53554705

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510227863.7A Pending CN104789510A (zh) 2015-05-06 2015-05-06 一种青霉素酰化酶、编码基因、产生菌株及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104789510A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105274082A (zh) * 2015-11-03 2016-01-27 湖南福来格生物技术有限公司 一种合成用青霉素g酰化酶突变体及其在制备阿莫西林中的应用
CN106399174A (zh) * 2016-11-03 2017-02-15 南京工业大学 一株青霉素酰化酶及其编码基因、产生菌和应用
CN109971742A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 艾美科健株式会社 来源于无色杆菌属ccm 4824的青霉素g酰化酶突变体及其应用
CN110106161A (zh) * 2019-05-09 2019-08-09 福建医科大学附属口腔医院 青霉素酰化酶基因及其编码蛋白
CN110846342A (zh) * 2019-11-20 2020-02-28 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种毕赤酵母突变菌及其在青霉素酰化酶生产中的应用
CN111500564A (zh) * 2020-06-02 2020-08-07 南京工业大学 青霉素g酰化酶突变体及其在酶法合成头孢孟多中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101563459A (zh) * 2007-01-31 2009-10-21 酵素生物技术有限公司 编码青霉素酰化酶的dna序列，携带该序列的新型重组dna结构及重组微生物
CN103184182A (zh) * 2013-04-11 2013-07-03 南京工业大学 青霉素酰化酶、其高产菌株及应用
CN103275960A (zh) * 2013-06-25 2013-09-04 珠海联邦制药股份有限公司 一种人工设计的青霉素g酰化酶原及编码序列和发酵方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101563459A (zh) * 2007-01-31 2009-10-21 酵素生物技术有限公司 编码青霉素酰化酶的dna序列，携带该序列的新型重组dna结构及重组微生物
US20100112673A1 (en) * 2007-01-31 2010-05-06 Fermenta Biotech Limited Dna sequence encoding penicillin acylase, novel recombinant dna constructs and recombinant microorganisms carrying this sequence
CN103184182A (zh) * 2013-04-11 2013-07-03 南京工业大学 青霉素酰化酶、其高产菌株及应用
CN103275960A (zh) * 2013-06-25 2013-09-04 珠海联邦制药股份有限公司 一种人工设计的青霉素g酰化酶原及编码序列和发酵方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALLE BRUGGINK主编: "《β-内酰胺类抗生素的合成》", 31 January 2010 *
张爱晖: "两种来源青霉素酞化酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *
梅建凤等: "固定化酶催化合成头孢羟氨苄", 《浙江工业大学学报》 *
郭礼和等: "大肠杆菌青霉素酞化酶基因及其邻近区域的核昔酸全序列", 《实验生物学报》 *
陆健美: "合成阿莫西林用青霉素酰化酶在大肠杆菌中的表达", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *
陈红等: "化学修饰对育霉素G酞化酶活性的影响", 《生物化学杂志》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105274082A (zh) * 2015-11-03 2016-01-27 湖南福来格生物技术有限公司 一种合成用青霉素g酰化酶突变体及其在制备阿莫西林中的应用
CN106399174A (zh) * 2016-11-03 2017-02-15 南京工业大学 一株青霉素酰化酶及其编码基因、产生菌和应用
CN106399174B (zh) * 2016-11-03 2019-11-26 南京工业大学 一株青霉素酰化酶及其编码基因、产生菌和应用
CN109971742A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 艾美科健株式会社 来源于无色杆菌属ccm 4824的青霉素g酰化酶突变体及其应用
CN109971743A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 艾美科健株式会社 来源于无色杆菌属ccm4824的青霉素g酰化酶突变体及其应用
CN109971743B (zh) * 2017-12-28 2022-09-06 艾美科健株式会社 来源于无色杆菌属ccm 4824的青霉素g酰化酶突变体及其应用
CN110106161A (zh) * 2019-05-09 2019-08-09 福建医科大学附属口腔医院 青霉素酰化酶基因及其编码蛋白
CN110106161B (zh) * 2019-05-09 2022-03-22 福建医科大学附属口腔医院 青霉素酰化酶基因及其编码蛋白
CN110846342A (zh) * 2019-11-20 2020-02-28 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种毕赤酵母突变菌及其在青霉素酰化酶生产中的应用
CN111500564A (zh) * 2020-06-02 2020-08-07 南京工业大学 青霉素g酰化酶突变体及其在酶法合成头孢孟多中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104789510A (zh) 一种青霉素酰化酶、编码基因、产生菌株及其应用
EP0454478B1 (en) Cephalosporin acetylhydrolase gene and protein encoded by said gene
CN112522173B (zh) 一种生产异源碱性蛋白酶的工程菌及其构建方法
EP3926043A1 (en) Special enzyme for producing galactooligosaccharides, preparation therefor and use thereof
CN107904223A (zh) 一种褐藻胶裂解酶、分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞及其应用
CN114426961B (zh) 一种β-葡萄糖苷酶突变体、其编码基因、表达菌株及其应用
CN109897862A (zh) 庆大霉素b生产菌及其制备方法和应用
CN108841770A (zh) 一种能够表达磷脂酶d的枯草芽孢杆菌工程菌
KR101062978B1 (ko) 신균주 페니실륨 피노필럼 ｋｍｊ601 유래 엔도글루카네이즈의 생산 최적화 및 유전자 클로닝
CN104726435A (zh) 一种β-葡萄糖苷酶突变体、其重组表达质粒及转化的工程菌株
CN104845926B (zh) 一种有利于重组蛋白胞外分泌的基因敲除大肠杆菌及其应用
CN110396507A (zh) 源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶
CN112175919B (zh) 内酯水解酶突变体及其应用
CN103184182B (zh) 青霉素酰化酶、其高产菌株及应用
CN111057695B (zh) 一种腈水解酶及其制备方法和应用
CN107022556A (zh) 一种用枯草芽孢杆菌工程菌降解1，2，3‑三氯丙烷的方法
CN111621452A (zh) 一株生产d-对羟基苯甘氨酸的枯草芽孢杆菌
CN106399174B (zh) 一株青霉素酰化酶及其编码基因、产生菌和应用
CN105950595B (zh) (-)-γ-内酰胺酶、基因、突变体、载体及其制备与应用
CN115786315A (zh) 酰化酶、编码基因、工程菌，及在水解和合成n-脂肪酰谷氨酸型表面活性剂中的应用
CN112195129B (zh) 紫色杆菌素生物合成基因簇及其应用
CN111484988B (zh) 一种具有木聚糖酶和阿魏酸酯酶活性的双功能酶及其编码基因和应用
CN113930376A (zh) 一种用于催化生产d-对羟基苯甘氨酸的工程菌、高密度培养方法及催化生产方法
CN110923223A (zh) 一种新型腈水解酶及其应用
CN112322602B (zh) 一种共表达磷脂酶促进蛋白在枯草芽孢杆菌中胞外表达的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150722