JPH05501806A - 変異β―ラクタムアシラーゼ遺伝子 - Google Patents
変異β―ラクタムアシラーゼ遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
変異β−ラクタムアシラーゼ遺伝子
(関連分野)
本発明はアシラーゼをコードする遺伝子の変異(mutation)で、アシラ
ーゼ酵素の基質特異性を変化させる変異に関する。これらの変異酵素のい(っか
は、特にβ−ラクタム誘導体のデアシレージョン/アシレーションに適する触媒
活性を示す。これらの中では、セファロスポリン及びその誘導体の7−セファロ
スポリン酸及びその誘導体へのワンステップ変換を目的として設計したものが好
ましい。
(関連技術)
β−ラクタム型の基本的抗生物質は、原則的に醗酵で得られる。ペニシリウム(
Penicillium)及びセファリスポリウム(Cephalospori
um)(アクレモニウム(Acremonium))属の菌は、ペニシリンG、
ペニシリンVおよびセファロスポリンCなどのβ−ラクタム抗生物質の原料とし
て使用し得る。PenG、PenV及びCefCとも呼ばれるこれらの醗酵産物
は、現在市販されているほとんど全てのペニシリンやセファロスポリンの原料で
ある。各々のこれらの側鎖であるフェニルアセチル、フェノキシアセチル及びア
ミノアジピル基は、アミド結合の切断(デアシレージョン)により除去され、二
つのペニシリン分子の場合は6−アミノペニシラン酸(6−APA)及びセファ
ロスポリンの場合は7〜アミノセフア0スポラン酸(7−ACA)を生ずる。こ
の変換を行う特定の酵素は、”アシラーグ又は”アミダーぜと呼ばれる。本明細
書で使用するこれらの名称は、同じ意味を持っている。
また、セファロスポリンGの7−アミノ−3−デアセトキシセファ0スボラン酸
(7−ADCA)への変換も説明している。しかし、セファロスポリンG(Ce
fG)は醗酵産物ではなく、通常ペニシリンGから化学的に合成する。ここで述
べている種々のペニシリンおよびセファロスポリンの基本的構造を第1図に示す
。
種々のペニシリンおよびセファロスポリンの合成は基本的にそれぞれ6−APA
、7−ACAおよび7−ADCAを原料とする。
ペニシリンGおよびペニシリンVの6−APAへの変換は、化学的または酵素的
に行うことができる。古典的方法は化学的切断であったが、現在では酵素的方法
が好まれている(ロー(Lowe)[1)のレヴユー参照)。酵素的方法のコス
トおよび環境的配慮の利点が論じられている。
CefCの側鎖の切断による7−ACAへの変換は通常いわゆるイミノ−ハライ
ド法を用いて行う。しかし、この方法は複雑で、とりわけ多くのステップ、極端
に低い温度および高価な試薬を必要とするという重大な欠点を持っている。
目的の半合成抗生物質へのβ−ラクタム中間体の変換も、化学的または酵素的に
行うことができる。適当な酵素が使用できるなら基本的に酵素法の方が好ましい
。多くの場合に使用される酵素は、ペニシリンアシラーゼである。酵素的変換は
、正しい条件が得られればどの酵素反応も可逆的であるという利点を持っている
(アボット(Abbot) B、 J、[2) )。
醗酵によって得られるβ−ラクタム誘導体のデアシレージョンおよび、または選
択した半合成β−ラクタム抗生物質への6−APAおよび7−ACAのアシレー
ションに有用なアシラーゼ生産菌としては種々の微生物が提案されている。これ
らのアシラーゼ生産菌には、大腸菌、クルイベラ シトロフィラ(Kuyver
a citrophila)、プロテウス レトゲリ(Proteus ret
tgeri)、シュードモナス(Pseudomonas)種、アルカリゲネス
フェカリス(Alcaligenes faecalis)、バチルス メガ
テリウム(Bacillus megaterium)、バチルス スフエリカ
ス(Bacillus 5phaericus)、およびアースロバクターヒス
コサス(Arthrobacter viscosus)の特定の株がある。
参考文献にしたがって、分子構造および基質特異性に基づきいくつかのアシラー
ゼを選んだ(Vandamme E、J、[3))。
タイプIアシラーセはペニシリンVに特異的である。これらの酵素はそれぞれ3
5kDaの分子量を持つ4個の同じサブユニットからなっている。バチルススフ
エリカス(Bacillus 5phaericus)からクローン化した遺伝
子の完全なヌクレオチド配列が報告された(オルソン(Oflson)A。
〔4〕)。
タイプ■アシラーゼは全て共通した分子構造を共有している。この酵素は小さい
サブユニット(α; 20−25kDa)および大きいサブユニット(β、6O
−65kDa)からなるヘテロダイマーである。基質特異性に関して、タイプ■
アシラーセはさらに二つのグループに分けられる。
タイプIIAアシラーセはペニシリンGに非常に特異的である。一般に、これら
はアミド基の窒素原子に隣接する部分(セフェム基、ペネム基、アミノ酸など)
に対しては特異性を示さず、基質のアシル部分に特異性を示す。このアシル部分
は疎水性が高くなければならず、ベンジル基または(短い)アルキル基であるこ
とが好ましい。タイプ■アシラーセによって加水分解しない基質には、CefC
の側鎖にアシル部分としてスクシニル、グルタリル、アジピルおよびアミノアジ
ピル基のようなジカルボン酸を持つものがある。タイプIrBアシラーセは、ア
シル部分としてスクシニル、グルタリルおよびアジピル基をもつセファロスポリ
ン(デスアセトキシ誘導体を含む)、またある場合には非常に限られた程度では
あるがCefCでさえも加水分解し得ることが報告されている(シブヤ(Shi
buya)Y、[5):マッダ(Matsuda)A、[6))、これまで、こ
れらのアシラーゼは、シュードモナス(Pseudomonas)種およびバチ
ルス メガテリウム(Bacillus megaterium)およびアース
ロバフタ−ビスコサス(Arthrobacter viscosus)のある
株のみに見いだされている。
文献は主にペニシリンアシラーゼに関するものである。しかし、ペニシリンアシ
ラーゼの合成能は、この酵素の特異性のために制限されている。また、最近セフ
ァロスポリンCアシラーゼに関する報告が出たが、報告された酵素の活性は比較
的低いものであった。適当な酵素の発見に相当の努力か払われたが、これまでの
ところセファロスポリンCの7−ACAへの変換を目的とした酵素法は商業的に
使われていない(ウオルトン(Wa I t on) R,B、C7) )。
それゆえ、目的の化学物質を生産するためのデアシレージョン/アシレーション
に高い効率を有するアシラーゼ酵素の開発には実質的な興味が持たれる。β−ラ
クタム特にPenG、PenVおよびCefCおよびこれらの誘導体の6−AP
Aおよび7−ACAおよびこれらの誘導体への酵素的デアシレージョンおよび目
的の半合成ペニシリンおよびセファロスポリンを生産する後者化合物のアシレ−
ジョンは、特に興味深い。この関係において、CefC(および誘導体)の7−
ACA (および誘導体)への変換を触媒しつる有効なアシラーゼ酵素は特に重
要である。
本発明は、このような有効な酵素を提供することを目的とする。
(関連先行技術)
マハジャン(Mahajan)[8)は、種々のペニシリンアミダーゼのレヴユ
ーを提供し、また、PenGおよびPenV特異的7゛シラーセを区別した。
ヨーロッパ特許出願EP−A−0283218は、アースロバフタ−ビスコサス
(Arthobacter viscosus)ATCC53594株由来の酵
素を用いたCefCおよびその誘導体の7−ACAおよびその誘導体への酵素的
ワンステップ変換を開示している。
プ変換法を公開している。
理的に処理することによってこれらの微生物から得られる物質を用いる同様の変
換法を公開している。
これまで述べてきたように、これらの酵素の低い活性が商業的に使用されなかっ
た要因であった。
組み換えDNA技術の発展で商業的に使用できるアシラーゼの生産レベルの増加
が可能になり(メイヤー(Mayer)(9))、これらの酵素の処理に関する
知見も増えたくンユメイチャ=(Schumacher)N O〕)。大腸菌の
ベニンジンア/ラーセは、大きな前駆体蛋白質として生産され、これがさらに小
(α)および大(β)サブユニットからなる細胞周辺腔の成熟蛋白質にブロセグ
でこの遺伝子と大腸菌アシラーゼ遺伝子との緊密なホモロジーが明らかになっr
oteus rettgeri)ペニシリンGアンラーゼについても大小のサブ
ユニットの存在が報告された(ドーミ−(Daumy) [12] )。
ウィリアムス(W目1 i ams)[33)は、天然に存在する変異体である
大腸菌ATCC9637のPenGアシラーゼの基質特異性の変化について報告
している。この方法は、野生型遺伝子中の天然変異体の遺伝子の等低領域による
置換的サブクローニングに基づいている。
フォーネイ(Forney) [34,35]は、大腸菌のペニシリンアミダー
ゼからの新しい基質特異性を持つアミダーセの選択、および高い変異効率を持つ
大腸菌株におけるこのような組み換えプラスミドの増殖によるこれらのペニシリ
ンアミダーゼ(大腸菌ATCC11105由来)の触媒効率の改善について報告
している。ペニシリンおよびセファレキシンの基質アナログとしてD−(−)−
α−アミノフェニルアセチル−(L)−ロイシンを使用した。ペニシリンアミダ
ーゼの基質特異性の改善および低pHでのα−アミノフェニルアセチル部分を有
するアミドのより迅速な加水分解を行う酵素の発見が可能となった。
これらの刊行物は、本発明を開示あるいは示唆しているわけではない。
(本発明の概要)
本発明は、アシラーゼ遺伝子の突然変異に関しており、そのい(つかはアシラー
ゼ酵素の基質特異性に変化を起こしているものに関する。突然変異は、アシラー
ゼ遺伝子の特異的ヌクレオチドに生起されており、種々の態様において、この変
異酵素は生化学的性質に変化を示し、これに限られるわけではないが特定のβ−
ラクタム抗生物質のデアシレージョンに関する特異性の増加が見られる。
好ましい対様において、Cef−Cおよびその誘導体を7−ACAおよびその誘
導体にワンステップ変換するのに適した新しい変異酵素が提供される。
別の好ま駿い態様においては、特に、目的のペニシリンおよびセファロスポリン
誘導体を生成する6−APAおよび?−A (D)CAのアシレージョンに特に
適した新しい変異酵素を提供する。
本発明の態様では、既知のタイプIIAまたはタイプI[Bアシラーゼ、flI
えば大腸菌、クルイベラ シトロフィラ(Kluyvera citrophi
la)、アルカリゲネス フェカリス(A!caligenes faecal
is)またはその他のそのような酵素を生産する生物由来のPenGアンラーセ
をコードする遺伝子を変異させ、その基質特異性を変化させる。
これらの態様については、以後詳細に説明する。
図面の簡単な説明
第1図・特定のβ−ラクタム変換の反応図式。反応■は6−APAおよびフェニ
ル酢酸を生ずるPenGのデアシレージョンである。反応2は6−APAおよび
フェニル酢酸を生ずるPenVのデアシレージョンを示している。反応3は7−
ACAおよび(α−)アミノアジピン酸へのCefCのデアシレージョンを示し
ている。反応4は7−ADCAおよびフェニル酢酸へのCe fGのデアシレー
ジョンを示している。
第2図・プラスミドpUNNIの制限地図。
第3図二大腸菌ATCCl l l O5ペニシリンアシラーゼ遺伝子を有する
プラスミドpUNNECの制限地図。
第4図ニブラスミドpAFlの6.4kb挿入物の制限地図。
第5図:アルカリゲネス フェカリス(Alcaligenes faecal
is)のペニシリンアシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列および誘導されるアミ
ノ酸配列。
第6図 シュードモナス(Pseudomonas)SY−77グルタリルーC
efアシラーゼ遺伝子を有するI)UNNGL7の挿入物。
第7図:シュードモナス(Pseudomonas)SY−77のグルタリル−
Cefアシラーゼ遺伝子を有するプラスミドpU018ニブラスミドpUCGL
7Aの制限地図。
第8図:シュードモナス(Pseudomonas)SE−IL3 AcyII
遺伝子を有するプラスミドpTZI8RニブラスミドpTZSE5−1の制限地
図。
第9図:TACプロモーターのコントロール下のNdeI挿入部位を有する突然
変異誘発発現プラスミドpMa/cの誘導体ニブラスミドpMcTNdeの地図
。
第1O図ニブラスミドpMcTNdeのNde1部位に挿入した5Y−77グル
タリルーCefアシラーセ遺伝子(開始コドンを有する)を含むプラスミドpM
cTGL7ANdeの地図。
第11図:Nde1部位に挿入した5E−83AcylI遺伝子を有するプラス
ミドpNcTNde ニブラスミドpMcTSE5Ndeの地図。
第12図:Nde1部位に挿入したA、フェカリス(faecalis)ペニシ
リンアシラーゼ遺伝子を有するプラスミドpMcTNde ニブラスミドpMc
TAFNdeの地図。
第13図・完全なシュードモナス(Pseudomonas)SY−77グルタ
リルーCefアシラーセ遺伝子のヌクレオチド配列および誘導されるアミノ酸配
列。
第14図 大腸菌(e、col)、クルイベラ シトロフイラ(Kluyver
a citrophila)(K、cit)、アルカリゲネス フェカリス(A
lcaligenes faecalis)(a、fae)、シュードモナス(
Pseudomonas)SE−83AcyII (AcyII)およびシュー
ドモナス(Pseudomonas)SY−77(SY−77)由来のタイプ■
アシラーゼの配列。アステリスクはその配列が大腸菌アシラーゼの配列と同じア
ミノ酸をその場所に含んでいることを示している。
第15a図:アルカリゲネス フェカリス(Alcaligenes″ fae
calis)α−サブユニットにおける領域選択。
第15b図:アルカリゲネス フェカリス(Alcaligenes faec
alis)β−サブユニットにおける領域選択。
第16a図:5Y−77α−サブユニットにおけるアミノ酸残基選択。
第16b図: 5Y−77β−サブユニットにおけるアミノ酸残基選択。
第17図:グルタリルアシラーゼ5Y−77野生型および変異型V62Lによる
アジピルセリンの変換。酵素はグルタリル?−ACAに関して同じ活性が得られ
るように添加した。
第18図:グルタリルアシラーゼ5Y−77野生型および変異型Yl 78Hお
よびV179Gによるアジピルセリンの変換。酵素はグルタリル?−ACAに関
して同じ活性が得られるように添加した。
第19図:グルタリルアシラーゼ5Y−77野生型および変異型Y178Hおよ
びL177r+Y178Hによるアジピルセリンの変換。酵素はグルタリル7−
ACAに関して同じ活性が得られるように添加した。
(発明の詳細な説明)
本発明は、基質特異性の変化したアシラーゼの開発に蛋白質工学を使用する。
本発明は、種々の(既知の)アシラーゼが特定の領域に有意なホモロジーを示す
ことを見出したことに基づいている。比較分析によってアシラーゼの生化学的性
質は、特定の変異によって変化することが示された。以下に概説する方法によっ
て多くの有力な変異部位が明らかになった。
相同的蛋白質における三次構造は進化の過程で一次構造よりも、またDNA配列
よりも保存されていることが分かってきた。このことは、例えばグロビン群によ
って示されている(ディッカーソン(Dickerson [13:l )。グ
ロビン構造は、非常に多くの異なるアミノ酸配列によってコードされており、あ
るものでは86%もの違いが見られる(150残基中130)。それにもかかわ
らず、それらが非常に似た構造を取っていることは、それらが共通の祖先に由来
しているという仮説を支持している。
生物が、進化の過程で多様化するとき、それらの遺伝子は徐々に変異を蓄積し、
全く異なるアミノ酸配列の蛋白質を生成する。それらが多様化すればするほど、
配列のホモロジーは小さくなる。ホールディング、安定性または触媒活性に無関
係な部位における突然変異の頻度は高い。通常、これらの部位は、側鎖が表面に
出ているポリペプチド中の部位に存在する。折り返しのところにのみ、残基が短
い極性側鎖を有するか、もしくは、グリシンまたはプロリンである傾向を持つ。
これらの残基はほとんどこの部位に存在する。内部の残基は余り変化せず、その
側鎖の非極性は非常に良く保存される。進化の過程での突然変異はランダム過程
なので、機能性に影響する置換も存在する。これらの置換がその生物に害を起こ
さないときのみ、それは保存される。通常、触媒活性に直接関係する残基は、非
常に良く保存されることが分かっている。二次構造ユニット間の表面ループでは
、内部を乱すことなく挿入および欠失が起きる傾向にある。通常、分岐した分子
における二次構造要素は同様の三次元的構造に配列している。
これらの分子の分子構造における類似性と同様に、タイプ■アシラーゼ間に見ら
れる配列ホモロジーは、タイプIIAおよびタイプI[Bアシラーゼが単一の祖
先遺伝子から進化してきたことを示している。また、典型的な成熟過程も共通起
源を指示している。共通の祖先から分岐してきた蛋白質の配列比較は、その酵素
の機能に直接関係する残基を明らかにし得る。
本発明の態様においては、既知のタイプmAまたはタイプI[Bアシラーゼをコ
ードする遺伝子、例えば、大腸菌、クルイベラ シトロフィラ(Kluyver
a citrophila)、アルカリゲネス フェカリス(Alcalige
nes faecalis)またはその他の生物由来のPenGアシラーセ、お
よびシュードモナス(Pseudomonas)SE−83AcyII、シュー
ドモナス(Pseudomonas)SY−77またはその他の生物に由来する
グルタリル−Cefアシラーセをコードする遺伝子をそれらの基質特異性が変化
するように変異させている。
PenGアシラーゼ(タイプI[A)の基質特異性の修正は、変異酵素が天然の
ペニシリンGの側鎖であるフェニルアセチル基以外の側鎖を有するペニシリンお
よびセファロスポリン誘導体を切断または合成し得るように行った。実際にPe
nGアシラーゼによって影響を受けない側鎖には、ジカルボン酸であるコノ1り
酸、グルタル酸、アジピン酸およびアミノアジピン酸(後者はCefCの天然の
側鎖である)由来のアシル基がある。
本発明の別の態様では、Cefアシラーゼ(タイプnB)の基質特異性を修正し
、グルタル酸以外の側鎖を有するペニシリンおよびセファロスポリン誘導体を切
断または合成する変異酵素を調製している。このような新しい変異酵素によって
切断または合成される適当な側鎖には、アジピン酸およびアミノアジピン酸由来
の部分(天然のセファロスポリンの側鎖である)、天然のペニシリンGの側鎖で
あるフェニル酢酸の部分のような疎水性側鎖、およびアルキル側鎖などCefア
シラーセによって実質的に影響されないものである。
別の特徴に於いて、アシラーゼ(タイプI[AおよびI[B)の特異性および活
性の修正は該アシラーゼに関して既に存在する側鎖について行った。蛋白質工学
を用いることにより、基質に対するアフィニティーが修正することもあるしく例
えば増加、基質に対するより低いKmによって表される)、触媒的ターンオーバ
ーが変化することもある(例えば増加、基質に対するより高いk c* lで表
される)。
酵素分子の修正を行うために、その酵素の3D構造を役立てることは非常に望ま
しい。これまで、アシラーゼに関する高分解能の3D構造は報告されていない。
しかし、アシラーゼをコードする幾つかの遺伝子、例えば、大腸菌、クルイベラ
(タイプIrB)由来の遺伝子がシーケンシングされ、このことは、これらの酵
素の生物学的処理に関する洞察を与えた。単離したサブユニットのアミノおよび
カルボキシ末端のシーケンシングは、その遺伝子が、シグナル配列とそれに続く
α−サブユニット、連結ペプチド(スペーサー)および最後のβ−サブユニット
からなる前駆体蛋白質をコードしていることを示した。
本発明の態様に従い、アンラーゼの蛋白質工学は選択したアシラーゼの3D構造
の使用可能性に依存して、二つの戦術で行った。3D構造の測定操作はよく知ら
れている。
3D構造が手に入らないときは、以下の戦術に従った第一に、幾つかの選択した
アシラーゼ遺伝子を適当な発現宿主生物にクローン化する。好ましい微生物には
、大腸菌、バチルス(Bac i l 1us) 、シュードモナス(Pseu
domonas)がある。次に、クローン化した各アシラーゼのDNA配列を決
定する。このDNA配列を対応するアミノ酸に翻訳し、それらのアミノ酸配列を
可能な限りホモロジーが高くなるように整列させる。配列の整列に関して、同一
性や類似性に基づくアミノ酸のタイプをパラメータとして用いると良い。例えば
、セリンはスレオニンと似ており、アスパラギン酸はグルタミン酸に似ている。
さらに、適当なパラメータには二次構造予測(いくつかの標準的操作、例えばチ
ョウ ファスマン(Chou Fassman))および配列中の荷電分布があ
る。次のステップは変異領域の選択である。
ランダムに生じた変異体は、特異的基質を切断し得るもののみを増殖させること
によって選択する。通常、これらの基質にはアシル部分として酸アシラーゼの特
異性としては好ましい側鎖およびアミド部分としては発現宿主の増殖には欠かせ
ないし一アミノ酸を含むアミド誘導体が含まれる。それゆえ、望ましい基質特異
性を有するアシラーゼを発現する宿主のみが該アミド化合物を切断することがで
き、それにより必須アミノ酸を放出することができる。たとえば、D−α−アミ
ノアジピル L−ロイシン(以後アミノアジピルロイシンと呼ぶ。この化合物は
D型である)をアミド化合物として用いてロイシン栄養要求性発現生物を使用し
たCe fCアシラーセを選択できる。アミン部分のもう一つの例は、アンモニ
アで発現宿主の唯一の窒素源として働きうる。
使用した選択操作に基づく目的とする基質特性を持つ“ポジティブ変異アシラー
ゼを精製しテストする。突然変異誘発部位は変異アシラーゼ遺伝子のシーケンシ
ングにより同定する。このような変異体には5Y−77アシラーセの変異体V6
2L、Y178H,V179Gがある。他の突然変異(アミノ酸置換、欠失およ
び挿入を含む)を変異アシラーゼの活性を増加させるためにこれらの部位または
その周辺に導入することもある。したがって、上述の変異のどの組み合わせも本
発明の範囲に入ることが理解されよう。このような組み合わせの例には、5Y−
77アシラーセの変異体5177I/Y178Hがある。
アシラーゼの3D構造が使用可能なときは、上述の操作の第一ステップを行う必
要があるが、変異の選択は3D構造に基づいてできる。これには二つの方法が考
えられる:
a)一つもしくは幾つかのアミノ酸を他のアミノ酸に変異させる合理的方法。
これは多量の変異体を生成しないので全ての変異体を精製や基質特異性のテスト
について取り扱い得る。三次元構造から、活性部位の一つ以上のアミノ酸を変異
させるために選択し、その活性部位における側鎖を至適なものにする。たとえば
、CefCのアミノアジピル側鎖をPenGアシラーゼに適応させるためには、
まず、結合ポケットを大きくしてより長いアルキル鎖がフィツトするようにし、
かつ、第二にアミノアジピル側鎖のアミ人および、またはカルボキシ基を結合す
る正しい静電的環境を供給することが必要である。別の例では、CefCの側鎖
の正電荷のアミノ基を適応させるための適正な静電的環境の導入は、グルタリル
−Cefアシラーゼ(すでにアミノアジピルセファロスポリンに対する活性をい
(らか示す)の特異性をCefCアンラーゼへと変化させる。
b)″ターゲラティドランダム突然変異誘発(TRM)法”。3D構造が分がっ
ていても予想は非常に難しい。もし、基質結合に幾っがのアミノ酸が関係してい
ることが分かれば、ターゲラティドランダム突然変異誘発を行うことができ、続
いて先に述べた選択テストを行うことができる。この方法では、例えば三個の部
位をランダムに変異させたときは、8000個の変異体が生成する(アミノ酸に
関しテハ、20*20*20 ;DNAレベルテハ、(4*4*4)’ =26
2゜000の変異体)。
(べき高いホモロジーを示すことが分がった。アルカリゲネス フェカリス(A
lcaligenes faecalis)由来のアシラーゼをコードする遺伝
子を単離し、シーケンスし、他の二つの種の遺伝子と比較した。その配列に共通
した特徴は、遺伝子力吠きいポリペプチド前駆体をコードしていることで、この
事は第1表で見ることができる。アルカリゲネス フェカリス(Alcalig
enes faecalis)に関するクエスジョンマークは、この配列の最後
か不明確で決定できなかったことを示している。
第1表
アシラーセペプチド当たりのアミノ酸数本発明のもう一つの特徴として、シュー
ドモナス(Pseuclomonas)SY−77由来のアシラーゼのα−およ
びβ−サブユニットが、タイプmAアシラーゼおよびタイプIIBSE−83A
cyI Iアシラーゼの両方に対して高いポモロシーを有する領域を含んでいる
ことが示された。シュードモナス(Pseudomonas)SY−77のアシ
ラーゼコート遺伝子を単離し、この遺伝子の完全な配列を決定した。両方のシュ
ードモナス(Pseudomonas)アシラーゼに関して、α−およびβ−サ
ブユニットの間に連結ペプチドがあるという証拠はない。5Y−77酵素は、5
E−83Acy I IのN末端のシーケンシングによってその成熟α−サブユ
ニットが開始メチオニンのすぐ後ろで始まっていることが示されているにもかが
わらず、シグナルペプチドを有していると考えられている(マツダ(Matsu
da)A、[6]’Lタイプ■アンラーセの速度論は、アシル酵素中間体を介す
る触媒プロセスと一致している(マハジャン(Mahajan) [8))。
このメカニズムの最初のステップでは、基質のPenGが酵素に結合して非共有
結合的メカエリスーメンテン複合体e:PenGを生成する。続くステップでは
、酵素とアシル部分の間で、第一の生成物6−APAの放出を伴って共有結合中
間体が生成する(e−PhAc−アンル化酵素;PhAc=フェニル酢酸)。
デアシレージョンは水分子の助けを借りて進行し、第二生成物PhAcの放出お
よび酵素の再生が起こる。このメカニズムもPhAcが競合的インヒビターとし
て働き、6−APAが非競合的に働くという観察と一致いている。
セリンプロテアーゼに対して推論されているのと同様に、上記のメカニズムはフ
ェニルメチルスルフォニルフルオライド(PMSF、セリンプロテアーゼの強力
なインヒビター)がこの酵素を阻害するという知見とともに、これらの酵素もセ
リン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸からなる触媒トリオを含むセリンプロテ
ーゼであることを示している。このような触媒トリオはトリプシンおよびズブチ
リシン群のセリンプロテアーゼばかりではなく、ヒト膵臓および菌類リゾムコー
ル ミニヘイ(Rhizomucor m1ehei)由来の構造的に異なる二
つのトリアシルグリセロールリパーセにも発見されている(ブロー(B I 。
w)D、[14] ;ウィンクラ−(Wi nk l e r) F、 K、1
:15] ;ブラディ−(Brady)L、〔l 6))。配列整列化に基づき
、アルカリゲネス フェカリス(Alcaligenes faecalis)
の5et765は、このアシラーゼの活性部位のセリンらしい。この知見に基づ
きさらに活性を改善した変異体か、提供される。
本発明の別の特徴として、大腸菌、アルカリゲネス フェカリス(Alcali
genes faecalis)、シュードモナス(Ps eudomona
5)SY−77およびシュードモナス(Pseudomonas)SE−83A
cy■■由来のアシラーゼをコードする遺伝子を発現宿主生物大腸菌にクローン
化している。
大腸菌、クルイベラ シトロフィラ(Kluyvera citrophili
)、シュードモナス(Pseudomonas)SE−83AcyrlのDNA
配列およびシュードモナス(Pseudomonas)SE−77の部分的DN
A配列は、文献から引用した。アルカリゲネス フェカリス(AlcaligP
enGアシラーセとグルタリル−Cefアシラーゼ間のホモロジーは低かった(
25〜35%)にもかかわらず、五つのアミノ酸配列の整列化は、PenGアシ
ラーセ間の近接したホモロジー(〉45%)を示す一方、グルタリル−Cefア
ノラーセ間のホモロジーも同じオーダーであることを示された。また、五つ全て
の配列間で高いホモロジーを示す領域は、同様の3D構造に位置することぐ既に
、ヘテロニ量体構造により支持されている)が検出された。
変異に特に興味深い領域は、アシラーゼのα−およびβ−サブユニットである。
本明細書で用いられている全てのアミノ酸は、他言しないかぎり、L型である。
“アミノアジピル”という語句は、D−α−アミノアジピル部分を示している。
また、β−ラクタムアシラーゼ変異体をクローン化し、β−ラクタム生産微生物
中で発現し得る。このことは、デアシル化β−ラクタム中間体を醗酵培地から直
接回収し得るという利点を有している。セファロスポリウム(C6phal。
sporium)およびペニシリウム(Penicillium)株は、β−ラ
クタムアンラーゼの応用に関する宿主として望ましい。
以下に示す例は、説明を目的とするもので制限を与えるものではない。
(材料と方法)
アシラーゼ遺伝子のクローニングおよび欠失一般的なりローニング操作は、マニ
アチス(Maniatis)[17L オースベル(Ausubel (18)
およびパーパル(Pe rba l C19)の方法に従った。これらのハンド
ブックには、cDNA分子の構築および増殖操作、遺伝子ライブラリー構築操作
および部位特異的またはランダムなりNAの変異法等が詳細に述べられている。
DNA操作に必要な酵素は市販されているものをその説明書にしたがって使用し
た。プラスミドおよび大腸菌クローニング宿主は公的な培養物保管機関から入手
した。
プラスミドpUNNIの構築
プラスミドpUNNlは以下のようにして構築した。プラスミドpUB 110
(S、aureus)をSua Bl及びTag Iで切断し、ネオマイシン耐
性遺伝子をSma I、AC(l消化pUc19にクローン化し、pPNeoを
得た。pPNeoの旦且旦R1一旦旦且I小フラグメントをpUc18の旦旦旦
Rン化した。KpuI、XbuI消化、ヌクレアーゼS1処理及び結合の後、プ
ラスミドpUNNlを回収した。このプラスミドは陽性選択ベクターとして使用
でき(Nilsson、前出)、一般のクローニングベクターに較べて、β−ラ
クタム抗生物質を破壊し得るβ−ラクタマーゼ遺伝子を含んでいないという利点
をアシラーゼ活性は蛍光色素フルオレサミンによる一級アミノ基の検出に基づく
分光測定法によって検定した(S、アンダーフレンド(Underf ri e
nd)等[32))。?−ACAの検出には、レイニス(Reyes)等の方法
を採用した〔21〕。
酵素活性を測定するために、酵素を基質と共に室温でインキュベートした。反応
液の組成は、20mMリン酸ナトリウムバッファpH7,5,1,2mM基質、
1.0mMβ−ラクタマーゼインヒビター6−プロモーペニシラン酸および酵素
である。反応は、0.5N HCIを添加することによって停止した。遅い反応
は、塩酸による停止なしに直ちに検定した。反応液から100μリツトル採取し
、800μリツトルの0.2 M酢酸ナトリウムバッファI)H4,5およびA
Rアセトンで調整した100μリツトルのフルオレサミン(1mg/ml)を混
合した。基質が、7−ACAの代わりにアミノ酸を含む場合、酢酸ナトリウムバ
ッファの代わりに0.2Mリン酸ナトリウムpH7,5を使用する。15分後、
Uvicon860分光光度計で378nmの吸収を測定し、適当なブランクで
補正した。校正曲線によると378nmでの吸収は基質の加水分解によって放出
された遊離したアミノ酸の数に関連していた。
アシラーゼ遺伝子の突然変異誘発
クローン化したDNAフラグメントの部位特異的突然変異誘発は、プラスミドp
Ma/cシステムを用いスタンセンズ(Stanssens)[22)の方法で
行った。アシラーゼ遺伝子の適当なギャップ二本鎖分子を構築した。オリゴヌク
レオチド部位指定突然変異で特異的ミスマツチを導入した。アシラーゼ遺伝子の
発現は、大腸菌WK6中、同種発現シグナル、または大腸菌1ac、tacまた
はtrpプロモーターで始まった(デボア(De Boer)[23))oギャ
ップ二本鎖分子を”スパイクト”オリゴヌクレオチドとアニールし、リーノヨン
ターケッティドランダム突然変異誘発を行った(エルメス(He rme 5)
C24’J)。これらの“スパイクト”オリゴヌクレオチドは、アプライドバイ
オシステムダDNA合成機でオリゴヌクレオチドを合成する際に四種全てのヌク
レオチドを含めておくことで調製した。それとは別に、ギャップドDNAのラン
ダム突然変異は、リーソバラ(Leethovaara)[25)の方法の修正
法を用いて酵素的に行った。ギヤングを選択することで、酵素的に変異させる領
域を選んだ。
別のタイプの実験では、ターゲソティトランダム突然変異誘発を行った。これは
、オリゴヌクレオチドの合成の際に、特定のアミノ酸のコドンに四種全ての塩基
を含める事を含む。これを行うために、どのアミノ酸も他の全てのアミノ酸に変
異させうる変異性オリゴヌクレオチドを合成する。その様にして、単一のアミノ
酸部位または幾つかの部位の組み合わせを変異し得る。別に、PCR法を用いた
ランダム突然変異も使用し得る[36)。
選択培地
フェニルアセチルロイシン(“fal”)に関する選択培地は、ガルシア(Ga
rcia)[:2Uにより報告されているものを調製した。最小プレートは以下
のものを含んでいる。M63最小寒天、2g/Iグルコ〜ス、1mg/lチアミ
ン、10mg/lプロリンおよび適当な抗生物質(50μg/mlクロラムフェ
ニコール(c a p)または25μg/mlアンピシリン(amp))。アシ
ラーゼの側鎖特異性(例えば、アジピルまたはアミノアジピル)に関する選択に
は、100μg/I!の対応するアシルロイシンを最小プレートに含めた。アシ
ルロイシン存在下で排他的に増殖する大腸菌HBIOI (Leu )のトラン
スホーマントまたは変異体は、目的の特異性を有するアシラーゼ遺伝子を持つと
考えられる。ロイシンの代わりに、選択基質のアミノ酸部分を変化させてみた。
このような場合、選択には大腸菌の適当な栄養要求変異体を用いた。たとえば、
基質N−アジピルセリンに関する選択には、宿主として大腸菌PC2051株を
用いた(Phubagen、ユトレヒト、オランダより入手)。フェニルアセチ
ルロイシン、アミノアジピルロイシン、グルタリルロイシン、アジピルアラニン
およびアジピルセリンはLGSS、Transferbureau Ni jm
egen。
オランダから購入した。
炭素源として0,2%のコハク酸塩、グリセロール、またはグルコース、および
チアミン(lμg/mlLプロリン(10μg/ml)および適当な抗生物質を
補った最小M63培地に最終濃度が15mMとなるようにフェニルアセチルアミ
ドを添加した。基礎培地中の全ての塩は、アミドに関する選択的増殖を保証する
ために、Na+またはK“イオンを含む対応する塩に置換した(ドーミー(Da
umy)[12))。目的の側鎖を有するアミドは市販のものを購入するか、も
しくは、標準法にしたがって調製した。宿主として大腸菌JMIOI、WK6.
HBIO1,PC2051およびPC1243株を用いて、選択的アミドに対す
る特異性を持つ変異遺伝子を選択した。
野生型および変異型グルタリルアシラーゼの単離操作遠心により細胞を回収し、
140mM NaC1を含む10mMリン酸ナトリウムバッファpH7,4に懸
濁した。この細胞を超音波処理で破壊した(6X20秒、l OOW、100m
mba r、ラブソニック1510.20秒毎に細胞を氷で30秒間冷却した。
)。続いて、このサスペンションを遠心した。超音波処理操作を懸濁したペレッ
トに繰り返し、最後にこの細胞破壊物を遠心で除いた。上滑を集め、これに30
%飽和となるように硫酸アンモニウムを添加した。三十分の攪拌後、沈殿物質を
遠心で除去した。この上清の硫酸アンモニウム濃度を60%に増加し、30分後
、沈殿を遠心で回収した。このペレットを20mMリン酸ナトリウムバッファp
H7,5に溶解し、同バッファに対して十分透析した。
(実施例1)
大腸菌ペニノリンアシラーセ遺伝子のクローニング大腸菌ATCCl 1105
ペニシリンアンラーゼ遺伝子の公表されている制限地図および配列から(サン−
ジン(Sang−Jin)[27] )、2.9kbのHi n dII[−S
ma Iフラグメントがアシラーゼ遺伝子(“pac″)を含んでいると結論し
た。染色体DNAをHindII[およびSma Iで消化し、0.5%アガロ
ースゲルで分画した。2乃至4kbのフラクションをシーンクリーン(BIo
101、 ランヨラ、CA)で精製し、大腸菌pacの配列由来の下記のオリゴ
ヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。
TCGTACA’r’rTTCAG CTGATCTTCATAGTGCTTA
TCそれからポジティブなハイブリダイズフラクションをベクターpUNNlに
連結し、大腸菌HBIOIにトランスホームした。2000個のトランスホーマ
ントの上記オリゴプローブによるフィルターハイブリダイゼーションによってプ
ラスミドpUNNEc1が同定された。その構造を第3図に示す。
pUNNEclを有するコロニーをHl−寒天プレート中30°Cで24時間増
殖させた。その後、このプレートにベニ/リンG(5mg/ml)を含む5ml
の栄養培地トップアガーおよび0.5mlのセラチア マルセセンス(Serr
atia marcescens)ATCC27117の一晩培養物を重層し、
もう24時間インキュベートした。このトランスホーマントのペニシリンアシラ
ーセ活性は、セラチア マルセセンス(Serratia marcescen
Σ)の6−APAに対する高い感受性に由来するコロニーの周辺の阻害ゾーンで
確認できる(ミーブーチソム(Meevootisom)[28))。
(実施例2)
アルカリゲネス フェカリス(Alcaligenes faecalis)ペ
ニンジンアンラーセ遺伝子のクローニングアルカリゲネス フェカリス(Alc
aligenes faecalis)ATCC19018株(=NCTC41
5)の染色体DNAを単離し、5au3Aで部分分解した。4乃至7kbの範囲
のフラクションを精製し、BamHIで消化したベクターpACY184にライ
ゲーションした。このDNAを大腸菌HBlotにトランスホームし、fal−
プレートにブレーティングした(方法セクション参照)。二つのポジティブクロ
ーン、pAFlおよびpAF2、が同定された。これらのクローンもセラチア
マルセセンス(Serratia marcescens)重層法でポジティブ
な結果を示した。pAF 1プラスミドの6、4 k b挿入物を第4図に示す
。
この遺伝子の位置は、Δ、フェカリス(faecalis)ペニシリンアシラー
セのβ−サブユニットのNH2末端配列に関して設計したオリゴヌクレオチドを
用いて決定した。そのアミノ酸配列を以下に示す。
5−N−L−W−3−T/R−(C)−P−E−(C)−VpAF1挿入物に関
するハイブリダイゼーシヨンプローブとしては、以下のオリゴヌクレオチドを用
いた。
AGCAACCTに TGG AGCA/CC/G CTGCCCG GAG
TGCGT制限地図上の7ゾブリダインングシグナルの位置から、A、フェカリ
ス(faeca I i 5)pac遺伝子の方向を決定した(第4図)。6.
4kb挿入物の3.9kbSau3A−Nde Iサブクローンは、ペニシリン
アシラーセ活性を与えることを示したが、3.1kbSau3A−sph+フラ
グメントは、不活性であった(第4図)。3.9kb挿入物のDNA配列は、p
TZ18RおよびpTZ19R(ファルマシア)における適当なフラグメントの
ダイデオキシシーケンシングで決定した。Δエフェカリス(f aeca 1
i s)ペニシ1ルアシラーゼのコードDNA配列および誘導されるアミノ酸配
列を第5図に示す。
(実施例3)
シュードモナス(Pseudomonas)グルタリル−セファロスポリンアシ
ラーゼ遺伝子(A)のクローニング
シュードモナス(Pseudomonas)SY−77は、グルタリルアミドセ
ファロスポラン酸を7−ACAおよびグルタリン酸に加水分解しつる酵素を生産
する。この酵素をコードする遺伝子をクローニングした(マツダ(Matsud
a)[29))。シュードモナス5Y−77から抽出したDNAを旦且見Iおよ
びSma Iで消化し、HBIOI株中Sma Iで線状化したベクターpUN
N1にクローン化し、そのDNA配列(マツダ(Ma t 5uda)、l:2
9) 、上述)に出来する以下のプローブとl\イブリダイズさせた。
ATG CTG AGA GTT CTG CACCGG GCG GCG T
CCGCCTTGハイブリダイジングプラスミドpUNNGL−7は、制限地図
によりシュードモナス(Pseuclomonas)SY−77のアシラーゼコ
ード化フラグメントを宿すことが示された(第6図)。このプラスミドを精製し
、BamHIおよ一ノヨンした。生成したプラスミドは、第7図に示したように
特徴付けられた。
コロニーをLBC培地で増殖させ、そのアシラーゼ活性を分析した(方法参照)
。
ブスミドpUCGL−7Aが、5ユニット/g−細胞ペレyトを生成することが
、マシア)にクローン化し、プラスミドpTzI 9GL−7Aを生成した。そ
の2.6kbBamHI−3a l Iフラグメントの全DNA配列を決定しく
第13図参照)、5Y−77アシラーセの完全なアミノ酸配列を誘導した。最初
の311残基(全部で850残基)は、5Y−77アンラーセの公表されている
部分的配列と同じであった(マツダ(Matsuda)[29)、上述)。
(実施例4)
シュードモナスのグルタリル−セファロスボリンアシラーゼ遺伝子(B)のクロ
セファロスポラン酸およびセファロスポリンCを7−ACAおよびグルタル酸に
加水分解しつるアシラーゼを生産する。この酵素をコートする遺伝子をシュード
モナス(Pseudomonas)SE−83(AcyII、7ツダ(Mats
uda) 〔30〕)の染色体DNAからクローニングした。これらのデータか
ら、シュードモナス(Pseudomonas)SE−83の6.OkbBgl
ITフラグメントをBcII線状化pUN121(−ルソン(Nilsson)
(20) )にクローン化することを決定した。JMIOIのトランスホーマン
トをAcyIIのDNA配列由来のオリゴヌクレオチド・CGG CCG AT
GcTCCI’CGCCCCA GCCGCG CCCGGT CAG GrT
とハイブリダイズさせた。
ポジティブクローンpUNSE−5を単離した。このプラスミドの2. 3kb
SacI−3maIフラグメントを生成し、ベクターpTZ18にサブクローン
化してpT2183E5−1を得た(第8図)。
(実施例5)
タイプ■アシラーゼのホモロノー比較
第14図では、種々のアシラーゼの前駆体のアミノ酸配列を、大腸菌のアシラー
ゼの配列を基準に整列させた。
大腸菌(E、col)、 クルイベラ シトロフィラ(Kluyvera ci
trophila)(K、cit)およびアルカリゲネス フェカリス(Δ1旦
s aligenes faecalis)(A、fae)由来のアシラーゼは
、タイプIIAアシラーゼ(PenG アシラーゼ)であるが、シュードモナス
(ハeudomonas)(SE−83および5Y−77)由来のアシラーゼは
タイプUBアシラーゼ(グルタリル−Cef アシラーゼ)である。
また、第14図には、リーダー、α−サブユニット、連結ベフチドおよびβ−サ
ブユニットが始まる位置が示されている。これらの位置は、第2表にまとめられ
ているペプチドシーケンシングデータから誘導した。ペプチドシーケンシングデ
ータが入手できない場合は、それらの位置を大腸菌の対応する位置から誘導した
。
第2表
タイプ■アシラーセのα−およびβ−サブユニットのペプチド配列データアミノ
酸配列間のホモロジーは、(推定上の)α−サブユニットおよびβ−サブユニッ
トに関して計算した(各々第3表および第4表)。
第3表
タイプ■アシラーセのα−サブユニットのホモロジーマトリクス第4表
タイプ■アシラーゼのβ−サブユニットのホモロジーマトリクスカツコ内の値は
類似の残基に基づ(ホモロジーを示し、カッコの前の値は同一の残基を示す。
第3表および第4表からα−サブユニットに関しては46−83%、β−サブユ
ニットに関しては41−86%のタイプmAアシラーゼ間の高いホモロジーが見
て取れる。このことは、残基間の類似性(例えば、S e r/Th r、 A
s p/Glu、Arg/Lys等)を考慮しても、高いと言える。この高い
ホモロジーは、三つのPenGアシラーゼの3D構造が、たいへん似ていること
を示している。
タイプIIAおよびタイプ[3アシラ一セ間のホモロジーは、低かった(22−
30%)。アミノ酸間の類似性を考慮すると、これらの値はより高くなる(35
−45%)。それゆえ、タイプIIBアシラーゼは、タイプIIAアシラーセと
構造的に関連していると考えられる。このホモロジーはアミノ酸配列全体に渡っ
て均等に分布しておらず、特定の領域に高いホモロジーが見られる。
アルカリゲネス フェカリス(Alcaligenes faecalis)お
よびシュードモナス(Pseudomonas)SY−77アシラーゼの配列決
定で、直接触媒に関係する残基を同定できる。
タイプ■アシラーセが、PMSFにより阻害されるという観察は、活性化セリン
が触媒に関係することを強く指示している。活性化セリンは、セリンブロテアー
セおよびリパーゼ中に見られる。それらは、常にヒスチジンおよびアスパラギン
酸と共に見いだされ、触媒性トリオを形成している。
第14[Nの配列の整列は、三つの保存されているセリン:5er174,5e
r266および5er765(A、フェカリス(faecaljs)の番号付け
)のみを示している。
5er174は、タイプffBアシラーセ中には余り保存されていないが、タイ
プIIAアシラーセ内の良く保存されている領域中のα−サブユニットに存在す
る(第14図)。PMSF−感受性アミノ酸が、β−サブユニットに存在すると
いう実験的観察を考慮すると(ドーミー(Daumy)[:l 2)) 、Se
r l 74は活性部位セリンではないようである。
5et266は、β−サブユニットのN末端に存在し、この酵素の成熟に必須で
あることから、非常に保存性がよい。それゆえ、これも活性部位セリンの候補で
はないようだ。
5et765は、β−サブユニットに存在しくPMSF−感受性アミノ酸が、β
−サブユニットに存在するという実験結果から確認された)、これが活性部位セ
リンであるらしい。このセリンの回りのコンセンサス配列は、−−−−Gly−
XXX−5er= ・・である。
このセリンの前のグリシンは、全てのセリンヒドロラーセに共通している(ブo
−(Blow) [1t))。
二つの異なるヒスチジンが、五つの配列(第14図)に保存されている・His
42およびHis777゜これらは、すべての配列中の非常に保存性の高い領域
に存在する。しかし、His777は、部位765の推定される活性部位セリン
に近いので、その候補ではないようだ。逆に、His42は、α−サブユニット
に存在する活性部位ヒスチジンであり、このことは、ヘテロダイマーのみがこの
酵素の活性型であるという実験観察とも一致している(すなわち、β−サブユニ
ットのセリンおよびα−サブユニットのヒスチジン)。
提唱されている触媒性トリオの3残基に関して、β−サブユニットには3個の候
補:Asp44g、Asp590.Asp780およびα−サブユニットには1
個の候補:Asp36がある。後者は、提唱されている活性部位His42に近
いが非常に保存性の高い領域の始めに含まれる。同様に、Asp780は、非常
に保存性が高いが提唱されている活性部位5er765に近いところに含まれて
いる。Asp448およびAsp590は、両方とも中程度の保存性の領域にあ
り、それゆえ、活性部位アスパラギン酸の候補となりうる。
(実施例6)
タイプmAアシラーゼに基づ(突然変異誘発のための残基の選択本実施例では、
生化学的性質を変えたアシラーゼを得るために変異させるアミノ酸残基を選択す
る。これらの性質の変化は、特定のβ−ラクタム抗生物質のアシレージョンおよ
び、またはデアシレージョンに関するタイプ■アシラーゼの基質特異性を変え得
る。
この選択に関する基準について概説すると同時に、全ての選択部位を含む第15
a図および第15b図についても言及する。簡単にするために、示した残基はア
ルカリゲネス フェカリス(Alcaligenes faecalis)のタ
イプIIAアシラーセのものである。他のアシラーゼの対応する残基は、第14
図の整列させた配列データから見つけることができる。
突然変異誘発のための領域の選択は、以下の規準に基づいて行った。
l)タイプ■アンラーセの基質特異性を変えるために、変異は成熟α−およびβ
−サブユニットに限定した。これは、残基27−236 (α−サブユニット)
および266−816(β−サブユニット)を意味し、各々全部で210および
551残基に関する。
2)PenGの疎水性側鎖を結合するPenG−アシラーゼ(タイプIIA)の
アミノ酸は、タイプIIAアシラーセ中に保存されており、基質特異性が異なる
ために、おそらくタイプJIBアシラーセではない。それゆえ、第14図の配列
において、大腸菌、クルイベラ シトロフィラ(Kluyvera citro
ph基をα−およびβ−サブユニットから選択することが望ましい。
その部位に存在するこの残基が、以下のグループに属する場合、その部位は、類
似するアミノ酸を含むということができる。
a)疎水性残基−このグループには、アミノ酸のイソロイシン、バリン、システ
ィン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシ
ンが含まれる。
b)柔軟なセグメント中に存在する傾向にある、小さな残基−このグループには
、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、プロリン、バリンおよびシスティ
ンが含まれる。
C)極性または荷電残基−このグループには、セリン、スレオニン、ヒスチジン
、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニンおよ
びリジンが含まれる。α−サブユニットにおける突然変異誘発として考えられる
部位数は、選択規準により、169個(80%)およびβ−サブユニットに関し
ては、416(75%)と限定される。第15a図および第15b図には、これ
らの選択された残基が項目1の欄にまとめられている。この番号は、第14図に
示されているアルカリゲネス フェカリス(Alcaligenes faec
alis)アンラーゼの配列中の各アミノ酸の位置を示している。
3)PenG−アシラーゼとPenGの側鎖との相互作用は、性質から非常に疎
水的であると考えられるので、荷電を持たない保存的または類似するアミノ酸の
みを選択すべきであるという仮定に基づいて選ぶことが望ましい。このことは、
グループCについて先に定義した保存的または類似する組のなかの少なくとも一
個の荷電残基を含むあらゆる選択部位を除外することができる。さらに、この選
択規準は、好ましいアミノ酸部位をα−サブユニットでは119(57%)、β
−サブユニットでは304(55%)に限定する。第15a図および第15b図
では、これらの残基を項目2の欄にまとめである。
4)保存的グリシンおよびプロリンが、触媒的役割よりもむしろ蛋白質の構造的
役割を果たしているという観察に基づき、より好ましいグループを選択する。
選択したアミノ酸から保存的なGIYおよびProを除くことで、α−サブユニ
ットでは102個のアミノ酸(49%)、β−サブユニットでは258個のアミ
ノ酸(47%)からなるより好ましいグループができる。第15a図および第1
5b図では、項目3の欄にこのグループをまとめである。このアミノ酸のグルー
プは、荷電したアミノ酸、保存的グリシンおよびプロリンを除(保存的残基およ
び類似的残基からなる。
5)より好ましいアミノ酸のグループは、グルタミン、アスパラギン、スレオニ
ン、セリンおよびその他の極性アミノ酸が、疎水的基質の結合には関係しないら
しいという仮定に基づいて得られる。さらにこの選択規準を用いて、α−サブユ
ニット中の74個のアミノ酸(35%)およびβ−サブユニット中の162個の
アミノ酸(29%)のグループが得られる。第15a図および第15b図では、
これらを項目4の欄にまとめである。このグループのアミノ酸は、パラグラフ2
のa)で述べられているように、同一および類似する疎水性アミノ酸のみから成
り立っている。
6)さらに、変異すべき、または、変異し得るアミノ酸の選択は、タイプIIA
アンラーゼの結合部位が、同一の疎水性アミノ酸からなるという仮定によって行
われる。この事はさらに選択されるアミノ酸の数を減らし、最終的にα−サブユ
ニットでは44個の保存的疎水性アミノ酸(α−サブユニット中の全アミノ酸の
21%)また、β−サブユニットでは81個の保存的疎水性アミノ酸(β−サブ
ユニット中の全アミノ酸の15%)からなるグループを作る。第15a図および
第15b図の第5欄は、この用にして選択したアミノ酸グループを示している。
(実施例7)
タイプnBアシラーセはアシル部分としてコハク酸、グルタル酸およびアジピン
酸等のジカルボン酸を含む基質に特異的である。このことは、その結合部位が、
、 タイプIIAアシラーセに比べてより極性が高いことを示している。それは
、基質の側鎖のアノル部分のマイナス電荷を補償するプラス電荷を含むこともあ
る。これらの特徴は、この基質特異性を示す酵素に保存されていることが期待さ
れる。
それゆえ、タイプIIAおよびタイプI[Bアシラーゼ配列を比較して、タイプ
I[Aおよびタイプ[rBアンラーゼ配列の両方に保存されているが、マイナス
電荷のアシル部分によりよ(結合するために、極性が変化した領域を探した。
この選択規準を概説すると同時に、全ての選択部位を含む第16a図および第1
6b図についても言及する。与えられた残基は、タイプIIBアシラーセ5Y−
77に関するものである。他のアシラーゼの対応する残基は、第14図の整列さ
せた配列データから見ることができる。
タイプnBアンラーセに保存されている領域の同定は、タイプIIAアシラーゼ
について実施例6で述べた方法で行った。
1)突然変異は、成熟α−およびβ−サブユニットに限定した。これは、残基3
0−198 (α−サブユニット)および199−720 (β−サブユニット
)に関するものである。
2)実施例6のグループ分けに従って、同一または類似したアミノ酸残基を含む
タイプnBアシラーセ中のこれらの部位を選択する。選択した残基を第16a図
および第16b図の項目lの欄にまとめた。
3)次の選択は、PenG−アシラーゼ(タイプIIAアシラーセ)とPenG
の側鎖との相互作用が性質として非常に疎水的である一方、グルタリルアシラー
ゼについてはプラスに帯電した残基を持ち得るより極性の高い結合部位が考えら
れるという仮定に基づいて行われる。それゆえ、タイプIIAおよびタイプII
B両アシラーセにおいて荷電を示す第14図の配列中の全ての部位は、省かれる
。タイプHAアシラーゼがAspまたはGluを示し、かつ、タイプIrBが明
確にマイナスではない荷電残基を示す場合のみ、その部位か維持される。さらに
、この選択の適用は、好ましいアミノ酸部位の番号を限定する。第16a図およ
び第16b図は、項目2の欄にこれらの残基を示している。
4)実施例6で述べたように選択されたアミノ酸グループから、保存されている
GlyおよびProを除外することによって選択を行った。このアミノ酸グル、
−プのまとめは、第15a図および第15b図の項目3に示した。
5)さらに、タイプnBグルタリルーCefアシラーセにおいて、疎水性アミノ
酸は、マイナス荷電のグルタリル側鎖の結合に関係しそうもないと考えて、選択
されるアミノ酸のグループを絞った。したがって、同一または同様の疎水性残基
を含むタイプnBアシラーセ内の部位は、ステップ4以後に残ったグループか1
ら除外した。第16a図および第16b図の項目4にこの結果を示す。
6)残った残基グループには、主に極性または荷電残基が含まれる。また、タイ
プmAおよびタイプnB中の極性残基を含む部位は、表面の残基であり、必ずし
も基質結合に関係しないと仮定することにより、変異すべきまたは変異し得るア
ミノ酸の選択を行った。それゆえ、これらの残基は、第16a図および第16b
図のステップ5からは除いた。
7)ステップ7において、タイプIIAアシラーゼ中の対応する部位の残基とは
異なって、マイナスに荷電したグルタリル側鎖と静電的に適合する残基を含む部
位を選択した。特に、突然変異誘発には、タイプIIAでは疎水性で、かつタイ
プI[Bアシラーゼではプラスに荷電している部位を選択した。
(実施例8)
アシラーゼ遺伝子のための発現/突然変異誘発ベクターの構築突然変異誘発のた
め、プラスミドpTzl 9GL−7Aを業者の指示にしたがい一本鎖DNAと
して増殖した。ATG開始コドンにNdeI部位(、CATATG)を導入する
ために、以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
CAG MCTCT CAG CAT ATG TTT CCCCTCTCA有
効に部位特異的および領域指定突然変異誘発を行うために、生成した変異体のN
deI−HindIIIフラグメントをプラスミドpMcの誘導体であるpMc
TNdeにサブクローン化した(スタンセンズ(Stanssens) [:2
2))。
プラスミドpMcTNdeは、RBS部位およびNdelクローニング部位の前
にTACプロモーターをコートするフラグメントを挿入することによりpMc5
−8 (EP−A−0351029)から誘導した(第9図)。
同様に、プラスミドpTZsE5−1を以下のオリゴヌクレオチドで変異させ、
AGG TCCAGA CAG CAT ATG ACG ATG GCGドp
McTNdeに移した。得られたプラスミドpMcTGL7ANde (第10
図)およびpMcTSE5Nde (第11図)は、強力な誘導可能なTACプ
ロモーターのコントロール下、各々5Y−77および5E−83グルタリル−C
efアシラーゼを合成する(デボア(De Boer [23] )。
LBC培地中の大腸菌WK6における発現レベルは、各々2.2および12.3
ユニット/g−細胞ペレットである。
プラスミドpMcTGL?ANdeの完全なアシラーゼコード領域の配列を決定
した。その結果を第12図に示す。
(実施例9)
SY−77アシラーゼの突然変異誘発
プラスミドpMaTBdeGL?AをNdelおよびNc旦Iで消化した。−重
鎖のpMcTNdeGL7Aを用いてギヤノブ二本鎖を作り、先に述べた方法で
(方法参照)一本鎖状のギャップに酵素的に突然変異を誘発した。この変異体ラ
イブラリーを大腸菌WK6 MutSにトランスホームし、つづいて大腸菌HB
IOIにトランスホームしてから、50μg/mlのcapを補ったアミノアジ
ピルロイシン含有最小プレートで選択した。これらのプレートでは増殖できるが
、最小プレートでは増殖できない(これらはロイシン復帰突然変異体(reve
rtant)のため)コロニーを、セファロスポリンCに関する酵素活性に関し
てテストした。領域指定突然変異誘発のため、アシラーゼのα−サブユニットの
種々の部分をカバーするスパイクトオリゴマーを部位指定突然変異誘発と同じ方
法で取り込ませた(スタンセンズ(Stanssens)[22) )。
合成の際に2%の混入を含ませた以下のオリゴヌクレオチドを使用した。各オリ
ゴヌクレオチドは、制限酵素認識部位の生成または消失に基づく野生型および変
異型プラスミドの区別を可能にするサイレントな変異を有するよう設計する。
各オリゴヌクレオチドにカバーされる5Y−77アシラーゼの残基は、括弧内に
示した。
A32237(残基50−80)
GCCCTGGCT GCGCGCCTGG GCCCAGCCAT AGCC
GTAG品GGCTGAGGGCGCGTCTACGCCGTAGATGTG
CGGGACGCCG TAGCCGTCCCACAGAB2233(残基8l
−109)
CCA GACGGTCGTCTGTTCGTAAT CCGGTCCCCA
GTA’I’rCGGCCCCCTTGCCCCGCGCTTCTCCATAC
AGGCGCAGGATATTGT CAB2234(残基109−136)
A32237(残基137−164)
G GCGCCGGAAA CCGGCAGCACCTGCCGCACG TC
GGcCGAGATGTCGTCGGG GTTCTGCTGCGCATAGG
CGT TGATGCCCGCTGCAB2236(残基165−192)
CGGCG GGTCGCCCTCGCCCAGGGTG CGCCCGGにC
G ACGCGACATAGAGGAAGTTCATCAにGCGGT GGG
CGTGGGCCACCACGTC各オリゴヌクレオチドに対して、大腸菌WK
a mutS中lO5個以上のコロニーの変異体ライブラリーを構築した。これ
らのライブラリーをアジピルセリンに関する選択には大腸菌PC2051および
アミノアジピルロイシンに関する選択には大腸菌HBIOIにトランスホームし
た。30°CIO日で選択されたコロニーを原栄養性への復帰突然変異、および
増殖能力およびプラスミドの存在の関連について調べた。
アジピルセリンに関して良い増殖能を示す変異体を選択した。
これらの変異プラスミドを、α−サブユニットのスパイクトオリゴマーを用いた
次の回の突然変異誘発の原料として用い、続いてアミノアジピルロイシンに関す
る選択を行った(大腸菌HBIOIにおけるライブラリーの構築)。
残基177.178および179は、5Y−77アシラーゼの基質特異性に関し
て重要であることが分かつているので、タープ・ソテイトラじダム突然変異誘発
法を使用した。この目的のため、残基176.177.178,179および1
80に関するターゲノティドランダム突然変異誘発用の混合オリゴヌクレオチド
を合成した。
NNN NNN GTT CAT CAG GCG GTG GGCGTG G
GC領域60−64についても次のオリゴヌクレオチドを用いた同様の方法を応
用した
ATA GCCGTA G晶GGCTGA GGG NNN NNN NNNN
NN NNN GAT GTG CGG GACGCCGTA GCC106個
の変異体のライブラリーを、上記のオリゴヌクレオチドを用いて大腸菌HBIO
Iに構築し、アミノアジピルロイシンプレート上で選択した。
また、同様のギャップ二本鎖分子についても下記のオリゴヌクレオチドを用いた
ターゲラティドランダム突然変異誘発を行った:GCT GCG CGCCTG
NN’N r GCCMキGCCN’N’N GAA NNN TGA GG
G CGCGTにれにより、5Y−77アシラーゼのアミノ酸部位67.69,
71.73および74について、20種金石のアミノ酸への置換が起きる。10
7個の変異体ライブラリーを構築し、アミノアジピルロイシンプレートで選択し
た。
α−サブユニットについて先に述べた方法を5Y−77アシラーゼβ−サブユニ
ットから選択した領域に応用した。先に述べた配列比較および選択規準に基づき
、以下の領域を下記のオリゴヌクレオチドを使用したスパイクトオリゴ突然変異
誘発用に選んだ・
AB2399(残基253−277)
入TAGTTGGTG GCCCCCACCA TGCCGTTAACGGTA
TTGGTG ATGCCCATCCGCTGGTTGAA GGCGAAGC
GG ATGACAB2400(残基375−399)
CTCGGCCCGTTTGGGCGCCACGCCGT TGAAGCTGT
A GTTGATGGTACCTTCGCGGT CGGCGTAGACGAT
GTTGAAAB2401(残基415−442)
ATTGG MTTCTGCACGMGCCGCCCGGCGGATTGG T
GACGCGCGGCAGATCGTCCAGCGGGTGTG TCTCGG
TCCA CAGGTAACGAB2402(残基505−529)
CAGCAG GCGCGCCGCCGCCTGGACCT CGGGATCG
GG ATCGATCAGGGCGGCCGGGA TCAGGTCCGG C
AAGGTGCGAB2403(残基6613−695)GTCG GCGCG
CGACA CGCGTTCGAT CTGATCGCTG TAGTGCGT
CGTGCCCGGGTG GCGAGAGTTG CCGTAGCTCA T
CAGGCCATAこれらのオリゴヌクレオチドを用いて、β−サブユニットの
特異的領域に関する変異体ライブラリーを構築し、アンビルセリンまたはアミノ
アジピルロイシンに関して選択を行った。
オリゴAB2403は、触媒性セリン残基の候補として他のA、フェカリスPe
n−アシラーゼおよび5Y−77アシラーゼとの配列比較に基づいて同定された
5er674付近の領域を含んでいる。この領域付近の変異は、触媒部位に近く
、基質特異性を変化させる可能性が高い。
(実施例10)
アンビルセリンに対する特異性が増加した5Y−77アシラ一ゼ変異体変異体を
セリン要求性の大腸菌にトランスホームし、唯一の炭素源としてアジピルセリン
を含む最小培地で増殖し得る能力で選択した。野生型5Y−77グルタリルアシ
ラーセを含む細胞は、このような培地では余りよ(増殖できない。
14日間でも有意なコロニーは出現しなかった。14日間で出現したコロニーを
プレートから選択し、それらがプレートからアジピルセリンを除いた場合増殖し
ないことを確認した。次に、選択したコロニーからプラスミドDNAを単離し、
本来の大腸菌にトランスホームした。このトランスホーマント細胞は、アジピル
セリンを含む選択培地で増殖することが確認された。以下に示す変異体が得られ
た:V62L、Y178H,V179GおよびL177+Y178H。
基質としてグルタリル7−ACA、グルタリルロイシンおよびアジピルセリンを
用いて、野生型5Y−77グルタリルアシラーゼおよび変異体5Y−77グルタ
リルアシラーセを検定した。この基質の加水分解は、378nmの蛍光で7−A
CA、ロイシンまたはセリンの放出を測定することにより追跡した。グルタリル
セリンおよびアジピルセリンを用いた活性検定では、グルタリル7−ACAに関
するそれらの活性に応じて変異型および野生型酵素を添加した。第17図−第1
9図は、与えられた酵素によるアジピルセリンの加水分解速度を示している。
加水分解は、放出されたセリンとフルオレサミンとの反応による378nmの吸
収の増加を経時的に測定することにより追跡した。この変異体は、野生型の5Y
−77グルタリルアシラーセよりもアジピルセリンに関して3−5倍高い活性を
示した。アジピルセリンが唯一の炭素源であるとき、野生型は非常にゆっくりと
増殖するので、この5Y=77アシラ一セ変異体は、この基質に関してより高い
特異性を示すと結論し得る。
グルタリルロイシンについてアジピルセリンと同様の操作を行い、変異型と野生
型の活性を比較した。グルタリルロイシンは、突然変異がアシル側鎖またはβ−
ラクタム部分またはアミノ酸のような相補的側面に対する特異性に影響するかど
うかをチェックするのに適した基質である。もし変異がアシル側鎖に対する特異
性に影響するなら、野生型および変異型グルタリルロシンーセの活性はグルタリ
ル7−ACAおよびグルタリルロイシンのような基質に対して同様な傾向を示す
であろう。この検定では、酵素がそのグルタリル?−ACA活性に応じて添加さ
れるために、このことは、グルタリルロイシンに関する活性が変異体と野生型で
非常に似ていることを意味している。事実、実験誤差範囲で、全ての変異体は野
生型と一致しており、この事はこの変異がアシル側鎖に対する特異性に影響して
アジピル部分に対する特異性を特異的に増加させていることを示している。
(実施例11)
Ndeの領域指定およびターゲラティドランダム突然変異誘発を行った。5E−
83のアミノ酸部位30−50をカバーする“スパイクト”オリゴマーを使用し
た。
TRM突然変異誘発は、以下のオリゴヌクレオチドを使用した・AAG GCG
GTCI NNN NN’N GACNN’N GCCNNN CGCNNN
ATA NNN ATCαX: CTCCbG
別のTRM突然変異誘発は、5Y−77アシラーセの領域176−180と相同
的な領域に関して行った。以下に示すミックストオリゴヌクレオチドを使用した
。
CCA CAG CTT CAA CCA GACGGA NNN NNN N
NN tJNN NN’N CAGCCG CCG CAT CACGGCGC
Cギヤツブは酵素NotIおよびSma Iを用いて生成した。このギャップ二
本鎖を5E−83のアミノ酸部位730−846をカバーするスパイクトオリゴ
ヌクレオチドを用いて変異させた。TRM突然変異誘発は、以下のオリゴヌクレ
オチドを用いて行った。
CACCAT αZ GCA NNN GCT CCA NNN NNN A’
IT CTG GTCGGC変異体は、アミノアジピルロイシンまたはアミノア
ジピルアミド寒天プレートで選択した。
(実施例12)
一ンにおいて、以下のオリゴヌクレオチドを用いてA、フェカリス遺伝子の開始
部位にNdeI部位を構築した
G CCCTTT CTG CAT ATG TGT CCCTTA TTT
TTAこの変異体のNdeI消化後プラスミドpMaAFndeを構築した。B
amHlによる線状化後、−重鎖pMcAFNdeを含むギャップ二本鎖を調製
した。
領域37−46をカバーするスパイクトオリゴマーを領域指定突然変異誘発に使
用し、大腸菌WK6 Muts続いて大腸菌HBIOIに転移後、10 u g
/mIグルタリルロイシンおよび50Bg/mI capを含む最小プレートで
変異体ライブラリーを選択した。これらのプレートで増殖する(最小プレートで
は増殖しない)コロニーのグルタリルセファ0スポリンに関する活性をテストし
た。
A、フェカリスの領域51−72をカバーするオリゴマーを用いた同様の実験を
行った。
同様のギャップ二本鎖分子に関して以下のオリゴヌクし・オチドを用いたターゲ
ラティドランダム突然変異誘発を行ったーCAG ACG GTCTTG NN
N NN’Nα;CNNN ACCNNN GCCNNN ATANNN GC
CATA GTGGCr
このオリゴマーを使用すると、部位51.53,55,57.59および6゜、
の20種類全てのアミノ酸への置換が起こる。別のTRMを5Y−777シラー
セの部位176−180に相同的な領域に関して、以下のミックストオリゴヌク
レオチドを用いて行った
TI’CCAG ATT CGT GTCGGA NNN N’NN NNN
NNN NNN GGA GCCCACCCA CJtT bAT
10’個の変異体からなる変異体ライブラリーが構築され、アミノアノビルロイ
シンまたはグルタリルロインンプレートで選択した。
別の実験では、Nru IおよびMluIを用いたギャップ二本鎖を作成した。
このギャップ二本鎖をアミノ酸部位761−790をカバーする“スパイクト”
オリゴヌクレオチドで変異させた。この変異体ライブラリーを各々グルタリルロ
イシンおよびアミノアジピルロイシンで選択した。
(実施例13)
大腸菌アシラーゼの突然変異誘発
プラスミドpUNNEclの挿入物を制限酵素部位旦工旦dDIおよびSma
Iを用いてベクターpTZ18にサブクローン化した。以下の特異的オリゴヌク
レ、オチドを用いて、開始コドンにNdeI部位を作成したTCT ATT T
TT CAT ATG ATCCTCTGG CAGそれからアシラーゼ遺伝子
を制限酵素NdeIおよびSma Iを用いてプラスミドpMaTECNdeに
サブクローン化した。このプラスミドを大腸菌アシラーゼのアミノ酸53−74
をカバーする“スパイクト”オリゴヌクレオチドを用、いて変異させ、実施例9
に述べた方法で選択した。
大腸菌Pen−アシラーゼのTRMは、5Y−77アシラーゼの部位176−1
80に相同的なミックストオリゴマーを用いて行った。使用したオリゴマーを以
下に示す
’ITCGCr AGr GCr ATCAGA NN’N NNN NNN
NNN NNN GGT GCCCACAAA TAT C`T
本明細書で述べている特許および特許出願を含む全ての刊行物は、当業者を対象
としている。本明細書で引用している全ての刊行物は、個々に参考として引用し
ていることを記述しているのと同様に参考として引用している。
先に示した内容では、より良く理解されることを目的として図式および実施例を
用いて詳細に説明しているが、請求の範囲の精神および範囲を逸脱することなし
に、本発明の変化および修正を行い得ることは当業者にとって明白である。
たとえば、選択した変異体は、上述のいずれかの方法およびいずれかのスパイク
トオリゴマーを用いた連続的突然変異誘発に使用し得るっまた、単一の突然変異
誘発実験に二つ以上のスパイクトオリゴマーを用いることも、本発明の範囲に入
る。
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A Yr工GURE 5
ヨユ
r工GURE 5 (CONTINUED)シ1
F工ORE 5 (Co酊工■圧D)
F工GURE 5 (CONTINUED)rigure s
r工GURE 9
F工Gt7RE 12
SWAVAP(iKTANGNALLLQNP1! L S W T T D
YF T Y YE A HL V T P DF E X Y G A T
Q 工(: L P V 工RF A F N QP、M CI T li T
V N CM V G A T N Y RL Tr工G田ε 13
コラ−96197: 981 991 1c0二ニー −:ASF−へC::’
ニーSS:TATCT’:τAτCACCCTCACσ丁ご;00023772
口AGCCC:Cw7−AGb::
FIGURE 13 (CONT工NUED)FIGURE 13 (CONT
工NUED)タイプ−■アノラーゼの整列化
Figure ユ4
B−サブユニット
Figure 14 (continuadlF’igure 14 (con
tinued)Time (hours)
wlld typa ”””’ Val 62 LauF工GURΣ 15
゜ヘ フェカリスα−サブユニットに3けるアミノ酸残基の1択Figure
1sa
Figure 15a (continuadlA フェカリスβ−サブユニッ
トにお1するアミノ酸残基の選択各行の番号の前にある1文字コードはアルカリ
ゲネスフェカリスタイプ−TIA7’zラーゼにおけるアミノ酸を表わしている
。
Figure 15b
Figure 15b (continuadlFigure 15b (co
ntinuadlFigure 15b (continued)Time (
hours)
wlld typa −”’ Tyr 178 His Vat 179 Gl
yr工GURE 16
SY−77α−サブユニットにおけるアミノ酸残基の選択選 択 1 : 同一
および類似残基 108 (64&)(疎水性+荷電性+極性)
選 択 2 二 同一および類似残基 87 (51%)選 択 3 : 同一
および類似残基 76 (454)(選択2 引くことの保存的GlyおよびP
ro)選 択 4 : 同一および類似残基 23 (14t)(選択3 引く
ことの同一および類似疎水性残基)選 択 5 : 同一および類似残基 9
(5ル)Figure 16a
Figure i6a (continuedl旦LユL辷ヱ△ミヱ坦し旦虹1
」鴫員り膵−一残基数
選 択 1 : 同一および類似残基 323 (621)(疎水性+荷電性+
極性)
選 択 3 : 同一および類似残基 225 (4311(選択2 引くこと
の保存的GIYおよびPro)遺 択 4 :同一および類似残基 80 (1
511(選択3 引くことの同一および類億疎水性残基)Figur@16b
Figure 16b (eontinued)Figure 16b (co
ntinue41Figure 16b (continued1378nmに
おける吸光度
Figure 17
78nmにおける吸光度
時間(h)
一野生型 −−Tyr 178 His Vat 179 GlyFigure
1B
時間(h)
一野生型 ””・・’ Tyr178HIs Leu17711a −Tyr1
78H1s’I’4 rruyeh 16
基質特異性が変化した新しいβ−ラクタムアシラーゼ変異体が提供される。これ
らのβ−ラクタムアシラーゼは、野生型β−ラクタムアシラーゼとは少なくとも
一つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する該β−ラクタムアシラーゼをコー
ドする遺伝子を発現させることにより得られる。
OrT/1llQlnnnC’)
Claims (25)
- 1.変異体β−ラクタムアシラーゼをコードする遺伝子の発現により得られ、か つ、野生型β−ラクタムアシラーゼとは少なくとも一つのアミノ酸が異なるアミ ノ酸配列を有する変異体β−ラクタムアシラーゼで、変化した基質特異性を示す ことを特徴とする変異体β−ラクタムアシラーゼ。
- 2.前記野生型アシラーゼがタイプII酵素である請求項1記載の変異体β−ラ クタムアシラーゼ。
- 3.前記野生型アシラーゼが、大腸菌、クルイベラシトロフィラ(Kluyve racitrophila)、アルカリゲネスフェカリス(Alcaligen esfaecalis)またはシュードモナス(Pseudomonas)に由 来する請求項1または2記載の変異体β−ラクタムアシラーゼ。
- 4.第15a図または第15b図に示した一つ以上の部位に、少なくとも一つの 突然変異を含むことで野生型タイプIIA酵素とは異なる請求項1乃至3のいず れか1項記載の変異体β−ラクタムアシラーゼ。
- 5.第16a図または第16b図に示した一つ以上の部位に、少なくとも一つの 突然変異を含むことで野生型タイプIIB酵素とは異なる請求項1乃至3のいず れか1項記載の変異体β−ラクタムアシラーゼ。
- 6.前記野生型アシラーゼが、アルカリゲネスフェカリス(Alcaligen esfaecalis)ATCC19018株に由来する請求項1乃至4のいず れか1項記載のβ−ラクタムアシラーゼ変異体。
- 7.前記野生型アシラーゼが、シュートモナス(Pseudomonas)SE −83AcyIIまたはSY−77に由来する請求項1乃至3および5のいずれ か1項記載の変異体β−ラクタムアシラーゼ。
- 8.シュードモナス(Pseudomonas)SY−77における62,17 7,178および179に対応する部位の一つ以上に少なくとも一つの変異を有 する先に示した請求項のいずれか1項記載の変異体β−ラクタムアシラーゼ。
- 9.請求項1乃至8のいずれか1項記載の変異体アシラーゼをコードするDNA 配列。
- 10.請求項9記載のDNA配列を含む発現ベクター。
- 11.請求項10記載の発現ベクターでトランスホームした微生物宿主株。
- 12.前記宿主株が原核生物である請求項11記載のトランスホームした微生物 宿主株。
- 13.前記宿主株がセファロスポリウム(Cephalosporium)また はペニソリウム(Penicillium)である請求項11記載のトランスホ ームした微生物宿主株。
- 14.変異体アシラーゼ酵素をコードするDNA配列を含む発現ベクターでトラ ンスホームした微生物宿主株を増殖させて前記変異体アシラーゼを生産し、該酵 素を回収することからなる請求項1乃至9のいずれか1項記載の変異体アシラー ゼ酵素の調製方法。
- 15.タイプIIアシラーゼ酵素に変異を起こし、かつ、該変異に由来する該酵 素の活性の変化を検定することを含む方法。
- 16.前記アシラーゼ酵素が、大腸菌、クルイベラシトロフィラ(Kluyve racitrophila)、アルカリゲネスフェカリス(Alcaligen esfaecalis)またはシュードモナス(Pseudomonas)に由 来する請求項15記載の方法。
- 17.前記アルカリゲネスフェカリス株がATCC19018株である請求項1 6記載の方法。
- 18.前記シュードモナスがSE−83AcyIIまたはSY−77である請求 項16記載の方法。
- 19.前記タイプIIAアシラーゼ酵素中、第15a図または第15b図に示し た一つ以上の部位に、少なくとも一つの突然変異を起す請求項15乃至18のい ずれか1項記載の方法。
- 20.前記タイプIIB酵素中、第16a図または第16b図に示した一つ以上 の部位に、少なくとも一つの突然変異を起す請求項15乃至18のいずれか1項 記載の方法。
- 21.シュードモナスSY−77における62,177,178および179に 対応する一つ以上の部位に、少なくとも一つの突然変異を起す請求項15乃至2 0のいずれか1項記載の方法。
- 22.望ましい活性変化を有する選択アシラーゼ変異体の製造及びその後の請求 項15記載のその同定を含む方法。
- 23.アシレーションまたはデアシレーションに用いたとき、対応するタイプI Iの野生型アシラーゼと比べて少なくとも一つの望ましい活性変化を有する変異 体β−ラクタムアシラーゼを得る方法で、目的のアシラーゼをコードするクロー ン化した遺伝子またはそのフラグメントに突然変異を起し変異体アシラーゼ遺伝 子を得、該変異体アシラーゼ遺伝子を宿主株に導入し、トランスホームした宿主 株を得、 該トランスホーム宿主を増殖し、該変異体遺伝子を発現させて変異体アシラーゼ を生産させ、 アシレーションまたはデアシレーション反応について少なくとも一つの望ましい 活性変化を示す一つ以上の変異体アシラーゼを同定する各ステップを含む方法。
- 24.アシレーションまたはデアシレーション工程における、請求項1乃至23 のいずれか1項記載の一つ以上の変異体β−ラクタムアシラーゼの使用。
- 25.β−ラクタム化合物の生産における請求項1乃至23のいずれか1項記載 の一つ以上の変異体アシラーゼの使用。
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