KR101677755B1 - 아목시실린 생산성이 증가된 변이 알파-아미노산 에스터 가수분해효소 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아목시실린 생산성이 증가된 변이 알파-아미노산 에스터 가수분해효소(α-amino acid ester hydrolase)및 이의 이용에 관한 것이다. 본 발명의 변이 AEH는 아목시실린(Amox)의 합성수율은 높으면서도 HPGM의 분해율이 현저히 낮아, 아목시실린의 생산성이 현저하게 증가되었으므로 산업상 이용가능성이 높다.

Description

아목시실린 생산성이 증가된 변이 알파-아미노산 에스터 가수분해효소{Mutant alpha-amino acid ester hydrolase with enhanced productivity of amoxicillin}

본 발명은 페니실린계 항생물질인 아목시실린(amoxicillin)을 생산하기 위한 변이효소에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아목시실린 생산성이 증가된 변이 알파-아미노산 에스터 가수분해효소(α-amino acid ester hydrolase) 및 이의 이용에 관한 것이다.

아목시실린(amoxicillin, 이하 본 명세서에서“Amox”라 약칭함)은 페니실린의 베타 락탐(β-lactam)계 항생물질로서 그람 양성 세균과 그람 음성 세균을 살균하는 능력을 가지고 있다. Amox은 세균이 분열되는 동안 세균의 세포벽 합성단계를 방해하여 세포벽을 파괴함으로써 살균효과를 보여준다. 특히, 다른 베타 락탐계 항생제 보다 흡수력이 좋아서 경구형으로 제품화되어 있는 장점이 있다. 단점으로는 Amox은 베타 락타마제(β-lactamase)를 만들어 내는 박테리아에 쉽게 분해되기 때문에 가끔은 베타 락타마제의 저해제인 클라불라닉산(clavulanic acid)와 같이 사용되어 처방되기도 한다.

Amox은 화학적 방법을 통해 산업적으로 생산되어 왔다. 그러나 화학공정에서는 유기용매를 사용하거나, 합성온도가 매우 낮아 많은 에너지를 필요로 하는 등의 여러 가지 단점이 있기 때문에, 최근의 환경규제에 맞물려 화학공정 대신 효소공정을 통해 생산하고자 하는 연구가 꾸준히 진행되고 오고 있다.

항생제를 합성할 수 있는 베타 락탐계 아실라제(β-lactam acylase)는 다섯가지 그룹으로 알려져 있다. 자세하게는 페니실린 G 아실라제(penicillin G acylase), 페니실린 V 아실라제(penicillin V acylase), 알파-아미노산 에스터 하이드로라제(α-amino acid ester hydrolase, 이하 “AEH”라 약칭함), 세팔로스포린 C 아실라제(cephalosporin C acylase), 글루타릴 아실라제(Glutaryl acylase)이다. 특히 Amox을 합성하는 효소는 대부분 AEH이며, 대표적인 생산균주로는 아세토박터 툴비단스(Acetobacter turbidans), 싼토모나스 씨트리(Xanthomonas citri) 및 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus)가 있다. 이 균주 유래 효소들의 특징은 생산물의 분해(product hydrolysis)가 적고, 낮은 pH에서 합성이 이루어지는 장점이 있다. 특히, 낮은 pH에서는 생산물(product)과 기질인 전구체(precursors)가 안정하여 합성반응의 수율이 높다.

본 명세서의 도 1에서 AEH 효소에 의한 Amox 합성반응, 상기 Amox 및 이의 합성 전구체 물질(HPGM)의 분해반응에 대한 대략적 개념이 도시된다. 효소반응에서 Amox을 합성(S)하기 위한 기질로는 하이드록시 페닐글리신 메틸 에스터(hydroxy-phenylglycine methyl ester, 이하 본 명세서에서“HPGM”라 약칭함)와 6-아미노 페니실린산 (6-amino penicillanic acid, 이하 본명세서에서 “6-APA”라 약칭함)이 사용된다. 기질인 HPGM는 효소에 의해 가수분해되어 하이드록시 페닐글리신(hydroxy-phenylglycine, 이하 본 명세서에서“HPG”라 약칭함)으로 전환되기도 하며(H1), 합성된 Amox도 효소에 의해 가수분해(H2)되어 HPG가 만들어지기도 한다.

Amox의 생산성을 높이기 위해서는 합성반응(S)은 높이고, 분해반응(H1, H2)를 낮추는 것이 중요하다. Amox을 생산하는 AEH는 생산물에 대한 분해활성(H2)이 상대적으로 낮은 것으로 알려져 있기 때문에, Amox의 생산성을 높이기 위해서는 특히, 높은 Amox 합성반응(S)과 낮은 HPGM의 분해반응(H1)이 이루어지는 것이 필요하다.

일반적으로 효소반응에서 6-APA에 비해 HPGM이 많을수록 Amox의 합성수율은 증가한다 (Alemzadeh et al., Transaction C: Chemistry and Chemical Engineering, Vol. 17, No. 1, pp. 106-113, 2010). 그러나 산업적·경제적인 관점에서는 6-APA와 HPGM의 비율을 1:1로 합성반응을 시키는 것이, 생산공정 및 생산효율에 있어서 유리하다. 이를 위해서는 합성반응에서 효소에 의한 HPGM의 분해반응(H1)을 낮추어 더 많은 HPGM이 Amox 합성반응으로 사용될 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 그러나 아직까지는 합성수율은 높이면서 HPGM의 분해율을 낮춘 효소가 개발되어 있지 않아, 경제적인 Amox 생산을 위해서는 HPGM의 분해율(H1)을 낮춘 변이 효소의 개발이 필요한 실정이다.

[비특허 문헌1] Alemzadeh et al., "Enzymatic Synthesis of Amoxicillin with Immobilized Penicillin G acylase." Transaction C: Chemistry and Chemical Engineering, 2010년, 17(1):106-113.

이에 본 발명의 발명자들은 효과적으로 아목시실린 생산 효율을 높일 수 있는 방법을 연구하던 중, 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) 유래의 알파-아미노산 에스터 하이드로라제(α-amino acid ester hydrolase, AEH)로부터 제작한 본원 발명의 변이 AEH들이 아목시실린의 합성 수율이 뛰어날 뿐만 아니라 HPGM의 분해율이 현저히 감소된 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은, 아목시실린 생산성이 증가된 변이 알파-아미노산 에스터 가수분해효소(α-amino acid ester hydrolase, AEH)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 변이 알파-아미노산 에스터 가수분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 변이 알파-아미노산 에스터 가수분해효소를 포함하는 아목시실린 제조용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 변이 알파-아미노산 에스터 가수분해효소를 이용한 아목시실린 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아목시실린 생산성이 증가된 변이 알파-아미노산 에스터 가수분해효소(α-amino acid ester hydrolase, AEH)를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 변이 알파-아미노산 에스터 가수분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 변이 알파-아미노산 에스터 가수분해효소를 포함하는 아목시실린 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 변이 알파-아미노산 에스터 가수분해효소를 이용한 아목시실린 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서 용어 "단백질"은 "폴리펩타이드(polypeptide)" 또는 “펩타이드(peptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 발명에서 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 는 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.

본 명세서에서 용어 "발현(expression)"이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미한다.

본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다:

A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp):아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라긴; O(Ply)피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르기닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 트레오닌; U(Sec):셀레노시스테인, V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 티로신.

본 명세서에 표기되는 "(아미노산일문자)(아미노산위치)(아미노산일문자)"는 천연형 폴리펩타이드(본 발명에서, 서열번호 1의 야생형 AEH)의 해당 아미노산 위치에서 선행 표기된 아미노산이 후행 표기된 아미노산으로 치환된다는 것을 의미한다. 예를 들면, D218N은 천연형 폴리펩타이드(본 발명에서, 서열번호 1의 야생형 AEH)의 218번에 해당하는 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환된다는 것을 가리킨다. 또한 후행 표기된 아미노산에서‘사선(/)’표시는 ‘또는’을 의미한다. 예를 들면, M183K/L는 천연형 폴리펩타이드(본 발명에서, 서열번호 1의 야생형 AEH)의 183번에 해당하는 메티오닌이 라이신 또는 류신으로 치환된다는 것을 가리킨다.

본 발명은 아목시실린 생산성이 증가된 변이 알파-아미노산 에스터 가수분해효소(α-amino acid ester hydrolase, AEH)를 제공한다.

‘알파-아미노산 에스터 가수분해효소(AEH, EC 3.1.1.43)’는 알파 아미노산 에스테르(alpha-amino acid ester, 예를들어 D-α-phenylglycine methyl ester, hydroxy-phenylglycine methyl ester 등)의 가수분해 및 상기 아미노산 에스테르로부터 아민 뉴클레오필(amine nucleophile, 예를들어 7-aminocephalosporanic acid, 7-amino-3-deacetoxycephalosporanic acid, 6-aminopenicillanic acid 등)로의 아실기(acyl group) 전이(transfer)를 촉매한다.

본 발명에서 야생형 알파-아미노산 에스터 가수분해효소(야생형 AEH)는 바람직하게 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus)로부터 유래되고 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 의미한다.

상기 서열번호 1로 표시되는 야생형 알파-아미노산 에스터 가수분해효소는,예를 들어 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의‘변이 알파-아미노산 에스터 가수분해효소(이하, 본 명세서에서 '변이 AEH'로 혼용하여 표기)’는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 야생형 AEH 서열 중에서, 119번째 히스티딘, 211번째 트레오닌, 218번째 아스파르트산, 262번째 알라닌, 404번째 알라닌, 463번째 발린, 542번째 아스파르트산, 571번째 세린 및 610번째 트레오닌으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 한다.

구체적으로 상기 돌연변이는 119번째 히스티딘이 아르기닌으로 치환, 211번째 트레오닌이 세린으로 치환, 218번째 아스파르트산이 아스파라긴 또는 글루탐산으로 치환, 262번째 알라닌이 글루탐산으로 치환, 404번째 알라닌이 트레오닌으로 치환, 463번째 발린이 알라닌으로 치환, 542번째 아스파르트산이 글라이신 또는 아스파라긴으로 치환, 571번째 세린이 트레오닌으로 치환 및 610번째 트레오닌이 세린으로 치환되는 것으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

예를 들어, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 야생형 AEH 서열 중에서 218번째 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 HEP4로 칭함), 상기 야생형 AEH 서열 중에서 542번째 아스파르트산이 글라이신으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 HEP15로 칭함), 상기 야생형 AEH 서열 중에서 119번째 히스티딘이 아르기닌으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 HEP22로 칭함), 상기 야생형 AEH 서열 중에서 262번째 알라닌이 글루탐산으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 HEP30으로 칭함), 상기 야생형 AEH 서열 중에서 218번째 아스파르트산이 글루탐산으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 HEP31로 칭함), 상기 야생형 AEH 서열 중에서 463번째 발린이 알라닌으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 HEP59로 칭함), 상기 야생형 AEH 서열 중에서 211번째 트레오닌이 세린으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 HEP67로 칭함), 상기 야생형 AEH 서열 중에서 404번째 알라닌이 트레오닌으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 HEP70으로 칭함), 상기 야생형 AEH 서열 중에서 610번째 트레오닌이 세린으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 HEP73으로 칭함)와 같이 하나의 돌연변이 부위(site)를 가지는 것일 수 있으며,

상기 야생형 AEH 서열 중에서 542번째 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환되고 571번째 세린이 트레오닌으로 치환된 폴리펩타이드(서열번호 5, 본 발명의 명세서에서 HEP6로 칭함), 상기 야생형 AEH 서열 중에서 119번째 히스티딘이 아르기닌으로 치환, 211번째 트레오닌이 세린으로 치환, 218번째 아스파르트산이 글루탐산으로 치환, 404번째 알라닌이 트레오닌으로 치환, 542번째 아스파르트산이 글라이신으로 치환 및 610번째 트레오닌이 세린으로 치환되어 6개의 돌연변이 부위를 가지는 폴리펩타이드(서열번호 2, 본 발명의 명세서에서 HES47로 칭함)와 같이 하나 이상의 다중 돌연변이 부위를 가지는 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게 본 발명의 변이 AEH는 서열번호 2 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 일 수 있으며, 가장 바람직하게 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 변이 AEH 폴리펩타이드에서 추가적인 아미노산 잔기의 변형을 포함한다. 상기 용어‘변형’은 아미노산 잔기의 결실, 치환 또는 부가를 의미한다. 상기 추가적인 아미노산 잔기의 변형은 본 발명 변이 AEH의 아목시실린 합성 활성 증가 및 HPGM 분해활성의 감소를 목적으로 수행되는 것으로서, 상기 목적을 달성할 수 있는 한 아미노산 잔기의 변형 형태(종류) 및 위치는 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 변이 AEH 서열(HES47서열) 중에서, 19번째 메티오닌, 183번째 메티오닌, 208번째 세린, 350번째 페닐알라닌, 385번째 세린, 388번째 세린, 415번째 알라닌, 417번째 아스파르트산 및 447번째 프롤린으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 돌연변이는 19번째 메티오닌이 발린으로 치환, 183번째 메티오닌이 류신으로 치환, 208번째 세린이 시스테인으로 치환, 350번째 페닐알라닌이 류신으로 치환, 385번째 세린이 트레오닌으로 치환, 388번째 세린이 프롤린으로 치환, 415번째 알라닌이 발린으로 치환, 417번째 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환 및 447번째 프롤린이 세린으로 치환되는 것으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 추가적으로 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

예를 들어 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 HES47 서열 중에서 447번째 프롤린이 세린으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 HES47-50로 칭함), 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 HES47 서열 중에서 415번째 알라닌이 발린으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 HES47-37로 칭함), 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 HES47 서열 중에서 388번째 세린이 프롤린으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 HES47-39로 칭함), 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 HES47 서열 중에서 385번째 세린이 트레오닌으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 HES47-45로 칭함), 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 HES47 서열 중에서 19번째 메티오닌이 발린으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서HES47-52로 칭함)와 같이 하나의 돌연변이 부위(site)를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으며,

서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 HES47 서열 중에서 183번째 메티오닌이 류신으로 치환되고 208번째 세린이 시스테인으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 HES47-3로 칭함), 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 HES47 서열 중에서 350번째 페닐알라닌이 류신으로 치환되고 417번째 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서HES47-6로 칭함), 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 HES47 서열 중에서 19번째 메티오닌이 발린으로 치환, 183번째 메티오닌이 류신으로 치환, 385번째 세린이 트레오닌으로 치환, 388번째 세린이 프롤린으로 치환 및 447번째 프롤린이 세린으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 HES47-s41로 칭함)와 같이 하나 이상의 다중 돌연변이 부위를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

가장 바람직하게, 본 발명의 상기 변이 AEH는 상기 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드에서 447번째 프롤린이 세린으로 치환을 추가적으로 포함하는 것일 수 있으며, 상기 추가적 치환을 포함하는 펩타이드는 본원 발명의 명세서에서 서열번호 3으로 표시되며 HES47-50으로 칭한다. 즉, 상기 HES47-50은 야생형 AEH와 비교하여 총 7개의(중) 돌연변이 부위로 이루어진다.

또한 본 발명의 상기 변이 AEH는, 상기 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드에서 19번째 메티오닌이 발린으로 치환, 183번째 메티오닌이 류신으로 치환, 385번째 세린이 트레오닌으로 치환 및 388번째 세린이 프롤린으로 치환을 추가적으로 포함하는 것일 수 있으며, 상기 추가적 치환을 포함하는 펩타이드는 본원 발명의 명세서에서 서열번호 4로 표시되며 HES47-s41로 칭한다. 즉, 상기 HES47-s41은 야생형 AEH와 비교하여 총 11개의(중) 돌연변이 부위로 이루어진다.

본 발명의 변이 AEH는 아목시실린(Amox)의 합성수율은 높으면서도 HPGM의 분해율이 현저히 낮아, 아목시실린의 생산성이 현저하게 증가된 것이 특징이다.

이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나있다.

먼저, 본 발명에 따른 변이 AEH 제작과정이 도 2의 모식도를 통해 개시된다. 본 발명의 실시예에서는 1, 2차 개량을 통하여 변이 AEH 들을 제작하였으며, 야생형 AEH 단백질의 1차 개량을 통하여 Amox합성활성이 증가된 변이를 제작하였고, 2차 개량을 통하여 Amox합성 활성은 높으면서도 HPGM의 분해활성이 감소된 변이체를 제작하였다.

구체적으로 1차 개량은 서열번호 1의 야생형 AEH 폴리펩타이드를 코딩하는 aeh DNA(서열번호 6)와 에러 유발성 중합효소연쇄반응(error prone PCR) 및 위치지정 돌연변이(DNA shuffling) 방법을 이용하여 Amox합성이 증가된 변이 AEH를 제조하였다 (실시예 2 참조). 에러 유발성 중합효소연쇄반응을 통하여 돌연변이 라이브러리를 제조하고 야생형 대비 Amox합성활성이 증가된 변이를 탐색한 결과, 야생형 AEH 폴리펩타이드(서열번호 1)의 H119, T211, D218, A262, A404, V463, D542, S571, T610 위치에서 하나 또는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이들을 선별할 수가 있었다. 구체적으로 상기 돌연변이는 H119가 아르기닌으로 치환, T211가 세린으로 치환, D218가 아스파라긴 또는 글루탐산으로 치환, A262가 글루탐산으로 치환, A404가 트레오닌으로 치환, V463가 알라닌으로 치환, D542가 글라이신 또는 아스파라긴으로 치환, S571가 트레오닌으로 치환 및 T610가 세린으로 치환되는 돌연변이들 중 하나 또는 하나 이상을 포함하여 HEP4(D218N), HEP6(D542N, S571T), HEP15(D542G), HEP22(H119R), HEP30(A262E), HEP31(D218E), HEP59(V463A), HEP67(T211S), HEP70(A404T), HEP73(T610S)의 변이체들을 제작하였다. 상기 돌연변이 중에 가장 활성이 높은 변이체는 D542N/S571T(‘HEP6 변이효소’)에 아미노산 치환이 발생되었으며, 이것은 야생형에 비해 약 1.2배 Amox합성 활성이 증가되었다. 다음으로는 위치지정 돌연변이(DNA shuffling)를 이용하여 Amox합성 활성이 증가된 변이를 선별하였다. 그 결과로, H119R/T211S/D218E/A404T/D542G/T610S(‘HES47 변이효소’, 서열번호 2)에 아미노산이 치환된 변이체는 Amox합성 활성이 야생형에 비해 3.13배 증가되었다.

2차 개량은 상기 1차 개량으로 제조된 HES47 변이효소를 코딩하는 DNA(서열번호 7)와 에러 유발성 중합효소연쇄반응(error prone PCR) 및 위치지정 돌연변이(DNA shuffling) 방법을 이용하여, HPGM분해 활성이 감소된 변이 AEH를 제조하였다 (실시예 3 참조). 에러 유발성 중합효소연쇄반응을 통하여 돌연변이 라이브러리를 제조하고 HES47 변이효소 대비 HPGM분해 활성이 감소된 변이체들을 탐색한 결과, M19, M183, S208, F350, S385, S388, A415, D417, P447 위치에서 하나 또는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이들을 선별할 수가 있었다. 구체적으로 상기 돌연변이는 M19가 발린으로 치환, M183가 류신으로 치환, S208이 시스테인으로 치환, F350가 류신으로 치환, S385가 트레오닌으로 치환, S388가 프롤린으로 치환, A415가 발린으로 치환, D417가 아스파라긴으로 치환 및 P447가 세린으로 치환되는 돌연변이들 중 하나 또는 하나 이상을 포함하여, HES47-3(M183L, S208C), HES47-6(F350L, D417N), HES47-37(A415V), HES47-39(S388P), HES47-45(S385T), HES47-50(P447S), HES47-52(M19V)의 변이체들을 제작하였다. 상기 돌연변이 중에 가장 활성이 높은 변이체는 HES47 변이효소에 P447S(‘HES47-50 변이효소’)의 아미노산 치환이 발생되었으며, 이것은 야생형에 비해 Amox합성은 약 5.13배 활성이 증가되었고 HPGM분해활성은 47% 감소하였다. 다음으로는 위치지정 돌연변이(DNA shuffling)를 이용하여 Amox합성 활성은 증가되고 HPGM 분해활성은 감소한 변이체를 선별하였다. 그 결과로, HES47 변이효소의 M19V/M183L/S385T/S388P/P447S (‘HES47-s41 변이효소’)에 아미노산이 치환된 변이체가 야생형에 비해 Amox합성은 약 13.4배 활성이 증가되었고 HPGM분해활성은 61% 감소하였음을 확인하였다.

즉, 본 발명의 실시예에서 제조한 상기 변이 AEH들은 야생형 보다 아목시실린(amoxicillin) 합성수율을 1.2배 내지 13.4배 증가시키고, 전구체인 하이드록실 페닐글리신 메틸 에스터(hydroxyl-phenylglycine methyl ester)의 분해율을 야생형보다 47% 내지 61% 감소시켜주므로, 아목시실린의 생산성을 높이는데 효과적이다.

한편, 본원 발명은 상기 변이 AEH를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 변이 AEH 폴리펩타이드를 암호화하는 것을 특징으로 하며, 구체적으로 상기 HEP4, HEP6(서열번호 5), HEP15, HEP22, HEP30, HEP31, HEP59, HEP67, HEP70, HEP73, HES47(서열번호 2), HES47-3, HES47-6, HES47-37, HES47-39, HES47-45, HES47-50(서열번호 3), HES47-52 및 HES47-s41(서열번호 4)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 변이 AEH 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함하여 단쇄 또는 이중쇄의 형태의 핵산분자로서 제공될 수 있다.

바람직하게 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 변이 AEH 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 예를 들어 서열번호 7 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로 서열번호 2의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 것 일 수 있으며, 서열번호 3의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 것 일 수 있고, 서열번호 4의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 것 일 수 있으며, 서열번호 5의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10의 염기서열을 가지는 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

가장 바람직하게 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 변이 AEH 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 예를 들어 서열번호 7 내지 9로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어“재조합 발현벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 핵산(RNA)을 발현할 수 있는 벡터로서, 폴리뉴클레오티드(유전자) 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어, “작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 즉, 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어 본 발명의 변이 AEH를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열)이 발현 조절 서열에 의해 유전자 발현이 가능하게 되는 방식으로 연결된 것을 의미하는 것으로, 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어야 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 재조합 발현벡터는 상기 변이 AEH를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 벡터 내에 클로닝된 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 적절한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절서열은 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커 및/또는 복제 기원(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 또한 상기 발현벡터는 발현조절 서열 및 필요에 따라 막표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 상기 발현 조절 서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다. 상기 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 발현벡터는 클로닝분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 본 발명의 재조합 발현벡터로서, 일례로 본 발명자는 서열번호 4의 변이 AEH(HES47-s41)를 암호화하는 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터 pBC-HES47-s41 플라스미드를 제조한 바 있다.

본 발명은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포 및 미생물을 제공한다.

상기 형질전환은 핵산(본 발명의 변이 AEH를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 탄화물 위스터(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG(polyethylenglycol)에 의한 침전법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 열충격(heat shock)법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment) 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

상기 숙주세포(host cell)는 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다.

본 발명에서 상기 숙주세포는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 종류의 단세포 유기체, 예컨대 각종 박테리아 (예컨대, Clostridia속, 대장균, 등) 등의 원핵세포 미생물, 효모 등의 하등 진핵세포 미생물과 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 당업자가 목적하는 바에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 숙주세포는 클로스트리디아 속(Clostridia spp., 예컨대, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, 또는 Clostridium saccharobutylicum 등), 에세리치아 속(Escherichia spp.), 아세토박터 속(Acetobacter spp., 예컨대 Acetobacter turbidans, Acetobacter pasteurianus 등), 아에로모나스 속(Aeromonas spp.), 알칼리제네스 속(Alcaligenes spp.), 아파노클라디움 속(Aphanocladium spp.),바실러스 속(Bacillus spp.), 세팔로스포리움 속(Cephalosporium spp.), 플라보박테리움 속(Flavobacterium spp.), 클루이베라 속(Kluyvera spp.), 미코플라나 속(Mycoplana spp.), 프로타미노박터 속(Protaminobacter spp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas spp.) 및 잔토모나스 속(Xanthomonas spp., 예컨대 Xanthomonas citri 등)으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 속(genus) 미생물일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 에세리치아 속 미생물은 바람직하게 에세리치아 콜라이(대장균, Escherichia coli)일 수 있으며, 본 발명은 상기 변이 AEH를 발현하도록 형질전환된 에세리치아 콜라이로서 에세리치아 콜라이 MC1061/pBC-HES47-s41(Escherichia coli MC1061/pBC-HES47-s41, 기탁번호: KCTC 12718BP)의 균주를 제공한다. 상기 에세리치아 콜라이 MC1061/pBC-HES47-s41는 서열번호 9로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 그 유전체 내에 삽입된 것이 특징이며, 이에 따라 서열번호 4로 표시되는 변이 AEH 폴리펩타이드(HES47-s41)를 발현한다.

또한 본 발명은 상기 변이 AEH를 포함하는 아목시실린 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 변이 AEH 폴리펩타이드(단백질)는 천연에서 추출하거나 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 통상적인 방법에 따라 상기 변이 AEH 폴리펩티드를 암호화하는 핵산(예를 들어, 서열번호 7 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나)을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어 (operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 그리고 상기와 같이 제조된 본 발명의 변이 AEH를 목적산물 제조를 위해서 그대로 사용하거나 또는 정제하여 사용하는 것이 가능하다. 변이 AEH 효소의 분리정제는 기존에 밝혀진 AEH의 성질을 이용하여 다양한 크로마토그래피 방법에 의한 단백질 분리방법을 그대로 사용하거나 실험 목적에 맞게 약간 변형하여 사용 가능하다. 또한, 히스티딘 펩티드와 니켈 컬럼 성분과의 결합력 또는 섬유소 결합부위 (cellulose binding domain, CBD), 섬유소와의 결합력 등과 같은 특정 결합력 성질을 이용한 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography) 방법에 의해 변이 AEH를 정제하는 것도 가능하다.

상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩티드(substally pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

또한, 본 발명의 변이 AEH 폴리펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).

본 발명의 변이 AEH는 유리(free) 상태뿐만 아니라 고정화시킨 상태로 사용하는 것이 가능하다. 변이 AEH의 고정화는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 제조가 가능한데, 담체로서는 섬유소, 전분, 덱스트란, 아가로즈 (agarose) 등의 천연 폴리머; 폴리아크릴아마이드 (polyacrylamide), 폴리아크릴레이트 (polyacrylate), 폴리메타크릴레이트 (polymethacylate), 유퍼짓 C (Eupergit C) 등의 합성 폴리머; 또는 실리카 (silica), 벤토나이트 (bentonite), 금속과 같은 미네랄 등이 사용 가능하다. 또한, 이들 담체에 공유결합, 이온결합, 소수성결합, 물리적 흡착, 마이크로 인캡슐레이션(microencapsulation) 등에 의해 변이 AEH를 결합시키는 것이 가능하다. 아울러, 이들 담체-효소 결합체가 글루타르알데히드 (glutaraldehyde), 시아노겐 브로마이드 (cyanogen bromide) 등의 작용에 의해 공유결합을 형성함으로써 변이 AEH를 고정화시키는 것도 가능하다. 또한, 더욱 바람직한 방법으로는 변이 AEH를 따로 정제할 필요가 없이 변이 AEH를 함유한 미생물 세포를 그대로 고정화하여 사용하는 것도 가능하다. 이와 같은 전세포 고정화 (whole cell immobilization)시 미생물에 함유된 변이 AEH의 반응성을 높이기 위하여 세포에 구멍을 내거나 표면발현 등의 기술을 적용할 수도 있다.

본 발명의 상기 아목시실린 제조용 조성물에서, 상기 용어‘변이 AEH를 포함’은 조성물에 처음부터 변이 AEH 폴리펩타이드를 포함하는 직접적 방식뿐만 아니라,

상기 변이 AEH를 암호화(코딩)하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포(미생물)로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 것을 조성물 내에 포함하여 궁극적으로 변이 AEH의 생성을 유도하는 간접적인 방식을 모두 포함하는 의미이다.

상기 본 발명의 변이 AEH를 사용한 아목시실린 제조의 한 실시양태는, 구체적으로 상기 변이 AEH를 하기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물과 접촉 및 반응시켜 화학식 3의 화합물(Amox)을 제조하는 방법일 수 있다.

<화학식 1>

이때, 상기 화학식 1에서 R은 OCH3 또는 NH2이다.

<화학식 2>

<화학식 3>

상기 화학식 1 및 화학식 2의 화합물에 있어서 이들 사이의 반응은 하기 반응식 1과 같이 진행되는 것으로서, 본 발명의 상기 변이 AEH의 촉매 작용에 의하여 촉진된다. 상기 반응은, 구체적으로 화학식 1의 화합물로부터 화학식 2의 화합물에의 아실 전이(acyl transfer) 반응 일 수 있다.

[반응식 1]

이때, 상기 화학식 1에서 R은 OCH3 또는 NH2이다. 구체적으로, 상기 화학식 1의 화합물은 hydroxy-phenylglycine methyl ester(R이 메톡시기(-OCH3)인 경우) 또는 (2R)-2-Amino-2-(4-hydroxyphenyl)acetamide(R이 아미노기(-NH2)인 경우)를 포함한다.

상기 화학식 2의 화합물은 6-아미노 페니실린산(6-amino penicillanic acid)이다.

이때 상기 변이 AEH 효소는, 상기 변이 AEH 폴리펩타이드 함유 조성물 또는 상기 변이 AEH 생산균주 배양물의 형태로 제공될 수 있고, 상기 변이 AEH를 유리 상태 또는 고정화 시킨 상태로 제공될 수 있다.

본 발명의 변이 AEH 효소의 활성이 손실되지 않는 조건이라면 상기 반응 조건이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 수용 액(물 또는 완충용액) 상에서 이루어지는 것 일 수 있으며, 바람직한 반응 혼합액의 pH는 pH 5 내지 7 범위 내에서, 바람직한 반응시간은 0.1 내지 24시간 범위 내에서, 바람직한 반응온도는 4 내지 40℃ 범위 내에서 선택될 수 있다.

상기 반응에서 화학식 1의 화합물이 반응혼합물 내에 첨가되는 농도는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 1 내지 560 mM 범위 내 일 수 있고, 이때 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물의 첨가 비율은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 1 내지 2 : 1 일수 있고, 바람직하게 1:1일 수 있다.

상기 반응에서 본 발명의 변이 AEH의 첨가량은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 0.1~100 U/㎖ 범위 내일 수 있으며, 상기 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물의 총량에 비하여 10~50%의 비율로 포함될 수 있다.

상기 화학식 1 및 2의 화합물과 본 발명의 변이 AEH 효소 반응을 통하여 생성된 화학식 3의 화합물은 아목시실린으로서, 상기 생성된 아목시실린은 통상의 방법(예를들어, 크로마토그래피 등)에 의해 반응액으로부터 분리 및 정제될 수 있다.

본 발명은 아목시실린 생산성이 증가된 변이 알파-아미노산 에스터 가수분해효소(α-amino acid ester hydrolase) 및 이의 이용에 관한 것이다. 본 발명의 변이 AEH는 아목시실린(Amox)의 합성수율은 높으면서도 HPGM의 분해율이 현저히 낮아, 아목시실린의 생산성이 현저하게 증가된 것이 특징이다.

도 1은 전구체인 HPGM 및 6-APA로부터 효소반응을 통하여 생산물인 Amox를 합성하는 반응(S), 상기 전구체 중 HPGM의 HPG로의 가수분해반응(H1), 상기 Amox의 HPG 및 6-APA로의 가수분해반응(H2)을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 변이 AEH의 제조과정을 도식화한 것이다(1차 개량: Amox합성수율 증가, 2차 개량: HPGM 분해감소, AEH_AP: 야생형 AEH ).
도 3은 각 변이 AEH의 시간에 따른 Amox합성 수율을 비교한 데이터이다.
도 4는 각 변이 AEH의 unit당 HPGM분해 수율을 비교한 데이터이다.
도 5는 변이 AEH(HES47-s41)에 의한 효소반응에서 시간에 따른 6-APA 전환율, 잔존 HPGM양, HPG의 생성량을 나타낸 데이터이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

아세토박터 파스테우리아누스( Acetobacter pasteurianus )유래 aeh 유전자 제조

<1-1> aeh 유전자 합성

Amox을 합성하는 효소를 개발하기 위해 기본 유전자로서 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus)유래의 aehA 유전자(Genbank : AF439262.1)를 바이오니아(대전, 한국) 회사에 의뢰하여 합성하였다.

<1-2> pBC-aeh 플라스미드의 제조

pBC-aeh 플라스미드는 상기 실시예<1-1>에서 수득한 aehA 유전자를 pBC KS(+) 벡터 (Stratagene사, 미국)의 XbaI과 NotI 제한효소 인식부위에 삽입하여 제조하였다. 자세하게는 하기와 같이 진행하였다.

상기 실시예 <1-1>에서 합성을 통해 얻은 약 2.1 kb 크기의 aehA 유전자 DNA 산물을 제한효소 XbaI과 NotI로 절단한 후, 정제 키트 (QIAEX Gel Extraction Kit; Qiagen사, 독일)로 정제하여 이를 삽입 DNA로 사용하였다. 또한, pBC KS(+) 벡터 DNA를 제한효소 XbaI과 NotI로 절단하고 CIP로 탈인산화시킨 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기의 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가제 (Roche사, 독일)를 이용하여 16℃에서 12~16시간 동안 접합 (ligation)시킨 후, 상기 접합액을 이용하여 전기천공법(electrophoration)으로 E. coli MC1061 균주에 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 20 μg/mL 농도의 클로람페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 30℃에서 하룻밤 정치배양함으로써 형질전환체들을 선별하였다. 이 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하여 삽입 DNA의 염기서열을 결정함으로써, 서열번호 6의 염기서열을 갖는 aeh 유전자를 포함하는 pBC-aeh플라스미드를 제조하였다. 상기 pBC-aeh플라스미드는 서열번호 1로 표시되는 야생형 AEH 단백질을 발현한다.

<실시예 2>

돌연변이에 의한 Amox 합성활성이 높은 변이체의 제조

<2-1> 에러 유발성 중합효소연쇄반응(error prone PCR)에 의한 HEP6 변이체의 제조

Amox합성 활성이 증가된 변이 AEH를 제조하기 위해서 상기 실시예 1에서 합성한 aeh 유전자의 염기서열에 인위적으로 무작위 돌연변이를 유발하였고, 이를 위해 에러 유발성 중합효소연쇄반응(error prone PCR)을 수행함으로써 돌연변이 라이브러리를 제조하였다. 구체적인 돌연변이 라이브러리의 제조과정은 하기에 설명한 바와 같다. 에러 유발성 중합효소 연쇄반응은 Diversity®PCR Random Mutagenesis kit (Clontech사, 미국)를 사용하여 1000 bp당 2개의 돌연변이가 일어나도록 하였고, PCR 반응액의 조성은 주형 DNA로서 1 ng의 aeh DNA(서열번호 6), 각 10 pmol의 T3 프라이머(서열번호 11)와 T7 프라이머(서열번호 12), 40 μM dGTP, Diversity dNTP mix, TITANIUM Taq polymerase로 최종부피는 100 μl로 조정하여 수행하였다. PCR은 Takara PCR Thermal Cycler (Takara사, 일본)를 사용하였고, 반응조건은 반응 혼합액을 94℃에서 30초 동안 전-변성시키고 변성을 94℃에서 30초, 어닐링을 52℃에서 30초 및 중합을 68℃에서 3분 동안 수행하는 반응을 16회 반복한 후 68℃에서 1분 동안 후-중합시켰다. 상기 조건의 에러 유발성 중합효소 연쇄반응을 통해 얻은 각각의 변이 aeh 유전자들, 즉, 2.1 kb 크기의 PCR 산물을 제한효소 XbaI과 NotI로 절단한 후 QIAEX Gel Extraction Kit (QIAGEN, 독일)를 사용하여 정제한 후 삽입 DNA로 사용하였고, pBC-KS플라스미드를 제한효소 XbaI과 NotI로 절단하여 회수한 3.4 kb 크기의 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기의 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, 스웨덴)를 이용하여 16℃에서 16시간 동안 접합시킨 후, 상기 접합액을 이용하여 전기천공법으로 E. coli MC1061 균주의 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 20 μg/mL 농도의 클로람페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 30℃에서 하룻밤 정치배양함으로써 무작위 돌연변이 라이브러리를 제조하였다.

상기 돌연변이 라이브러리로부터 Amox합성에 대한 반응성이 증가된 변이 AEH를 하기와 같은 방법으로 탐색하였다. 돌연변이가 유발된 변이 aeh 유전자를 함유한 E. coli MC1061 형질전환체를 클로람페니콜 항생제가 함유된 LB 액체배지가 200 μL씩 분주된 96-웰 플레이트에 접종한 후, 25℃, 165 rpm 조건으로 60~70시간 동안 진탕배양하였다. 그 후 상기 웰 플레이트에서 25 μL씩의 배양액을 취하여 이를 새로운 96-웰 플레이트로 옮겼다. 상기 배양액을 100 μL의 세포 분해용액 (1.25 mg/mL 라이소자임 (AMRESCO사, 미국), 1.25 mM EDTA, 0.375% Triton X-100)을 포함한 0.1 M potassium phosphate (pH 8.0) 완충용액과 혼합하여 25℃에서 3시간 동안 방치하였다. 그 후, 0.1 M potassium phosphate (pH 8.0) 완충용액에 15 mM 6-APA 및 이를 기준으로 하여 1:1.5 비율인 22.5 mM HPGM을 함께 용해시켜 제조한 기질용액을 첨가하고, 25℃에서 14~16시간 동안 Amox합성 반응을 수행하였다. 합성반응을 수행한 후에 반응액 중의 상등액 70 μL를 새로운 96-웰 플레이트로 옮겼다. 여기에 반응 정지액 1 N NaOH 70 μL를 첨가하여 효소반응을 정지시킨 후 실온에서 10분간 방치하였다. HPLC를 사용하여 Amox합성활성이 증가된 변이체를 탐색하였다. HPLC분석 조건은 0.01 M Potassium phosphate (pH 6.4)와 Acetonitrile (95:5)을 용매로 사용하였고, 컬럼은 YMC-Triart C18, 250*4.6mm를 사용하였으며, 10 μl를 주입하여 0.8 ml/min으로 흘려서 14분간 분석하였다.

상기와 같은 방법으로 10개의 변이체에서 Amox합성활성이 증가됨을 확인하였다. 10개 변이체는 유전자의 염기서열 결정을 통하여 HEP4(D218N), HEP6(D542N, S571T), HEP15(D542G), HEP22(H119R), HEP30(A262E), HEP31(D218E), HEP59(V463A), HEP67(T211S), HEP70(A404T), HEP73(T610S)으로 돌연변이 되었음을 확인하였다. 그 중에서 가장 아목시실린 합성활성이 높은 HEP6(서열번호 5)을 선발하였다.

<2-2> 위치지정 돌연변이(DNA shuffling)에 의한 HES47 개량 균주 선발

추가적으로 Amox합성효소를 개량하기 위해 에러 유발성 중합효소연쇄반응에서 얻은 개량균주의 활성을 바탕으로 9개의 아미노산 잔기(H119R, T211S, D218E/N, A262E, A404T, V463A, D542G/N, S571T, T610S)에 대한 위치지정 돌연변이 라이브러리를 제조하였다.

구체적으로는, 119, 211번째 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위하여, 야생형 AEH, HEP22를 주형으로 하고 M13R 프라이머(서열번호 30)와 211-R 프라이머(서열번호 14)를 사용하는 PCR을 수행하여 약 0.81 kb 크기의 PCR산물을 회수하였고, 218, 262번째 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해서 야생형 AEH, HEP4, HEP31을 주형으로 하여 211-F 프라이머(서열번호 13)와 262-R 프라이머(서열번호 16)를 사용한 PCR을 수행하여 약 0.19 kb 크기의 PCR산물을 회수하였고, 404, 463번째 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해 야생형 AEH, HEP70을 주형으로 하고 262-F 프라이머(서열번호 15)와 463-R프라이머(서열번호 18)를 사용하는 PCR을 수행하여 약 0.65 kb 크기의 PCR산물을 회수하였으며, 또한 542, 571번째 아미노산을 변이시키기 위해 야생형 AEH, HEP6, HEP15를 주형으로 하여 463-F프라이머(서열번호 17), 571-R 프라이머(서열번호 20)를 사용하는 PCR을 수행하여 약 0.36 kb 크기의 PCR을 회수하였고, 610번째 아미노산을 변이시키기 위해 야생형 AEH, HEP73을 주형으로 하여 571-F프라이머(서열번호 19)와 M13F(-20) 프라이머(서열번호 29)를 사용하는 PCR을 수행하여 약 0.26 kb 크기의 PCR 산물을 회수하였다. PCR 반응액의 조성은 각각의 주형 DNA, 프라이머, pfu-x buffer, dNTPs mix, pfu-x polymerase로 최종부피는 100 μl로 조정하여 수행하였다. PCR 반응조건은 반응 혼합액을 96℃에서 2분 동안 전-변성시키고 변성을 96℃에서 30초, 어닐링을 52℃에서 30초 및 중합을 72℃에서 1분 동안 수행하는 반응을 16회 반복한 후 72℃에서 5분 동안 후-중합시켰다.

상기조건에서 얻은 811 bp의 PCR산물과 186 bp의 PCR산물, 649 bp의 PCR산물, 361 bp의 PCR산물 및 256 bp의 PCR산물을 혼합하여 프라이머를 첨가하지 않고 PCR을 수행하여 다섯 PCR 산물이 하나로 연결된 약 2.1 kb 크기의 PCR산물을 회수하였다. 이로부터 상기 약2.1 kb의 PCR산물을 주형으로 하고 T3 프라이머 (서열번호 11)와 T7 프라이머(서열번호 12)를 사용한 PCR을 수행하여 약 2.1kb 크기의 다중 변이체 DNA 단편을 증폭하였다. 이렇게 얻은 약2.1 kb의 PCR산물을 실시예 <2-1>의 방법과 동일하게 pBC KS(+) 벡터 DNA에 삽입하고 E. coli MC1061 균주의 형질전환을 수행하여 위치지정 돌연변이체 라이브러리를 제조하였다.

상기 위치지정 돌연변이 라이브러리로부터 Amox합성에 대한 반응성이 증가된 변이 AEH를 실시예 <2-1>의 방법과 동일하게 탐색한 결과, HEP6 변이효소 대비 Amox합성활성이 증대된 6중 변이체(H119R/T211S/D218E/A404T/D542G/T610S)를 선발하여 HES47(서열번호 2)로 명명하였다.

<실시예 3>

돌연변이에 의한 HPGM 분해활성이 감소된 변이체의 제조

<3-1> 에러 유발성 돌연변이에 의한 HES47변이체 제조

상기 실시예 2에서 제조된 HES47 변이체의 HPGM 분해활성을 감소시키기 위해서 HES47의 DNA(서열번호 7)를 주형 DNA로 사용하여 실시예<2-1>의 방법과 동일하게 에러 유발성 돌연변이 라이브러리를 제조하였다.

그 후 Amox 합성 및 HPGM 분해에 대한 반응성의 탐색에서는, 0.1 M potassium phosphate (pH 8.0) 완충용액에 15 mM 6-APA 및 이를 기준으로 하여 1:1 비율인 15 mM HPGM을 함께 용해시켜 제조한 기질용액을 첨가하고, 반응온도도 낮추어 15℃에서 14~16시간 동안 Amox합성 반응을 수행하였다. 상기 기질비율과 기질반응온도를 제외하고는 모두 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일하게 수행되었다.

상기 제작된 에러 유발성 돌연변이 라이브러리를 탐색한 결과 7개의 변이체에서 HES47대비 Amox합성활성이 증가됨을 확인하였다. 7개 변이체는 유전자의 염기서열을 통하여 HES47-3(M183L, S208C), HES47-6(F350L, D417N), HES47-37(A415V), HES47-39(S388P), HES47-45(S385T), HES47-50(P447S), HES47-52(M19V)로 돌연변이 되었음을 확인하였고, HES47대비 HPGM 분해활성이 가장 많이 감소한 변이체로 447번째 아미노산 프롤린이 세린으로 치환된 HES47-50(서열번호 3)을 선발하였다.

<3-2> 위치지정 돌연변이에 의한 HES47-s41 개량 균주 선발

Amox합성효소개발을 완성하기 위해 상기 실시예 <3-1>에서 얻은 개량균주의 활성을 바탕으로, HES47의 DNA(서열번호 7)를 주형 DNA로 사용하여 10개의 아미노산 잔기(M19V, M183K/L, S208C, Q285V, F350L, S385T, S388P, A415V, D417N, P447S)에 대한 위치지정돌연변이 라이브러리를 제조하였다.

구체적으로, 19, 183번째 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해서 HES47, HES47-52를 주형으로 하여 M13R 프라이머(서열번호 30)와 183-R 프라이머(서열번호 22)를 사용하는 732 bp 크기의 PCR산물을 회수하였고, 208, 285번째 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해서 HES47, HES47-3을 주형으로 하여 183-F 프라이머(서열번호 21)와 285-R 프라이머(서열번호 24)를 사용하는 343 bp 크기의 PCR산물을 회수하였고, 350, 385, 388번째 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해 HES47, HES47-6을 주형으로 하여 285-F 프라이머(서열번호 23)와 385-388-R프라이머(서열번호 26)를 사용하는 344 bp 크기의 PCR산물을 회수하였으며, 447번째 아미노산을 변이시키기 위해 HES47, HES47-50을 주형으로 하여 385-388-F프라이머(서열번호 25), M13F(-20) 프라이머(서열번호 29)를 사용하는 810 bp 크기의 PCR산물을 회수하였다. 상기 732 bp 크기의 PCR 산물과 343 bp 크기의 PCR 산물, 344 bp 크기의 PCR산물 및 810 bp 크기의 PCR산물을 혼합하고, M13F(-20)프라이머(서열번호 29)와 M13R 프라이머(서열번호 30)를 사용한 PCR을 수행하여 2.1 kb 크기의 산물을 얻었다. 추가적으로, 415, 417번째 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해서 상기에서 얻은 2.1 kb크기의 PCR 산물을 주형으로 하여 M13R 프라이머(서열번호 30)와 415,417-R 프라이머(서열번호 28)를 사용하는 1.43 kb 크기의 PCR산물을 회수하고, 415,417-F 프라이머(서열번호 27)와 M13F(-20)프라이머(서열번호 29)를 사용하는 723 bp 크기의 PCR 산물을 회수하여 최종적으로 M13F(-20)프라이머(서열번호 29)와 M13R 프라이머(서열번호 30)를 사용하는 2.1 kb 크기의 PCR산물을 회수하였다. 상기의 PCR 반응조건은 실시예<2-2>의 방법을 사용하였다.

그 후 상기 실시예<3-1>의 방법과 동일한 방법으로 라이브러리를 탐색한 결과, HES47 대비 Amox 합성활성이 증가 되고 HPGM 분해 활성이 감소한 변이체로 M19V/M183L/S385T/S388P/P447S가 변이된 균주를 선발하여 HES47-s41(서열번호 4)로 명명하였다.

<실시예 4>

AEH 변이체들의 활성비교

<4-1> 효소액 제조

상기 실시예 2 내지 실시예 3에서 제조한 변이 AEH들의 Amox합성 활성을 비교하기 위해서 각 효소액을 하기와 같이 제조하였다.

상기 실시예 2 내지 실시예 3에서 제조한 각각의 변이 AEH를 코딩하는 유전자들을 상기 실시예 <1-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 pBC KS(+) 벡터에 삽입한 후, 상기 각 발현 벡터들을 E. coli MC1061의 대장균 균주에 형질전환하였다.

상기 대장균 형질전환체 각각을 20 μg/mL 클로람페니콜이 함유된 3 mL의 LB 배지 (1% Bacto-tryptone, 0.5% Yeast Extract, 0.5% NaCl)에 접종한 후 25℃, 200 rpm 조건으로 16시간 동안 진탕배양하였다. 그 후에 배양액 30μL를 20μg/mL 클로람페니콜이 함유된 30 mL의 새로운 LB 배지에 접종한 후 23℃, 200 rpm 조건으로 48시간 동안 진탕배양하였다. 이 플라스크 배양액을 원심분리 (4℃, 13,500 rpm, 10분)하여 균체를 회수한 후 0.1 M potassium phosphate 완충용액으로 1회 세척하였다. 이 균체를 30 mL의 동일 완충용액에 현탁한 후 4℃에서 초음파 분쇄기로 5분 동안 파쇄하고 4℃, 13,500 rpm 조건으로 20분 동안 원심분리하여 상등액을 취함으로써 각각의 변이AEH 효소액을 제조하였다.

<4-2> Amox합성활성측정

실시예 <2-1>에서 선발한 HEP6변이체, <2-2>에서 선발한 HES47변이체, <3-1>에서 선발한 HES47-50변이체, <3-2>에서 선발한 HES47-s41변이체의 Amox합성활성 정도를 측정하기 위해, 하기와 같이 실시하였다. 먼저, 상기 실시예<4-1>에 기재된 방법으로 각각 HEP6, HES47, HES47-50, HES47-s41에 대한 효소액을 제조하였다. 그 후, 6-APA와 HPGM을 0.1 M potassium phosphate (pH 8.0) 완충용액에 각각 60 mM 농도로 녹여 기질용액을 제조하였다. 이 기질용액 500 μL에 효소액 500 μL를 첨가하여 효소반응을 10분 시킨 후 1 N NaOH용액을 500 μL을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 그 후에 필터링(filtration)을 하여 상기 실시예 2-1과 동일한 조건으로 HPLC 분석하고, 표준물질의 정량곡선과 비교하여 정량하였다. 이때, 본 명세서에서 1 단위(unit, U)는 분당 1 μmole의 Amox을 생성할 수 있는 효소의 양으로 정의한다.

실험결과 도 3에서 보는 바와 같이, 야생형 AEH와 비교하여 본원 발명의 변이체들은 연속적인 개량에 의해 Amox의 합성 수율이 증가되었다. HEP6는 야생형에 비해 약 1.2배 활성이 증가되었고, HES47는 3.13배, HES47-50는 5.13배, HES47-s41는 13.4배의 순서로 Amox 합성 수율이 높았으며, 특히 최종 변이체인 HES47-s41는 야생형 AEH에 비해 약 13.4배 증가하여, 현저히 높은 Amox 생산률을 나타냈다.

<4-3> HPGM 잔존양 측정

마찬가지로 HEP6, HES47, HES47-50, HES47-s41에 대한 HPGM 분해활성 정도를 측정하기 위해, 40 mM HPGM을 0.1 M potassium phosphate (pH 8.0) 완충용액에 녹인 기질용액을 제조하였다. 이 기질용액 100 μl에 상기 변이 AEH들 각각의 효소액 100 μl를 첨가하여 효소반응을 10분 시킨 후, 상기 반응액에 0.2 N HCl용액 100 μl를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 그 후에 상기 실시예 4-2와 동일한 방법으로 필터링(filtration) 및 하여 HPLC 분석하여, 가수분해된 HPGM(hydrolyzed HPGM, 즉 HPG)의 양을 산출하였다.

그 결과 도 4에서 보는 바와 같이, 야생형 AEH와 비교하여 본원 발명의 변이체들은 HPGM 분해 수율이 감소된 것을 확인하였다. 특히, HEP6, HES47, HES47-50, HES47-s41의 순서로 HPGM 분해 활성이 낮았으며, 최종 변이체인 HES47-s41에서 HPGM분해활성이 61%감소하여 가장 낮은 분해활성을 나타내었다.

<4-4> 균주기탁

상기 변이 효소 중, HES47-s41 변이 효소를 암호화하는 유전자(서열번호 9)를 포함하는 pBC-HES47-s41 플라스미드로 형질전환된 E. coli MC1061 균주를“ Escherichia coli MC1061/pBC-HES47-s41”라 명명하였고, 2014년 11월 20일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다 (기탁번호: KCTC 12718BP).

<실시예 5>

HES47-s41 변이체의 6-APA 전환반응 측정

<5-1> 효소액 제조 및 효소분리정제

Amox의 전환율을 측정하기 위해서는, 전구체인 6-APA 전환율을 측정하는 것으로 Amox의 합성율을 유추할 수 있다. 최종 변이체인 HES47-s41를 이용하여 6-APA 전환율을 측정하였다 (도 5).

클로람페니콜이 함유된 LB 배지의 양을 1L로 한 것 이외에는 상기 실시예<4-1>과 동일한 방법으로, 상기 Escherichia coli MC1061/pBC-HES47-s41(기탁번호: KCTC 12718BP) 균주를 배양하였다. 배양한 세포현탁액은 4℃에서 7,000 rpm으로 10분간 원심분리하고 상층액을 제거한 다음 cell pellet을 얻었다. 90 ml의 0.1 M potassium phosphate buffer 로 현탁한 다음 초음파 발생기(Vibra Cell VC750, Sonics & Materials Inc, 미국)를 이용하여 세포를 파쇄 하였다. 초음파 발생기는 4초간 pulse on, 9초간 pulse off로 조절하여 90 ml 현탁액에 20분간 세포 파쇄를 실행하였다. 이 효소액을 분리정제하기 위해 파쇄한 균체를 10℃에서 2시간동안 정치시킨 다음 원심분리(10℃, 10,000 rpm, 30분)하여 상등액을 취하였다. 이 용액을 6-APA 전환반응시에 사용하였다.

<5-2> 전환반응

상기 실시예 5-1에서 제조된 분리정제액(상등액)을 10 U/ml 사용하였고, 0.1 M potassium phosphate (pH 8.0) 완충용액에 각각 280 mM 6-APA와 280 mM HPGM을 넣어 총 40 ml로 제조한 기질용액과 반응시켰다. 15℃에서 3시간동안 Amox합성반응을 진행하면서 6-APA 전환율과 HPGM 잔존양, HPG 생성양을 HPLC로 측정(상기 실시예4-2와 동일한 방법)하였다.

그 결과 도 5에서 보는 바와 같이, 본원 발명의 HES47-s41 변이 효소는 시간이 경과함에도 높은 6-APA 전환율을 유지하였으며, HPG의 양은 감소하는 결과를 나타내었다. 이로서 본 발명의 HES47-s41 변이효소는 아목시실린을 고효율로 합성할 뿐만 아니라 이의 효소 활성이 장시간 동안 높은 수준으로 유지되고 있으며, 동시에 HPGM의 HPG로의 분해율을 현저하게 낮추어줌으로써 아목시실린의 생산성이 뛰어남을 확인하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 아목시실린 생산성이 증가된 변이 알파-아미노산 에스터 가수분해효소(α-amino acid ester hydrolase) 및 이의 이용에 관한 것이다. 본 발명의 변이 AEH는 아목시실린(Amox)의 합성수율은 높으면서도 HPGM의 분해율이 현저히 낮아, 아목시실린의 생산성이 현저하게 증가되었으므로 산업상 이용가능성이 높다.

한국생명공학연구원 KCTC12718BP 20141120

<110> AMICOGEN CO., LTD. <120> Mutant alpha-amino acid ester hydrolase with enhanced productivity of amoxicillin <130> NP14-0102 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 619 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wild-type alpha- amino acid ester hydrolase (aeh) protien from Acetobacter pasteurianus (amino acid sequence) <400> 1 Met His Asp Pro Leu Ser Val Gln Thr Gly Ser Asp Ile Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val His Met Pro Thr Asp Gln Gln Arg Asp Tyr Ile Lys Arg Glu Val 20 25 30 Met Val Pro Met Arg Asp Gly Val Lys Leu Tyr Thr Val Ile Val Ile 35 40 45 Pro Lys Asn Ala Arg Asn Ala Pro Ile Leu Leu Thr Arg Thr Pro Tyr 50 55 60 Asn Ala Lys Gly Arg Ala Asn Arg Val Pro Asn Ala Leu Thr Met Arg 65 70 75 80 Glu Val Leu Pro Gln Gly Asp Asp Val Phe Val Glu Gly Gly Tyr Ile 85 90 95 Arg Val Phe Gln Asp Ile Arg Gly Lys Tyr Gly Ser Gln Gly Asp Tyr 100 105 110 Val Met Thr Arg Pro Pro His Gly Pro Leu Asn Pro Thr Lys Thr Asp 115 120 125 Glu Thr Thr Asp Ala Trp Asp Thr Val Asp Trp Leu Val His Asn Val 130 135 140 Pro Glu Ser Asn Gly Arg Val Gly Met Thr Gly Ser Ser Ala Glu Gly 145 150 155 160 Phe Thr Val Val Met Ala Leu Leu Asp Pro His Pro Ala Leu Lys Val 165 170 175 Ala Ala Pro Glu Ser Pro Met Val Asp Gly Trp Met Gly Asp Asp Trp 180 185 190 Phe His Tyr Gly Ala Phe Arg Gln Gly Ala Phe Asp Tyr Phe Val Ser 195 200 205 Gln Met Thr Ala Arg Gly Gly Gly Asn Asp Ile Pro Arg Arg Asp Ala 210 215 220 Asp Asp Tyr Thr Asn Phe Leu Lys Ala Gly Ser Ala Gly Ser Phe Ala 225 230 235 240 Thr Gln Ala Gly Leu Asp Gln Tyr Pro Phe Trp Gln Arg Met His Ala 245 250 255 His Pro Ala Tyr Asp Ala Phe Trp Gln Gly Gln Ala Leu Asp Lys Ile 260 265 270 Leu Ala Gln Arg Lys Pro Thr Val Pro Met Leu Trp Glu Gln Gly Leu 275 280 285 Trp Asp Gln Glu Asp Met Trp Gly Ala Ile His Ala Trp Gln Ala Leu 290 295 300 Lys Asp Ala Asp Val Lys Ala Pro Asn Thr Leu Val Met Gly Pro Trp 305 310 315 320 Arg His Ser Gly Val Asn Tyr Asn Gly Ser Thr Leu Gly Pro Leu Glu 325 330 335 Phe Glu Gly Asp Thr Ala His Gln Tyr Arg Arg Asp Val Phe Arg Pro 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gaccatgcgg 240 gaggttctgc cgcaggggga tgatgtgttt gtagagggcg gctatatccg cgtgtttcag 300 gatattcgcg ggaaatatgg ctctcagggc gattatgtga tgacgcgccc cccgcacggc 360 cccctaaacc ccaccaaaac ggatgaaacc accgacgcat gggatacggt ggactggctg 420 gtgcataatg tgccggagtc caatggccgt gtgggtatga caggctcgtc cgcggagggc 480 tttactgttg tcatggcgtt gctggacccg caccctgccc tgaaagtcgc cgcaccggaa 540 agcccgatgg tggatggctg gatgggagat gactggttcc attatggcgc gtttcgtcag 600 ggggcgtttg attattttgt cagccagatg acagcgcgtg gcggagggaa tgatattccc 660 cgcagagatg ctgatgacta caccaatttt ctgaaagccg gatcagccgg gagttttgcg 720 acacaggccg gtctggacca gtatccgttc tggcagcgta tgcatgcaca cccggcgtat 780 gatgcgttct ggcaggggca ggcgctggat aaaattctgg ctcagcgcaa gccgacagtt 840 ccgatgctgt gggaacaggg cttgtgggat caggaagata tgtggggggc cattcatgcc 900 tggcaggcgc tgaaggatgc agacgttaaa gcccccaata cgctggtgat gggcccctgg 960 cggcatagtg gggtgaacta taacggctcc acacttggcc cgctggaatt tgaaggtgat 1020 acagcccacc agtatcggcg ggatgtcttc cggcccttct ttgatgaata tctgaaaccg 1080 ggcagcgcgt ctgtgcatct gcctgacgcc atcatctaca atacagggga ccagaaatgg 1140 gattattacc gttcctggcc gtctgtgtgt gaaagcaact gcactggtgg cctgaccccg 1200 ctttatctgg cagacgggca cgggctgagc tttacacacc cggcagcaga tggggcggac 1260 agctatgtgt ctgacccggc gcatccggtt ccgttcatct cccgcccctt tgcctttgcg 1320 cagagcagtc ggtggaagcc ctggctggtg caggaccagc gggaagcaga atcccgcccg 1380 gatgtggtga cctatgaaac ggaggtgctg gacgagcctg tgcgcgtgag cggtgtgccg 1440 gtggcagacc tgtttgccgc gacaagcggc acggattcag actgggtggt gaagctgatt 1500 gacgtacagc ctgccatgac accggatgac cccaaaatgg gtgggtatga actgcctgtg 1560 tctatggata ttttccgggg ccgctaccgc aaggactttg ccaaaccgga agcactccag 1620 ccggatgcaa cgctgcatta tcacttcacg cttcctgctg tgaaccatgt gtttgcaaaa 1680 gggcatcgga ttatggtgca gatccagtcg tcctggttcc cgctttatga ccggaatccg 1740 cagaagttcg tgccgaacat ttttgatgca aaaccggcag attataccgt ggcgacccag 1800 agcattcatc atggtggcaa ggaggcgacc tccattctgc tcccggttgt gaaacagtaa 1860 t 1861 <210> 7 <211> 1860 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant enzyme_HES47(nucleotide sequence) <400> 7 atgcatgatc cgctaagcgt gcagaccggc agcgatattc cggccagtgt gcacatgcca 60 acagaccagc agcgtgatta catcaagcgc gaggttatgg tccccatgcg ggacggcgtg 120 aagctgtata cggttattgt tattccgaaa aacgcccgta atgctccaat tcttttgaca 180 cgtaccccct ataacgccaa aggccgggct aaccgtgtgc ccaatgccct gaccatgcgg 240 gaggttctgc cgcaggggga tgatgtgttt gtagagggcg gctatatccg cgtgtttcag 300 gatattcgcg ggaaatatgg ctctcagggc gattatgtga tgacgcgccc cccgcgcggc 360 cccctaaacc ccaccaaaac ggatgaaacc accgacgcat gggatacggt ggactggctg 420 gtgcataatg tgccggagtc caatggccgt gtgggtatga caggctcgtc cgcggagggc 480 tttactgttg tcatggcgtt gctggacccg caccctgccc tgaaagtcgc cgcaccggaa 540 agcccgatgg tggatggctg gatgggagat gactggttcc attatggcgc gtttcgtcag 600 ggggcgtttg attattttgt cagccagatg tcagcgcgtg gcggagggaa tgaaattccc 660 cgcagagatg ctgatgacta caccaatttt ctgaaagccg gatcagccgg gagttttgcg 720 acacaggccg gtctggacca gtatccgttc tggcagcgta tgcatgcaca cccggcgtat 780 gatgcgttct ggcaggggca ggcgctggat aaaattctgg ctcagcgcaa gccgacagtt 840 ccgatgctgt gggaacaggg cttgtgggat caggaagata tgtggggggc cattcatgcc 900 tggcaggcgc tgaaggatgc agacgttaaa gcccccaata cgctggtgat gggcccctgg 960 cggcatagtg gggtgaacta taacggctcc acacttggcc cgctggaatt tgaaggtgat 1020 acagcccacc agtatcggcg ggatgtcttc cggcccttct ttgatgaata tctgaaaccg 1080 ggcagcgcgt ctgtgcatct gcctgacgcc atcatctaca atacagggga ccagaaatgg 1140 gattattacc gttcctggcc gtctgtgtgt gaaagcaact gcactggtgg cctgaccccg 1200 ctttatctga cagacgggca cgggctgagc tttacacacc cggcagcaga tggggcggac 1260 agctatgtgt ctgacccggc gcatccggtt ccgttcatct cccgcccctt tgcctttgcg 1320 cagagcagtc ggtggaagcc ctggctggtg caggaccagc gggaagcaga atcccgcccg 1380 gatgtggtga cctatgaaac ggaggtgctg gacgagcctg tgcgcgtgag cggtgtgccg 1440 gtggcagacc tgtttgccgc gacaagcggc acggattcag actgggtggt gaagctgatt 1500 gacgtacagc ctgccatgac accggatgac cccaaaatgg gtgggtatga actgcctgtg 1560 tctatggata ttttccgggg ccgctaccgc aaggactttg ccaaaccgga agcactccag 1620 ccgggtgcaa cgctgcatta tcacttcacg cttcctgctg tgaaccatgt gtttgcaaaa 1680 gggcatcgga ttatggtgca gatccagtcg tcctggttcc cgctttatga ccggaatccg 1740 cagaagttcg tgccgaacat ttttgatgca aaaccggcag attataccgt ggcgacccag 1800 agcattcatc atggtggcaa ggaggcgtcc tccattctgc tcccggttgt gaaacagtaa 1860 1860 <210> 8 <211> 1860 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant enzyme_HES47-50(nucleotide sequence) <400> 8 atgcatgatc cgctaagcgt gcagaccggc agcgatattc cggccagtgt gcacatgcca 60 acagaccagc agcgtgatta catcaagcgc gaggttatgg tccccatgcg ggacggcgtg 120 aagctgtata cggttattgt tattccgaaa aacgcccgta atgctccaat tcttttgaca 180 cgtaccccct ataacgccaa aggccgggct aaccgtgtgc ccaatgccct gaccatgcgg 240 gaggttctgc cgcaggggga tgatgtgttt gtagagggcg gctatatccg cgtgtttcag 300 gatattcgcg ggaaatatgg ctctcagggc gattatgtga tgacgcgccc cccgcgcggc 360 cccctaaacc ccaccaaaac ggatgaaacc accgacgcat gggatacggt ggactggctg 420 gtgcataatg tgccggagtc caatggccgt gtgggtatga caggctcgtc cgcggagggc 480 tttactgttg tcatggcgtt gctggacccg caccctgccc tgaaagtcgc cgcaccggaa 540 agcccgatgg tggatggctg gatgggagat gactggttcc attatggcgc gtttcgtcag 600 ggggcgtttg attattttgt cagccagatg tcagcgcgtg gcggagggaa tgaaattccc 660 cgcagagatg ctgatgacta caccaatttt ctgaaagccg gatcagccgg gagttttgcg 720 acacaggccg gtctggacca gtatccgttc tggcagcgta tgcatgcaca cccggcgtat 780 gatgcgttct ggcaggggca ggcgctggat aaaattctgg ctcagcgcaa gccgacagtt 840 ccgatgctgt gggaacaggg cttgtgggat caggaagata tgtggggggc cattcatgcc 900 tggcaggcgc tgaaggatgc agacgttaaa gcccccaata cgctggtgat gggcccctgg 960 cggcatagtg gggtgaacta taacggctcc acacttggcc cgctggaatt tgaaggtgat 1020 acagcccacc agtatcggcg ggatgtcttc cggcccttct ttgatgaata tctgaaaccg 1080 ggcagcgcgt ctgtgcatct gcctgacgcc atcatctaca atacagggga ccagaaatgg 1140 gattattacc gttcctggcc gtctgtgtgt gaaagcaact gcactggtgg cctgaccccg 1200 ctttatctga cagacgggca cgggctgagc tttacacacc cggcagcaga tggggcggac 1260 agctatgtgt ctgacccggc gcatccggtt ccgttcatct cccgcccctt tgcctttgcg 1320 cagagcagtc ggtggaagtc ctggctggtg caggaccagc gggaagcaga atcccgcccg 1380 gatgtggtga cctatgaaac ggaggtgctg gacgagcctg tgcgcgtgag cggtgtgccg 1440 gtggcagacc tgtttgccgc gacaagcggc acggattcag actgggtggt gaagctgatt 1500 gacgtacagc ctgccatgac accggatgac cccaaaatgg gtgggtatga actgcctgtg 1560 tctatggata ttttccgggg ccgctaccgc aaggactttg ccaaaccgga agcactccag 1620 ccgggtgcaa cgctgcatta tcacttcacg cttcctgctg tgaaccatgt gtttgcaaaa 1680 gggcatcgga ttatggtgca gatccagtcg tcctggttcc cgctttatga ccggaatccg 1740 cagaagttcg tgccgaacat ttttgatgca aaaccggcag attataccgt ggcgacccag 1800 agcattcatc atggtggcaa ggaggcgtcc tccattctgc tcccggttgt gaaacagtaa 1860 1860 <210> 9 <211> 1860 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant enzyme_HES47-s41(nucleotide sequence) <400> 9 atgcatgatc cgctaagcgt gcagaccggc agcgatattc cggccagtgt gcacgtgcca 60 acagaccagc agcgtgatta catcaagcgc gaggttatgg tccccatgcg ggacggcgtg 120 aagctgtata cggttattgt tattccgaaa aacgcccgta atgctccaat tcttttgaca 180 cgtaccccct ataacgccaa aggccgggct aaccgtgtgc ccaatgccct gaccatgcgg 240 gaggttctgc cgcaggggga tgatgtgttt gtagagggcg gctatatccg cgtgtttcag 300 gatattcgcg ggaaatatgg ctctcagggc gattatgtga tgacgcgccc cccgcgcggc 360 cccctaaacc ccaccaaaac ggatgaaacc accgacgcat gggatacggt ggactggctg 420 gtgcataatg tgccggagtc caatggccgt gtgggtatga caggctcgtc cgcggagggc 480 tttactgttg tcatggcgtt gctggacccg caccctgccc tgaaagtcgc cgcaccggaa 540 agcccgctgg tggatggctg gatgggagat gactggttcc attatggcgc gtttcgtcag 600 ggggcgtttg attattttgt cagccagatg tcagcgcgtg gcggagggaa tgaaattccc 660 cgcagagatg ctgatgacta caccaatttt ctgaaagccg gatcagccgg gagttttgcg 720 acacaggccg gtctggacca gtatccgttc tggcagcgta tgcatgcaca cccggcgtat 780 gatgcgttct ggcaggggca ggcgctggat aaaattctgg ctcagcgcaa gccgacagtt 840 ccgatgctgt gggaacaggg cttgtgggat caggaagata tgtggggggc cattcatgcc 900 tggcaggcgc tgaaggatgc agacgttaaa gcccccaata cgctggtgat gggcccctgg 960 cggcatagtg gggtgaacta taacggctcc acacttggcc cgctggaatt tgaaggtgat 1020 acagcccacc agtatcggcg ggatgtcttc cggcccttct ttgatgaata tctgaaaccg 1080 ggcagcgcgt ctgtgcatct gcctgacgcc atcatctaca atacagggga ccagaaatgg 1140 gattattacc gtacctggcc gcctgtgtgt gaaagcaact gcactggtgg cctgaccccg 1200 ctttatctga cagacgggca cgggctgagc tttacacacc cggcagcaga tggggcggac 1260 agctatgtgt ctgacccggc gcatccggtt ccgttcatct cccgcccctt tgcctttgcg 1320 cagagcagtc ggtggaagtc ctggctggtg caggaccagc gggaagcaga atcccgcccg 1380 gatgtggtga cctatgaaac ggaggtgctg gacgagcctg tgcgcgtgag cggtgtgccg 1440 gtggcagacc tgtttgccgc gacaagcggc acggattcag actgggtggt gaagctgatt 1500 gacgtacagc ctgccatgac accggatgac cccaaaatgg gtgggtatga actgcctgtg 1560 tctatggata ttttccgggg ccgctaccgc aaggactttg ccaaaccgga agcactccag 1620 ccgggtgcaa cgctgcatta tcacttcacg cttcctgctg tgaaccatgt gtttgcaaaa 1680 gggcatcgga ttatggtgca gatccagtcg tcctggttcc cgctttatga ccggaatccg 1740 cagaagttcg tgccgaacat ttttgatgca aaaccggcag attataccgt ggcgacccag 1800 agcattcatc atggtggcaa ggaggcgtcc tccattctgc tcccggttgt gaaacagtaa 1860 1860 <210> 10 <211> 1860 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant enzyme_HEP6(nucleotide sequence) <400> 10 atgcatgatc cgctaagcgt gcagaccggc agcgatattc cggccagtgt gcacatgcca 60 acagaccagc agcgtgatta catcaagcgc gaggttatgg tccccatgcg ggacggcgtg 120 aagctgtata cggttattgt tattccgaaa aacgcccgta atgctccaat tcttttgaca 180 cgtaccccct ataacgccaa aggccgggct aaccgtgtgc ccaatgccct gaccatgcgg 240 gaggttctgc cgcaggggga tgatgtgttt gtagagggcg gctatatccg cgtgtttcag 300 gatattcgcg ggaaatatgg ctctcagggc gattatgtga tgacgcgccc cccgcacggc 360 cccctaaacc ccaccaaaac ggatgaaacc accgacgcat gggatacggt ggactggctg 420 gtgcataatg tgccggagtc caatggccgt gtgggtatga caggctcgtc cgcggagggc 480 tttactgttg tcatggcgtt gctggacccg caccctgccc tgaaagtcgc cgcaccggaa 540 agcccgatgg tggatggctg gatgggagat gactggttcc attatggcgc gtttcgtcag 600 ggggcgtttg attattttgt cagccagatg acagcgcgtg gcggagggaa tgatattccc 660 cgcagagatg ctgatgacta caccaatttt ctgaaagccg gatcagccgg gagttttgcg 720 acacaggccg gtctggacca gtatccgttc tggcagcgta tgcatgcaca cccggcgtat 780 gatgcgttct ggcaggggca ggcgctggat aaaattctgg ctcagcgcaa gccgacagtt 840 ccgatgctgt gggaacaggg cttgtgggat caggaagata tgtggggggc cattcatgcc 900 tggcaggcgc tgaaggatgc agacgttaaa gcccccaata cgctggtgat gggcccctgg 960 cggcatagtg gggtgaacta taacggctcc acacttggcc cgctggaatt tgaaggtgat 1020 acagcccacc agtatcggcg ggatgtcttc cggcccttct ttgatgaata tctgaaaccg 1080 ggcagcgcgt ctgtgcatct gcctgacgcc atcatctaca atacagggga ccagaaatgg 1140 gattattacc gttcctggcc gtctgtgtgt gaaagcaact gcactggtgg cctgaccccg 1200 ctttatctgg cagacgggca cgggctgagc tttacacacc cggcagcaga tggggcggac 1260 agctatgtgt ctgacccggc gcatccggtt ccgttcatct cccgcccctt tgcctttgcg 1320 cagagcagtc ggtggaagcc ctggctggtg caggaccagc gggaagcaga atcccgcccg 1380 gatgtggtga cctatgaaac ggaggtgctg gacgagcctg tgcgcgtgag cggtgtgccg 1440 gtggcagacc tgtttgccgc gacaagcggc acggattcag actgggtggt gaagctgatt 1500 gacgtacagc ctgccatgac accggatgac cccaaaatgg gtgggtatga actgcctgtg 1560 tctatggata ttttccgggg ccgctaccgc aaggactttg ccaaaccgga agcactccag 1620 ccgaatgcaa cgctgcatta tcacttcacg cttcctgctg tgaaccatgt gtttgcaaaa 1680 gggcatcgga ttatggtgca gatccagtcg acctggttcc cgctttatga ccggaatccg 1740 cagaagttcg tgccgaacat ttttgatgca aaaccggcag attataccgt ggcgacccag 1800 agcattcatc atggtggcaa ggaggcgacc tccattctgc tcccggttgt gaaacagtaa 1860 1860 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T3 primer <400> 11 aattaaccct cactaaaggg a 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 primer <400> 12 taatacgact cactataggg 20 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 211-F Primer <400> 13 ttgattattt tgtcagccag atgwcagcgc gtggcggagg 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 211-R Pimer <400> 14 cctccgccac gcgctgwcat ctggctgaca aaataatcaa 40 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 262-F Primer <400> 15 gcacacccgg cgtatgatgm gttctggcag gggcagg 37 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 262-R Primer <400> 16 cctgcccctg ccagaackca tcatacgccg ggtgtgc 37 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 463-F Primer <400> 17 tcccgcccgg atgtggygac ctatgaaacg gaggtgctg 39 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 463-R Primer <400> 18 cagcacctcc gtttcatagg tcrccacatc cgggcggga 39 <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 571-F Primer <400> 19 ttatggtgca gatccagtcg wcctggttcc cgctttatga cc 42 <210> 20 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 571-R Primer <400> 20 ggtcataaag cgggaaccag gwcgactgga tctgcaccat aa 42 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 183-F(L) Primer <400> 21 cgcaccggaa agcccgmtgg tggatggctg gatgggag 38 <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 183-R(L) Primer <400> 22 ctcccatcca gccatccacc akcgggcttt ccggtgcg 38 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 285-F Primer <400> 23 gacagttccg atgctgtggg wacagggctt gtgggatcag 40 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 285-R Primer <400> 24 ctgatcccac aagccctgtw cccacagcat cggaactgtc 40 <210> 25 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 385-388-F Primer <400> 25 atgggattat taccgtwcct ggccgyctgt gtgtgaaagc a 41 <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 385-388-R Primer <400> 26 tgctttcaca cacagrcggc caggwacggt aataatccca t 41 <210> 27 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 415,417-F Primer <400> 27 tgctttcaca cacagrcggc caggwacggt aataatccca t 41 <210> 28 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 415,417-R Primer <400> 28 ctgtccgccc catctgctrc cgggtgtgta aagctcagc 39 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13F(-20) Primer <400> 29 ttgtaaaacg acggccagtg 20 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13R Primer <400> 30 ggaaacagct atgaccatg 19

Claims (13)

1. 삭제
2. 삭제
3. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 야생형 알파 아미노산 에스터 가수분해효소(AEH) 서열 중에서 119번째 히스티딘이 아르기닌으로 치환, 211번째 트레오닌이 세린으로 치환, 218번째 아스파르트산이 글루탐산으로 치환, 404번째 알라닌이 트레오닌으로 치환, 542번째 아스파르트산이 글라이신으로 치환, 및 610번째 트레오닌이 세린으로 치환되는 것을 특징으로 하는,
   서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 변이 알파 아미노산 에스터 가수분해효소(AEH).
   
4. 제3항에 있어서, 상기 변이 AEH는 447번째 프롤린이 세린으로 치환을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 변이 알파 아미노산 에스터 가수분해효소(AEH).
   
5. 제4항에 있어서, 상기 변이 AEH는 19번째 메티오닌이 발린으로 치환, 183번째 메티오닌이 류신으로 치환, 385번째 세린이 트레오닌으로 치환 및 388번째 세린이 프롤린으로 치환을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 변이 알파 아미노산 에스터 가수분해효소(AEH).
   
6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 변이 AEH를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7 내지 9로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 염기 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 변이 AEH를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
   
8. 제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터.
   
9. 제8항의 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포.
   
10. 제8항의 발현벡터에 의해 형질전환된 미생물.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 미생물은 클로스트리디아 속(Clostridia spp.) 에세리치아 속(Escherichia spp.), 아세토박터 속(Acetobacter spp.), 아에로모나스 속 (Aeromonas spp.), 알칼리제네스 속(Alcaligenes spp.), 아파노클라디움 속(Aphanocladium spp.), 바실러스 속(Bacillus spp.), 세팔로스포리움 속(Cephalosporium spp.), 플라보박테리움 속(Flavobacterium spp.) , 클루이베라 속(Kluyvera spp.), 미코플라나 속(Mycoplana spp.), 프로타미노박터 속(Protaminobacter spp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas spp.) 및 잔토모나스 속(Xanthomonas spp.)으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 속(genus) 미생물인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
    
12. 제11항에 있어서, 상기 에세리치아 속의 미생물은, 서열번호 9의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터에 의해 형질전환된 에세리치아 콜라이 MC1061/pBC-HES47-s41 (Escherichia coli MC1061/pBC-HES47-s41, 기탁번호: KCTC 12718BP)인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
    
13. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 변이 AEH를 포함하는 아목시실린 제조용 조성물.
    

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