CN109694829A - 一种富硒酿酒酵母、富硒富番茄红素酿酒酵母及其制备方法 - Google Patents

一种富硒酿酒酵母、富硒富番茄红素酿酒酵母及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种富硒酿酒酵母、富硒富番茄红素酿酒酵母及其制备方法，涉及番茄红素发酵技术。本发明公开的制备富硒酿酒酵母的方法，包括往接种有酿酒酵母的发酵培养基中添加表面活性剂的步骤；采用该制备方法可以有效提高酵母的硒元素含量。

Description

一种富硒酿酒酵母、富硒富番茄红素酿酒酵母及其制备方法
技术领域
本发明涉及番茄红素发酵技术领域，具体而言，涉及一种富硒酿酒酵母、富硒富番茄红素酿酒酵母及其制备方法。
背景技术
番茄红素是植物中所含的一种天然色素。主要存在于茄科植物西红柿的成熟果实中。它是目前在自然界的植物中被发现的最强抗氧化剂之一。科学证明，人体内的单线态氧和氧自由基是侵害人体自身免疫***的罪魁祸首。番茄红素清除自由基的功效远胜于其他类胡萝卜素和维生素E，其淬灭单线态氧速率常数是维生素E的100倍。它可以有效的防治因衰老，免疫力下降引起的各种疾病。因此，它受到世界各国专家的关注。硒(Se)被世界卫生组织和中华医学会定为21世纪继碘、锌后必补的第三大微量营养保健元素，它对人体具有抗氧化、防癌变、排毒、提高免疫力等作用。
目前，普通酵母的硒转化能力较弱，需要通过筛选驯化得到高产菌株，但筛选驯化需要花大量的时间人力，尤其针对已经通过基因技术构建好的工程菌株，罕见有报道提高基因工程菌株硒元素含量的研究。
酵母体内有机硒大部分已硒代甲硫氨酸的形式存在，但是现有技术中却很少有通过提高酵母体内甲硫氨酸的表达含量来提高有机硒的含量。
CN106566779A构建了生产番茄红素的重组酿酒酵母，但重组酵母菌株只产番茄红素，产品单一，营养单一，资源利用不充分，所得的番茄红素制品中缺乏硒元素或其含量较低。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种制备富硒酵母的方法，采用该方法，可以有效提高酵母的硒元素含量。
本发明的另一个目的在于提供一种制备富硒富番茄红素酿酒酵母的方法，采用该制备方法制得的同时含有番茄红素和有机硒的酵母。
本发明的还有一个目的在于提供一种富硒酿酒酵母，该酵母含有较高的硒元素含量。
本发明的还有一个目的在于提供一种富硒富番茄红素的酵母，该酵母体内含有较高含量的硒元素和番茄红素。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供了一种制备富硒酿酒酵母的方法，其包括以下步骤：
发酵步骤：往接种有酿酒酵母的发酵培养基中添加富硒助剂。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述富硒助剂为十二烷基磺酸钠(SDS)或者环己氨基磺酸钠(甜蜜素)。
该制备方法利用富硒助剂改变酵母细胞的通透性，使培养基中的无机硒元素能够更顺利通过细胞膜，进入到细胞内，形成有机硒元素，进而在生产番茄红素的同时，产物中有机硒元素也相应提高。
同时，硒在体内大部分会与甲硫氨酸结合，发明人发现，加入 SDS(十二烷基磺酸钠)或者环己氨基磺酸钠作为有机硫，可促进酵母增强甲硫氨酸的表达量，进一步提高硒与甲硫氨酸的结合率，进而提高有机硒含量。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在接种所述酿酒酵母后的第0-30h添加所述富硒助剂。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述富硒助剂的添加量为添加量为0.1-5g/L。
优选的，在本发明的一些实施方案中，所述富硒助剂的添加量为 0.25g/L-0.5g/L。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述富硒助剂的添加方式是一次性加入、分批加入或流加。
其实分批加入可以是分两批或者三批。分两批加的加入的时间为 10h、30h，分三批加入的时间为0h、15h、30h。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在发酵过程中，在第 12-36h进行超声波处理。
为了进一步提高硒进入细胞的量，采用一定强度的超声波进行处理，可提高细胞的通透性，加强硒元素进入细胞内，提高有机硒的含量。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述超声波处理的条件如下：
频率：20-25KHz，功率：400-600W，间隔时间：每次3s，间隔4s，超声波处理总时间为：90s-210s。
超声条件是影响酵母细胞细胞膜通透性的因素之一，只有采用合适的超声条件才可以改善酿酒酵母的细胞膜通透性，有利于环境中的无机硒元素进入到细胞内，被合成有机硒，提高有机硒元素含量。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在第12-36h往所述发酵培养基中添加硒盐。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述硒盐的添加量为 20-200mg/L。
优选的，在本发明的一些实施方案中，所述硒盐的添加量为优选的25-50mg/L。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述酿酒酵母的保藏编号为CGMCCNO.13013。
该酿酒酵母菌株在培养酵母的过程中加入硒元素，酵母生长时吸收利用了硒，使硒与酵母体内的蛋白质和多糖有机结合转化为生物硒，从而消除了化学硒(如***钠)对人体的毒副反应和肠胃刺激，使硒能够更高效、更安全地被人体吸收利用。
该酿酒酵母菌株于2016年9月19如保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏编号：CGMCC NO.13013，拉丁文学名： Saccharomyces cerevisiae。
该酿酒酵母的保藏编号为CGMCC NO.13013，所述重组酵母菌株敲除gal1、gal7、gal10、ypl062w以及rox1基因，且包含经酵母同源重组整合到基因组上的6个基因片段，在其基础上还进一步整合到酵母基因组上1个基因片段，并且选取特定来源组合的合成番茄红素的功能基因crtE、crtB和crtI，及特定的酵母内源基因和外源基因等，经模块化设计整合至基因敲除酵母菌株基因组上，获得保藏号为 CGMCC No.13013的高产番茄红素的重组菌株。该菌株的制备方法可参考申请号为“CN201610969721.2”，名称为“一种重组酵母菌株及其构建方法和应用”的中国发明专利申请。
本发明的另一个目的在于提供一种制备富硒富番茄红素酿酒酵母的方法，其包括：采用如上所述的制备富硒酵母的方法制备得到富硒酿酒酵母；
其中，所用的酿酒酵母原料为保藏编号为CGMCC NO.13013的酿酒酵母。
采用该制备方法制得的酵母中同时富含番茄红素和硒元素。
CGMCC NO.13013酿酒酵母为基因构建的能够产番茄红素的菌株。以该菌株作为原种子菌，并结合如上所述的制备富硒酵母的方法，使得该酿酒酵母不仅可以产生番茄红素，还可提高硒元素含量。
本发明的制备方法通过优化、改变发酵中的工艺条件例如添加适宜的表面活性剂、设置适宜的超声波处理条件等，使重组酵母菌株的硒转化能力有较大的提高，得到富含硒元素尤其是有机硒的番茄红素产品。
另一方面，本发明提供了一种富硒酵母，其由上述的制备富硒酿酒酵母的方法所制得，或者由上述的制备富硒番茄红素酵母的方法所制得。
另一方面，本发明提供了一种富硒富番茄红素的酵母，其由如上所述的方法制备得到。
还有一方面，本发明提供了一种富硒富番茄红素的酵母中，番茄红素和有机硒同时存在，番茄红素的含量不小于3.5％；
进一步地，在本发明地一些实施方式中，该富硒番茄红素酵母番茄红素地含量不小于4.6％。
在本发明的一些实施方案中，该富硒番茄红素酵母硒元素含量不小于302ppm。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，该富硒番茄红素酵母硒元素含量为不小于412ppm。
进一步地，该富硒番茄红素酵母硒元素含量不小于826ppm，进一步，硒元素含量不小于1133ppm，进一步，硒元素含量不小于 1530ppm，进一步，硒元素含量不小于2230ppm，进一步，硒元素含量不小于2490ppm，进一步，硒元素含量不小于2840ppm，进一步，硒元素含量不小于3020ppm，进一步，硒元素含量为3450ppm。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的制备富硒番茄红素制品的方法，具体如下：
所用菌种：酿酒酵母，保藏编号为CGMCC NO.13013。
1菌种活化：
菌种在斜面培养基中进行平板划线后，在30℃恒温培养箱中活化培养24-36h。
其中，斜面培养基含有(g/L)：葡萄糖20，酵母膏10，蛋白胨20，琼脂20，121℃灭菌20min。
2种子培养：
活化培养后的菌种转接到种子培养基中，培养温度为30℃，转速为250rpm，培养12～16h后作为种子液。
种子培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母膏10，蛋白胨20，50mg/L 尿嘧啶，121℃灭菌20min。
3发酵：
将活化好的种子液接入发酵培养基中(记为第0h)，接种量为5％ (v/v)，培养温度为30℃，转速为250rpm，培养120h。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖40，酵母膏10，蛋白胨20，20mg/L 尿嘧啶，10g/L D-(+)-半乳糖，121℃灭菌20min。
4补加硒盐
在发酵第24h，往发酵培养基添加25mg/L的***钠，(即每L 发酵培养基中添加100mg的***钠)，继续发酵。
5补加SDS
在接种种子液后的第12h，按0.25g/L的量往发酵培养基中一次性加入SDS，继续发酵。
6超声处理
在接种种子液后的第20h，进行超声处理，条件：频率：20KHz，功率：500W，间隔时间：每次3s，间隔4s，超声波处理总时间为： 120s。
7发酵培养结束后，收集发酵后得到的菌体，将菌体过滤清洗后烘干，得到干重，即富硒番茄红素制品。
8检测
8.1番茄红素检测
准确称量0.02g干菌体，用酸热法破壁后，用四氢呋喃萃取，用高效液相色谱法检测番茄红素产量。
其中，高效液相色谱检测方法参考如下：
(1)色谱条件：
色谱柱：Suplex PKB-100(Supelco)；250×4.6mm，5μm；
波长：472nm；
流速：0.5ml/min；
进样体积：10μL；
柱温：30℃；
(2)流动相配制及条件：
A相：甲醇
B相：称取50mg BHT至1L容量瓶中，加20ml异丙醇溶解。加入0.2ml N,N-二异丙基乙胺，25ml 0.2％醋酸铵溶液，455ml乙腈， 450ml甲醇，溶液恢复至室温，并用甲醇稀释至刻度。
流动相梯度表
时间(min) 流速(ml/min) A％ B％
0 0.5 0 100
32 0.5 16 84
50 0.5 16 84
57 0.5 0 100
8.2硒元素含量的检测方法
(1)硒标准溶液
准确称取2.19g干燥的***钠(优级纯)，溶于蒸馏水中，添加80mL 48％的HBr，用蒸馏水稀释至1L，制备成含硒1g/L的标准硒配备液或直接购买1g/L的硒标准液。
(2)样品消化
精确称取0.1～0.2g干菌体于150mL高脚烧杯中，加少量水湿样，加消化液(双氧水∶高氯酸∶硫酸＝3∶3∶1)，摇匀，待气泡平息后加盖表面皿，置通风橱内的电炉上消化至终点，若消化不完全可稍冷后补加双氧水，继续加热消化至完全。置冷后用少量水冲洗表面皿及瓶壁，加氢氧化钠调pH值为7.0，摇匀，用甲酸调pH值为 2.0～3.0，加入4mL 40％盐酸羟胺,然后定容至50mL，同法做空白溶液。
(3)样品总硒测定
取消化液10mL于125mL分液漏斗中，另取7个分液漏斗，分别加入与消化液等量的空白溶液及标准硒工作液0.0、2.0、4.0、6.0、 8.0、10.0mL，加水适量，各加入5％EDTA-2Na溶液4mL，0.5％的 3，3-二氨基联苯胺溶液2mL，摇匀，置暗处反应30min，用氨水溶液调pH值6.5～7.0，加入甲苯4mL，猛烈振摇萃取3min，静置分层，取甲苯层滤液于1cm比色皿中，在波长425nm处测定吸光度。用标准硒工作液的吸光度绘制标准曲线，从标准曲线上查出与消化液的吸光度对应的硒含量。
(4)样品无机硒测定
取样品1.0g左右干菌体于50mL蒸馏水中，置于超声波震荡仪中超声震荡30min,小火微沸30min,过滤，定容50mL,吸取10mL上清液，精确加入甲苯4mL，猛烈振摇萃取3min，静置分层，取甲苯层滤液于l cm比色皿中，在波长425nm处测定吸光度。用标准硒工作液的吸光度绘制标准曲线，从标准曲线上查出对应的无机硒含量。
(5)样品有机硒含量测定
有机硒含量用测定的总硒含量减去样品中无机硒的含量即可得到。
实施例2-6
实施例2-6提供的制备富硒番茄红素制品的方法与实施例1基本相同，不同的参数见下表1。
表1
其中，“-”代表实施例6中未进行超声处理。
实施例7
本实施例采用普通酿酒酵母，购自广东环凯公司，酿酒酵母标准菌株ATC9763,富硒的工艺和参数与实施例1相同。
实施例8
本实施例采用普通酿酒酵母，购自广东环凯公司，酿酒酵母标准菌株ATC9763,富硒的工艺和参数与实施例1相同，不同的是本实施例未采用超声处理。
对比例1
本对比例提供的制备富硒番茄红素制品的方法与实施例1基本相同，不同的是以Tween-80代替实施例1中的SDS。
对比例2
本对比例提供的制备富硒番茄红素制品的方法与实施例1基本相同，不同的是以CTAB代替实施例1中的SDS。
对比例3
本对比例提供的制备富硒番茄红素制品的方法与实施例1基本相同，不同的是本对比例无机硒的添加量为50mg/L，且在接种种子液后的第60h小时才添加0.05g/L的SDS。
对比例4
本对比例提供的制备富硒番茄红素制品的方法与实施例1基本相同，不同的是本对比例在无机硒的添加量为30mg/L，SDS添加量为7g/L，超声处理的功率为400w。
对比例5
本对比例提供的制备富硒番茄红素制品的方法与实施例1基本相同，不同的是本对比例未添加SDS，也未经过超声处理。
对比例6
本对比例采用普通酿酒酵母，购自环凯公司，酿酒酵母标准菌株 ATC9763，工艺与实施例1相同，不同的是本对比例未添加SDS也未经过超声处理。
对比例7
本对比例采用普通酿酒酵母，购自环凯公司，酿酒酵母标准菌株 ATC9763，工艺与实施例1相同，不同的是本对比例SDS添加量为 0.01g/L。
检测结果
按实施例1中的提供的番茄红素和硒元素的检测方法，对实施例 1-6，对比例1-5的收集发酵后得到的菌体进行检测，结果如下表2：
表2
其中ppm为每千克酵母制品中含有的硒量。
可以看出，采用实施例1-6的方法制得的菌体中的番茄红素含量或硒转化率明显高于对比例1-5，同样采用普通酿酒酵母的实施例7 和8富硒含量和硒转化率明显高于对比例6和对比例7，由此说明，采用本发明实施例提供的富硒番茄红素的制备方法可以提高番茄红素同时，提高硒元素的含量。另外，由实施例1和实施例7对比，对比例5和对比例6对比，能够发现构建的保藏号为CGMCC NO.13013 的酿酒酵母，比普通酿酒酵母有更好的富硒表现。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种制备富硒酿酒酵母的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
发酵步骤：往接种有酿酒酵母的发酵培养基中添加富硒助剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述富硒助剂为十二烷基磺酸钠或者环己氨基磺酸钠。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在接种所述酿酒酵母后的第0-30h添加所述富硒助剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述富硒助剂的添加量为0.1-5g/L；
优选的，所述富硒助剂的添加量为0.25g/L-0.5g/L。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述富硒助剂的添加方式是一次性加入、分批加入或流加。
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，在发酵过程中，在第12-36h进行超声波处理。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述超声波处理的条件如下：
频率：20-25KHz，功率：400-600W，间隔时间：每次3s，间隔4s，超声波处理总时间为：90s-210s。
8.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，在发酵过程中，在第12-36h往所述发酵培养基中添加硒盐。
9.一种制备富硒富番茄红素酿酒酵母的方法，其特征在于，其包括：采用权利要求1-8任一项所述的方法制备得到富硒酿酒酵母，所述酿酒酵母的保藏编号为CGMCC NO.13013。
10.一种富硒的酵母，其特征在于，其由权利要求1-8任一项所述的方法制备得到，或者由权利要求9所述的方法制备得到。
11.一种富硒富番茄红素的酵母，其特征在于，该酵母体内有机硒和番茄红素同时存在，番茄红素的含量为不小于3.5％。
12.根据权利要求11所述的富硒富番茄红素的酵母，其特征在于，所述酵母的有机硒含量不小于302ppm。
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