CN106566779A - 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

一种重组酵母菌株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种重组酵母菌株及其构建方法和应用。所述重组酵母菌株敲除gal1、gal7、gal10、ypl062w以及rox1基因，且包含经酵母同源重组整合到基因组上的6个基因片段，在其基础上本发明还进一步整合到酵母基因组上1个基因片段，获得更优的重组酵母。本发明构建基因敲除酵母菌株，为生产番茄红素提供优化的宿主细胞，选取特定来源组合的合成番茄红素的功能基因crtE、crtB和crtI，及特定的酵母内源基因和外源基因等，经模块化设计整合至基因敲除酵母菌株基因组上，获得一株全新的高产番茄红素的重组菌株。

Description

一种重组酵母菌株及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种重组酵母菌株及其构建方法和应用。
背景技术
在世界范围内，随着经济水平和对健康需求的提高，食品的安全性、营养性和功能性受到越来越多的关注，因此功能性营养化学品已成为发展趋势，代表当代食品发展的新潮流，具有广阔的市场前景。番茄红素是一种脂溶性天然食用色素，在化学结构上属于类胡萝卜素，具备极强的抗氧化能力，是近年来国际上功能食品成分研究的热点。
番茄红素的制备主要依赖植物提取、化学合成和微生物合成，前两种方法各有其自身的不足，微生物合成则以低成本、高产量和产品安全性，被认为是最有前途的方法。目前，在微生物合成番茄红素的研究中，所采用的宿主菌主要集中于大肠杆菌与酿酒酵母。2011年，Yeong-Su Kim等人在大肠杆菌中引入成团泛菌来源的合成番茄红素三个基因crtE、crtB和crtI，同时上调内源MEP途径中的关键基因并在胞内搭建异源MVA路径，最终通过分批补料发酵优化实现1.35g/L(32mg/gDCW)的番茄红素产量。2014年，天津工业生物技术研究所马延和课题组通过优化大肠杆菌胞内NADPH和ATP的供给，并利用核糖体结合位点文库筛选获得一株高产番茄红素的重组大肠杆菌，其在分批补料发酵罐上的产量为3.52g/L(50.6mg/g DCW)，属目前公开报道的重组菌株中最高产量。
酿酒酵母作为公认的安全模式微生物，相比大肠杆菌，它的菌体维生素、蛋白质含量高，可作食用、药用和饲料酵母；相比三孢布拉氏霉菌，它的生长周期更短且更易培养。因此，实现番茄红素在酿酒酵母中的高产将会在类胡萝卜素产业化上展现极大的竞争力。2014年Bahieldin等人报道的在酿酒酵母中通过ADH2启动子表达经密码子优化的噬夏孢欧文氏菌来源的crtE、crtB和crtI的番茄红素产量仅3.3mg/gDCW。2015年，浙江大学于洪巍课题组通过蛋白定向进化手段改造红发夫酵母来源的双功能酶crtYB，使其失去番茄红素环化酶的编码功能，而仅保留其编码八氢番茄红素合成酶的功能；同时，对红发夫酵母来源的crtE进行定向进化，提高酶的催化性能；再次，通过调整crtE、crtB和crtI的拷贝数，获得一株高产番茄红素的二倍体重组酿酒酵母，其摇瓶产量达到159.56mg/L(23.23mg/gDCW)，最后通过分批补料发酵优化，番茄红素的产量达到1.61g/L(24.41mg/gDCW)。中国专利CN105087406A公开了一种一种重组酵母菌株及其构建方法和应用，其通过将酵母菌株敲除gal1、gal7、gal10或gal80基因，以及ypl062w基因构建基因敲除酵母菌株，然后选取不同来源的合成番茄红素的功能基因crtE、crtB和crtI，及特定的酵母内源基因等，经模块化设计整合至基因敲除酵母菌株基因组上，获得一株全新的高产番茄红素的重组菌株，番茄红素的产量达到30-45mg/gDCW；然而，这与此前报道的利用重组大肠杆菌合成番茄红素的最高产量(50.6mg/g DCW)相比仍有一定差距。
中国专利CN105420134A公开了一种重组酵母菌株及其构建方法和应用，其通过将酵母菌株敲除gal1、gal7、gal10以及ypl062w基因，且包含经酵母同源重组整合到基因组上的3个基因片段，在其基础上其还进一步敲除rox1基因以及整合到酵母基因组上2个基因片段，获得更优的重组酵母，番茄红素的产量高于45mg/gDCW，最高可达54.62mg/gDCW，不仅优于专利CN105087406A中的酵母工程菌，而且高于当下重组大肠杆菌的番茄红素最高产量。但是，开发以酿酒酵母为宿主菌株实现番茄红素的高产依然存在很大的潜力与空间，值得研究人员去进一步提升重组工程菌的产番茄红素能力。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组酵母菌株，使得所述重组菌株能够应用于番茄红素的生物合成中，并保持较高产量，同时提供所述重组菌株的构建方法和应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种重组酵母菌株，其特征在于，所述酵母基因组敲除gal1、gal7、gal10、ypl062w、rox1基因，且包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：
酵母trp1位点上游同源序列、CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、PacrtB、PGK1终止子、酵母trp1位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段1；
酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、TDH2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、TmcrtE、GPM1终止子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段2；
基因片段2中TDH2终止子及其上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、CYC1终止子、Bt crtI、GAL7启动子、基因片段2中ACT1终止子及其下游同源序列顺次拼接而成的基因片段3；
酵母his3位点上游同源序列、HIS3标记、ENO2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、融合基因BTS1-ERG20、FBA1终止子、酵母his3位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段4；
酵母YPRCdelta15位点上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、CPS1终止子、转录因子INO2、GAL1启动子、酿酒酵母YPRCdelta15位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段5；
酵母YNRCdelta9位点上游同源序列、GAL1启动子、转录因子INO2、CPS1终止子、DR-Kl URA3-DR营养标签、酵母YNRCdelta9位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段6(模式图见图1)；
其中，在酵母基因组敲除gal1、gal7、gal10、ypl062w、rox1基因并同源重组基因片段1-5后，获得中间菌株，所述重组酵母菌株在中间菌株基础上经自身同源重组整合基因片段6后获得。本发明所述基因片段1-5的具体序列、基因元件、合成方法以及模式图均可参见专利CN105420134A中记载。
本发明通过利用特定的酵母内源基因以及外源基因进行基因元件、基因模块的构建，并转入到敲除gal1、gal7、gal10、ypl062w、rox1基因的酵母基因组上，实现重组菌株番茄红素的合成产量提高。
其中，所涉及的酵母中的氨基酸标记、转录因子、启动子和终止子，包括但不限于CYC1终止子、GAL10启动子、GAL1启动子、PGK1终止子、ACT1终止子、GPM1终止子、LEU2标记、TDH2终止子、FBA1终止子、ENO2终止子、HIS3标记、CPS1终止子、PGK1启动子、转录因子INO2，上述基因元件的获得可以酵母基因组为模板，通过PCR扩增获得；
在本发明中，上述各基因元件以及相关的上下游同源序列以酿酒酵母菌株BY4741的基因组为模板，设计并合成合适的引物，通过PCR扩增得到；而LEU2上游同源序列及LEU2标记是一并从质粒pRS405上PCR扩增下来，HIS3上游同源序列及HIS3标记是一并从质粒pRS313上PCR扩增下来。
本发明所涉及的外源基因包括香叶基焦磷酸(GGPP)合酶基因crtE、八氢番茄红素合成酶基因crtB和八氢番茄红素脱氢酶基因crtI。其中crtE的来源为曼地亚红豆杉(Taxusx media)，简写为Tm crtE；crtB的来源为成团泛菌(Pantoea agglomerans)，简写为PacrtB；crtI的来源为三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)，简写为Bt crtI；VHb来源于透明颤菌(Vitreoscilla stercoraria)，上述基因均为经过密码子优化并适当规避常用限制性酶切位点后通过人工合成得到。
作为优选，所述基因片段6如SEQ ID NO:1所示。
作为优选，所述中间菌株为保藏编号CGMCC No.11748的菌株，该菌株于2015年11月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并详细记录在专利CN105420134A中；本发明可在保藏编号CGMCC No.11748的菌株基础上转化基因片段6获得新的重组酵母菌株。
作为优选，所述酵母为酿酒酵母、解脂属酵母或克鲁维属酵母。除此之外，也可以以藻类、霉菌(如链霉菌等)和细菌(如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等)为改造菌株将本发明所限定的基因元件和模块根据这些菌株的已被解析的类胡萝卜素生物合成路径来重组。
更优选地，所述酿酒酵母为CEN.PK系列酿酒酵母或BY系列酿酒酵母。进一步优选地，所述CEN.PK系列酿酒酵母为酿酒酵母CEN.PK2-1D。
在上述各技术方案基础上，优选地还包括经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：
酵母YFLWtau1位点上游同源序列、PGK1启动子、来源于透明颤菌的基因VHb、ACT1终止子、DR-Kl URA3-DR营养标签、酿酒酵母YFLWtau1位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段7(模式图见图1)。进一步优选地，所述基因片段7如SEQ ID NO:2所示。在此基础上，更优选地，所述菌株为保藏编号为CGMCC No.13013的菌株。
本发明所述重组酵母菌株能够大量的合成番茄红素，因此本发明还提供了所述重组酵母菌株在生产番茄红素中的应用以及在生产以番茄红素为中间产物的产品中的应用。
此外，本发明还提供了所述重组酵母菌株的构建方法，包括：
步骤1、构建由酵母gal7基因下游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、gal1基因下游同源序列顺次连接的敲除盒片段1、由ypl062w基因上游同源序列、kanMX抗性标签、ypl062w基因下游同源序列顺次连接的敲除盒片段2，以及构建由酵母rox1基因上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、rox1基因下游同源序列顺次连接的敲除盒片段3，利用敲除盒片段1-3通过酵母自身同源重组敲除酵母gal1、gal7、gal10、ypl062w和rox1基因，获得基因敲除酵母，备用；
将酵母trp1位点上游同源序列、CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、Pa crtB、PGK1终止子、酵母trp1位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段1，即trp1位点上游同源序列-TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1-trp1位点下游同源序列，备用；
将酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、TDH2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、Tm crtE、GPM1终止子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段2，即leu2位点上游同源序列-LEU2-TTDH2-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1-leu2位点下游同源序列，备用；
将基因片段2中TDH2终止子及其上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、CYC1终止子、Bt crtI、GAL7启动子、基因片段2中ACT1终止子及其下游同源序列顺次拼接，获得基因片段3，即TDH2终止子及其上游同源序列-DR-Kl URA3-DR-TCYC1-Bt crtI-PGAL7-TACT1-ACT1终止子及其下游同源序列，备用；
将酵母内源FPP合酶基因ERG20和GGPP合酶基因BTS1进行连接，获得融合基因BTS1-ERG20，然后将酵母his3位点上游同源序列、HIS3标记、ENO2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、融合基因BTS1-ERG20、FBA1终止子、酵母his3位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段4，即his3位点上游同源序列-HIS3-TENO2-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1-his3位点下游同源序列，备用；
将酵母YPRCdelta15位点上游同源序列、DR-KlURA3-DR营养标签、CPS1终止子、转录因子INO2、GAL1启动子、酿酒酵母YPRCdelta15位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段5，即YPRCdelta15位点上游同源序列-DR-KlURA3-DR-TCPS1-INO2-PGAL1-YPRCdelta15位点下游同源序列，备用；
将酵母YNRCdelta9位点上游同源序列、GAL1启动子、转录因子INO2、CPS1终止子、DR-Kl URA3-DR营养标签、酵母YNRCdelta9位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段6，即YNRCdelta9位点上游同源序列-PGAL1-INO2-TCPS1-DR-Kl URA3-DR-YNRCdelta9位点下游同源序列，备用；
步骤2、将基因片段1通过醋酸锂法转入所述基因敲除酵母中，通过基因片段1中trp1位点上、下游同源序列与基因敲除酵母基因组上trp1位点发生重组而整合到基因组上；
将基因片段2通过醋酸锂法转入所述基因敲除酵母中，通过基因片段2中leu2位点上、下游同源序列与基因敲除酵母基因组上leu2位点发生重组而整合到基因组上；
将基因片段3继续通过醋酸锂法转化到已转入基因片段2的基因敲除酵母中，通过基因片段3中TDH2终止子及其上游同源序列、ACT1终止子及其下游同源序列，与已整合的基因片段2上的TDH2终止子和ACT1终止子位点发生重组而***到已整合基因片段2的基因敲除酵母基因组上；
将基因片段4通过醋酸锂法转入所述基因敲除酵母中，通过基因片段4中his3位点上、下游同源序列与基因敲除酵母基因组上his3位点发生重组而整合到基因组上；
将基因片段5通过醋酸锂法转化到基因敲除酵母中，通过基因片段5中YPRCdelta15位点上、下游同源序列与基因敲除酵母基因组上YPRCdelta15位点发生重组而整合到基因组上；
将基因片段1-5通过醋酸锂法转化到基因敲除酵母中后获得中间菌株；
将基因片段6通过醋酸锂法转化到中间菌株中，通过基因片段6中YNRCdelta9位点上、下游同源序列与中间菌株基因组上YNRCdelta9位点发生重组而整合到基因组上，获得重组酵母菌株。
作为优选，所述构建方法还包括：
构建基因片段7，并将基因片段7转入获得重组酵母菌株；
具体为，将酵母YFLWtau1位点上游同源序列、PGK1启动子、来源于透明颤菌的基因VHb、ACT1终止子、DR-KlURA3-DR营养标签、酿酒酵母YFLWtau1位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段7，即YFLWtau1位点上游同源序列-PPGK1-VHb-TACT1-DR-KlURA3-DR-YFLWtau1位点下游同源序列；
将基因片段7通过醋酸锂法转化到已转入基因片段1-6或已转入基因片段1-5的基因敲除酵母中，通过基因片段7中YFLWtau1位点上、下游同源序列与基因敲除酵母基因组上YFLWtau1位点发生重组而整合到基因组上。
本发明所述基因敲除酵母(包括各敲除盒的详细构建)、基因片段1-5的具体构建方法以及详细记载情况可参照专利CN105420134A的记载，本发明在此将基因片段6和7的构建情况提供如下：
扩增酵母YNRCdelta9位点上游256bp同源序列、GAL1启动子、转录因子INO2、CPS1终止子、DR-Kl URA3-DR营养标签、酵母YNRCdelta9位点下游267bp同源序列，顺次通过OE-PCR方法拼接起来，获得两端包含PmeI 酶切位点的基因片段6，将上述得到的片段与平末端载体pJET1.2连接，得到基因片段6整合质粒记为pYNRCdelta9-PGAL1-INO2-TCPS1-DR-KlURA3-DR，PmeI酶切获得基因片段6，即YNRCdelta9位点上游同源序列-PGAL1-INO2-TCPS1-DR-Kl URA3-DR-YNRCdelta9位点下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
扩增酵母YFLWtau1位点上游297bp同源序列、PGK1启动子、来源于透明颤菌的基因VHb、ACT1终止子、DR-Kl URA3-DR营养标签、酿酒酵母YFLWtau1位点下游208bp同源序列，顺次通过OE-PCR方法拼接起来，获得两端包含PmeI酶切位点的基因片段7，将上述得到的片段与平末端载体pJET1.2连接，得到基因片段7整合质粒记为pYFLWtau1-PPGK1-VHb-TACT1-DR-KlURA3-DR，PmeI酶切获得基因片段7，即YFLWtau1位点上游同源序列-PPGK1-VHb-TACT1-DR-KlURA3-DR-YFLWtau1位点下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
作为优选，在构建方法中，所述酵母为酿酒酵母、解脂属酵母或克鲁维属酵母。除此之外，也可以以藻类、霉菌(如链霉菌等)和细菌(如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等)为改造菌株将本发明所限定的基因元件和模块根据这些菌株已被解析的类胡萝卜素生物合成路径来重组。更优选地，所述酿酒酵母为CEN.PK系列酿酒酵母或BY系列酿酒酵母。进一步优选地，所述CEN.PK系列酿酒酵母为酿酒酵母CEN.PK2-1D。
本发明所述重组酵母菌株用于生产番茄红素时，番茄红素产量为60.97mg/gDCW(356.22mg/L)-66.14mg/gDCW(376.78mg/L)，产量显著高于CN105420134A专利中重组酵母菌株的54.62mg/gDCW(318.13mg/L)的最高产量。
根据本发明所述菌株的相关应用，本发明还提供了一种生产番茄红素的方法，将本发明所述菌株经种子培养基培养活化后接种于发酵培养基中发酵培养，发酵培养后收集菌体细胞提取番茄红素。
更为具体地，将本发明所述菌株接种于5mL种子培养基中培养后，以初始菌体浓度OD600＝0.2转接于新鲜的25mL种子培养基培养至对数生长中期，以初始菌体浓度OD600＝0.5接种于50mL发酵培养基中培养，发酵培养后收集菌体细胞提取番茄红素。
其中，作为优选，所述种子培养基为20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，50mg/L尿嘧啶，其余为水。
作为优选，所述发酵培养基为20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，20mg/L尿嘧啶，10g/L D-(+)-半乳糖，其余为水。
作为优选，所述培养为在30℃、250rpm条件下培养。
由以上技术方案可知，本发明构建基因敲除酵母菌株，为生产番茄红素提供优化的宿主细胞，选取特定来源组合的合成番茄红素的功能基因crtE、crtB和crtI，及特定的酵母内源基因以及外源基因等，经模块化设计整合至基因敲除酵母菌株基因组上，获得一株全新的高产番茄红素的重组菌株。
生物保藏说明
SyBE_Sc0014D018，分类命名：酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae于2016年9月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13013。
附图说明
图1所示为基因片段6的基因元件模式图；其中，两端YNRCdelta9-L、YNRCdelta9-R分别表示酵母YNRCdelta9位点上、下游同源序列；
图2所示为基因片段7的基因元件模式图；其中，两端YFLWtau1-L、YFLWtau1-R分别表示酵母YFLWtau1位点上、下游同源序列；
图3所示为专利CN105420134A中SyBE_Sc0014D014菌株、本发明SyBE_Sc0014D017和SyBE_Sc0014D018菌株的番茄红素产量柱形图；
图4所示为本发明SyBE_Sc0014D018菌株摇瓶发酵的生长和番茄红素产量曲线。
具体实施方式
本发明公开了一种重组酵母菌株及其构建方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中所涉及的一些质粒载体、菌株均可市售获得，如pJET1.2质粒载体购买自Thermo Scientific公司的CloneJET PCR Cloning Kit，#K1231；酿酒酵母菌株CEN.PK2-1D购买自德国Scientific Research and Development GmbH的EUROSCARF，菌株编号为30000A和30000B；酿酒酵母BY4742单敲库菌株YPL062W购买自美国Thermo FisherScientific公司；质粒pRS405、pRS313以及酿酒酵母BY4741是从BioVector中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心-NTCC国家典型培养物保藏中心购买的。上述质粒图谱和序列可参见专利CN105420134A记载。
对于本发明构建重组酵母菌株中所采用的各基因元件，如氨基酸标记、标签、内源基因、外源基因等均为本领域公知，本领域技术人员知晓其具体序列。为方便理解本发明，本发明对各基因片段中的各基因元件进行说明：
敲除盒片段1(参见专利CN105420134A中的SEQ ID NO:7)：1-40bp为gal7基因下游40bp同源序列；41-1615bp为DR-Kl URA3-DR营养标签序列；1616-1655bp为gal1基因下游40bp同源序列。
敲除盒片段2(参见专利CN105420134A中的SEQ ID NO:8)：1-394bp为ypl062w基因上游394bp同源序列；395-1864bp为kanMX抗性标签序列；1865-2181bp为ypl062w基因下游317bp同源序列。
敲除盒片段3(参见专利CN105420134A中的SEQ ID NO:9)：1-40bp为rox1基因上游40bp同源序列；41-1615bp为DR-Kl URA3-DR营养标签序列；1616-1655bp为rox1基因下游40bp同源序列。
基因片段1(参见专利CN105420134A中的SEQ ID NO:1)：1-631bp为trp1位点上游631bp同源序列；632-637bp为BamHI酶切位点；638-640bp为无意义序列；641-646bp为HindIII酶切位点；647-901bp为CYC1终止子序列；902-2650bp为Bt crtI序列；2651-3318bp为GAL10-GAL1双向启动子序列；3319-4248bp为Pa crtB序列；4249-4523bp为PGK1终止子序列；4524-4529bp为XhoI酶切位点；4530-5262bp为trp1位点下游同源733bp序列。
基因片段2(参见专利CN105420134A中的SEQ ID NO:2)：1-561bp为leu2位点上游同源561bp序列；562-1656bp为LEU2标记；1657-2056bp为TDH2终止子序列；2057-2062bp为BamHI酶切位点；2063-2349bp为ACT1终止子序列；2350-3858bp为截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1；3859-4526bp为GAL10-GAL1双向启动子序列；4527-5708bp为Tm crtE基因；5709-6108bp为GPM1终止子序列；6109-6114bp为XhoI酶切位点；6115-6698bp为leu2位点下游同源584bp序列。
基因片段3(参见专利CN105420134A中的SEQ ID NO:3)：1-869bp为TDH2终止子及其上游同源序列869bp；870-2444bp为DR-Kl URA3-DR营养标签序列；2445-2699bp为CYC1终止子序列；2700-4448bp为Bt crtI序列；4449-4948bp为GAL7启动子；4949-5303bp为ACT1终止子及其下游同源序列355bp。
基因片段4(参见专利CN105420134A中的SEQ ID NO:4)：1-312bp为his3位点上游312bp同源序列；313-975bp为HIS3标记；976-1375bp为ENO2终止子；1376-1381bp为BamHI酶切位点；1382-1668bp为ACT1终止子序列；1669-3177bp为截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1；3178-3845bp为GAL10-GAL1双向启动子序列；3846-5921bp为融合基因BTS1-ERG20；5922-6121bp为FBA1终止子序列；6122-6127bp为PstI酶切位点；6128-6705bp为his3位点下游578bp同源序列。
基因片段5(参见专利CN105420134A中的SEQ ID NO:5)：1-606bp为YPRCdelta15位点上游606bp同源序列；607-2181bp为DR-Kl URA3-DR营养标签序列；2182-2372bp为CPS1终止子序列；2373-3287bp为转录因子INO2序列；3288-3744bp为GAL1启动子序列；3745-4103bp为YPRCdelta15位点下游359bp同源序列。
基因片段6(本发明SEQ ID NO:1所示)：1-256bp为YPRCdelta9位点上游256bp同源序列；257-713bp为GAL1启动子序列；714-1634bp为转录因子INO2序列；1635-1825bp为CPS1终止子序列；1826-3373bp为DR-KlURA3-DR营养标签序列；3374-3640bp为YPRCdelta9位点下游267bp同源序列；
基因片段7(本发明SEQ ID NO:2所示)：1-297bp为YFLWtau1位点上游297bp同源序列；298-1075bp为PGK1启动子序列；1076-1516bp为来源于透明颤菌的基因VHb序列；1517-1803bp为ACT1终止子序列；1804-3351bp为DR-Kl URA3-DR营养标签序列；3352-3559bp为YFLWtau1位点下游208bp同源序列；
DR-Kl URA3-DR营养标签序列中URA3为乳酸克鲁维酵母来源(Kluyveromyceslactis，Kl)。
在知晓上述各基因元件的具体序列后，本领域技术人员可按照常规引物设计原则进行扩增和OE-PCR拼接。同时，本发明所采用的SD培养基是在酵母筛选领域常用的一种培养基，根据酵母具有哪些基因缺陷而在基本培养基的组成上特意删减某一种成分或几种成分来实现筛选出目标菌株。
根据本发明技术方案以及优选方案，本发明以酿酒酵母CEN.PK2-1D为出发菌株，概述重组菌株构建过程：
1).将敲除盒片段1转入CEN.PK2-1D，敲除gal1、gal7、gal10基因，所得菌株命名为SyBE_Sc0014D003；
2).将敲除盒片段2转入SyBE_Sc0014D003，敲除ypl062w基因，所得菌株命名为SyBE_Sc0014D004；
3).将基因片段1转入SyBE_Sc0014D004，所得菌株命名为SyBE_Sc0014D005；
4).将基因片段2转入SyBE_Sc0014D005，所得菌株命名为SyBE_Sc0014D006；
5).将基因片段3转入SyBE_Sc0014D006，所得菌株命名为SyBE_Sc0014D007；
6).将基因片段4转入SyBE_Sc0014D007，所得菌株命名为SyBE_Sc0014D009；
7).将敲除盒片段3转入SyBE_Sc0014D009，敲除rox1基因，所得菌株命名为SyBE_Sc0014D011；
8).将基因片段5转入SyBE_Sc0014D011，所得菌株命名为SyBE_Sc0014D014(中间菌株)；
9).将基因片段6转入SyBE_Sc0014D014，所得菌株命名为SyBE_Sc0014D017；
10).将基因片段7转入SyBE_Sc0014D017，所得菌株命名为SyBE_Sc0014D018；
其中，SyBE_Sc0014D014已于2015年11月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11748。
此外，在本发明所构建的菌株中可在不影响其正常功能的任意位点***一段用于识别该菌株的序列，其作用相当于“水印”或“条形码”，防止构建的重组菌株外泄而无法快捷识别，所述的识别序列可以是当前领域任何适宜的序列，其不会影响菌株正常功能，可用对应的扩增引物扩增后检测到。所述的识别序列具体为：两端为tag序列(扩增引物)，中间为编码C、M、E、P、S、A、H、V、N、W、T、Y、G、I、D中一个或多个氨基酸的核苷酸序列，整体大小为180-220bp，识别序列的***方法采用常规方法即可。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：基因敲除菌株的构建
以酿酒酵母CEN.PK2-1D为出发菌株，构建四基因敲除菌株CEN.PK2-1C△gal1,△gal7,△gal10::DR,△ypl062w::kanMX。具体过程如下：
首先构建△gal1,△gal7,△gal10::DR-Kl URA3-DR敲除盒，即敲除盒片段1，以质粒pWJ1042为模板，设计上、下游引物PCR扩增带基因上、下游40bp同源臂及DR-Kl URA3-DR营养标签的敲除盒片段，利用酵母自身的同源重组机制将该片段通过醋酸锂法酵母转化整合到酵母基因组上，转化后采用SD-URA固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，单缺尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子通过分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株用YPD液体培养基培养后取少许菌液涂布5-氟乳清酸(5-FOA)固体板(DR-KlURA3-DR营养标签两端各有143bp的同向重复序列DR，酵母自身会利用这两段相同的序列发生同源重组而删除URA3基因以及其中一个DR；YPD培养基因为没有氨基酸营养缺陷这种筛选压力，这样自发删除了URA3的酵母菌能够生长。然后用5-FOA进行筛选，因为含有URA3的菌株在URA3基因编码的酶作用下可以使5-FOA变成对细胞有毒性的物质，使酵母细胞在含5-FOA的培养基上不能生长，从而筛选出删除URA基因的菌)，挑取单菌落分纯培养后提取基因组进行PCR验证筛选通过DR序列间自发重组而删除URA3基因的正确菌株，即三基因敲除菌株，命名为SyBE_Sc0014D003。敲除gal1、gal7、gal10的菌株将不会代谢D-半乳糖，从而可以维持胞内诱导物半乳糖浓度恒定，实现高效诱导。
然后，在三基因敲除菌株SyBE_Sc0014D003的基础上构建△ypl062w::kanMX敲除盒，以BY4742单敲库中的单敲菌株YPL062W的基因组为模板，设计上、下游引物PCR扩增带基因YPL062W上、下游同源序列及kanMX抗性标签的敲除盒片段2，将该片段通过酵母转化整合到酵母基因组上，转化后采用含200mg/L G418抗性的YPD固体板筛选四敲菌株(kanMX抗性标签可对遗传霉素G418这种抗生素产生抗性，从而利用G418板筛选出成功敲除了基因ypl062w的菌)，得到的转化子通过分纯培养后提取基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌，并将其命名为SyBE_Sc0014D004。
实施例2：基因片段1的构建
扩增CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、Pa crtB、PGK1终止子并顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含HindIII和XhoI酶切位点的片段TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1；
同时，扩增酵母trp1位点上游同源631bp序列、酵母trp1位点下游同源733bp序列并顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含SacI和ApaI酶切位点，且在酵母trp1位点上、下游同源序列之间包含HindIII和XhoI酶切位点的片段，然后通过SacI和ApaI酶切位点连入载体pRS405，得到TRP1整合质粒pRS405-TRP，将上述得到的片段TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1与pRS405-TRP质粒通过HindIII和XhoI酶切位点进行连接，得到基因片段1整合质粒，记为pRS405-TRP-TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1；
整合质粒转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
验证正确后，分别用SacI和ApaI双酶切位点切割，获得基因片段1，核苷酸序列参见专利CN105420134A中的SEQ ID NO:1所示。
实施例3：基因片段2的构建
将ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、TMcrtE、GPM1终止子顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含BamHI和XhoI酶切位点的片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1；同时，将酵母leu2位点上游同源561bp序列、LEU2标记、TDH2终止子、酵母leu2位点下游同源584bp序列顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含SacI和ApaI酶切位点，且在TDH2终止子、酵母leu2位点下游同源序列之间包含BamHI和XhoI酶切位点的片段，通过SacI和ApaI酶切位点连入载体pRS405，得到LEU2整合质粒pRS405-LEU。将得到的上述片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1和pRS405-LEU质粒通过BamHI和XhoI酶切位点进行连接，得到基因片段2整合质粒，记为pRS405-LEU-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1。
整合质粒转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
验证正确后，分别用SacI和ApaI双酶切位点切割，获得基因片段2，leu2位点上游同源序列-LEU2-TTDH2-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1-leu2位点下游同源序列，核苷酸序列参见专利CN105420134A中的SEQ ID NO:2所示。
实施例4：基因片段3的构建
扩增基因片段2中TDH2终止子及其上游869bp同源序列、ACT1终止子及其下游355bp同源序列，然后将TDH2终止子及其上游同源序列、DR-KlURA3-DR营养标签、CYC1终止子、Bt crtI、GAL7启动子、基因片段2中ACT1终止子及其下游同源序列顺次通过OE-PCR方法拼接起来，获得两端包含PmeI酶切位点的基因片段3，即TDH2终止子及其上游同源序列-DR-KlURA3-DR-TCYC1-Bt crtI-PGAL7-ACT1终止子及其下游同源序列，与平末端载体pJET1.2连接得到基因片段3整合质粒，记为pleu-DR-Kl URA3-DR-TCYC1-BtcrtI-PGAL7。
整合质粒转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
验证正确后，用PmeI酶切位点切割，获得基因片段3，核苷酸序列参见专利CN105420134A中的SEQ ID NO:3所示。
实施例5：基因片段4的构建
将酵母内源FPP合酶基因ERG20和GGPP合酶基因BTS1进行融合表达，通过OE-PCR方法用GGGS linker(GGTGGTGGTTCT)将BTS1的C端与ERG20的N端连接形成融合基因BTS1-ERG20；从实施例4中LEU2整合质粒pRS405-LEU上扩增TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1片段；
将片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1、融合基因BTS1-ERG20、FBA1终止子通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含BamHI和PstI酶切位点的片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1；同时，PCR分别扩增酵母his3位点上游同源312bp序列、HIS3标记、ENO2终止子以及酵母his3位点下游同源578bp序列，并通过OE-PCR方法顺次拼接，得到两端包含SacI和ApaI酶切位点，且在ENO2终止子、酵母his3位点下游同源序列之间包含BamHI和PstI酶切位点的片段，通过SacI和ApaI酶切位点连入载体pRS405，得到HIS3整合质粒pRS405-HIS。将得到的上述片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1和pRS405-HIS质粒通过BamHI和PstI酶切位点进行连接，得到基因片段4整合质粒，记为pRS405-HIS-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1；
整合质粒转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
验证正确后，用SacI和ApaI双酶切切割，获得基因片段4，即his3位点上游同源序列-HIS3-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1-his3位点下游同源序列，核苷酸序列参见专利CN105420134A中的SEQ ID NO:4所示。
实施例6：基因片段5的构建
扩增酵母YPRCdelta15位点上游606bp同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、CPS1终止子、转录因子INO2、GAL1启动子、酿酒酵母YPRCdelta15位点下游359bp同源序列顺次通过OE-PCR方法拼接起来，获得两端包含PmeI酶切位点的基因片段5，即YPRCdelta15位点上游同源序列-DR-KlURA3-DR-TCPS1-INO2-PGAL1-YPRCdelta15位点下游同源序列，将上述得到的片段与平末端载体pJET1.2连接，得到基因片段5整合质粒记为pYPRCdelta15-DR-KlURA3-DR-TCPS1-INO2-PGAL1。
整合质粒转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
验证正确后，用PmeI酶切位点切割，获得基因片段5，核苷酸序列参见专利CN105420134A中的SEQ ID NO:5所示。
实施例7：基因片段6的构建
扩增酵母YNRCdelta9位点上游256bp同源序列、GAL1启动子、转录因子INO2、CPS1终止子、DR-Kl URA3-DR营养标签、酵母YNRCdelta9位点下游267bp同源序列，顺次通过OE-PCR方法拼接起来，获得两端包含PmeI酶切位点的基因片段6，将上述得到的片段与平末端载体pJET1.2连接，得到基因片段6整合质粒记为pYNRCdelta9-PGAL1-INO2-TCPS1-DR-KlURA3-DR；
整合质粒转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
验证正确后，用PmeI酶切位点切割，获得基因片段6，核苷酸序列参见本发明中的SEQ ID NO:1所示。
实施例8：基因片段7的构建
扩增酵母YFLWtau1位点上游297bp同源序列、PGK1启动子、来源于透明颤菌的基因VHb、ACT1终止子、DR-Kl URA3-DR营养标签、酿酒酵母YFLWtau1位点下游208bp同源序列，顺次通过OE-PCR方法拼接起来，获得两端包含PmeI酶切位点的基因片段7，将上述得到的片段与平末端载体pJET1.2连接，得到基因片段7整合质粒记为pYFLWtau1-PPGK1-VHb-TACT1-DR-KlURA3-DR；
整合质粒转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
验证正确后，用PmeI酶切位点切割，获得基因片段7，核苷酸序列参见本发明中的SEQ ID NO:2所示。
实施例9：基因片段1-2整合构建重组酿酒酵母CEN.PK2-1D
基因片段1采用醋酸锂法将片段转化四基因敲除酵母菌株SyBE_Sc0014D004，通过TRP1上、下游同源序列与酵母基因组上trp1位点发生重组而整合到基因组上。转化后采用SD-TRP固体板(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，单缺色氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并分别命名为SyBE_Sc0014D005。
然后，将基因片段2采用醋酸锂法将片段转化酵母菌株SyBE_Sc0014D005，通过LEU2上、下游同源序列与酵母基因组上leu2位点发生重组而整合到基因组上。转化后采用SD-TRP-LEU固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，双缺色氨酸和亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并命名为SyBE_Sc0014D006。
实施例10：基因片段1-3整合构建重组酿酒酵母CEN.PK2-1D
将基因片段3采用醋酸锂法将该片段转化重组酵母菌株SyBE_Sc0014D006，通过TDH2终止子上游同源序列和ACT1终止子下游同源序列发生重组而***到基因组上之前整合的基因片段2的中间。转化后采用SD-URA-TRP-LEU固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株用YPD液体培养基培养后取少许菌液涂布5-氟乳清酸(5-FOA)固体板，挑取单菌落分纯培养后提取基因组进行PCR验证筛选通过DR序列间自发重组而删除URA基因的正确菌株，将正确菌株分别命名为SyBE_Sc0014D007。
实施例11：基因片段1-4整合构建重组酿酒酵母CEN.PK2-1D
将基因片段4采用醋酸锂法将该片段转化重组酵母菌株SyBE_Sc0014D007，通过HIS3上、下游同源序列与酵母基因组上his3位点发生重组而整合到基因组上。转化后酵母采用SD-TRP-LEU-HIS固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、组氨酸和亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并分别命名为SyBE_Sc0014D009。
实施例12：rox1基因的敲除
首先构建△rox1::DR-Kl URA3-DR敲除盒，即敲除盒片段3，以质粒pWJ1042为模板，设计上、下游引物PCR扩增带基因上、下游40bp同源臂及DR-Kl URA3-DR营养标签的敲除盒片段，利用酵母自身的同源重组机制将该片段通过醋酸锂法酵母转化整合到重组酵母菌株SyBE_Sc0014D009上，转化后采用SD-TRP-LEU-HIS-URA固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、色氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子通过分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株用YPD液体培养基培养后取少许菌液涂布5-氟乳清酸(5-FOA)固体板(DR-Kl URA3-DR营养标签两端各有143bp的同向重复序列DR，酵母自身会利用这两段相同的序列发生同源重组而删除URA3基因以及其中一个DR；YPD培养基因为没有氨基酸营养缺陷这种筛选压力，这样自发删除了URA3的酵母菌能够生长。然后用5-FOA进行筛选，因为含有URA3的菌株在URA3基因编码的酶作用下可以使5-FOA变成对细胞有毒性的物质，使酵母细胞在含5-FOA的培养基上不能生长，从而筛选出删除URA基因的菌)，挑取单菌落分纯培养后提取基因组进行PCR验证筛选通过DR序列间自发重组而删除URA3基因的正确菌株，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并分别命名为SyBE_Sc0014D011。
实施例13：基因片段1-5整合构建重组酿酒酵母CEN.PK2-1D
将基因片段5采用醋酸锂法将该片段转化重组酵母菌株SyBE_Sc0014D011，通过YPRCdelta15位点上、下游同源序列与酵母基因组上YPRCdelta15位点发生重组而整合到基因组上。转化后酵母采用SD- TRP-LEU-HIS-URA固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、色氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株用YPD液体培养基培养后取少许菌液涂布5-氟乳清酸(5-FOA)固体板(DR-Kl URA3-DR营养标签两端各有143bp的同向重复序列DR，酵母自身会利用这两段相同的序列发生同源重组而删除URA3基因以及其中一个DR；YPD培养基因为没有氨基酸营养缺陷这种筛选压力，这样自发删除了URA3的酵母菌能够生长。然后用5-FOA进行筛选，因为含有URA3的菌株在URA3基因编码的酶作用下可以使5-FOA变成对细胞有毒性的物质，使酵母细胞在含5-FOA的培养基上不能生长，从而筛选出删除URA基因的菌)，挑取单菌落分纯培养后提取基因组进行PCR验证筛选通过DR序列间自发重组而删除URA3基因的正确菌株，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并分别命名为SyBE_Sc0014D014。
实施例14：基因片段1-6整合构建重组酿酒酵母CEN.PK2-1D
将基因片段6采用醋酸锂法将该片段转化重组酵母菌株SyBE_Sc0014D014，通过YNRCdelta9位点上、下游同源序列与酵母基因组上YPRCdelta15位点发生重组而整合到基因组上。转化后酵母采用SD-TRP-LEU-HIS-URA固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、色氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株用YPD液体培养基培养后取少许菌液涂布5-氟乳清酸(5-FOA)固体板(DR-Kl URA3-DR营养标签两端各有143bp的同向重复序列DR，酵母自身会利用这两段相同的序列发生同源重组而删除URA3基因以及其中一个DR；YPD培养基因为没有氨基酸营养缺陷这种筛选压力，这样自发删除了URA3的酵母菌能够生长。然后用5-FOA进行筛选，因为含有URA3的菌株在URA3基因编码的酶作用下可以使5-FOA变成对细胞有毒性的物质，使酵母细胞在含5-FOA的培养基上不能生长，从而筛选出删除URA基因的菌)，挑取单菌落分纯培养后提取基因组进行PCR验证筛选通过DR序列间自发重组而删除URA3基因的正确菌株，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并分别命名为SyBE_Sc0014D017。
实施例15：基因片段1-7整合构建重组酿酒酵母CEN.PK2-1D
将基因片段7采用醋酸锂法将该片段转化重组酵母菌株SyBE_Sc0014D017，通过YFLWtau1位点上、下游同源序列与酵母基因组上YPRCdelta15位点发生重组而整合到基因组上。转化后酵母采用SD-TRP-LEU-HIS-URA固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、色氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株用YPD液体培养基培养后取少许菌液涂布5-氟乳清酸(5-FOA)固体板(DR-Kl URA3-DR营养标签两端各有143bp的同向重复序列DR，酵母自身会利用这两段相同的序列发生同源重组而删除URA3基因以及其中一个DR；YPD培养基因为没有氨基酸营养缺陷这种筛选压力，这样自发删除了URA3的酵母菌能够生长。然后用5-FOA进行筛选，因为含有URA3的菌株在URA3基因编码的酶作用下可以使5-FOA变成对细胞有毒性的物质，使酵母细胞在含5-FOA的培养基上不能生长，从而筛选出删除URA基因的菌)，挑取单菌落分纯培养后提取基因组进行PCR验证筛选通过DR序列间自发重组而删除URA3基因的正确菌株，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并分别命名为SyBE_Sc0014D018。
实施例16：重组酿酒酵母菌株的摇瓶发酵
菌株：SyBE_Sc0014D0014(现有专利CN105420134A中菌株)、SyBE_Sc0014D017、SyBE_Sc0014D018。
试验方法：
种子培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉、50mg/L尿嘧啶；
发酵培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉、20mg/L尿嘧啶、10g/LD-(+)-半乳糖。
将上述菌株接种于5mL种子培养基中，在30℃、250rpm培养14-16h，以初始菌体浓度OD600＝0.2转接于新鲜的25mL种子培养基中，于30℃、250rpm条件下培养至对数生长中期，以初始菌体浓度OD600＝0.5分别接种于50mL发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下培养，发酵48h时取样监测番茄红素产量。
番茄红素定量方法：取两等份的发酵液，4000g离心2min收集菌体，并水洗两次。将其中一份菌体置于80℃烘干至恒重，称重计算细胞干重；另一份菌体用以产物提取，具体方法为：用3N HCl重悬细胞，置于沸水浴中煮沸2min，然后立即冰浴3min；将破碎的细胞12000rpm、4℃离心4min弃上清，水洗2次后加入丙酮，并涡旋5min；最后离心收集丙酮相，用2μm滤膜过滤后上紫外液相检测，番茄红素检测波长为471nm。结果见图3和图4。
试验结果：由图3和图4可见，在酿酒酵母SyBE_Sc0014D014的基础上继续上调转录激活因子INO2，获得菌株SyBE_Sc0014D017，番茄红素产量从54.62mg/gDCW(318.13mg/L)提高至60.97mg/gDCW(356.22mg/L)。在此基础上引入透明颤菌来源的血红蛋白基因VHb以加强胞内氧气输送，得到菌株SyBE_Sc0014D018，其番茄红素产量显著提高，达到66.14mg/gDCW(376.78mg/L)，这在目前利用重组酿酒酵母生产番茄红素的公开报道中已属最高。
实施例17：重组酿酒酵母菌株的摇瓶发酵
按照本发明实施例1-15的方法重复构建重组酵母菌株，分别命名并按照实施例16方法检测番茄红素产量，结果如下表：
表1重组酵母菌株番茄红素产量
菌株编号(包含片段1-6) 番茄红素产量 菌株编号(包含片段1-7) 番茄红素产量
SyBE_Sc0014D027 60.97mg/gDCW SyBE_Sc0014D028 65.03mg/gDCW
SyBE_Sc0014D037 59.88mg/gDCW SyBE_Sc0014D038 64.98mg/gDCW
SyBE_Sc0014D047 60.04mg/gDCW SyBE_Sc0014D048 64.34mg/gDCW
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津大学
<120> 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用
<130> MP1614119
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3640
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gacattagga cgccagggta gccagtatta ttcaagtcca tagaacagcc tgtatacctt 60
cacttcatta ggtatattct tggttatgcg ttatttaaat cctcatctgc cgctgcttaa 120
aaaaagcagc taaagtgttg cgtaggcact tcgaacaagt agtcagtaat atcacctttt 180
aacatctaat catcaaaaga gacatttttt gggattaatt gtttataaaa gctatgaact 240
taggtctaca gaatgtagta cggattagaa gccgccgagc gggtgacagc cctccgaagg 300
aagactctcc tccgtgcgtc ctcgtcttca ccggtcgcgt tcctgaaacg cagatgtgcc 360
tcgcgccgca ctgctccgaa caataaagat tctacaatac tagcttttat ggttatgaag 420
aggaaaaatt ggcagtaacc tggccccaca aaccttcaaa tgaacgaatc aaattaacaa 480
ccataggatg ataatgcgat tagtttttta gccttatttc tggggtaatt aatcagcgaa 540
gcgatgattt ttgatctatt aacagatata taaatgcaaa aactgcataa ccactttaac 600
taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc aaatgtaata aaagtatcaa 660
caaaaaattg ttaatatacc tctatacttt aacgtcaagg agaaaaaacc ccgtaaacaa 720
tgtcccaagc aactgggaac gaattactgg gtatcctaga tctggataac gatatagact 780
ttgaaactgc ttaccaaatg ctcagcagta acttcgacga ccaaatgtct gcgcacatac 840
atgaaaacac gtttagtgca acttcccctc ctctgttaac acacgagctc ggcataattc 900
ctaacgtagc aaccgtgcaa ccctctcacg tagaaactat acctgccgat aaccaaactc 960
atcatgctcc tttgcatact catgcacact atctaaatca caaccctcat caaccaagca 1020
tgggttttga tcaagcgctt ggtctcaagt tgtctccttc cagttcgggg ttgttgagca 1080
cgaatgaatc gaatgccatt gaacagtttt tagacaatct aatatcacag gatatgatgt 1140
cttccaacgc ttccatgaac tccgaatcac atctacatat aagatcacca aaaaagcagc 1200
ataggtatac cgaattaaat caaagatatc ctgaaacaca tccacacagt aacacagggg 1260
agttacccac aaacacagca gatgtgccaa ctgagttcac cacgagggaa ggacctcatc 1320
agcctatcgg caatgaccac tacaacccgc caccgttttc agtacctgag atacgaatcc 1380
cagactctga tattccagcc aatatcgagg acgaccctgt gaaggtacgg aaatggaaac 1440
acgttcaaat ggagaagata cgaagaataa acaccaaaga agcctttgaa aggctcatta 1500
aatcagtaag gaccccaccg aaggaaaacg ggaaaagaat tcccaagcat attcttttaa 1560
cttgtgtaat gaacgatatc aagtccatta gaagcgcaaa tgaagcacta cagcacatac 1620
tggatgattc ctgagcgcaa tgattgaata gtcaaagatt tttttttttt aatttttttt 1680
ttttaatttt tttttttttt catagaactt tttatttaaa taaatcacgt ctatatatgt 1740
atcagtataa cgtaaaaaaa aaaacaccgt cagttaaaca aaacataaat aaaaaaaaaa 1800
agaagtgtca aatcaagtgt caaatgtgat tctgggtaga agatcggtct gcattggatg 1860
gtgtaacgca tttttttaca cacattactt gcctcgagca tcaaatggtg gttattcgtg 1920
gatctatatc acgtgatttg cttaagaatt gtcgttcatg gtgacacttt tagctttgac 1980
atgattaagt catctcaatt gatgttatct aaagtcattt caactatcta agatgtggtt 2040
gtgattgggc cattttgtga aagccagtac gccagcgtca atacactccc gtcaattagt 2100
tgcaccatgt ccacaaaatc atataccagt agagctgaga ctcatgcaag tccggttgca 2160
tcgaaacttt tacgttaatg gatgaaaaga agaccaattt gtgtgcttct cttgacgttc 2220
gttcgactga tgagctattg aaacttgttg aaacgttggg tccatacatt tgccttttga 2280
aaacacacgt tgatatcttg gagatttcag ttatgagggt actgtcgttc cattgaaagc 2340
attggcagag aaatacaagt tcttgatatt tgaggacaga aaattcgccg atatcggtaa 2400
cacagtcaaa ttacaatata catcgggcgt taccgtatcg cagaatggtc tgatatcacc 2460
aacgcccacg gggttactgg tgctggtatt gttgctggct tgaaacaagg tgcgcaagag 2520
gtcaccaaag aaccaagggg attattgatg cttgctaatt gtcttccaag ggttctctag 2580
cacacggtga atatactaag ggtaccgttg atattgcaaa gagtgataaa gatttcgtta 2640
ttgggttcat tgctcagaac gatatgggag gaagagaaga aggtttgatt ggctaatcat 2700
gaccccaggt gtaggtttag acgacaaagg cgatgcattg ggtcagcagt acagaaccgt 2760
cgacgaagtt gtaagtggtg gatcagatat catcattgtt ggcagaggac tttcgccaag 2820
ggtagagatc ctaaggttga aggtgaaaga tacagaaatg ctggatggga agcgtaccaa 2880
aagagaatca gcgctcccca ttaattatac aggaaactta atagaacaaa tcacatatta 2940
atctaatagc cacctgcatt ggcacggtgc aacactactt caacttcatc ttacaaaaag 3000
atcacgtgat ctgttgtatt gaactgaaaa ttttttgttt gcttctctct ctctctcttt 3060
catttgtgag atttaaaaac cagaaactac atcatcgaat tccagctgac caccatgagc 3120
cgaattccag cacactggcg gccgttacta gtggatccga gctcggtacc aagctgggct 3180
gcaggaattc gtatcaagct tatcgatgtg attctgggta gaagatcggt ctgcattgga 3240
tggtggtaac gcattttttt acacacatta cttgcctcga gcatcaaatg gtggttattc 3300
gtggatctat atcacgtgtt tgcttaagaa ttgtcgttca tggtgacacg ggcccggtac 3360
ccaattcgcc ctaacaagta gtatgagtac acaccaatag atgattaatt ttttccgaca 3420
atcaaatatt gggatcataa acacacataa tcgccatatc cgttaattcg ggtttcaatc 3480
acttcgtttg tctatcgtat cgcagcctag tgaatattta attctttcaa taaaaaaggc 3540
ttaaaatcac catgaaaatc acaagaggaa tctttcaaca agaacaatag tatacaatcc 3600
atgaatgaag gagttcatat ttgactagaa ctatacaaag 3640
<210> 2
<211> 3559
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaagacgtat agtccaaagc aatattcaag gaaactacaa agtgagatta gctacgtaga 60
aataggagaa aaagtataaa tttaaagtta aattcagatc tcaaattctc ttaatatttg 120
aaataaatcc gctgcgtgac aaatcccgtg atgatctcgg aatatttata tgttaccatt 180
tatacttatg gtagaattat actcactaat gaatgtacgg ttactatttg gaacaagtgg 240
tcatcaattg ccatagtaac attttgaatg cttgcatcgt gcatgaatac ataccgctat 300
tttagattcc tgacttcaac tcaagacgca cagatattat aacatctgca taataggcat 360
ttgcaagaat tactcgtgag taaggaaaga gtgaggaact atcgcatacc tgcatttaaa 420
gatgccgatt tgggcgcgaa tcctttattt tggcttcacc ctcatactat tatcagggcc 480
agaaaaagga agtgtttccc tccttcttga attgatgtta ccctcataaa gcacgtggcc 540
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aaaacccaga cacgctcgac ttcctgtctt cctattgatt gcagcttcca atttcgtcac 660
acaacaaggt cctagcgacg gctcacaggt tttgtaacaa gcaatcgaag gttctggaat 720
ggcgggaaag ggtttagtac cacatgctat gatgcccact gtgatctcca gagcaaagtt 780
cgttcgatcg tactgttact ctctctcttt caaacagaat tgtccgaatc gtgtgacaac 840
aacagcctgt tctcacacac tcttttcttc taaccaaggg ggtggtttag tttagtagaa 900
cctcgtgaaa cttacattta catatatata aacttgcata aattggtcaa tgcaagaaat 960
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gttgggtgct attaaagaag ttttgggtga cgctgcaaca gatgatattt tagatgcttg 1440
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taagaattgt cgttcatggt gacactttta gctttgacat gattaagtca tctcaattga 1980
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ctggtattgt tgctggcttg aaacaaggtg cgcaagaggt caccaaagaa ccaaggggat 2520
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taccgttgat attgcaaaga gtgataaaga tttcgttatt gggttcattg ctcagaacga 2640
tatgggagga agagaagaag gtttgattgg ctaatcatga ccccaggtgt aggtttagac 2700
gacaaaggcg atgcattggg tcagcagtac agaaccgtcg acgaagttgt aagtggtgga 2760
tcagatatca tcattgttgg cagaggactt tcgccaaggg tagagatcct aaggttgaag 2820
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cacggtgcaa cactacttca acttcatctt acaaaaagat cacgtgatct gttgtattga 3000
actgaaaatt ttttgtttgc ttctctctct ctctctttca tttgtgagat ttaaaaacca 3060
gaaactacat catcgaattc cagctgacca ccatgagccg aattccagca cactggcggc 3120
cgttactagt ggatccgagc tcggtaccaa gctgggctgc aggaattcgt atcaagctta 3180
tcgatgtgat tctgggtaga agatcggtct gcattggatg gtggtaacgc atttttttac 3240
acacattact tgcctcgagc atcaaatggt ggttattcgt ggatctatat cacgtgtttg 3300
cttaagaatt gtcgttcatg gtgacacggg cccggtaccc aattcgccct atcagcgtgt 3360
gttttatact tctcttatat agtataagaa gatccatatt taatcttcat taacactact 3420
tcttaacctc taattaccaa cgggtcaatg ttaggataat tgttggcatt ccattgttat 3480
taaagggaat caaagtatat taaaaattct tcccaaggat gtaataacct aaaaaaggaa 3540
gcccatattt ctatataat 3559

Claims (20)

1.一种重组酵母菌株，其特征在于，所述酵母基因组敲除gal1、gal7、gal10、ypl062w、rox1基因，且包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：
酵母trp1位点上游同源序列、CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、PacrtB、PGK1终止子、酵母trp1位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段1；
酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、TDH2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、Tm crtE、GPM1终止子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段2；
基因片段2中TDH2终止子及其上游同源序列、DR-KlURA3-DR营养标签、CYC1终止子、BtcrtI、GAL7启动子、基因片段2中ACT1终止子及其下游同源序列顺次拼接而成的基因片段3；
酵母his3位点上游同源序列、HIS3标记、ENO2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、融合基因BTS1-ERG20、FBA1终止子、酵母his3位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段4；
酵母YPRCdelta15位点上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、CPS1终止子、转录因子INO2、GAL1启动子、酿酒酵母YPRCdelta15位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段5；
酵母YNRCdelta9位点上游同源序列、GAL1启动子、转录因子INO2、CPS1终止子、DR-KlURA3-DR营养标签、酵母YNRCdelta9位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段6；
其中，在酵母基因组敲除gal1、gal7、gal10、ypl062w、rox1基因并同源重组基因片段1-5后，获得中间菌株，所述重组酵母菌株在中间菌株基础上经自身同源重组整合基因片段6后获得。
2.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述基因片段6如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述中间菌株为保藏编号CGMCC No.11748的菌株。
4.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述酵母为酿酒酵母、解脂属酵母或克鲁维属酵母。
5.根据权利要求4所述菌株，其特征在于，所述酿酒酵母为CEN.PK系列酿酒酵母或BY系列酿酒酵母。
6.根据权利要求5所述菌株，其特征在于，所述CEN.PK系列酿酒酵母为酿酒酵母CEN.PK2-1D。
7.根据权利要求1-6任意一项所述菌株，其特征在于，还包括经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：
酵母YFLWtau1位点上游同源序列、PGK1启动子、来源于透明颤菌的基因VHb、ACT1终止子、DR-KlURA3-DR营养标签、酿酒酵母YFLWtau1位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段7。
8.根据权利要求7所述菌株，其特征在于，所述基因片段7如SEQ ID NO:2所示。
9.根据权利要求8所述菌株，其特征在于，所述菌株为保藏编号为CGMCC No.13013的菌株。
10.根据权利要求1-9任意一项所述菌株，其特征在于，还包括识别序列，该识别序列两端为tag序列，中间为编码C、M、E、P、S、A、H、V、N、W、T、Y、G、I、D中一个或多个氨基酸的核苷酸序列，整体大小为180-220bp。
11.权利要求1-10任意一项所述菌株在生产番茄红素中的应用以及在生产以番茄红素为中间产物的产品中的应用。
12.权利要求1所述重组酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括：
步骤1、构建由酵母gal7基因下游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、gal1基因下游同源序列顺次连接的敲除盒片段1、由ypl062w基因上游同源序列、kanMX抗性标签、ypl062w基因下游同源序列顺次连接的敲除盒片段2，以及构建由酵母rox1基因上游同源序列、DR-KlURA3-DR营养标签、rox1基因下游同源序列顺次连接的敲除盒片段3，利用敲除盒片段1-3通过酵母自身同源重组敲除酵母gal1、gal7、gal10、ypl062w和rox1基因，获得基因敲除酵母，备用；
将酵母trp1位点上游同源序列、CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、PacrtB、PGK1终止子、酵母trp1位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段1，即trp1位点上游同源序列-TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1-trp1位点下游同源序列，备用；
将酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、TDH2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、Tm crtE、GPM1终止子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段2，即leu2位点上游同源序列-LEU2-TTDH2-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1-leu2位点下游同源序列，备用；
将基因片段2中TDH2终止子及其上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、CYC1终止子、Bt crtI、GAL7启动子、基因片段2中ACT1终止子及其下游同源序列顺次拼接，获得基因片段3，即TDH2终止子及其上游同源序列-DR-Kl URA3-DR-TCYC1-Bt crtI-PGAL7-TACT1-ACT1终止子及其下游同源序列，备用；
将酵母内源FPP合酶基因ERG20和GGPP合酶基因BTS1进行连接，获得融合基因BTS1-ERG20，然后将酵母his3位点上游同源序列、HIS3标记、ENO2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、融合基因BTS1-ERG20、FBA1终止子、酵母his3位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段4，即his3位点上游同源序列-HIS3-TENO2-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1-his3位点下游同源序列，备用；
将酵母YPRCdelta15位点上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、CPS1终止子、转录因子INO2、GAL1启动子、酿酒酵母YPRCdelta15位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段5，即YPRCdelta15位点上游同源序列-DR-Kl URA3-DR-TCPS1-INO2-PGAL1-YPRCdelta15位点下游同源序列，备用；
将酵母YNRCdelta9位点上游同源序列、GAL1启动子、转录因子INO2、CPS1终止子、DR-KlURA3-DR营养标签、酵母YNRCdelta9位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段6，即YNRCdelta9位点上游同源序列-PGAL1-INO2-TCPS1-DR-Kl URA3-DR-YNRCdelta9位点下游同源序列，备用；
步骤2、将基因片段1通过醋酸锂法转入所述基因敲除酵母中，通过基因片段1中trp1位点上、下游同源序列与基因敲除酵母基因组上trp1位点发生重组而整合到基因组上；
将基因片段2通过醋酸锂法转入所述基因敲除酵母中，通过基因片段2中leu2位点上、下游同源序列与基因敲除酵母基因组上leu2位点发生重组而整合到基因组上；
将基因片段3继续通过醋酸锂法转化到已转入基因片段2的基因敲除酵母中，通过基因片段3中TDH2终止子及其上游同源序列、ACT1终止子及其下游同源序列，与已整合的基因片段2上的TDH2终止子和ACT1终止子位点发生重组而***到已整合基因片段2的基因敲除酵母基因组上；
将基因片段4通过醋酸锂法转入所述基因敲除酵母中，通过基因片段4中his3位点上、下游同源序列与基因敲除酵母基因组上his3位点发生重组而整合到基因组上；
将基因片段5通过醋酸锂法转化到基因敲除酵母中，通过基因片段5中YPRCdelta15位点上、下游同源序列与基因敲除酵母基因组上YPRCdelta15位点发生重组而整合到基因组上；
将基因片段1-5通过醋酸锂法转化到基因敲除酵母中后获得中间菌株；
将基因片段6通过醋酸锂法转化到中间菌株中，通过基因片段6中YNRCdelta9位点上、下游同源序列与中间菌株基因组上YNRCdelta9位点发生重组而整合到基因组上，获得重组酵母菌株。
13.根据权利要求12所述构建方法，其特征在于，还包括：构建基因片段7，并将基因片段7转入获得重组酵母菌株；
具体为，将酵母YFLWtau1位点上游同源序列、PGK1启动子、来源于透明颤菌的基因VHb、ACT1终止子、DR-Kl URA3-DR营养标签、酿酒酵母YFLWtau1位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段7，即YFLWtau1位点上游同源序列-PPGK1-VHb-TACT1-DR-Kl URA3-DR-YFLWtau1位点下游同源序列；
将基因片段7通过醋酸锂法转化到已转入基因片段1-6或已转入基因片段1-5的基因敲除酵母中，通过基因片段7中YFLWtau1位点上、下游同源序列与基因敲除酵母基因组上YFLWtau1位点发生重组而整合到基因组上。
14.根据权利要求13所述构建方法，其特征在于，所述基因片段7具体构建方法如下：
扩增酵母YFLWtau1位点上游297bp同源序列、PGK1启动子、来源于透明颤菌的基因VHb、ACT1终止子、DR-Kl URA3-DR营养标签、酿酒酵母YFLWtau1位点下游208bp同源序列，顺次通过OE-PCR方法拼接起来，获得两端包含PmeI酶切位点的基因片段7，将上述得到的片段与平末端载体pJET1.2连接，得到基因片段7整合质粒记为pYFLWtau1-PPGK1-VHb-TACT1-DR-KlURA3-DR，PmeI酶切获得基因片段7，即YFLWtau1位点上游同源序列-PPGK1-VHb-TACT1-DR-KlURA3-DR-YFLWtau1位点下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
15.根据权利要求12所述构建方法，其特征在于，所述基因片段6具体构建方法如下：
扩增酵母YNRCdelta9位点上游256bp同源序列、GAL1启动子、转录因子INO2、CPS1终止子、DR-Kl URA3-DR营养标签、酵母YNRCdelta9位点下游267bp同源序列，顺次通过OE-PCR方法拼接起来，获得两端包含PmeI酶切位点的基因片段6，将上述得到的片段与平末端载体pJET1.2连接，得到基因片段6整合质粒记为pYNRCdelta9-PGAL1-INO2-TCPS1-DR-Kl URA3-DR，PmeI酶切获得基因片段6，即YNRCdelta9位点上游同源序列-PGAL1-INO2-TCPS1-DR-Kl URA3-DR-YNRCdelta9位点下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
16.一种生产番茄红素的方法，其特征在于，将权利要求1-8任意一项所述菌株经种子培养基培养活化后接种于发酵培养基中发酵培养，发酵培养后收集菌体细胞提取番茄红素。
17.根据权利要求16所述方法，其特征在于，将权利要求1-8任意一项所述菌株接种于5mL种子培养基中培养后，以初始菌体浓度OD600＝0.2转接于新鲜的25mL种子培养基培养至对数生长中期，以初始菌体浓度OD600＝0.5接种于50mL发酵培养基中培养，发酵培养后收集菌体细胞提取番茄红素。
18.根据权利要求16或17所述方法，其特征在于，所述种子培养基为20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，50mg/L尿嘧啶，其余为水。
19.根据权利要求16或17所述方法，其特征在于，所述发酵培养基为20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，20mg/L尿嘧啶，10g/L D-(+)-半乳糖，其余为水。
20.根据权利要求16或17所述方法，其特征在于，所述培养为在30℃、250rpm条件下培养。
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