实施例3催化剂在生产L-薄荷醇-α-糖苷中的应用
一、催化剂的活性检测
将实施例2方法制备的湿菌体细胞0.5g重新悬浮于10mL的pH8.0硼酸缓冲液(10mmol/L H3BO3-KCl缓冲液)中;加入终浓度5g/L的L-薄荷醇和40g/L的麦芽糖,在40℃、150rpm条件下水浴摇床催化30min和2h,反应液用于HPLC分析。
30min的底物转化率分析:L-薄荷醇添加5g/L,经过30min的转化反应,HPLC分析测得残留的底物为L-薄荷醇浓度为1.0g/L,形成的产物L-薄荷醇-α-糖苷浓度为8.2g/L,底物转化率在80%以上。
2h的底物转化率分析:L-薄荷醇添加5g/L,经过2h的转化反应,HPLC分析测得残留的底物为L-薄荷醇浓度为0.01g/L,形成的产物L-薄荷醇-α-糖苷浓度为10.0g/L,底物转化率在99.9%以上。
液相色谱检测条件。
1)样品前处理:将10mL反应液全部转移至50mL离心管,加23mL甲醇至原先的锥形瓶,充分振荡后倒入之前的离心管;8000rpm离心5min;取2mL上清12000rpm离心5min;用0.22μm滤膜过滤,将滤液加入液相样品瓶中。
2)色谱柱:Cl8柱,250×4.6mm;柱温:30℃;流动相:CH3OH(甲醇):H2O:C2HF3O2(三氟乙酸)=70:30:0.01(体积比);流速:1.0mL·min-1;检测器:视差折光检测器;进样量:10μL。底物L-薄荷醇的出峰时间一般为8.5-9.0min,产物L-薄荷醇-α-糖苷的出峰时间为14.5-15.5min。
二、2L发酵罐中的催化剂制备及其在1L体系底物添加量50g/L的催化转化应用
(1)菌种活化
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)IFE-agl538在含有50mg/L卡那霉素的种子培养基中,37℃、200rpm培养至对数生长中期,获得种子液。
(2)2L发酵罐中的菌剂制备
将新鲜培养的种子液按照体积浓度5%的接种量,接种到1.5L的含质量浓度0.05%消泡剂和50mg/L卡那霉素的发酵培养基中,37℃培养4h;加入终浓度为10g/L的α-乳糖,控制发酵温度25℃,继续发酵18h,得到用于生产L-薄荷醇-α-糖苷的大肠杆菌(Escherichia coli)IFE-agl538发酵液,湿菌体含量为30g/L。
(3)发酵转化
取步骤(2)制备的1L发酵液,用2mol/L NaOH调节pH8.0,直接用于催化反应。加入400g麦芽糖和终浓度50g/L的L-薄荷醇,放在40℃水浴锅上,安装全自动机械搅拌器,进行催化反应,连续反应10h。
(4)L-薄荷醇-α-糖苷产物浓度检测
向1L的转化反应液中加入2.3L甲醇,充分搅拌后,过滤,收集滤液;将滤渣重新导入烧杯中,加入0.7L的甲醇水溶液(甲醇:水=7:3),充分搅拌后过滤,收集滤液;混合两次过滤的滤液,取2ml滤液,12000×g离心5min,用0.22μm滤膜过滤,将滤液加入液相样品瓶中。
色谱柱:Cl8柱,250×4.6mm;柱温:30℃;流动相:CH3OH(甲醇):H2O:C2HF3O2(三氟乙酸)=70:30:0.01(体积比);流速:1.0mL·min-1;检测器:视差折光检测器;进样量:10μL。底物L-薄荷醇的出峰时间一般为8.5-9.0min,产物L-薄荷醇-α-糖苷的出峰时间为14.5-15.5min。
底物转化率和产物生产量的HPLC分析结果:一次投料50g/L的L-薄荷醇底物,经过10h的转化,测得残留的底物L-薄荷醇浓度为0.5g/L,形成的产物L-薄荷醇-α-糖苷浓度约为100g/L,底物转化率为99%。
三、L-薄荷醇添加量100g/L的1L体系的催化转化应用
1L发酵液中的底物L-薄荷醇添加量为100g/L的催化转化。取1L大肠埃希氏菌(Escherichia coli)IFE-agl538发酵液(同步骤二(2)),用2mol/L NaOH调节pH8.0。加入400g麦芽糖和100g的L-薄荷醇,放在40℃水浴锅上,安装全自动机械搅拌器,进行催化反应,连续反应10h;补加100g麦芽糖,继续反应14h。
L-薄荷醇-α-糖苷产物浓度检测。
样品前处理:向1L的转化反应液中加入2.3L甲醇,充分搅拌后,过滤,收集滤液;将滤渣重新导入烧杯中,加入2.7L的甲醇水溶液(甲醇:水=7:3),充分搅拌后过滤,收集滤液;混合两次过滤的滤液,取2ml滤液,12000×g离心5min,用0.22μm滤膜过滤,将滤液加入液相样品瓶中。
色谱柱:Cl8柱,250×4.6mm;柱温:30℃;流动相:CH3OH(甲醇):H2O:C2HF3O2(三氟乙酸)=70:30:0.01(体积比);流速:1.0mL·min-1;检测器:视差折光检测器;进样量:10μL。底物L-薄荷醇的出峰时间一般为8.5-9.0min,产物L-薄荷醇-α-糖苷的出峰时间为14.5-15.5min。
底物转化率和产物生产量的HPLC分析结果:一次投料100g/L的L-薄荷醇底物,补加一次麦芽糖,经过24h的转化,测得残留的底物L-薄荷醇浓度为5.0g/L,形成的产物L-薄荷醇-α-糖苷浓度为196g/L,底物转化率为95%。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工业大学
<120> 一种含α-葡萄糖苷酶基因的重组大肠杆菌及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1617
<212> DNA
<213> Xanthomonas campestris
<400> 1
atgtcgcaga caccatggtg gcgcggggcc gtcatttatc agatttatcc gcgtagtttt 60
ctggattcca atggcgatgg cgtaggcgat ctgccgggca tcattgccaa gctcgactac 120
atcgccgggc tgggagtaga tgcgatctgg atttcgcctt ttttcaagtc gccgatggcc 180
gatttcggct atgacatcgc agactatcgc gcggtggacc cgttgttcgg gtcgttggtc 240
gatttcgatc gcttgctcga aaaggcacat ggccttgggt tgaaagtgat gatcgatcag 300
gtactgagcc attcctcgat cgcgcatgtg tggtttcagg agagccgaca ggaccggagc 360
aacccgaagg ctgattggta cgtgtgggcc gatccgcgcg aggatggaac gccgccgaac 420
aactggctgt cgttgtttgg tggggtcgca tggcagtggg agccgcggcg tgagcagtac 480
tacctgcaca actttctggt ggaccagccc gatctcaatt tccacaacgc cgaggtgcag 540
caggcaacgc tcgataacgt gcggttctgg ctcgatcgcg gtgtggatgg gttccgcctg 600
gatgcgatca acttctgctt tcacgacgcg cagctgcgcg ataacccggc caagccggca 660
gacaagcggg tggggcgcgg ctttagcgcg gacaatccgt atgcctacca gtaccactac 720
ttcaacaaca cgcagccgga aaatttgccg tttctggagc ggctgcgcgg gctgttggac 780
agctacccgg gtgcggtgag tctgggcgag atttcgtcgg aagattcgct ggcgaccacc 840
gccgaataca ccgccaaggg ccgcttacat atgggctaca gcttcgagct gctggtgcag 900
gattacagcg ctgcctacat ccgcgacacc gtaagccggc tcgaggccac catgttggag 960
ggctggccat gctgggccat ttccaatcac gacgtagtgc gcgcggtaac gcgctggggt 1020
ggggcgcatg cgacgccggc gttcgcgcgg atggtggtgg cgctgctgtg ttcgttgcgt 1080
ggctcgattt gcttgtatca gggcgaagag ctcgggctca gtgaggcaga ggtggcgttc 1140
gaggacctgc aggatccgta tgggattacc ttctggccga ccttcaaggg ccgggatggc 1200
tgccgtacgc cgatgccgtg gaccgacgcg ccatctgccg gattcaccag cggcaagcct 1260
tggctgccgt tagctgcgtc gcatcgtgcc gctgctgtga gcgtgcaaca agacgatgcg 1320
cattccgtgt tgagtgcagt acgggatttt ctagcttggc gcaaagagat gccggcgctg 1380
cgtgagggat ccatcgcttt ctacgacacg gccgaaccgg tgctgatgtt ccgccgcgaa 1440
cacgccggcc aggttgtgct gttggcattc aatctgtccg ccgatcctgc cgacctggct 1500
ttgcctgcag gcgagtggga gcaggtcgat gtacctggtg tcgagcttgg ggcgatggat 1560
ggcggacacc taaggctggc cgggcatgcg gtcgttgctg ctgtcggtcg tggctga 1617
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<211> 538
<212> PRT
<213> Xanthomonas campestris
<400> 2
Met Ser Gln Thr Pro Trp Trp Arg Gly Ala Val Ile Tyr Gln Ile Tyr
1 5 10 15
Pro Arg Ser Phe Leu Asp Ser Asn Gly Asp Gly Val Gly Asp Leu Pro
20 25 30
Gly Ile Ile Ala Lys Leu Asp Tyr Ile Ala Gly Leu Gly Val Asp Ala
35 40 45
Ile Trp Ile Ser Pro Phe Phe Lys Ser Pro Met Ala Asp Phe Gly Tyr
50 55 60
Asp Ile Ala Asp Tyr Arg Ala Val Asp Pro Leu Phe Gly Ser Leu Val
65 70 75 80
Asp Phe Asp Arg Leu Leu Glu Lys Ala His Gly Leu Gly Leu Lys Val
85 90 95
Met Ile Asp Gln Val Leu Ser His Ser Ser Ile Ala His Val Trp Phe
100 105 110
Gln Glu Ser Arg Gln Asp Arg Ser Asn Pro Lys Ala Asp Trp Tyr Val
115 120 125
Trp Ala Asp Pro Arg Glu Asp Gly Thr Pro Pro Asn Asn Trp Leu Ser
130 135 140
Leu Phe Gly Gly Val Ala Trp Gln Trp Glu Pro Arg Arg Glu Gln Tyr
145 150 155 160
Tyr Leu His Asn Phe Leu Val Asp Gln Pro Asp Leu Asn Phe His Asn
165 170 175
Ala Glu Val Gln Gln Ala Thr Leu Asp Asn Val Arg Phe Trp Leu Asp
180 185 190
Arg Gly Val Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Ile Asn Phe Cys Phe His
195 200 205
Asp Ala Gln Leu Arg Asp Asn Pro Ala Lys Pro Ala Asp Lys Arg Val
210 215 220
Gly Arg Gly Phe Ser Ala Asp Asn Pro Tyr Ala Tyr Gln Tyr His Tyr
225 230 235 240
Phe Asn Asn Thr Gln Pro Glu Asn Leu Pro Phe Leu Glu Arg Leu Arg
245 250 255
Gly Leu Leu Asp Ser Tyr Pro Gly Ala Val Ser Leu Gly Glu Ile Ser
260 265 270
Ser Glu Asp Ser Leu Ala Thr Thr Ala Glu Tyr Thr Ala Lys Gly Arg
275 280 285
Leu His Met Gly Tyr Ser Phe Glu Leu Leu Val Gln Asp Tyr Ser Ala
290 295 300
Ala Tyr Ile Arg Asp Thr Val Ser Arg Leu Glu Ala Thr Met Leu Glu
305 310 315 320
Gly Trp Pro Cys Trp Ala Ile Ser Asn His Asp Val Val Arg Ala Val
325 330 335
Thr Arg Trp Gly Gly Ala His Ala Thr Pro Ala Phe Ala Arg Met Val
340 345 350
Val Ala Leu Leu Cys Ser Leu Arg Gly Ser Ile Cys Leu Tyr Gln Gly
355 360 365
Glu Glu Leu Gly Leu Ser Glu Ala Glu Val Ala Phe Glu Asp Leu Gln
370 375 380
Asp Pro Tyr Gly Ile Thr Phe Trp Pro Thr Phe Lys Gly Arg Asp Gly
385 390 395 400
Cys Arg Thr Pro Met Pro Trp Thr Asp Ala Pro Ser Ala Gly Phe Thr
405 410 415
Ser Gly Lys Pro Trp Leu Pro Leu Ala Ala Ser His Arg Ala Ala Ala
420 425 430
Val Ser Val Gln Gln Asp Asp Ala His Ser Val Leu Ser Ala Val Arg
435 440 445
Asp Phe Leu Ala Trp Arg Lys Glu Met Pro Ala Leu Arg Glu Gly Ser
450 455 460
Ile Ala Phe Tyr Asp Thr Ala Glu Pro Val Leu Met Phe Arg Arg Glu
465 470 475 480
His Ala Gly Gln Val Val Leu Leu Ala Phe Asn Leu Ser Ala Asp Pro
485 490 495
Ala Asp Leu Ala Leu Pro Ala Gly Glu Trp Glu Gln Val Asp Val Pro
500 505 510
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515 520 525
His Ala Val Val Ala Ala Val Gly Arg Gly
530 535
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<211> 1364
<212> DNA
<213> Xanthomonas campestris
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aataagcacc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat acgaagggtg caagcgttac 480
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agtcggaatc gctagtaatc gcagatcagc attgctgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1320
gtacacaccg cccgtcacac catgggagtt tgttgcacca gaag 1364