CN110628654A - 一种可用于饲料的酿酒酵母及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及饲料制备领域，具体涉及一种可用于饲料的酿酒酵母及其制备方法与应用。所述酿酒酵母的细胞膜完整，细胞壁部分破坏。制备方法包括：在酿酒酵母发酵结束后，以发酵液总体积为基准，加入0.01‑1％的酶制剂，作用1‑8h；所述酶制剂为选自β‑1,3‑葡聚糖酶，β‑1,6‑葡聚糖酶，β‑1,4‑葡聚糖酶，α‑1,6糖苷酶，纤维素酶，碱性蛋白酶，几丁质酶，蜗牛酶中的一种或其混合物。本发明提供了一种可用于饲料的“半破壁”的酿酒酵母，并针对酿酒酵母提供了一种特定的酶解破壁的方法，可以有效防止胞内有效物质的破坏，同时菌体进入动物体内后有效成分能够从开孔处释出，有利于动物的快速吸收。

Description

一种可用于饲料的酿酒酵母及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及饲料制备领域，具体涉及一种可用于饲料的酿酒酵母及其制备方法与应用。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是单细胞微生物，属于真菌类，耐酸性强，是兼性厌氧菌。活性干酵母、酵母培养物、酵母提取物、酵母细胞壁等都是我国农业部《饲料添加剂品种目录》(2008)所允许使用的饲料添加剂。酵母类产品能有效改善畜禽消化道菌群平衡、增强机体免疫力、提供丰富的营养物质，从而达到防治消化道疾病和促进生长等多重作用，具有无毒、无副作用、无污染、不产生抗药性等特点，是一种绿色的饲料添加剂，在饲料工业中有广泛的研究和应用。

本领域存在很多将同源或者异源基因转入酿酒酵母以使其可以发酵产生所需成分的研究，如通过重组酿酒酵母菌株，使其产生类胡萝卜素，再将其加入饲料中，能够提高动物免疫功能，保护动物有效预防和抑制疾病的发生，替代或减少抗生素的使用量，减少由于饲料安全问题而带来的食品安全等一系列问题。

但在我们的研究中发现，重组酿酒酵母干菌体不经任何处理做成饲料时，由于酵母的细胞壁厚实，所需的有效成分在动物(例如鸡、鸭)体内难以释出，导致动物吸收效率低。但采用传统方法将其破壁并制备成饲料时，由于大多数所需的有效成分都不稳定或极易被氧化，而破壁后的干菌体中活性物质已经暴露在环境中，在饲料制作过程和存储运输过程中条件比较粗放，将导致其大量被氧化破坏或变质，不仅造成成本损失，而且给饲料安全也带来了隐患。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提出了一种可以提高所需成分的稳定性，同时有利于动物吸收的酿酒酵母及其制备方法与应用。

为了实现上述技术目的，本发明首先提供一种可用于饲料的酿酒酵母，所述酿酒酵母的细胞膜完整，细胞壁部分破坏。

当酿酒酵母的菌体处于上述状态时，能够有效防止内含的有效成分被氧化，同时作为饲料，菌体进入动物体内后，在消化环境中，细胞膜可以溶解，使有效成分顺利释出，有利于动物的快速吸收。

本发明进一步提供一种可用于饲料的酿酒酵母的制备方法，可用于制备上述酿酒酵母，其制备方法包括：在酿酒酵母发酵结束后，以发酵液总体积为基准，加入0.01-1％的酶制剂，作用1-8h；

优选所述酶制剂为选自β-1,3-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶，β-1,4-葡聚糖酶，α-1,6糖苷酶，纤维素酶，碱性蛋白酶，几丁质酶，蜗牛酶中的一种或其混合物。

本发明发现，采用酶解破壁的方法，通过选用上述特定酶，并进一步控制酶的添加量(相当于控制反应时酶的浓度)及处理时间，可以控制酿酒酵母细胞壁的溶解程度，达到细胞壁只是被部分破坏甚至产生多个开孔，但仍能保留完整或大部分完整的细胞结构的效果。

作为优选，所述酿酒酵母在发酵液中的浓度为60g/L～120g/L。

作为优选，通过转入所需的基因片段，使酿酒酵母产生所需成分。

在一些方案中，通过同源重组的方法转入所需的基因片段，使酿酒酵母产生所需成分。

作为优选，所述的所需成分为类胡萝卜素；进一步优选为番茄红素或β-胡萝卜素。

类胡萝卜素尤其是番茄红素、β-胡萝卜素作为动物饲料，能够对畜禽具有防治、抑制癌症的作用。且钾、镁、钙、锌离子对类胡萝卜素的影响不大，这样番茄红素与常用的饲料添加剂不产生拮抗作用。目前在禽蛋的领域中，消费者及生产者更青睐与蛋黄颜色更“红”的品质，尤其是在鸭蛋的领域，但之前的着色剂多为化学合成色素，屡被曝出安全问题，而类胡萝卜素作为天然色素，色泽丰满自然，在饲料中添加类胡萝卜素对改善肉类色泽有一定的应用空间，这样可以减低使用化学合成色素带来的危害。基于此情况，其在饲料中具有很大的需求与应用，但其稳定性较差，氧、光、金属离子pH等因素都会对其造成影响，而在使用本发明中的方法时，可以在保证动物快速吸收的同时，有效保证其稳定性。

优选的，酿酒酵母的保藏号为CGMCC No.13013。

优选的，酿酒酵母的保藏号为CGMCC No.10753。

同源重组后的酿酒酵母细胞壁同普通的酿酒酵母相比其细胞壁产生了较大变化，由于类胡萝卜素为脂溶性营养素容易富集到细胞膜上，发酵后期类胡萝卜素含量提高之后晶体会压迫细胞膜及细胞壁，为了保护其细胞膜及胞内类胡萝卜素产物，在重组过程中对其进行了细胞壁加固，所以与普通酿酒酵母相比其破壁难度也是不同的，本发明的方法更适合以上两种同源重组后的酿酒酵母，实现本发明的效果和目的。

此两种酿酒酵母产类胡萝卜素的含量为2-7％。

为了进一步使酿酒酵母达到细胞壁出现部分破坏甚至出现孔洞，但是细胞膜尽量完整的情况，本发明进一步对酶解条件进行了优化，得到了如下优选方案：

作为优选，所述酶制剂为选自β-1,3-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶，β-1,4-葡聚糖酶，α-1,6-糖苷酶，纤维素酶中的一种或其混合物；能够降解细胞壁多糖等成分，达到破坏细胞壁的作用。

优选所述酶制剂为β-1,3-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶，β-1,4-葡聚糖酶，纤维素酶的混合物；

优选更优选所述β-1,3-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶，β-1,4-葡聚糖酶，纤维素酶的质量比为3～5:0.5～1:0.5～1:3～5。

更优选所述β-1,3-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶，β-1,4-葡聚糖酶，纤维素酶的质量比5:1:0.5:3.5。

作为优选，当所述酶制剂按上述比例复配时，其加入量为0.1-0.6％，作用时间为1.5-5h。

作为优选，在pH为4-6的条件下进行酶解。

作为优选，采用柠檬酸、盐酸调节pH值。

作为优选，在40-70℃下进行酶解。

作为优选的，以上酶解反应均可配合搅拌操作进行。

优选的，在酶解前，将发酵液在pH值8-10的条件下保持0.5-2h。

此操作可在发酵结束前进行，也可以在发酵结束放罐后进行。此操作同前述的酶解步骤配合时，可以在不影响最终效果的情况下加快酶解效率。

在本领域大多数的方案中，需要将发酵液干燥后用于制作饲料，在将干燥应用于本发明技术方案中时，按照本领域一般的干燥方法即可获得不错的效果。

作为优选，采用喷雾干燥或滤出菌体后真空干燥或冷冻干燥的方式对破壁结束后的发酵液进行干燥。

上述方法在用于制备番茄红素时，干燥得到的干菌体中番茄红素含量一般在2-7％之间。

本发明进一步提供经上述方法制备得到的酿酒酵母。

本发明进一步提供上述酿酒酵母在动物养殖中的应用，优选为在动物药品或饲料中的应用。其中的动物指畜禽所涵盖的范围，偶蹄目下的包括猪、牛、羊等，禽类动物如鸡、鸭、鹅等。

本发明进一步提供一种饲料添加剂，含有所述的酿酒酵母。

本发明进一步提供一种饲料，含有所述的酿酒酵母。

优选的，所述酿酒酵母的添加量为60～1000mg/kg日粮。

饲料中的其他成分可以是玉米、豆粕、苜蓿、燕麦草等常见日粮饲料成分，可根据不同动物有所区别，在此不做进一步限定。

本发明有益效果如下：

本发明提供了一种可用于饲料的“半破壁”的酿酒酵母，并针对酿酒酵母提供了一种特定的酶解破壁的方法，可以控制其细胞壁只是被部分破坏，但仍能保留完整或大部分完整的细胞结构的效果。尤其在经条件优化后，进一步使酿酒酵母达到只是壁出现孔洞，但是细胞膜尽量完整的情况。通过上述制备方法，可以有效防止胞内有效物质的破坏，同时此种半破壁的菌体进入动物体内消化后有效成分容易释出，有利于动物的快速吸收。

当酿酒酵母中的有效成分为类胡萝卜素如番茄红素、β-胡萝卜素时，将本发明得到的酿酒酵母作为饲料添加剂与其他日粮成分一同作为饲料应用于畜禽养殖业，能够提高养殖畜禽的抗炎症、抗氧化能力，同时提高其免疫力，其中针对禽类动物如蛋鸡、鸭、鹅等能够加深其蛋黄色度，提高其营养和经济价值。

附图说明

图1为半破壁后的酿酒酵母菌体；

图2为完全破壁后的酿酒酵母菌体。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

为了对比不同实施例与对比例的效果，以下实施方式中均使用保藏编号为CGMCCNO.13013的酿酒酵母，其为可产番茄红素的重组酵母菌株。

所述酿酒酵母的发酵过程如下：

菌种活化：菌种在斜面培养基中进行平板划线后，在30℃恒温培养箱中活化培养24-36h。

种子培养：活化培养后的菌种转接到种子培养基中，培养温度为30℃，转速为250rpm，培养12～16h后作为种子液。

发酵：将活化好的种子液接入发酵培养基中，接种量为5％(v/v)，培养温度为30℃，转速为250rpm，培养120h。

其中，斜面培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母膏10，蛋白胨20，琼脂20，121℃灭菌20min。

种子培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母膏10，蛋白胨20，121℃灭菌20min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖40，酵母膏10，蛋白胨20，121℃灭菌20min。

实施例1

在发酵结束后，用柠檬酸将发酵液pH调至6，温度调至50℃，以发酵液总体积为基准，加入0.3％的酶制剂，在搅拌下作用2.5h；

所述酶制剂为β-1,3-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶，β-1,4-葡聚糖酶，纤维素酶的质量比5:1:0.5:3.5；

酶解反应结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

实施例2

在发酵结束后，用柠檬酸将发酵液pH调至6，温度调至50℃，以发酵液总体积为基准，加入0.3％的酶制剂，在搅拌下作用3h；

所述酶制剂为β-1,3-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶，β-1,4-葡聚糖酶，纤维素酶的质量比3:1:1:5；

酶解反应结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

实施例3

在发酵结束后，用柠檬酸将发酵液pH调至6，温度调至50℃，以发酵液总体积为基准，加入0.3％的酶制剂，在搅拌下作用5h；

所述酶制剂为β-1,3-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶，β-1,4-葡聚糖酶，纤维素酶的质量比1:1:3:6；

酶解反应结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

实施例4

在发酵结束后，用柠檬酸将发酵液pH调至5，温度调至55℃，以发酵液总体积为基准，加入0.6％的酶制剂，在搅拌下作用1.5h；

所述酶制剂为β-1,3-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶，β-1,4-葡聚糖酶，纤维素酶的质量比5:1:0.5:3.5；

酶解反应结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

实施例5

在发酵结束后，用柠檬酸将发酵液pH调至5，温度调至60℃，以发酵液总体积为基准，加入0.01％的酶制剂，在搅拌下作用8h；

所述酶制剂为β-1,3-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶，β-1,4-葡聚糖酶，纤维素酶的质量比5:1:0.5:3.5；

酶解反应结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

实施例6

在发酵结束后，先将发酵液pH调制8，搅拌持续1h，再使用柠檬酸将发酵液pH调至6，温度调至50℃，以发酵液总体积为基准，加入0.1％的酶制剂，在搅拌下作用1.5h；

所述酶制剂为β-1,3-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶，β-1,4-葡聚糖酶，纤维素酶的质量比5:1:0.5:3.5；

酶解反应结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

实施例7

在发酵结束后，用柠檬酸将发酵液pH调至5，温度调至60℃，以发酵液总体积为基准，加入1％的酶制剂，在搅拌下作用1h；

所述酶制剂为β-1,3-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶，β-1,4-葡聚糖酶，纤维素酶的质量比5:1:0.5:3.5；

酶解反应结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于：发酵得到的酿酒酵母发酵液直接喷雾干燥得到完整干菌体。

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于：发酵得到的酿酒酵母采用机械破壁法，使其粒径小于100μm，以彻底破坏酵母细胞壁。

试验例1

本试验例在显微镜下分别观察实施例1和对比例2所得到的酵母菌体，得到半破壁菌体(图1)与完全破壁菌体(图2)的显微镜图。由图1～2可知，经过实施例1的部分破壁处理，酿酒酵母中的内含物番茄红素依然保留在细胞中呈红色(转换为黑白色附图后呈深色)，而完全破壁后的酿酒酵母其中的番茄红素已经大部分流出细胞暴露在外，细胞内大部分都为白色。

试验例2菌体中番茄红素的稳定性

本试验例对实施例1-7以及对比例1-2所得到的酵母菌体进行稳定性试验，具体操作为：采用铝箔袋密封，在37℃的环境下静置2个月后，测量其样品前后番茄红素含量的变化。菌体中番茄红素的检测方法为：

①准确称取干菌体样品20-25mg，至离心管中。

②再加入四氢呋喃于离心管中。

③将快速研磨仪频率设置70Hz，时间90s，研磨3次(注意离心管的摆放位置必须对称放置；研磨仪上旋钮必须拧紧，盖好)。

④吸取5mL上清液转移至25mL容量瓶中。

⑤在离心管中加入3mL四氢呋喃，重复步骤③④，至氧化锆珠子中没有明显红色。将萃取完的溶液全部转移至容量瓶中(研磨后没有破碎的细胞会迅速沉降，可不用离心继续萃取)。

⑥吸取1mL溶液加入新的25mL容量瓶中，四氢呋喃定容至刻度，待上机检测吸光度，调整稀释倍数，保证吸光度在0.2-1.2之间。

⑦吸光度设定：472。

标准曲线为y＝2.1211x+0.0153，其中x为紫外检测吸光光度值，y为比色皿中样品番茄红素浓度，单位为mg/L。

结果计算：

总番茄红素含量以ω计，数值以％表示，按以下公式计算，计算结果见表1：

式中：

m——样品质量，单位mg；

C——比色皿中样品番茄红素浓度，单位mg/L；

A——样品稀释倍数。

表1番茄红素含量变化

由表1可知，完全破壁后的对比例2的番茄红素含量变化最大，而经过本发明方法半破壁处理后，实施例1-7中番茄红素的氧化率在5％以内，与对比例2相比氧化率明显较低。当处理条件控制在较优的范围时，其氧化率可以达到与未破壁干菌体相当。

试验例3动物吸收实验

本试验例中酿酒酵母含有番茄红素，番茄红素在动物体内的吸收转化以蛋鸡为例，最直观的方式是通过测量其蛋黄的颜色表现着色程度。当吸收转化率低时，蛋黄的色值相应也会降低；当吸收转化率高时，蛋黄的着色度会提高，相应的色值也会提高。本试验例具体操作如下：

(1)蛋鸡分组

选择230日龄、体况良好、体重相近的京粉1号商品蛋鸡，随机分为10个组，每组3个重复，每个重复9只鸡。对照组饲喂基础日粮(玉米-豆粕型)，其他9组分别为实施例1～7和对比例1～2的处理组，按照日粮中20mg/kg的番茄红素的比例添加干菌体进行喂养。

(2)蛋鸭分组

选择200日龄、体况良好、体重相近的商品蛋鸭，随机分为7个组，每组3个重复，每个重复15只鸭。对照组饲喂基础日粮(玉米-豆粕型)，其他6组分别为实施例1/5/6/7和对比例1～2的处理组，按照日粮中30mg/kg的番茄红素的比例添加干菌体进行喂养。

(3)饲养管理

三层笼养，光照为16L:8D。自由饮水，自由采食。环境温度为20-27℃。

预试期为2周，预试期过后的3天内收集各组所产鸡蛋和鸭蛋，测定蛋黄颜色，蛋黄色度采用蛋品质指标分析仪(以色列ORKA)进行测定，取其平均值。

鸡蛋测定结果见下表2。

表2

鸭蛋测定结果见下表3。

表3

从表2、3数据可知，本发明方法制备的干菌体在着色度方面与对比例1和对照组相比差值都在1以上，已经产生了肉眼即可区分的着色区别。在较优条件下半破壁处理的干菌体在着色方面与完全破壁的干菌体在蛋鸡、蛋鸭体内吸收程度近乎相当。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种可用于饲料的酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母的细胞膜完整，细胞壁部分破坏。

2.一种可用于饲料的酿酒酵母的制备方法，其特征在于，包括：在酿酒酵母发酵结束后，以发酵液总体积为基准，加入0.01-1％的酶制剂，作用1-8h；

优选所述酶制剂为选自β-1,3-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶，β-1,4-葡聚糖酶，α-1,6糖苷酶，纤维素酶，碱性蛋白酶，几丁质酶，蜗牛酶中的一种或其混合物；

优选所述酿酒酵母在发酵液中的浓度为60g/L～120g/L。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，通过转入所需的基因片段，使酿酒酵母产生所需成分；

优选所述的所需成分为类胡萝卜素；进一步优选为番茄红素或β-胡萝卜素；

更优选所述酿酒酵母为保藏号为CGMCC No.13013和/或CGMCC No.10753的酿酒酵母。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述酶制剂为选自β-1,3-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶，β-1,4-葡聚糖酶，α-1,6-糖苷酶，纤维素酶中的一种或其混合物；

优选所述酶制剂为β-1,3-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶，β-1,4-葡聚糖酶，纤维素酶的混合物；

更优选所述β-1,3-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶，β-1,4-葡聚糖酶，纤维素酶的质量比为3～5:0.5～1:0.5～1:3～5。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，在发酵结束后，以发酵液总体积为基准，加入0.1-1％的所述酶制剂，作用1.5-5h；

优选的，在pH为4-6的条件下进行酶解；和/或，在40-70℃下进行酶解。

6.根据权利要求2-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，在酶解前，将发酵液在pH值8-10的条件下保持0.5-2h。

7.权利要求2～6中任一项所述的制备方法制备得到的酿酒酵母。

8.权利要求1或7所述的酿酒酵母在动物养殖中的应用，优选为在动物药品或饲料中的应用。

9.一种饲料添加剂，其特征在于，含有权利要求1或7所述的酿酒酵母。

10.一种饲料，其特征在于，含有权利要求1或7所述的酿酒酵母；优选所述酿酒酵母的添加量为60～1000mg/kg日粮。