CN102618469B - 一株荚膜红细菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株荚膜红细菌及其应用。本发明提供了荚膜红细菌AYGHJ-16，它的保藏编号为CCTCC NO：M 2011377，属于光合细菌，能利用光能，将一些有机小分子(如有机酸、氨基酸等)转化为生长刺激物和抗病毒物质，刺激植物生长，提高植物的抗病免疫力。并且，光合细菌可以利用土壤中异氧微生物代谢所产生的有机酸，解除异氧微生物的产物反馈抑制，使其大量繁殖，促进了土壤中一些无机物质的转化和吸收，再加上光合细菌本身能进行强烈的固氮和固碳作用，可以为植物提供更多的无机物。本发明提供的富硒菌剂可以改善土壤微生态环境，从而提高植物的抗病能力以及对于各种矿物元素和稀有元素(比如硒)的内吸化，达到提高植物体富硒的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一株荚膜红细菌及其应用。
背景技术
硒是瑞典化学家Berzelius于1817年在生产硫酸的尾矿中发现的，当时被认为是一种有毒元素。1957年，Schwarz等首次证明硒是动物的必需营养元素，人们才对硒的营养保健作用有所认识。1973年，Rotmck等发现和证实硒是动物和人体谷胱甘肽过氧化物酶的组成成分以后，硒的重要性受到了空前的重视。1973年，世界卫生组织宣布硒是人体必需的生命元素。近年来的医学研究表明，硒缺乏会导致40多种疾病的发生，尤其会导致以下疾病：(1)克山病、大骨节病；(2)各种癌症；(3)***和妇女妊娠性高血压；(4)辐射损伤与衰老；(5)免疫功能低下与艾滋病；(6)重金属毒性与职业病；(7)心血管病；(8)流行性出血热。补充一定量的硒能够很好地预防上述疾病的发生，保证人体健康。
硒在地球上分布不均衡，已知有40多个国家和地区缺硒。据不完全统计，我国约72％的地区处于缺硒、低硒带。膳食中硒摄入量的不足严重影响着我国几亿人口的身体健康，根据中国营养学会调查报告，我国成人每日的硒摄入量仅为26.63μg，距中国营养学会和国际硒学会推荐的日摄入量50μg和60μg相差甚远。人体主要是通过膳食摄入硒，从不同形态硒源对人体的补硒作用来看，无机硒有一定毒性，吸收率又低，而通过生物转化作用将无机硒转化为有机硒，可降低无机硒的毒性，提高硒的生理活性与吸收率。因此，目前都把有机硒补硒视为最安全最有效的手段。
有机硒源中的植物硒源比动物性硒源要好。在植物性硒源中，富硒茶是一种理想的补硒源之一。茶树是一种天然富硒植物，产于富硒区的茶叶即为富硒茶，即使是种在低硒土壤上的茶树也可以通过人工增硒方法生产富硒茶。茶叶中的硒80％是对人体有益的有机硒。茶叶是世界三大保健饮料之一，我国人民有着长久的饮茶习惯，因此开发富硒茶对人体健康有着重要的意义。随着人们保健意识的增强，人们对富硒茶的需求将会不断增加。
我国是低硒国家，天然富硒茶的产地比较少，所以通过人工增硒途径增加茶叶中的硒含量有一定意义。茶叶增硒途径有很多种。天然的富硒茶园中，因为土壤含硒量高，茶叶当中的含硒量自然就高。但含硒量高的土壤毕竟分配范围有限，很难满足广大的市场需求，需要采用人工增硒。人工增硒主要有两种途径：一是土壤施硒肥，二是进行茶叶的叶面喷洒。茶园土壤增施硒肥后，大量的硒并不能很好的被茶树吸收，茶叶中的硒含量增加缓慢，增幅很小。叶面喷施硒肥后，可迅速提高茶叶中的硒含量，茶叶硒含量与喷施硒肥的量成正比，叶面喷硒尤应注意选择适宜喷硒浓度和合理的采摘时间，处于探索阶段，仍然不能保证茶叶对硒元素的利用率。
光合细菌(Photosynthetic Bacteria，缩写PSB)是水域微生物中的一种，是地球上最早出现的具有原始光能合成***的原核生物，它广泛分布在各类水体的厌氧层中。现已知光合细菌存在着色杆菌科、外硫红螺菌科、紫色非硫细菌、绿色硫细菌、多细胞丝状绿细菌、螺旋杆菌科、含细菌叶绿素的专性好氧菌等7大群共约50个属。光合细菌作为自然界中重要的微生物类群，广泛存在于自然界的水田、湖泊、江河、海洋、活性污泥及土壤中，生命力极强、营养要求低、生长繁殖快、无毒害性等特点。
发明内容
本发明的目的是提供一株荚膜红细菌及其应用。
本发明提供的荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)AYGHJ-16，简称荚膜红细菌AYGHJ-16，已于2011年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2011377。
所述荚膜红细菌AYGHJ-16可用于制备发酵液(富硒菌剂)。
本发明还保护一种制备发酵液(富硒菌剂)的方法，是发酵所述荚膜红细菌AYGHJ-16，得到发酵液。
所述发酵的条件具体可为：30℃，二氧化碳通气流速为4L/min，光照强度为1000-3000Lux。
所述发酵采用的发酵培养基的制备方法具体如下：取120mg***钠、40g葡萄糖、7.5g蛋白胨、9g尿素、5g酵母浸汁、0.4g NaHCO3、1g NH4Cl、0.2g K2HPO4、2.0CH3COONa、0.2g MgSO4·7H2O、2.0g NaCl和10mL微量元素溶液，用水溶解并定容至1000mL；所述微量元素溶液的制备方法如下：取0.5g H3BO3、400mg MnSO4、60mgZnSO4·7H2O、180mg NaMoO4·2H2O和10mg Ca(NO3)2·2H2O，用水溶解并定容至250mL。
所述发酵培养基的pH具体可为6.7-7.2。
以上任意所述方法制备得到的发酵液(富硒菌剂)也属于本发明的保护范围。
所述发酵液的使用方法，是将所述发酵液进行30-50倍稀释后喷洒于茶树叶面。
所述发酵液可用于生产茶叶。
所述发酵液可用于培养茶树。
本发明还保护一种生产茶叶的方法，包括将所述发酵液进行30-50倍稀释后喷洒于茶树叶面的步骤。所述茶树具体可为金观音茶树。
本发明还保护一种培养茶树的方法，包括将所述发酵液进行30-50倍稀释后喷洒于茶树叶面的步骤。采用本发明的方法培养茶树，可以使茶叶的硒含量显著增加。所述茶树具体可为金观音茶树。
本发明提供的荚膜红细菌AYGHJ-16，属于光合细菌，能利用光能，将一些有机小分子(如有机酸、氨基酸等)转化为生长刺激物和抗病毒物质，刺激植物生长，提高植物的抗病免疫力。并且，光合细菌可以利用土壤中异氧微生物代谢所产生的有机酸，解除异氧微生物的产物反馈抑制，使其大量繁殖，促进了土壤中一些无机物质的转化和吸收，再加上光合细菌本身能进行强烈的固氮和固碳作用，可以为植物提供更多的无机物。
本发明提供的富硒菌剂可以改善土壤微生态环境，从而提高植物的抗病能力以及对于各种矿物元素和稀有元素(比如硒)的内吸化，达到提高植物体富硒的要求。
本发明提供的富硒菌剂可以进一步提高茶树的硒利用率，提高茶叶的富硒效率，大规模生产生态富硒茶，满足人们的依量饮茶补硒保健服务的目的。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。金观音茶树：福建省农业科学研究院茶叶研究所。
实施例1、菌株AYGHJ-16的获得和保藏
一、菌株AYGHJ-16S的获得
利用富集和选择鉴别培养技术，从福州西湖底泥土壤中分离能耐受高浓度***钠、并能转化无机硒为有机硒的光合细菌。得到一株菌株，命名为菌株AYGHJ-16S。菌株AYGHJ-16S的富硒量为150ug/ml。
二、菌株AYGHJ-16S的鉴定
1、形态特征
革兰氏阴性菌；
菌体呈短杆或卵型，大小约为(0.6-1.2)μm-(2.0-2.2)μm；
菌落在光照条件下呈光滑、圆润、突起；
菌落在光照条件下为红色，在黑暗条件下为无色。
2、分子特征
16S rDNA的测序结果如序列表的序列1所示，与GENBANK ACCESSION NO.NR043407的荚膜红细菌的序列相似性为98％。
综合形态特征和分子特征，参照《伯杰氏***细菌学手册》(第9版)和东秀珠等编著的《常见细菌***鉴定手册》(第1版)，菌株AYGHJ-16S属于荚膜红细菌属(Rhodobacter capsulatus)。
三、菌株AYGHJ-16的获得
以菌株AYGHJ-16S为出发菌，通过常规的原生质体育种和DNA shuffling技术进一步选育富硒的高产菌种，得到菌株AYGHJ-16。菌株AYGHJ-16的富硒量为300ug/ml。
四、菌株AYGHJ-16的鉴定保藏
荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)AYGHJ-16，简称荚膜红细菌AYGHJ-16，已于2011年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2011377。
实施例2、荚膜红细菌AYGHJ-16的发酵成分及工艺条件的优化
通过单因素及正交试验，确定如下培养基组成参数：
葡萄糖为培养基中的最佳碳源，添加4-5％时可得到最高生物量与硒含量；
蛋白胨和尿素为培养基中的复合氮源，添加量分别为：蛋白胨0.5％，尿素0.9％；
酵母膏为培养基中的辅助氮源，添加量为0.4％；
***钠为培养基中的无机硒源选择，添加量为120ug/mL。
通过均匀设计的摇瓶发酵实验，确定如下培养条件参数：
采用250mL摇瓶，装液量120mL，培养温度28℃，pH5-6，培养时间5d。
采用上述优选参数，荚膜红细菌AYGHJ-16的生物量达到37.4g/L，菌体富集总硒含量达到36.4mg/L。
实施例3、富硒菌剂的的制备
一、富硒菌剂的的制备
发酵培养基(pH7.0)的制备方法：取120mg***钠、40g葡萄糖、7.5g蛋白胨、9g尿素、5g酵母浸汁、0.4g NaHCO3、1g NH4Cl、0.2g K2HPO4、2.0CH3COONa、0.2gMgSO4·7H2O、2.0g NaCl和10mL微量元素溶液，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。发酵培养基的无机硒浓度为120mg/L。实际应用中，发酵培养基采用6.7-7.2的pH均可。
将发酵培养基在115℃下灭菌20min。
微量元素溶液的制备方法：取0.5g H3BO3、400mg MnSO4、60mg ZnSO4·7H2O、180mgNaMoO4·2H2O和10mg Ca(NO3)2·2H2O，用蒸馏水溶解并定容至250mL。
采用200L发酵罐，并对发酵罐进行如下改造：(1)在发酵罐底部安装发红光的水下灯(灯光主要提供光合细菌的生长必须的光源作为能源)；(2)在发酵罐下部安装电热恒温控制棒；(3)在发酵罐底部设置两个外接开口，一个作为供给发酵罐二氧化碳的通气口，另一个作为加入发酵培养基和菌种的开口。
在发酵罐中加入160L发酵培养基，然后接种荚膜红细菌AYGHJ-16；发酵条件：温度控制在30℃，二氧化碳通气流速为4L/min，光照强度为1500Lux(1000-3000Lux均可)；当发酵罐中的菌浓度达到5.35×108cfu/mL时，升温至55℃处理45min(促使细胞破碎)，室温离心(5000g、15min)，收集上清液，即为富硒菌剂，4℃保藏。
二、富硒能力的测定
将4℃保藏3d后的富硒菌剂稀释10倍，吸取3mL并用水定容至10mL，作为待测溶液。采用亚甲蓝还原法检测待测溶液的褪色时间。
亚甲蓝还原法检测原理：在酸性条件下，***根可与DAB作用，生成黄色络合物(Se-DAB)，在一定pH时，使用有机溶剂萃取，根据有机层显色的程度，可进行分光光度法测定，根据无机硒含量标准曲线计算出无机硒的含量；有机硒不能与DAB络合，不能生成Se-DAB。
***钠：购自上海时代生物科技有限公司。
具体方法如下(依次进行以下操作)：
(1)取5支125ml的分液漏斗，分别加入2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml的***钠水溶液(1mg/L)，然后均加蒸馏水至40ml；
(2)每支漏斗加入2ml 0.2mol/L的EDTA-2Na水溶液以掩盖干扰离子，用甲酸调节pH至2-3；
(3)每支漏斗加入4ml 5g/L的DAB水溶液，摇匀，黑暗条件下60℃反应20min；
(4)用浓NaOH调节pH至7.0，然后每支漏斗加入4ml甲苯，充分摇匀，静置3-4min分层；
(5)将有机层通过脱脂棉滤到1cm的比色皿中，于420nm处测定溶液的吸光度(甲苯作为空白对照)。以吸光值A为横坐标，以硒浓度Y(单位为mg/L)为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线函数如下：Y＝1.8674X+0.0009(R2＝0.9995)。
用步骤一制备的富硒菌剂代替***钠水溶液进行以上步骤(1)至(5)的实验，将吸光值代入标准曲线，得到的结果即为富硒菌剂中的无机硒浓度。
富硒菌剂中的有机硒浓度＝发酵培养基的无机硒浓度-富硒菌剂中的无机硒浓度。
富硒能力(有机硒转化率)＝(富硒菌剂中的有机硒浓度/发酵培养基的无机硒浓度)×100％。
富硒菌剂中的有机硒浓度为116.4mg/L，富硒能力为98.9％。
三、富硒菌剂使用液的制备
将富硒菌剂用水稀释至50倍体积，即为富硒菌剂使用液。
实施例4、小区茶园的茶叶的富硒试验
实验时间为夏季。采用田间随机区组排列设计实验，共设置三组实验，每组采用3块实验小区，每块实验小区的面积为8m×2.5m，每块实验小区均匀种植有100株金观音茶树。实验设置三次重复，结果取平均值。
实验第1天，各组分别进行如下处理：
第一组：在茶树叶面均匀喷洒富硒菌剂使用液，每块实验小区喷洒20L；
第二组：在茶树叶面均匀喷洒清水，每块实验小区喷洒20L；
第三组：不作任何处理。
实验第18天采集茶叶并进行硒含量检测(按照GB5009.93-2010的检测方法)。第一组茶叶中的硒含量为350μg/kg，第二组茶叶中的硒含量为75μg/kg(请指明)，第三组茶叶中的硒含量为50μg/kg(请指明)。
夏茶施用富硒菌剂使用液后，效果明显，主要表现为：①提高夏梢的发芽密度与整齐度，增加夏茶产量；②促进夏梢生长，提早开采期：③改善夏茶品质、优化绿茶品质生化成分；④降低茶叶中的农药残留量；⑤增加了茶叶中的茶叶中的硒含量。
Claims (9)
1.荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)AYGHJ-16，其特征在于，它的保藏编号为CCTCC NO:M 2011377。
2.权利要求1所述荚膜红细菌AYGHJ-16在生产富硒菌剂中的应用。
3.制备权利要求1所述荚膜红细菌AYGHJ-16的发酵液的方法，其特征在于，发酵权利要求1所述荚膜红细菌AYGHJ-16，得到发酵液。
4.权利要求3所述方法制备得到的发酵液。
5.权利要求4所述发酵液的使用方法，其特征在于，该方法是将所述发酵液进行30-50倍稀释后喷洒于茶树叶面。
6.权利要求4所述发酵液在生产茶叶中的应用。
7.权利要求4所述发酵液在培养茶树中的应用。
8.一种生产茶叶的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求4所述发酵液进行30-50倍稀释后喷洒于茶树叶面的步骤。
9.一种培养茶树的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求4所述发酵液进行30-50倍稀释后喷洒于茶树叶面的步骤。
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