CN107475312A - 一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素k2的方法 - Google Patents

一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素k2的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，包括如下步骤：(1)将维生素K2生产菌株接种于斜面培养基中活化；(2)将活化后的菌株接种于添加有非离子型表面活性剂的种子培养基中培养；(3)将得到的培养液继续接种于添加有非离子型表面活性剂的种子培养基中培养；(4)将培养液接入发酵培养基中，100‑700rpm，0.5‑5vvm培养144‑240h；发酵至0‑72h时，添加非离子型表面活性剂，并采用***式低功率超声间隔处理，定时取样检测细胞和维生素K2浓度。本发明的优点在于：提供了简便、有效、经济的发酵工艺，有效提高维生素K2浓度，提高生产效率，降低生产成本。

Description

一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法
技术领域
本发明涉及生物技术制备领域，尤其涉及一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法。
背景技术
维生素K2(menaquinone，简写为MK)，是一种脂溶性维生素，是人体中不可缺少的重要维生素之一，能影响凝血酶原的合成和凝血，具有易于吸收、生物利用度高、生物活性强且对人体毒副作用小等诸多优点，目前临床用于治疗维生素K缺乏性出血症、防治骨质疏松和抗肿瘤等。
目前，维生素K2的生产方法主要集中在化学合成和天然物提取，利用生物法生产维生素K2还处于起步阶段。微生物法制备维生素K2相比化学合成法的优势在于原料成本低、条件要求温和、环境污染少且产物具有较高生物活性。目前发酵领域中用于合成维生素K2的菌种包括革兰氏阴性菌黄杆菌(主产MK-4)及革兰氏阳性菌纳豆芽孢杆菌(主产MK-6)，但维生素K2产量均不理想。为了提高发酵效率，研究者从发酵菌种的改造和发酵工艺优化等方面进行了大量的研究工作，例如维生素K2代谢途径关键基因的改造，菌种的理化诱变，发酵培养基优化，发酵过程参数调控等等。
利用超声波和表面活性剂提高微生物发酵过程中菌体细胞通透性是一种常见的细胞代谢人工调控方法。表面活性剂能改善细胞膜通透性，在微生物发酵中经常被用来提高目标产物的产量。在微生物发酵过程中加入表面活性剂，可加快物质传递运输，增加胞内胞外的物质平衡，从而提高了菌体对底物、产物的耐受度，解决发酵产物、副产物对微生物细胞生长和催化活性的抑制。因此，在微生物发酵过程中添加表面活性剂对增加终产物浓度，提高生产效率，缩短反应周期，降低生产成本，具有重要的现实意义。表面活性剂种类繁多且性质各不相同，它们一方面具有改善细胞膜通透性，减少氧及营养物质进入细胞的传递阻力，加快物质传递运输的能力；另一方面对微生物有毒性和杀菌作用。一般来说阳离子表面活性剂对细胞的毒性较大；非离子表面活性剂毒性小，对细胞的影响也较弱；阴离子表面活性剂的毒性和杀菌力介乎两者之间。
超声波有很强的生物学效应，在发酵过程中可增加细胞膜的通透性和选择性,能够在细胞表面瞬间造成微伤，使细胞壁局部破裂，从而改善细胞膜的通透性，使胞内物质释放或胞外物质进入细胞内，低功率时，伤口很小，容易被自身修复，不会对生物体造成损伤或死亡。
对于维生素K2发酵来说，如何保证氧和营养物质的传递吸收，促进维生素K2的胞外分泌能力，对进一步提高维生素K2产量具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种通过非离子表面活性剂和超声辐照协同作用来改善细胞膜通透性，从而进一步有效提高维生素K2产量的生产维生素K2的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，包括如下步骤：
(1)菌株活化
将维生素K2生产菌株接种于斜面培养基中进行活化；
(2)一级种子制备
将活化后的维生素K2生产菌株接种于添加有非离子型表面活性剂的种子培养基中培养12-24h，制成一级种子备用；
(3)二级种子制备
按照接种量3％-10％将步骤(2)得到的一级种子培养液接种于添加有非离子型表面活性剂的种子培养基中培养12-16h，制成二级种子备用；
(4)发酵培养
按装液量40％-70％，接种量1％-15％将二级种子培养液接入发酵培养基中，100-700rpm，0.5-5vvm培养144-240h；发酵至0-72h时，在培养基中添加非离子型表面活性剂，并采用***式低功率超声间隔处理，定时取样检测细胞和维生素K2浓度。
作为本发明的优选方式之一，所述非离子型表面活性剂具体为Span、Tween、Triton、OP和POE中的一种。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中非离子表面活性剂浓度范围0.01-8g/L。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中非离子表面活性剂浓度范围0.01-8g/L。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中非离子表面活性剂加入方式是一次性加入、分批加入或流加，浓度范围0.01-50g/L。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中***式低功率超声间隔处理的超声功率为100-500W，频率为10-30KHz。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中***式低功率超声间隔处理的处理时间为发酵24-96h后每隔12-24h超声30-400s。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中定时取样指每隔6-12h取样一次，直至发酵结束。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中通过分光光度计检测细胞浓度，通过液相色谱仪检测维生素K2浓度。
作为本发明的优选方式之一，所述维生素K2生产菌株具体为黄杆菌和纳豆芽孢杆菌中的一种。
作为本发明的优选方式之一，所述黄杆菌由中国普通微生物菌种保藏中心提供，编号为CCTCC AB 2010137；所述纳豆芽孢杆菌由中国典型培养物保藏管理中心提供，编号NKCCMR NK 2.新natto。
本发明原理：通过非离子表面活性剂和超声辐照协同作用，一方面降低培养基表面张力，减小菌体表面和培养基的界面阻力，减少氧及营养物质进入细胞的传递阻力，促进营养物质传输，加速细胞的生长；另一方面促使微生物代谢产物易于分泌至胞外，利于消除产物、副产物抑制，特别是减少胞内维生素K2累积对细胞生长和细胞催化活性的抑制，从而有利于维生素K2的合成。
本发明相比现有技术的优点在于：本发明提供了简便、有效、经济的发酵工艺，解决发酵终产物产量低以及发酵过程产物、副产物对细胞生长和细胞催化活性的抑制，有效提高发酵终产物浓度，提高生产效率，降低生产成本，易于实现工业化应用；其中，本发明的维生素K2最终浓度提高了183％-364％。
附图说明
图1是实施例1-8中通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法的流程图；
图2是实施例2-4中未经表面活性剂和超声处理所得MK6的HPLC检测对照图；
图3是实施例2中MK6的HPLC检测图；
图4是实施例3中MK6的HPLC检测图；
图5是实施例4中MK6的HPLC检测图；
图6是实施5-7中未经表面活性剂和超声处理所得MK7的HPLC检测对照图；
图7是实施例5中MK7的HPLC检测图；
图8是实施例6中MK7的HPLC检测图；
图9是实施例7中MK7的HPLC检测图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
如图1所示，本实施例的一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，包括如下步骤：
(1)菌株活化
以黄杆菌(由中国普通微生物菌种保藏中心提供，编号为CCTCC AB 2010137)为出发菌，将黄杆菌接种于斜面培养基中活化，斜面培养基成分为：甘油5g/L，葡萄糖10g/L，酵母提取物2.0g/L，鱼粉蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂1.5％，pH7.4，培养温度为30℃，培养48h；
(2)一级种子制备
将活化后的黄杆菌菌株接种于添加有0.01g/L Span的种子培养基中培养12h，制成一级种子备用；种子培养基成分为：甘油5g/L，葡萄糖10g/L，酵母提取物2.0g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，Span 0.01g/L，pH 7.2，培养温度37℃；
(3)二级种子制备
按照接种量3％将步骤(2)得到的一级种子培养液接种于添加有0.01g/L Span的种子培养基中培养12h，制成二级种子备用；种子培养基成分为：甘油5g/L，葡萄糖10g/L，酵母提取物2.0g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，Span 0.01g/L，pH 7.2，培养温度37℃；
(4)发酵培养
按装液量40％，接种量1％将二级种子培养液接入添加有0.01g/L Span的发酵培养基，具体配方为：甘油20g/L，麦芽糖10g/L，鱼粉蛋白胨10g/L，酵母浸膏1.5g/L，K2HPO44.5g/L，NaCl 3.0g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，Span 0.01g/L，pH 7.0；接着，100rpm，0.5vvm条件下进行发酵培养，培养24h时，采用100W、10KHz超声处理30s(作用3s，间歇4s)，并每隔12h超声一次；同时，每隔6h取样一次，分光光度计600nm条件下比浊法测量细胞浓度，液相色谱分析维生素K2浓度，直至144h的发酵结束。
本实施例中，维生素K2产量较未经表面活性剂和超声处理有明显提高，维生素K2总产量提高了183％。
实施例2
如图1所示，本实施例的一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，包括如下步骤：
(1)以黄杆菌(由中国普通微生物菌种保藏中心提供，编号为CCTCC AB 2010137)为出发菌，将黄杆菌接种于斜面培养基中活化，斜面培养基成分为：甘油5g/L，葡萄糖10g/L，酵母提取物2.0g/L，鱼粉蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂1.5％，pH7.4，培养温度为30℃，培养48h；
(2)将斜面培养基活化后的菌种接种至添加有0.05g/L OP-10的种子培养基中，种子培养基成分为：甘油5g/L，葡萄糖10g/L，酵母提取物2.0g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，OP-10 0.05g/L，pH7.2，培养温度37℃，培养18h；
(3)按照5％接种量将得到的一级种子培养液接种至添加有0.1g/L OP-10的种子培养基中，种子培养基成分为：甘油5g/L，葡萄糖10g/L，酵母提取物2.0g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，OP-10 0.1g/L，pH7.2，培养温度37℃，培养12h；
(4)按50％装液量、8％接种量接种至1L添加有5g/L OP-10的发酵培养基，具体配方为：甘油20g/L，麦芽糖10g/L，鱼粉蛋白胨10g/L，酵母浸膏1.5g/L，K2HPO4 4.5g/L，NaCl3.0g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，OP-10 5g/L，pH 7.0；接着，300rpm、1.5vvm、37℃条件下培养至96h时，120W、20KHz超声处理210s(作用3s，间歇4s)，每隔20h超声处理一次；同时，每隔10h间取样一次，分光光度计600nm条件下比浊法测量细胞浓度，液相色谱分析MK6(维生素K2的一种)浓度，直至216小时发酵结束。
图2为以黄杆菌为出发菌，未经表面活性剂和超声处理所得MK6的HPLC检测对照图(箭头指向为MK6目标峰)；图3为本实施例得到的MK6的HPLC检测图(箭头指向为MK6目标峰)。由图2和图3可知：本实施例中，维生素K2产量(35.6mg/L)较未经表面活性剂和超声处理(10.5mg/L)有明显提高，维生素K2总产量提高了239％。
实施例3
如图1所示，本实施例的一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，包括如下步骤：
(1)以黄杆菌(由中国普通微生物菌种保藏中心提供，编号为CCTCC AB 2010137)为出发菌，将黄杆菌接种于斜面培养基中活化，斜面培养基成分为：甘油5g/L，葡萄糖10g/L，酵母提取物2.0g/L，鱼粉蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂1.5％，pH7.4，培养温度为30℃，培养48h；
(2)将斜面培养基活化后的黄杆菌菌种接种至添加有1g/L OP-10的种子培养基中，种子培养基成分为：甘油5g/L，葡萄糖10g/L，酵母提取物2.0g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，OP-10 1g/L，pH 7.2，培养温度37℃，培养24h；
(3)按照3％接种量将步骤(2)得到的一级种子培养液接种至添加有0.1g/L OP-10的种子培养基中，种子培养基成分为：甘油5g/L，葡萄糖10g/L，酵母提取物2.0g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，OP-10 0.1g/L，pH7.2，培养温度37℃，培养16h；
(4)按照60％装液量、10％接种量接种至1L发酵培养基，具体配方为：甘油20g/L，麦芽糖10g/L，鱼粉蛋白胨10g/L，酵母浸膏1.5g/L，K2HPO4 4.5g/L，NaCl 3.0g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，pH 7.0；接着，250rpm、1vvm、37℃条件下培养至72h时，一次性添加OP-10 8g/L，并且，180W、20KHz超声处理280s(作用3s，间歇4s)，再每隔18h超声处理一次；同时，每隔12h取样一次，分光光度计600nm条件下比浊法测量细胞浓度，液相色谱分析MK6(维生素K2的一种)浓度，直至216小时发酵结束。
图2为以黄杆菌为出发菌，未经表面活性剂和超声处理所得MK6的HPLC检测对照图(箭头指向为MK6目标峰)；图4为本实施例得到的MK6的HPLC检测图(箭头指向为MK6目标峰)。由图2和图4可知：本实施例中，维生素K2产量(29.8mg/L)较未经表面活性剂和超声处理(10.5mg/L)有明显提高，维生素K2总产量提高了183.8％。
实施例4
如图1所示，本实施例的一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，包括如下步骤：
(1)以黄杆菌(由中国普通微生物菌种保藏中心提供，编号为CCTCC AB 2010137)为出发菌，将黄杆菌接种于斜面培养基中活化，斜面培养基成分为：甘油5g/L，葡萄糖10g/L，酵母提取物2.0g/L，鱼粉蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂1.5％，pH 7.4，培养温度为30℃，培养48h；
(2)将斜面培养基活化后的黄杆菌菌种接种至添加有1g/L POE的种子培养基中，种子培养基成分为：甘油5g/L，葡萄糖10g/L，酵母提取物2.0g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，POE 1g/L，pH7.2，培养温度37℃，培养18h；
(3)将步骤(2)得到培养液按照8％接种量接种至添加有2g/L POE的种子培养基中，种子培养基成分为：甘油5g/L，葡萄糖10g/L，酵母提取物2.0g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，POE 2g/L，pH 7.2，培养温度37℃，培养12h；
(4)将步骤(3)获得的黄杆菌培养液按照40％装液量、2％接种量接种至添加有15g/L POE的1L发酵培养基，具体配方为：甘油20g/L，麦芽糖10g/L，鱼粉蛋白胨10g/L，酵母浸膏1.5g/L，K2HPO4 4.5g/L，NaCl 3.0g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，POE 15g/L，pH 7.0；接着，250rpm、2vvm、37℃条件下培养，培养至96h时，220W、20KHz超声处理400s(作用3s，间歇4s)，再每隔24h超声一次；同时，每隔12h取样一次，分光光度计600nm条件下比浊法测量细胞浓度，液相色谱分析MK6(维生素K2的一种)浓度，直至192小时发酵结束。
图2为以黄杆菌为出发菌，未经表面活性剂和超声处理所得MK6的HPLC检测对照图(箭头指向为MK6目标峰)；图5为本实施例得到的MK6的HPLC检测图(箭头指向为MK6目标峰)。由图2和图5可知：本实施例中，维生素K2产量(48.8mg/L)较未经表面活性剂和超声处理(10.5mg/L)有明显提高，维生素K2总产量提高了364.7％。
实施例5
如图1所示，本实施例的一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，包括如下步骤：
(1)以纳豆芽孢杆菌(由中国典型培养物保藏管理中心提供，编号NKCCMR NK 2.新natto)为出发菌，将纳豆芽孢杆菌接种于斜面培养基中活化，斜面培养基成分为：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂粉20g/L，pH 7.0，37℃培养72h；
(2)将斜面培养基活化后的菌种接种至添加有1g/L POE的培养基，培养基成分为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，POE 1g/L，pH 7.2，37℃、200rpm培养18h；
(3)将步骤(2)得到培养液按照8％接种量接种至添加有3g/L POE的种子培养基中，种子培养基成分为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，POE 3g/L，pH 7.2，37℃、300rpm培养16h；
(4)将步骤(3)获得的纳豆芽孢杆菌培养液按照50％装液量、5％接种量接种至添加有8g/L POE的1L发酵培养基，具体配方为：蛋白胨15g/L，酵母粉25g/L，甘油70g/L，K2HPO40.5g/L，POE 8g/L，pH 7.3；接着，300rpm，1.5vvm，37℃培养至24h时，140W、20KHz超声处理280s(作用3s，间歇4s)，再每隔20h超声处理一次；同时，每隔10h取样一次，分光光度计600nm条件下比浊法测量细胞浓度，液相色谱分析MK7(维生素K2的一种)浓度，直至168小时发酵结束。
图6为以纳豆芽孢杆菌为出发菌，未经表面活性剂和超声处理所得MK7的HPLC检测对照图(箭头指向为MK7目标峰)；图7为本实施例得到的MK7的HPLC检测图(箭头指向为MK7目标峰)。由图6和图7可知：本实施例中，维生素K2产量(45.8mg/L)较未经表面活性剂和超声处理(15.6mg/L)有明显提高，维生素K2总产量提高了193.5％。
实施例6
如图1所示，本实施例的一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，包括如下步骤：
(1)以纳豆芽孢杆菌(由中国典型培养物保藏管理中心提供，编号NKCCMR NK 2.新natto)为出发菌，将纳豆芽孢杆菌接种于斜面培养基中活化，斜面培养基成分为：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂粉20g/L，pH 7.0，37℃培养72h；
(2)将斜面培养基活化后的菌种接种至添加有0.5g/L POE的种子培养基，种子培养基成分为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，POE 0.5g/L，pH 7.2，37℃、250rpm培养18h；
(3)将步骤(2)得到培养液按照10％接种量接种至添加有1g/L POE的种子培养基中，种子培养基成分为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，POE 1g/L，pH 7.2，37℃、350rpm培养16h；
(4)将步骤(3)获得的纳豆芽孢杆菌培养液按照60％装液量、12％接种量接种至1L发酵培养基，具体配方为：蛋白胨15g/L，酵母粉25g/L，甘油70g/L，K2HPO4 0.5g/L，pH 7.3；接着，500rpm，2vvm，37℃条件下培养，培养至24h时，分批添加POE 10g/L，并且160W、25KHz超声处理350s(作用3s，间歇4s)，再每隔24h超声处理一次；同时，每隔12h取样一次，分光光度计600nm条件下比浊法测量细胞浓度，液相色谱分析MK7(维生素K2的一种)浓度，直至192小时发酵结束。
图6为以纳豆芽孢杆菌为出发菌，未经表面活性剂和超声处理所得MK7的HPLC检测对照图(箭头指向为MK7目标峰)；图8为本实施例得到的MK7的HPLC检测图(箭头指向为MK7目标峰)。由图6和图8可知：本实施例中，维生素K2产量(45.7mg/L)较未经表面活性剂和超声处理(15.6mg/L)有明显提高，维生素K2总产量提高了192.9％。
实施例7
如图1所示，本实施例的一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，包括如下步骤：
(1)以纳豆芽孢杆菌(由中国典型培养物保藏管理中心提供，编号NKCCMR NK 2.新natto)为出发菌，将纳豆芽孢杆菌接种于斜面培养基中活化，斜面培养基成分为：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂粉20g/L，pH 7.0，37℃培养72h；
(2)将斜面培养基活化后的菌种接种至添加有1g/L OP-10的种子培养基，种子培养基成分为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，OP-10 1g/L，pH 7.2，37℃、300rpm培养24h；
(3)将步骤(2)得到培养液按照10％接种量接种至添加有2g/L OP-10的种子培养基中，种子培养基成分为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，OP-10 2g/L，pH 7.2，37℃、350rpm培养12h；
(4)将步骤(3)获得的纳豆芽孢杆菌培养液按照70％装液量、15％接种量接种至1L发酵培养基，具体配方为：蛋白胨15g/L，酵母粉25g/L，甘油70g/L，K2HPO4 0.5g/L，pH 7.3；接着，300rpm，1.5vvm，37℃条件下培养，培养至24h时，流加OP-10 15g/L，并且250W、25KHz超声处理400s(作用3s，间歇4s)，再每隔24h超声处理一次；同时，每隔12h取样一次，分光光度计600nm条件下比浊法测量细胞浓度，液相色谱分析MK7(维生素K2的一种)浓度，直至216小时发酵结束。
图6为以纳豆芽孢杆菌为出发菌，未经表面活性剂和超声处理所得MK7的HPLC检测对照图(箭头指向为MK7目标峰)；图9为本实施例得到的MK7的HPLC检测图(箭头指向为MK7目标峰)。由图6和图9可知：本实施例中，维生素K2产量(57.9mg/L)较未经表面活性剂和超声处理(15.6mg/L)有明显提高，维生素K2总产量提高了271.1％。
实施例8
如图1所示，本实施例的一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，包括如下步骤：
(1)菌株活化
以纳豆芽孢杆菌(由中国典型培养物保藏管理中心提供，编号NKCCMR NK 2.新natto)为出发菌，将纳豆芽孢杆菌接种于斜面培养基中活化，斜面培养基成分为：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂粉20g/L，pH 7.0，37℃培养72h；
(2)一级种子制备
将活化后的纳豆芽孢杆菌菌株接种于添加有8g/L Tween或Triton的种子培养基中培养12-24h，制成一级种子备用；种子培养基成分为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，Tween或Triton 8g/L，pH 7.2，培养条件：37℃、300rpm；
(3)二级种子制备
按照接种量10％将步骤(2)得到的一级种子培养液接种于添加有8g/L Tween或Triton的种子培养基中培养16h，制成二级种子备用；种子培养基成分为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，Tween或Triton 8g/L，pH 7.2，培养条件：37℃、350rpm；
(4)发酵培养
按装液量70％，接种量15％将二级种子培养液接入发酵培养基，具体配方为：蛋白胨15g/L，酵母粉25g/L，甘油70g/L，K2HPO4 0.5g/L，pH 7.3；接着，700rpm，5vvm条件下发酵培养，发酵至72h时，在培养基中流加50g/L Tween或Triton，发酵至96h时，500W、30KHz超声处理400s(作用3s，间歇4s)，每隔24h超声处理一次；同时，每隔12h取样一次，分光光度计600nm条件下比浊法测量细胞浓度，液相色谱分析维生素K2浓度，直至240h发酵结束。
本实施中，维生素K2产量较未经表面活性剂和超声处理有明显提高，维生素K2总产量提高了200％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌株活化
将维生素K2生产菌株接种于斜面培养基中进行活化；
(2)一级种子制备
将活化后的维生素K2生产菌株接种于添加有非离子型表面活性剂的种子培养基中培养12-24h，制成一级种子备用；
(3)二级种子制备
按照接种量3％-10％将步骤(2)得到的一级种子培养液接种于添加有非离子型表面活性剂的种子培养基中培养12-16h，制成二级种子备用；
(4)发酵培养
按装液量40％-70％，接种量1％-15％将二级种子培养液接入发酵培养基中，100-700rpm，0.5-5vvm培养144-240h；发酵至0-72h时，在培养基中添加非离子型表面活性剂，并采用***式低功率超声间隔处理，定时取样检测细胞和维生素K2浓度。
2.根据权利要求1所述的通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述非离子型表面活性剂具体为Span、Tween、Triton、OP和POE中的一种。
3.根据权利要求1所述的通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述步骤(2)中非离子表面活性剂浓度范围0.01-8g/L。
4.根据权利要求1所述的通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述步骤(3)中非离子表面活性剂浓度范围0.01-8g/L。
5.根据权利要求1所述的通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述步骤(4)中非离子表面活性剂加入方式是一次性加入、分批加入或流加，浓度范围0.01-50g/L。
6.根据权利要求1所述的通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述步骤(4)中***式低功率超声间隔处理的超声功率为100-500W，频率为10-30KHz。
7.根据权利要求1所述的通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述步骤(4)中***式低功率超声间隔处理的处理时间为发酵24-96h后每隔12-24h超声30-400s。
8.根据权利要求1所述的通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述步骤(4)中定时取样指每隔6-12h取样一次，直至发酵结束。
9.根据权利要求1所述的通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述步骤(4)中通过分光光度计检测细胞浓度，通过液相色谱仪检测维生素K2浓度。
10.根据权利要求1-9任一所述的通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述维生素K2生产菌株具体为黄杆菌和纳豆芽孢杆菌中的一种。
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