JP5571274B2

JP5571274B2 - 改変された特性を有する変異体

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Publication number: JP5571274B2
Application number: JP2001565869A
Authority: JP
Inventors: アンデルセン，カルステン; ベーデルボルチェルト，トルベン; レンフェルトニールセン，ブヤルネ
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 2000-03-08
Filing date: 2001-03-07
Publication date: 2014-08-13
Anticipated expiration: 2021-03-07
Also published as: WO2001066712A2; EP3594334A2; EP3594334A3; CN100482790C; AR028515A1; EP2302048A1; US20140073553A1; EP2302048B1; EP1263942A2; EP2298875B1; EP2221365A1; CN101532001A; US20150152361A1; JP2004505606A; CN101532000A; US20030129718A1; EP2298875A2; EP1263942B1; EP2298875A3; CN1436232A

Description

発明の分野
本発明は、αアミラーゼ活性を有し、かつ親のαアミラーゼと比べて次の特性、すなわち基質特異性、基質結合、基質切断パターン、熱安定性、ｐＨ／活性プロフィル、ｐＨ／安定性プロフィル、酸化に対する安定性、Ｃａ²⁺依存性、比活性、ならびに特に生産および使用条件下での溶解度のうちの少なくとも１つを変えた親ターマミル様αアミラーゼの変異体（突然変異体）に関する。

発明の背景
αアミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、E. C. 3. 2. 1. 1）は、デンプンならびにその他の線状および分枝状１，４−グルコシドオリゴ糖および多糖の加水分解を触媒する１群の酵素を構成する。

最新の工業的バイオテクノロジーでは、発酵、精製、回収の間に、また製品の配合で高いタンパク質濃度が達成される。

発酵の間、タンパク質濃度は使用される宿主細胞に左右される。工業的プロセスにおいてはタンパク質濃度は一般に、発酵ブイヨン1 l当たり0.1gを超えるところにある。Bacillus種中でのαアミラーゼの高収率組換え生産では、タンパク質濃度は発酵ブイヨン1 l当たり250gもの高濃度であることができる。精製後にはタンパク質濃度は、1 l当たり約1000gのレベルに達する可能性がある。このような高濃度は、活性タンパク質の損失をもたらす望ましくない沈殿を起こす。最近の傾向は、重要性の増しつつある溶液中で酵素を維持する能力を持つ、より丈夫な製品に向っている。往々にしてタンパク質溶液の濃度上昇は、溶解して活性タンパク質にするのが困難なタンパク質の沈殿をもたらす。

したがって本出願の目的は、下記に定義される改変された特性を有する、具体的には高い溶解度を有するαアミラーゼを提供することである。

発明の概要
本発明の目的は、対応する親αアミラーゼ、すなわち突然変異していないαアミラーゼと比較してその変異体がαアミラーゼ活性を有し、かつ上記親αアミラーゼと比べて次の特性、すなわち基質特異性、基質結合、基質切断パターン、熱安定性、ｐＨ／活性プロフィル、ｐＨ／安定性プロフィル、酸化に対する安定性、Ｃａ²⁺依存性、比活性、ならびに溶解度、具体的には生産条件下での高い溶解度のうちの少なくとも１つで変化を示すターマミル様アミラーゼを提供することである。

命名法：
この記述および特許請求の範囲においては、アミノ酸残基の従来の１字および３字コードが用いられる。参照しやすいように本発明のαアミラーゼ変異体は次の命名法、すなわち元のアミノ酸：位置：置換されたアミノ酸を用いて記述される。

この命名法によれば、例えば３０位でのアラニンのアスパラギンヘの置換は、
Ａｌａ３０ＡｓｎまたはＡ３０Ｎ
と示され、同じ位置におけるアラニンの欠失は、
Ａｌａ３０^*またはＡ３０^*
と示され、またリシンなどの付加アミノ酸残基の挿入は、
Ａｌａ３０ＡｌａＬｙｓまたはＡ３０ＡＫ
と示される。

アミノ酸残基３０〜３３位など、アミノ酸残基の連続的な区間の欠失は、（３０〜３３）^*またはDELTA（Ａ３０〜Ｎ３３）と示される。

特定のαアミラーゼが他のαアミラーゼと比較して「欠失」を含み、挿入がそのような位置で行なわれる場合、３６位へのアスパラギン酸の挿入は、
^*３６Ａｓｐまたは^*３６Ｄ
と示される。多重突然変異はプラス記号によって分けられ、
Ａｌａ３０Ａｓｐ＋Ｇｌｕ３４ＳｅｒまたはＡ３０Ｎ＋Ｅ３４Ｓ
は、アラニンとグルタミン酸をそれぞれにアスパラギンとセリンに置換する３０および３４位における突然変異を表す。

所定の位置に１または複数の別のアミノ酸残基を挿入することができる場合、それは
Ａ３０Ｎ、Ｅあるいは
Ａ３０ＮまたはＡ３０Ｅ
と示される。
さらに、或る特定の修飾が示唆されることなしに修飾に適した位置が本明細書中で識別される場合、その位置に存在する任意のアミノ酸残基を任意のアミノ酸残基に換えることができることが理解されるはずである。したがって、例えば３０位でのアラニンの修飾について述べられ、しかし特定されない場合、アラニンを欠失するか、または任意の他のアミノ酸、すなわちＲ、Ｎ、Ｄ、Ａ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖのいずれか１つで置換することができることが理解されるはずである。さらに、「Ａ３０Ｘ」は次の置換、すなわちＡ３０Ｒ、Ａ３０Ｎ、Ａ３０Ｄ、Ａ３０Ｃ、Ａ３０Ｑ，Ａ３０Ｅ、Ａ３０Ｇ、Ａ３０Ｈ、Ａ３０Ｉ、Ａ３０Ｌ、Ａ３０Ｋ、Ａ３０Ｍ、Ａ３０Ｆ、Ａ３０Ｐ、Ａ３０Ｓ、Ａ３０Ｔ、Ａ３０Ｗ、Ａ３０Ｙ、またはＡ３０Ｖ、また簡単に云えばＡ３０Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖのいずれか１つを意味する。

発明の詳細な説明
本発明の目的は、酵素などのポリペプチド、具体的には親ポリペプチドと比べて次の特性、すなわち基質特異性、基質結合、基質切断パターン、熱安定性、ｐＨ／活性プロフィル、ｐＨ／安定性プロフィル、酸化に対する安定性、Ｃａ²⁺依存性、比活性、ならびに溶解度、特に生産条件下での溶解度のうちの少なくとも１つを変えたαアミラーゼを提供することである。これらの特性はさらに下記に定義する。

ポリペプチド：
本発明によるポリペプチドには、生物活性、抗微生物活性、および酵素活性を有するタンパク質が含まれる。

検討された酵素活性には、プロテアーゼ、アミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、マンナナーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、グルコアミラーゼ、カルボヒドラーゼ、トランスフェラーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、リパーゼが含まれる。

好ましい一実施形態において酵素は、αアミラーゼ、具体的にはBacillusまたはAspergillusαアミラーゼである。好ましい実施形態においてBacillusαアミラーゼは、ターマミル様アミラーゼである。

生物活性を有するポリペプチドには、ＥＰＯ、ＴＰＯ、成長ホルモン、調節ペプチド、血液凝固因子、抗体などが含まれる。

改変された溶解度を有するポリペプチド：
タンパク質（ポリペプチド）の結晶は、三次元に密に詰め込まれた体系的な規則正しい同一単位に組み立てられている。単位格子は、１または複数のタンパク質分子とかなりの量の水を含有することができる。また、イオン様のカルシウム、ナトリウム、塩化物、硫酸塩、ならびに界面活性剤および基質などの大きな分子（結晶の成長の間存在する）を三次構造中に識別することができる。単一分子および単一原子はきわめて小さいが、同一単位の反復配列はＸ線散乱を容易にし、したがってタンパク質工学の目的に使用することができる構造情報を提供する。

結晶に比べて沈殿および凝集塊は小さな単位であり、また単一分子は結晶よりも無秩序である。それにもかかわらず分子間の相互作用の幾つかは規則正しい結晶中に見出されるものと同じであり、したがって特性の変わった、特に沈殿傾向の少ない、タンパク質工学的に創られるαアミラーゼの変異体、すなわち溶解度の大きい変異体を設計するためにこの三次構造（３Ｄ構造）および分子間情報を使用することができる。

タンパク質の球形、また往々にして不規則な表面構造により、単位格子中には水などのより無秩序な溶媒によって占められている大きな孔が存在する。実際にはタンパク質表面の大部分は水の層で覆われており、これがＸ線結晶学によって解明されたタンパク質構造が溶液中のタンパク質構造と同一である理由の一つである。タンパク質分子はわずかな領域で直接互いに接しているが、溶媒が介在する接触もまた結晶を互いに結合する「接着剤」として働いている。

一般にタンパク質の溶解度は、有機溶剤、硫酸アンモニウム、ＮａＣｌ、およびＣａＣｌ₂などの塩により、また分子の表面電荷を変えるｐＨの変化により影響を受ける。これらの要因は、酵素の生産では溶液中の酵素を維持すること、また結晶学的実験では有用な結晶を成長させることの両者への影響が考えられる。大きな対称性の結晶は、タンパク質濃度をゆっくり上昇することによって、またはタンパク質表面を変質し、それによって分子間の接触を増大させることによって成長する。すべてのタンパク質がＸ線結晶学的な判定法にとって有用な形態に結晶化するわけではないが、鋳型の分子と考察の対象になっている分子との間の相同性が十分に大きい場合は現存する三次構造に基づいて正確なモデルを組み立てることができる。

酵素などの相同ポリペプチド、具体的にはターマミル様αアミラーゼ（下記に定義される）を三次構造に基づいて比較すると、違いの多くは分子の表面に見出される。

それにもかかわらず本発明者等は、ターマミル様アミラーゼ（SEQ ID NO:4で開示されるSP722）の結晶形成に関係している（直接的に、または水分子を介して間接的に）ことが確認されている表面残留物が他のターマミル様アミラーゼ（下記に定義される）の結晶化においてもまた重要な役割を果たしていることを見出した。

或るターマミル様αアミラーゼの三次構造を別のターマミル様αアミラーゼの三次構造（添付資料１に開示したSP722構造）からモデル化する一例を下記に記述する。

本発明の概念および下記に記載の本発明によるモデル化の方法は、一般にすべてのポリペプチド、αアミラーゼなどのタンパク質、特に酵素に外挿することができることが理解されよう。

SP722三次構造ならびに別のターマミル様αアミラーゼ三次構造のモデル化：
本発明のαアミラーゼの突然変異体は、SP722（SEQ ID NO:4）の添付資料１に示した三次構造に基づいて見出された。別のポリペプチドの突然変異体は、別の三次構造に基づいて見出すことができる。アルカリ性ターマミル様αアミラーゼ（SP722）（SEQ ID NO:4で示され、また米国特許第5,824,531号に開示されている）の結晶は懸滴培養法(hanging drop method)（当業界でよく知られている）によって得られ、またその三次構造（３Ｄ構造）は本明細書の添付資料１に開示されている。

単位格子は４個の酵素分子を含有していることが分かり、各分子は８個の相互作用する帯域を有している（図２および３参照）。２つの帯域は活性部位を取巻く酵素の側面で識別され、また１つの大きな領域が活性部位に対してαアミラーゼの裏側に見出される。さらに側面に２つの相互作用帯域、および上部から底部まで相互作用を行なう分子の底部の相互作用面と上部の相互作用面がある。

図２から分かるように活性部位を取巻く２つの相互作用帯域は、逆平行の隣りの分子上の同じ２つの領域と相互作用している。同様に裏側の帯域は第三の逆平行アミラーゼ分子上の裏側の帯域と接している。ただしここですべての接触には水が介在している。相互作用する領域が分子全体に広がることもまた図２および３から分かる。

添付資料１に開示したSP722三次構造に基づいて別のアルカリ性ターマミル様アミラーゼAA560のモデルを組み立てた。AA560 αアミラーゼは、鋳型のアミラーゼ（SP722）と約８７％同一であり、その配列には挿入または欠失を何も含んでいない。高い相同性（同一性）、同じ対称性、および同じ結晶相互作用によりタンパク質表面の相互作用帯域が、生産すなわち発酵段階から始まり精製段階までの間に到達する高いタンパク質濃度で結晶化および沈殿と関係する（背景の項参照）。

これら相互作用帯域中の突然変異を構築し、その酵素を発現し精製し、そのタンパク質の溶解度を「材料および方法」の項に記載の方法を用いて実施例８および９に記載のように異なる条件下で測定した。

本発明の発見は、SEQ ID NO:12に示したターマミル様αアミラーゼと少なくとも６０％同一の、好ましくは少なくとも７０％同一の、より好ましくは８０％同一の、一層好ましくは８５％同一の、一層好ましくは９０％同一の、一層好ましくは９５％同一の、一層好ましくは９７％同一の、一層好ましくは９９％同一のターマミル様アミラーゼに応用することができる。好ましくはこの発見は、SP722（図１のアラインメントで番号１として示されたSEQ ID NO:4）と比べてアライニングされた一次構造中に追加のアミノ酸残基または間隙のないアルカリ性ターマミル様αアミラーゼ、特に同じ長さのアルカリ性αアミラーゼの場合に使用することができる。特にこの発見は、次のアルカリ性ターマミル様αアミラーゼ、すなわちSP690（SEQ ID NO:2）、SP722（SEQ ID NO:4）、AA560（SEQ ID NO:12）、#707 αアミラーゼ（SEQ ID NO:13）、国際公開特許第97/00324号に記載されているKSM AP1378 αアミラーゼ中に開示されたKSM APE 1378 αアミラーゼ、あるいはそれらの断片または端を切取った形態の場合に使用することができる。これらアルカリ性αアミラーゼは、上記相互作用帯域の周囲にきわめて類似の三次結晶構造を有し、かつアミノ酸４８５個の長さの同一の一次構造を有する。

これとは逆に、例えばターマミル（図１のアラインメントで配列番号４として示されている）は２個のアミノ酸残基（１および２位）を欠き、１７４および１８１〜１８２位に間隙を有し、かつSP722とアライニングした場合、３７８〜３８１位に３個の追加のアミノ酸残基を有する。BAN（図１のアラインメントで配列番号３として示されている）は、５個のアミノ酸残基（１〜４および４８８位）を欠き、１７４および１８１〜１８２位に間隙を有し、かつSP722とアライニングした場合、３７８〜３８１位に３個の追加のアミノ酸残基を有する。BSG（図１のアラインメントで配列番号５として示されている）は、１個のアミノ酸残基（１位）を欠き、かつSP722ｔ位置合わした場合、４８９〜５１９位に３１個の追加のアミノ酸残基を有する。

KSM-K36およびKSM-K38（欧州特許公開第1,022,334-A号）は、５個のアミノ酸残基（１および２位）を欠き、かつSP722とアライニングした場合、１７４および１８１〜１８２位に間隙を有する。AA180、AA20、およびAmrk385（デンマーク特許出願第PA2000 00347号または国際特許公開第PCT/DK01/00133号）は、SP722とアライニングした場合、２６１位に１個の追加のアミノ酸を有する。

どのようにして別のαアミラーゼからターマミル様αアミラーゼをモデル化するかを下記に記述する。実施例４においてはSP722からのAA560のモデル化について記述する。この方法は、例えば上記のように別のポリペプチドにも外挿することができる。

ターマミル様αアミラーゼのモデル化：
国際特許公開第96/23874号は、B. amyloliquefaciens αアミラーゼ（BAN(商標)）のＮ終末部の３００個のアミノ酸残基およびB. licheniformis αアミラーゼのＣ終末部末端のアミノ酸３０１〜４８３位（SEQ ID NO:8）からなるターマミル様αアミラーゼの三次構造（３Ｄ構造）、Ｘ線結晶構造データを提供する。国際特許公開第96/23874号はさらに、親ターマミル様αアミラーゼ、また親と比べて改変された特性を示す親ターマミル様αアミラーゼ変異体の構造解析に基づく設計（モデル化）の方法論について記述している。

国際特許公開第96/23874号によればその他のターマミル様構造もモデル化することができ、これは参照により本明細書に合体されている。

本発明の変異体を得ることに関しては、実施例１に記載のようにSP722三次構造（添付資料１に開示されている）に基づいてAA560三次構造が設計（モデル化）された。他のターマミル様αアミラーゼ（例えば本明細書中に開示されているもの）の構造も同様に組み立てることができる。

ターマミル様αアミラーゼ：
Bacillus spp.によって生成された幾つかのαアミラーゼは、アミノ酸レベルに関して高度に相同（同一）である。幾つかのBacillus αアミラーゼの同一性は、下記の表１に見出すことができる。

例えば、SEQ ID NO:8で示されたアミノ酸配列を含むB. lichenifomis αアミラーゼ（Termamyl(商標)として市販されている）は、SEQ ID NO:10で示されたアミノ酸配列を含むB. amyloliquefaciens αアミラーゼと約８１％相同であり、SEQ ID NO:6で示されたアミノ酸配列を含むB. stearothemophilus αアミラーゼとは約６５％相同であることが分かった。さらに、相同のαアミラーゼには、国際特許公開第95/26397号に開示され、またさらに本明細書中でそれぞれSEQ ID NO:2および SEQ ID NO:4で表されるSP690およびSP722が含まれる。その他のアミラーゼは、Bacillus sp.から得られ、SEQ ID NO:12で示されるAA560 αアミラーゼと、Bacillus sp. から得られ、SEQ ID NO:13で示される#707 αアミラーゼがあり、Tsukamoto等の論文、Biochemical and Biophysical Research Communications, 151, pp.25〜31 (1988) に記載されている。

KSM AP 1378 αアミラーゼは、国際特許公開第97/00324号（Kao Corporationから出願されている）に開示されている。また、欧州特許公開1,022,334号に開示されているK36およびK38 αアミラーゼが本発明により考察されている。

さらに、相同のαアミラーゼには、欧州特許公開0252666号に記載のB. licheniformis株（ATCC 27811）によって産生されたαアミラーゼと、国際特許公開第91/00353号および第94/18314号で同定されているαアミラーゼがある。その他の市販のターマミル様αアミラーゼは、Optitherm(商標)およびTakatherm(商標)(Solvayから入手できる)、Maxamyl(商標)(Gist-brocades/Genencorから入手できる)、Spezym AA(商標)およびSpezyme Delta AA(商標)(Genencorから入手できる)、Keistase(商標)(Daiwaから入手できる)、Purastar (商標)ST 5000E、PURASTRA(商標) HPAM L(Genencor Int.から入手できる)の商標名で販売されている製品中に含まれている。

これらαアミラーゼの間に見出される実質上の相同性のために、これらはαアミラーゼの同じクラス、すなわち「ターマミル様αアミラーゼ」のクラスに属すると考えられる。

したがって、本明細書の文脈においては用語「ターマミル様αアミラーゼ」は、Termamyl(商標)、すなわち本明細書中でSEQ ID NO:8で示されるアミノ酸配列を有するB. licheniformis αアミラーゼとアミノ酸レベルでほぼ同一性を示すαアミラーゼを指すことを意図している。

換言すれば、本明細書中でSEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、および13で示されるアミノ酸配列を有するすべてのαアミラーゼが「ターマミル様αアミラーゼ」であると考えられる。その他のターマミル様αアミラーゼは、ｉ）SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、および13で示される上記アミノ酸配列の少なくとも１つと、少なくとも７０％など少なくとも６０％、例えば少なくとも７５％、すなわち少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の相同性を示すαアミラーゼ、および／またはｉｉ）SEQ ID NO: 1、3、5、7、9で識別され、かつ本明細書の上記の特定されたαアミラーゼをコードするＤＮＡ配列（そのコード配列はそれぞれ本明細書のSEQ ID NO: 2、4、6、8、10、および12に示されるアミノ酸配列をコードする）にハイブリダイズするＤＮＡ配列によってコードされるαアミラーゼである。

特性ｉ）に関して相同性は、第一配列が第二配列から派生したことを示す２つの配列の間の同一性の度合として決定することができる。相同性は適切には、ＧＣＧプログラムパッケージとして提供されるＧＡＰなどの当業界で周知のコンピュータプログラムにより決定することができる（前述）。したがってGap GCGv8は、次のデフォルトパラメータ、すなわちＧＡＰ生成(creation)ペナルティ５．０およびＧＡＰ拡張(extension)ペナルティ０．３、また核酸配列については３．０、タンパク質配列については０．１それぞれのデフォルトのスコアリングマトリックスを用いて使用することができる。ＧＡＰは、アラインメントにNeedleman/Wunsch/Sellersの方法を用いる。

ターマミル（SEQ ID NO: 8）と別のターマミル様αアミラーゼの間の構造的アラインメントを用いて他のターマミル様αアミラーゼ中の等価の／対応する位置を識別することができる。上記の構造的アラインメントを得るための１つの方法は、ＧＡＰペナルティのデフォルト値、すなわちＧＡＰ生成ペナルティ３．０およびＧＡＰ拡張ペナルティ０．１を用いたＧＣＧパッケージの積み重ねプログラムを使用することである。その他の構造的アラインメントの方法には、疎水性クラスター分析（Gaboriaud等の論文、FEBS LETTERS 224, pp. 149~155 (1987)）および逆ねじ切り法（reverse threading）（Huber, TおよびTorda, AEの論文、PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No. 1, pp. 142~149 (1998)）がある。

ハイブリダイゼーション：
上記の特性ｉｉ）に合致するターマミル様αアミラーゼなどのポリペプチドの特徴描写に使用されるオリゴヌクレオチドプローブは適切には、検討対象になっているαアミラーゼの完全または部分ヌクレオチドあるいはアミノ酸の配列に基づいて調製することができる。

ハイブリダイゼーションを試験するための適切な条件は、５ＸＳＳＣ中に予備浸漬し、２０％ホルムアミド、５Ｘデンハート溶液、50mMリン酸ナトリウム（pH6.8）、および変性し音波処理された子ウシ胸腺のＤＮＡ 50mgからなる溶液中で〜４０℃で１時間予備ハイブリダイズさせ、続いて100mM ATPを追加した同じ溶液中で〜４０℃で１８時間ハイブリダイズさせ、続いて２ＸＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で３回のフィルタ洗浄を、４０℃（低ストリンジェンシー）、好ましくは５０℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは６５℃（高ストリンジェンシー）、さらに好ましくは〜７５℃（超高ストリンジェンシー）で３０分間行なうものである。ハイブリダイゼーション法に関してより詳細については、Sambrook等の著書、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989中に見ることができる。

本明細書の文脈中で「から得られる」とは、検討対象になっている生物株によって産生された、または産生可能なαアミラーゼを指すだけでなく、そのような株から単離されたＤＮＡ配列によってコードされ、そのＤＮＡ配列で形質転換された宿主生物中で産生されるαアミラーゼを指すことを意図している。結局、この用語は、合成および／またはｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によってコードされ、検討対象になっているαアミラーゼを識別する特徴を有するαアミラーゼを指すことを意図している。この用語はまた、親αアミラーゼが天然に産するαアミラーゼの変異体、すなわち天然に産するαアミラーゼの１または複数のアミノ酸残基の修飾（挿入、置換、欠失）の結果である変異体であってもよいことを指すことを意図している。

親ターマミル様αアミラーゼ：
本発明によれば、上記で定義した通りすべてのターマミル様αアミラーゼは、親αアミラーゼ（すなわち、骨格）として使用することができる。本発明の好ましい実施形態において親αアミラーゼは、B. licheniformis、例えばSEQ ID NO:10で示されるアミノ酸配列を有するB. licheniformis αアミラーゼなどの上記で言及されたものの１つから得られる。特に好ましい親αアミラーゼは、SP722αアミラーゼおよびAA560 αアミラーゼである。一実施形態において親αアミラーゼは、１または複数の次の突然変異／置換、すなわちDELTA(Ｒ８１〜Ｇ１８２）、DELTA（Ｒ１８３〜Ｇ１８４）、DELTA（Ｒ１８３〜Ｇ１８４）＋Ｎ１９５Ｆ、ＲＲ１８１Ｑ＋Ｎ４４５Ｑ＋Ｋ４４６Ｎ、DELTA（Ｒ１８３〜Ｇ１８４）＋Ｒ１８１Ｑを有する。

親のハイブリッドターマミル様αアミラーゼ：
親αアミラーゼ（すなわち骨格αアミラーゼ）はまた、ハイブリッドαアミラーゼ、すなわち少なくとも２種類のαアミラーゼから得られる部分アミノ酸配列の組合せを含むαアミラーゼであってもよい。

親のハイブリッドαアミラーゼは、アミノ酸の相同性（同一性）および／またはＤＮＡハイブリダイゼーション（上記で定義される）に基づいてターマミル様αアミラーゼのファミリーに属することを決めることができるものである。この場合、ハイブリッドαアミラーゼは一般に、ターマミル様αアミラーゼが少なくとも一部分と、ターマミル様αアミラーゼあるいは微生物（細菌または真菌）および／または哺乳類起源の非ターマミル様αアミラーゼから選択される１または複数の別のαアミラーゼ部分とから構成される。

したがって親のハイブリッドαアミラーゼは、少なくとも２種類のターマミル様αアミラーゼから得られる、または少なくとも１種類のターマミル様αアミラーゼと少なくとも１種類の非ターマミル様の細菌性αアミラーゼとから得られる、または少なくとも１種類のターマミル様αアミラーゼと少なくとも１種類の真菌性αアミラーゼとから得られる部分アミノ酸配列の組合せを含むことができる。部分アミノ酸配列を導出するターマミル様αアミラーゼは、本明細書で言及したこれら特定のターマミル様αアミラーゼのいずれかであることができる。

例えば親αアミラーゼは、B. licheniformis株から得られるαアミラーゼのＣ終末部分と、B. amyloliquefaciens株またはB. stearothermophilus株から得られるαアミラーゼのＮ終末部分とを含むことができる。例えば親αアミラーゼは、B. licheniformisのＣ終末部分の少なくとも４３０個のアミノ酸残基を含むことができ、また例えば、ａ）SEQ ID NO:10で示されるアミノ酸配列を有するB. amyloliquefaciens αアミラーゼのＮ終末部の３７個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントと、SEQ ID NO: 8で示されるアミノ酸配列を有するB. licheniformis αアミラーゼのＣ終末部の４４５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントとを含んでもよく、またはターマミル配列すなわちＮ終末部の３５個のアミノ酸残基（成熟タンパク質の）が、ＢＡＮすなわちSEQ ID NO:10で示されるB. amyloliquefaciens αアミラーゼのＮ終末部の３３個のアミノ酸残基（成熟タンパク質）により置き換えられていることを除けば、SEQ ID NO: 8で示されるB. licheniformis αアミラーゼと同一のハイブリッドターマミル様αアミラーゼを含んでもよく、あるいはｂ）SEQ ID NO: 6で示されるアミノ酸配列を有するB. stearothermophilus αアミラーゼのＮ終末部の６８個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントと、SEQ ID NO: 8で示されるアミノ酸配列を有するB. licheniformis αアミラーゼのＣ終末部の４１５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントとを含んでもよい。

別の好適な親のハイブリッドαアミラーゼは、ＢＡＮすなわちB. amyloliquefaciens αアミラーゼのＮ終末部（成熟タンパク質のアミノ酸１〜３００位）と、ターマミル由来のＣ終末部（成熟タンパク質のアミノ酸３０１〜４８３位）を構成する、以前に国際特許公開第96/23874号（Novo Nordiskから出願されている）に記載されたものである。

改変される特性：
下記に本発明の変異体中に存在する突然変異と、それによりもたらされる特性の望ましい変化（親ターマミル様αアミラーゼの特性と比べて）との関係について考察する。

前述のように本発明は改変された特性、特に生産条件下で改変された特性を有するターマミル様αアミラーゼに関する。

特に意図する特性の変化を実現することと関連して特に検討された親ターマミル様αアミラーゼは、前述の親ターマミル様αアミラーゼおよび親のハイブリッドターマミル様αアミラーゼである。SP722 αアミラーゼを出発点として用いるが、例えばターマミル、BSG、BAN、AA560、SP690、AA180、KSM AP1378、および#707、K38、K36中の対応する位置もまた開示されたものと理解されるべきである。

好ましい実施形態において本発明の変異体は、特に洗濯およびクリーニング条件下で高い溶解度を有する。

一態様において本発明は、前述のように改変された特性を有する変異体に関する。

第一の態様において親ターマミル様αアミラーゼの変異体は、

の群から選択される１または複数の位置（アミノ酸ナンバリングではSEQ ID NO:12を用いる）に変化を含む変異体であって、

（ａ）その変化は独立に、
（ｉ）その位置を占めるアミノ酸の下流に向ってアミノ酸の挿入、
（ｉｉ）その位置を占めるアミノ酸の欠失、または
（ｉｉｉ）異なるアミノ酸によるその位置を占めるアミノ酸の置換であり、
（ｂ）その変異体はαアミラーゼ活性を有し、かつ
（ｃ）各位置はSEQ ID NO: 12で示されるAA560のアミノ酸配列を有する親ターマミル様αアミラーゼのアミノ酸配列の位置に対応する。

SP722（SEQ ID NO:4）ではそのような対応位置は、Ｒ２８、Ｎ９４、Ｌ１１８、Ｎ１２５、Ｑ１７４、Ｒ１８１、Ｇ１８２、Ｄ１８３、Ｇ１８４、Ａ１８６、Ｗ１８９、Ｎ１９５、Ｍ２０２、Ｙ２９８、Ｎ２９９、Ｎ３０２、Ｓ３０３、Ｎ３０６、Ａ３１０、Ｎ３１４、Ｋ３２０、Ｈ３２４、Ｑ３４５、Ｆ３９６、Ｔ４００、Ｗ４３９、Ｑ４４４、Ｎ４４５、Ｋ４４６、Ｑ４４９、Ｋ４５８、Ｎ４７１、Ｋ４８４である。

好ましい実施形態において本発明の変異体（ナンバリングではSEQ ID NO:12を用いる）は、次の１または複数の突然変異／置換、すなわち

を有する。

好ましい二重、三重、および多重突然変異（ナンバリングの基準としてSEQ ID NO:12を用いた）には、

がある。

検討された変異体には、実施例で記述した特定のもの、およびさらに１または複数の突然変異／置換、すなわちDELTA（Ｄ１８３〜Ｇ１８４）；Ｎ１９５Ｆ；Ｒ１８１Ｑ；Ｇ１８６Ｒ；Ｍ２０２Ｌ；Ｖ２０６Ｆ、Ｌ、Ｍ；Ｎ１９３Ｓ、Ｔ、Ｐと組み合わせた前述の突然変異が含まれる。

高い溶解度：
前述の突然変異はすべて、上記の定義のようにターマミル様αアミラーゼのグループ内の任意のαアミラーゼで用いられた場合、改変された溶解度を有するターマミル様αアミラーゼ変異体をもたらす。

したがって好ましい実施形態において本発明の変異体は、

の群から選択される１または複数の位置（アミノ酸のナンバリングではSEQ ID NO:12を用いる）における変化を含む、親ターマミル様αアミラーゼと比べて高い溶解度（さきに定義した）を有する親ターマミル様αアミラーゼの変異体であって、

好ましい実施形態において、親αアミラーゼと比べて高い溶解度を有する本発明の変異体は、次の置換、すなわち

を有する。

好ましい実施形態において高い溶解度（「材料および方法」の項に記載の方法の一つを用いて決定される）を有する本発明の変異体（ナンバリングの基準としてSEQ ID NO:12を用いた）には、

が含まれる。

本発明による別の組合せには、実施例中に記述されている特定の組合せ、および次の置換、すなわちＮ１９５Ｆ；Ｒ１８１Ｑ；Ｇ１８６Ｒ；Ｍ２０２Ｌ；Ｖ２０６Ｆ、Ｌ、Ｍ；Ｎ１９３Ｐの１または複数が含まれる。

安定性：
本発明の文脈において改変された安定性、具体的には改良された安定性（すなわち、より高いまたはより低い）、特に高ｐＨ（すなわちpH 8 ~10.5）における安定性に関して重要な突然変異には、「改変された特性」の項でリストアップした突然変異のいずれかが含まれる。

Ｃａ²⁺安定性：
改変されたＣａ²⁺安定性とは、Ｃａ²⁺が消耗したときの酵素の安定性、すなわちより高いまたはより低い安定性が改良されたことを意味する。本発明の文脈において改変されたＣａ²⁺安定性、具体的には改良されたＣａ²⁺安定性、すなわち特に高ｐＨ（すなわちpH 8 〜10.5）における高いまたはより低い安定性を達成することに関して重要な突然変異（アミノ酸の置換および欠失を含む）には、「改変された特性」の項でリストアップした突然変異のいずれかが含まれる。

比活性：
本発明の更なる態様において、改変された比活性、具体的には特に温度１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃、特に３０〜４０℃における比活性の増加または減少を示す変異体を得ることに関して重要な突然変異（アミノ酸の置換および欠失を含む）には、「改変された特性」の項でリストアップした突然変異のいずれかが含まれる。

本発明の変異体における一般的な突然変異：
特に興味深い突然変異（アミノ酸の置換および欠失を含む）は、酵素の活性部位のまわりの動きやすさを増加させる突然変異である。これは活性部位の近傍、すなわち活性部位を構成する残基のいずれかから好ましくは１０Åまたは８Åまたは６Åまたは４Å以内で安定化をもたらす相互作用を乱す変化によって達成される。

例には、ＡｌａからＧｌｙ；ＶａｌからＡｌａまたはＧｌｙ；ＩｌｅまたはＬｅｕからＶａｌ、Ａｌａ、またはＧｌｙ；ＴｈｒからＳｅｒなどの側鎖のサイズを減少させる突然変異がある。

このような突然変異は空洞の導入、または突然変異によって残った空間を充たす構造的再配列のいずれかにより活性部位領域の柔軟性の増加を引き起こすと考えられる。

本発明の変異体は上記で略述したものに加えて１または複数の修飾を含むことが好ましい。したがって有利には修飾されるαアミラーゼの変異体の一部に存在する１または複数のプロリン残基を非プロリン残基で置換することができ、この非プロリン残基は考えられる天然に産する非プロリン残基のいずれであってもよく、また好ましくはアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、バリン、またはロイシンである。

同様に、親αアミラーゼを修飾するアミノ酸残基中に存在する１または複数のシステイン残基をセリン、アラニン、スレオニン、グリシン、バリン、またはロイシンなどの非システイン残基で置換することが好ましい。

さらに本発明の変異体は、単独の修飾として、または上記に略述した修飾のいずれかと組み合わせて、SEQ ID NO:10のアミノ酸断片１８５〜２０９位に対応するアミノ酸断片中に存在する１または複数のＡｓｐおよび／またはＧｌｕがそれぞれＡｓｎおよび／またはＧｌｎに置換されるように修飾してもよい。また、ターマミル様αアミラーゼ中で、SEQ ID NO:10のアミノ酸断片１８５〜２０９位に対応するアミノ酸断片中に存在するＬｙｓ残基の１または複数をＡｒｇに置換することも興味深い。

本発明が上記に略述した修飾の２つ以上を組み込んだ変異体を包含することが理解されよう。

さらに、有利には下記の１または複数の位置（ナンバリングではSEQ ID NO:10(Termamyl(商標))を用いる)に突然変異を導入することができる。すなわち、

Ｍ１５、Ｖ１２８、Ａ１１１、Ｈ１３３、Ｗ１３８、Ｔ１４９、Ｍ１９７、Ｎ１８８、Ａ２０９、Ａ２１０、Ｈ４０５、Ｔ４１２、特に下記の単一、二重、または三重もしくは多重突然変異：

Ｍ１５Ｘ、特にＭ１５Ｔ、Ｌ；
Ｖ１２８Ｘ、特にＶ１２８Ｅ；
Ｈ１３３Ｘ、特にＨ１３３Ｙ；
Ｎ１８８Ｘ、特にＮ１８８Ｓ、Ｔ、Ｐ；
Ｍ１９７Ｘ、特にＭ１９７Ｔ、Ｌ；
Ａ２０９Ｘ、特にＡ２０９Ｖ；
Ｍ１９７Ｔ／Ｗ１３８Ｆ；Ｍ１９７Ｔ／Ｗ１３８Ｙ；Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ；

Ｍ１５／Ｖ１２８Ｅ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ；Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ；Ｄ１２４Ｃ／Ｒ１２７Ｃ；Ｈ１３３Ｙ／Ｔ１４９Ｉ；Ｇ４７５Ｒ、Ｈ１３３Ｙ／Ｓ１８７Ｄ；Ｈ１３３Ｙ／Ａ２０９Ｖ；

ＡＡ５６０ではこれは、Ｌ１７Ｘ、特にＬ１７Ｔ；
Ｅ１３０Ｘ；
Ｙ１３５Ｘ；
Ｗ１４０Ｘ、特にＷ１４０Ｆ、Ｙ；
Ｔ１９３Ｘ、特にＴ１９３Ｓ、Ｐ；
Ｍ２０２Ｘ、特にＭ２０２Ｔ、Ｌ；
Ｖ２１４Ｘに対応し；
検討されたこれらの組合せには、
Ｍ２０２Ｔ／Ｗ１４０Ｆ；Ｍ２０２Ｔ／Ｗ１４０Ｙ；Ｌ１７Ｔ／Ｔ１９３Ｓ；Ｌ１７Ｔ／Ｎ１９３Ｐ；Ｅ１２１Ｃ／Ｓ１３２Ｃ；Ｎ１２６Ｃ／Ｑ１２９Ｃ；Ｔ１５１Ｉ；Ｇ４８０Ｒが含まれる。

本発明のαアミラーゼ変異体の調製方法：
遺伝子中に突然変異を導入するには幾つかの方法が当業界で知られている。αアミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニングについて簡単な考察の後、αアミラーゼをコードする配列内の特定の部位で突然変異を生じさせる方法について考察することにする。

αアミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニング：
親αアミラーゼをコードするＤＮＡ配列は、当業界でよく知られているさまざまな方法を用いて検討対象になっているαアミラーゼを産生する任意の細胞または微生物から単離することができる。まず、試験されるαアミラーゼを産生する生物由来の染色体ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを用いてゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡのライブラリーを構築する。次いで、αアミラーゼのアミノ酸配列が知られている場合は、相同の標識したオリゴヌクレオチドプローブを合成し、使用して検討対象になっている生物から調製されたゲノムライブラリーからαアミラーゼをコードするクローンを識別することができる。別法では、知られているαアミラーゼの遺伝子と相同の配列を含む標識したオリゴヌクレオチドプローブを、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いたαアミラーゼをコードするクローンを識別するためのプローブとして使用することができる。

αアミラーゼをコードするクローンを識別するためのさらに別の方法は、プラスミドなどの発現ベクターにゲノムＤＮＡの断片を導入し、得られたゲノムＤＮＡライブラリーでαアミラーゼ陰性細菌を形質転換し、次いで形質転換された細菌をαアミラーゼ用の基質を含有する寒天上で培養し、それによってクローンが識別すべきαアミラーゼを発現するのを可能にするものである。

別法では、酵素をコードするＤＮＡ配列を確立されている標準的な方法、例えばS.L.BeaucageおよびM.H.Caruthersの論文、Tetrahedron Letters 22, 1981, pp.1859~1869に記載されているホスホロアミダイト法、またはMattes等の論文、The RMBO J. 3, 1984, pp.801~805に記載されている方法により合成的に調製することができる。ホスホロアミダイト法ではオリゴヌクレオチドを、例えば自動ＤＮＡ合成装置で合成し、精製し、アニールし、連結反応させ、適切なベクター中でクローン化する。

結局ＤＮＡ配列は標準的な技術に従って、合成、ゲノム、またはｃＤＮＡ由来の断片（適宜、ＤＮＡ配列全体のさまざまな部分に対応する断片）を連結反応させることによって調製される、ゲノムと合成由来の混合配列、合成とｃＤＮＡ由来の混合配列、またはゲノムとｃＤＮＡ由来の混合配列であってもよい。ＤＮＡ配列はまた、例えば米国特許第4,683,202号またはR. K. Saiki等の論文、Science 239, 1988, pp.487~491に記載されているように特異的プライマーを用いた重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製することもできる。

αアミラーゼ変異体の発現：
本発明によれば、前述の方法によって、または当業界で知られている任意の別の方法によって生成される変異体をコードするＤＮＡ配列は、一般にプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始信号、および任意選択でリプレッサー遺伝子またはさまざまなアクチベーター遺伝子をコードする制御配列を含む発現ベクターを用いて酵素の形態で発現させることができる。

本発明のαアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を担持する組換え発現ベクターは、便利には組換えＤＮＡ手順に従わせることができる任意のベクターであり、ベクターの選択はそれが導入されることになる宿主細胞に左右されることが多い。したがってこのベクターは、自己複製ベクターすなわち染色体外の存在物として存在するベクター；染色体複製物とは無関係の複製物、例えばプラスミド、バクテリオファージ、または染色体外の構成分子；ミニクロモソーム；あるいは人工の染色体であってもよい。別法ではこのベクターは、宿主細胞に導入された場合、宿主細胞のゲノム中に取り込まれ、それを取り込んだ染色体と一緒に複製されるものであってもよい。

このベクター中でＤＮＡ配列は、適切なプロモーター配列と作動可能に結合することになる。このプロモーターは、選択された宿主細胞中で転写活性を示し、宿主細胞と相同または非相同いずれかの、遺伝子をコードするタンパク質から得ることができる任意のＤＮＡ配列であってよい。特に細菌性の宿主中で本発明のαアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列の転写に向わせるのに好適なプロモーターの例には、E.coliのLacオペロンのプロモーター、Streptomyces coelicolorアガラーゼ遺伝子dagAのプロモーター群、B. licheniformis αアミラーゼ遺伝子（amyL）のプロモーター群、B. stearothermophilus マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（amyM）のプロモーター群、B. amyloliquefaciens αアミラーゼ遺伝子（amyQ）のプロモーター群、B. subtilis xylAおよびxylB遺伝子のプロモーター群などがある。真菌性の宿主中での転写の場合、有用なプロモーターの例には、A. oryzae TAKA アミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、A. niger中性αアミラーゼ、A. niger 酸安定性αアミラーゼ、A. nigerグルコアミラーゼ、Rhizomucor mieheiリパーゼ、A. oryzaeアルカリ性プロテアーゼ、A. oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼ、またはA. nidulansアセトアミダーゼがある。

本発明の発現ベクターはまた、適切な転写ターミネーター、また真核生物では本発明のαアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列と作動可能に結合したポリアデニル化配列を含むことができる。終結およびポリアデニル化配列は、適切にはプロモーターと同じ供給源から得ることができる。

ベクターはさらに、検討対象になっている宿主細胞中でベクターが複製を行なうのを可能にするＤＮＡ配列を含むことができる。このような配列の例は、プラスミドpUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、およびpIJ702の複製開始点である。

ベクターはまた、選択可能な遺伝標識、例えばB. subtilis またはB. licheniformis由来のdal遺伝子など、その生成物が宿主細胞中の欠損を補完する遺伝子、あるいはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリン耐性など抗生物質耐性を付与する遺伝子を含むことができる。さらにベクターは、amdS、argB、niaD、およびsCなどのAspergillus選択マーカー、ヒグロマイシン耐性を生じさせるマーカーを含んでもよく、あるいはその選択は、例えば国際特許公開第91/17243号に記載のように同時形質転換によって達成することもできる。

細胞内発現は、例えば宿主細胞として或る種の細菌を用いる場合には幾つかの点で有利であるかも知れないが、一般には発現は細胞外であることが好ましい。一般に、本明細書に記述されたBacillus αアミラーゼは、発現したプロテアーゼの培地中への分泌を可能にする予備領域を具備している。望むならばこの予備領域は別の予備領域またはシグナル配列で置き換えることができ、便利にはそれぞれの予備領域をコードするＤＮＡ配列の置換によって達成される。

αアミラーゼ変異体、そのプロモーター、ターミネーター、およびその他の構成分子をそれぞれコードする本発明のＤＮＡ構築物を連結反応させるために、またそれらを複製に必要な情報を含有する適切なベクター中に挿入するために使用される手順は、当業技術者によく知られている（例えば、Sambrook等の著書、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989を参照されたい）。

さきに定義したように本発明のＤＮＡ構築物または発現ベクターのいずれかを含む本発明の細胞は、本発明のαアミラーゼ変異体の組換え産物の宿主細胞として使用するのが有利である。この細胞は、便利には宿主の染色体にそのＤＮＡ構築物を組み込む（１または複数のコピーに）ことにより、変異体をコードする本発明のＤＮＡ構築物で形質転換することができる。この組込みは、細胞中の方がＤＮＡ配列がより安定に保たれやすいので有利であると一般に考えられている。ＤＮＡ構築物の宿主染色体中への組込みは、従来の方法に従って、例えば相同的または非相同的組換えによって行なうことができる。別法では細胞は、異なる種類の宿主細胞と結びつけて前述のように発現ベクターで形質転換することができる。

本発明の細胞は、哺乳類または昆虫などのより高度の生物の細胞であってもよいが、好ましくは微生物の細胞、例えば細菌または真菌（酵母を含む）の細胞である。

好適な細菌の例は、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis、Bacillus lentus、Bacillus brevis、Bacillus stearothermophilus、Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus coagulans、Bacillus circulans、Bacillus lautus、Bacillus megaterium、Bacillus cillus thuringiensis、またはStreptomyces lividansとStreptomyces murinusなどのグラム陽性菌、あるいはE. coliなどのグラム陰性菌である。細菌の形質転換は、例えば原形質体の形質転換により、または公知のやり方でコンピテント細胞を用いることにより行なうことができる。

酵母生物は、好都合にはSaccharomycesまたはSchizosaccharomycesの種、例えばSaccharomyces cerevisiaeから選択することができる。糸状菌は、有利にはAspergillusの種、例えばAspergillus oryzaeまたはAspergillus nigerに属することができる。真菌細胞は、原形質体の形成および原形質体の形質転換、続いて細胞壁の再生を含むプロセスによって公知の方法で形質転換することができる。Aspergillus宿主細胞の形質転換の適切な手順は、欧州特許公開第238 023号に記載されている。

更なる態様において本発明は、変異体の生産に役立つ条件下で前述のように宿主細胞を培養すること、ならびに細胞および／または培地からその変異体を回収することを含む、本発明のαアミラーゼ変異体の生産方法に関する。

細胞を培養するために使用される培地は、検討対象になっている宿主細胞を増殖させ、本発明のαアミラーゼ変異体を発現させるのに適した任意の従来の培地であってよい。好適な培地は営利目的の供給業者から入手可能であり、あるいは出版物に掲載されている処方（例えば、American Type Culture Collectionのカタログに記載されている）に従って調製することができる。

宿主細胞から分泌されたαアミラーゼ変異体は、細胞を遠心分離または濾過によって培地から分離すること、硫酸アンモニウムなどの塩によって培地のタンパク質成分を沈殿させること、続いてイオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィなどのクロマトグラフの手順を用いることなどを含む周知の手順により培地から回収するのが便利である。

産業面への応用：
本発明のαアミラーゼ変異体は、さまざまな産業面の応用を可能にする有用な特性を持っている。具体的には本発明の酵素の変異体は、洗濯、皿洗い、および硬い表面のクリーニング用洗剤組成物の成分として応用できる。改変された特性を有する本発明の変異体は、デンプンの製造プロセス、具体的にはデンプンの転化、特にデンプンの液化に用いることができる（例えば、米国特許第3,912,590号、欧州特許公開第252 730号および第63 909号、国際特許公開第99/19467号を参照されたい）。

さらに、本発明の変異体はまた、特にデンプンからの甘味料およびエタノールの生産、および／または繊維の糊抜きに有用である。

組成物：
一態様において本発明は、本発明の変異体を含む組成物に関する。一実施形態において本発明の組成物は１または複数の別の酵素を含み、それにはリパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グルコアミラーゼ、ペルオキシダーゼ、もしくはラッカーゼ、および／または別のαアミラーゼなどの群から選択される１または複数の酵素がある。

洗剤組成物：
前述のように本発明の変異体は、洗剤組成物に配合するのに適している。洗剤組成物（洗濯または皿洗い用洗剤など）の関連する成分、このような洗剤組成物中に変異体を配合する適切な方法、および関連性のある洗剤組成物の種類の例に関してさらに詳細には、例えば国際特許公開第96/23874号および第97/07202号に参照されている。

本発明の変異体を含む洗剤組成物は、追加してリパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グルコアミラーゼ、ペルオキシダーゼ、もしくはラッカーゼ、および／または別のαアミラーゼなどの１または複数の別の酵素を含むことができる。

本発明のαアミラーゼ変異体は、従来採用している濃度で洗剤中に配合することができる。本発明の変異体は、洗剤の従来の用量レベルを用いた洗濯／皿洗い液１リットル当たりαアミラーゼ0.00001~10 mg（純粋な活性酵素タンパク質として計算）に相当する量を配合することが現在検討されている。

本発明はまた、親αアミラーゼと比べて改変された特性、具体的には溶解度、特に高い溶解度、基質特異性、基質結合、基質切断パターン、温度安定性、酵素活性のｐＨ依存、安定性のｐＨ依存、酸化に対する安定性、ＣＡ²⁺依存性、および比活性の改変された特性を有するαアミラーゼを提供する方法に関するもので、その方法は

（ａ）親αアミラーゼの三次元構造を描くために添付資料１に表されているSEQ ID NO: 4の三次元構造に倣って親αアミラーゼをモデル化するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた三次元構造において、その構造の一部分の変化が上記改変された特性をもたらすと予想される、親の構造の少なくとも一部分を識別するステップ、
（ｃ）親αアミラーゼをコードする核酸の配列を修飾して、上記構造の一部分に対応する位置で１または複数のアミノ酸の欠失、挿入、または置換をコードする核酸を生成するステップ、および
（ｄ）修飾された核酸を宿主細胞中で発現させて、αアミラーゼ酵素活性を有し、かつ親と比べて少なくとも１つの改変された特性を有する変異体αアミラーゼを産生するステップ、を含む。

一実施形態においてこの方法は、親と比べて改変された特性を有する親αアミラーゼの変異体を構築する方法であり、この親αアミラーゼはSEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、または13の配列を持つか、あるいは上記配列と少なくとも６０％同一の配列（前述のように決定された）を持ち、この方法は
（ａ）親αアミラーゼの三次元構造を描くために添付資料１に表されているSEQ ID NO: 4の三次元構造に倣って親αアミラーゼをモデル化するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた三次元構造を、上記特性が親αアミラーゼと異なった関連のないαアミラーゼの三次元構造と比較するステップ、
（ｃ）その関連のないαアミラーゼの三次元構造とは異なり、かつ上記特性と関連性があると予想される、ステップ（ａ）で得られた三次元構造の構造の一部分を識別するステップ、
（ｄ）親αアミラーゼをコードする核酸の配列を修飾して、上記構造の一部分に対応する位置で１または複数のアミノ酸の欠失、挿入、または置換をコードする核酸を生成するステップ、および
（ｅ）修飾された核酸を宿主細胞中で発現させて、αアミラーゼ活性を有し、かつ親と比べて１または複数の改変された特性を有する変異体αアミラーゼを産生するステップ、を含む。

検討されたターマミル様αアミラーゼは上記のものである。
ポリペプチドの溶解度を増加させる方法：
本発明はまた、酵素などのポリペプチド、具体的にはターマミル様αアミラーゼの溶解度を増加させる方法に関する。

本発明の方法は、タンパク質の結晶中に配置された隣りのポリペプチド分子に近接した位置を占める１または複数のアミノ酸残基の置換、挿入、および／または欠失を含む。本発明の文脈において隣りの分子に近接した位置を占めるポリペプチドのアミノ酸残基とは、それが結晶または沈殿中の隣りの酵素分子に配置されているアミノ酸残基から潜在的に分子間で相互作用する距離内にあるというやり方でポリペプチド中に配置されたアミノ酸残基を指す。

潜在的な分子間相互作用の例には、水素結合、塩架橋の形成、極性相互作用、および芳香族相互作用があるがこれらには限定されない。

本発明の文脈で用語「隣り」とは、例えば「Protein Crystallization Techniques, Strategies, and Tips」（A Laboratory Manual、Terese M. Bergfors著）、またはインターネットサイト：www.hamptonresearch.com. の記述のように調製されている結晶構造中の２つの位置の間の最も近い距離を意味する。

したがってこの態様において本発明は、酵素の結晶の溶解度を増加させる方法に関するもので、その方法は

１）三次結晶構造中の隣りのポリペプチド分子の６．０Åの距離内に位置し、かつ
２）その隣りのポリペプチド分子と相互作用する
１または複数のアミノ酸残基を、例えば置換または欠失によって突然変異させる。

好ましい実施形態においては、突然変異されるアミノ酸残基は隣りのポリペプチド分子の３．５Åに位置する。

検討されたポリペプチドには、抗菌性ポリペプチド、およびインスリン、成長ホルモン、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子などの生物活性を有するポリペプチドが含まれる。

検討された酵素活性には、プロテアーゼ、アミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、カルボヒドラーゼ、トランスフェラーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、リパーゼ、セルラーゼ、クチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチンリアーゼの活性が含まれる。

好ましい実施形態において酵素は、アミラーゼ、好ましくはαアミラーゼ、特に下記にさらに記述することになるターマミル様αアミラーゼである。

基質に「近接」したアミノ酸位置とは、単一水分子が介在するタンパク質−タンパク質相互作用に対応する６Å未満の距離を指す。好ましい実施形態において、基質に近接したアミノ酸位置とは、直接のタンパク質−タンパク質相互作用に対応する３．５Å未満の距離を指す。

ターマミル様αアミラーゼの溶解度を増加させる方法：
この態様において本発明は、ターマミル様αアミラーゼ結晶の溶解度を増加させる方法に関するもので、その方法は

１）三次結晶構造中の隣り合うターマミル様αアミラーゼ分子が６Åの距離内に配置され、かつ
２）その隣り合うターマミル様αアミラーゼ分子と相互作用する、
１または複数のアミノ酸残基を、例えば置換または欠失によって突然変異する。
好ましい実施形態においては、突然変異されるアミノ酸残基は、隣りのターマミル様αアミラーゼから３．５Åに位置する。添付資料１に表されているSP722の結晶構造は、隣り合うターマミル様αアミラーゼの間の距離を決定するための基準（固定点）として用いることができる。

しかしながら、基準（固定点）の結晶が添付資料１に表されているSP722からモデル化（上記、または国際特許公開第96/23874号に記載されている）される構造であるということは、本発明の範囲内にある。

好ましいターマミル様αアミラーゼには、B. licheniformis、B. amyloliquefaciens、B. stearothermophilus、Bacillus種のNCIB 12289、NCIB 12512、NCIB 12513、またはDSM 9375、あるいはDSMZ no.12649、KSM AP1378の株から得られるαアミラーゼからなる群から選択されたBacillus αアミラーゼがある。ターマミル様αアミラーゼは、SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、および13で表される群から選択されたαアミラーゼのいずれか、あるいはSEQ ID NO: 4との同一性の度合いが少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは少なくとも８０％、一層好ましくは少なくとも約９０％、一層好ましくは少なくとも９５％、一層好ましくは少なくとも９７％、一層好ましくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を有するターマミル様αアミラーゼ、あるいは低い、好ましくは中位の、好ましくは高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、SEQ ID NO: 11の核酸配列を備えた核酸配列によってコードされるターマミル様αアミラーゼであることができる。この条件は上記でさらに詳細に記述されている。

直近のアミラーゼ分子から６Å未満のところに存在するターマミル様αアミラーゼのアミノ酸残基は、下記のものである（SP722のナンバリングを用いた）。

直近のアミラーゼ分子から３．５Å未満のところに存在するターマミル様αアミラーゼのアミノ酸残基は下記のもの（SP722のナンバリングを用いた）、すなわち

直近のアミラーゼ分子から６．０Å未満のところに存在するアミノ酸残基は、SP722アミラーゼのモデル構造中に識別される下記の位置である。

直近のアミラーゼ分子から３．５Å未満のところに存在するアミノ酸残基は、SP722アミラーゼのモデル構造中に識別される下記の位置である。

直近のアミラーゼ分子から６．０Å未満のところに存在するアミノ酸残基は、AA560アミラーゼのモデル構造中に識別される下記の位置である。

直近のアミラーゼ分子から３．５Å未満のところに存在するアミノ酸残基は、AA560アミラーゼのモデル構造中に識別される下記の位置である。

高い溶解度したがって高性能をもたらすαアミラーゼ中の置換
一般に何らかのタンパク質−タンパク質相互作用を妨害または消失させる任意の置換は高い溶解度、したがって特定の用途で高い性能をもたらす。したがってタンパク質−タンパク質相互作用に加担するアミノ酸残基を、より高い溶解度をもたらす荷電または非荷電アミノ酸になるように、より大きい、より小さい、より疎水性、より親水性のものに変えることができる。

より大きいアミノ酸残基は、相互作用に対する立体障害になることができ、またより小さいアミノ酸残基は、相互作用する残基の間の距離を広げて相互作用を弱める。極性の相互作用、特に塩架橋は、関係する残基の少なくとも１つを疎水性の残基に変えることにより、関係する残基の少なくとも１つを、距離を広げて強い相互作用にする小さい残基に変えることにより、あるいは関係する残基の少なくとも１つを、立体障害になる大きい残基に変えることにより消失する。疎水性の相互作用は、相互作用するアミノ酸の１つを親水性のアミノ酸残基に変えることによって効果的に消失するが、より小さい、またはより大きい疎水性の残基もまたこの種の相互作用を消失させることができる。芳香族の相互作用は、親水性の残基または小さい疎水性の残基に変えることによって防ぐことができる。

材料および方法
酵素：
SP722: SEQ ID NO: 4は、Novozymesから入手可能で国際特許公開第95/26397号に開示されている。

AA560: SEQ ID NO: 12は、国際特許公開第00/60060号に開示されNovozymes A/Sから入手可能；デンマーク特許出願第PA 1999 00490号に開示されている；DSMZで１９９９年１月２５日に寄託され、DSMZ No. 12649が割り当てられている。

AA560は、Deutshe Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig DEにおける特許手続きのための微生物供託の国際承認に関するブタペスト条約の合意の下に本発明者等によって供託された。

Bacillus subtilis SHA273については、国際特許公開第95/10603号を参照されたい。

プラスミド：
pJE1は、SP722αアミラーゼ（SEQ ID NO: 4）の変異体、すなわち成熟タンパク質中のアミノ酸Ｄ１８３〜Ｇ１８４に対応する６個のヌクレオチドの欠失をコードする遺伝子を含有する。JE1遺伝子の転写はamyLプロモーターから指示される。プラスミドはさらにまた、複製開始点、およびプラスミドpUB110（gryczan, TJ等の論文、J. Bact. 34: 318〜329 (1978)）から得られる、カナマイシン耐性を付与するcat遺伝子を含有する。

「方法」
モデルの組立て：
「The Protein Data Bank (PDB) (<http://www.pdb.bnl.gov/>)」または「The Brookhaven databank at Brookhaven National Laboratory, US」などのタンパク質構造データベースが、モデルを組み立てようとしている検討対象になっている分子と似たタンパク質を探すために検索される。アミノ酸配列は構造的に保存される領域を考慮に入れてアライニングされ、座標は基準タンパク質から主題のタンパク質にコピーされる。挿入および欠失を有する領域の座標は、似たアミノ酸配列を有する別のタンパク質からか、または大部分の３Ｄソフトウェアパッケージ、例えばHomology from Biosym, MSI中に見出されるランダム構造生成機能を用いることによるかのいずれかで割り当てられる。

例えばBiosym, MSIのディスカバープログラム中のコマンドEND REPAIRおよびSPLICE REPAIRによって座標が主題のタンパク質のすべてのアミノ酸に割り当てられ、断片がつなぎ合わされたとき、モデルは精巧なものになる。モデルのエネルギーは、まず分子を弛緩させる（ディスカバープログラム中のRELAXコマンド）ことによってできるだけ少なくし、次に分子動力学によってできるだけ少なくする。参考資料は、相同組立て用ソフトウェアのマニュアル、例えばHomology from Biosym, MSI中に見出すことができる。

ライブラリーベクターpDorK101の構築：
E.coli / BacillusシャトルベクターpDorK101（下記に記述する）を用いてE.coli中でαアミラーゼを発現させることなく突然変異を導入し、次いでαアミラーゼがBacillus中で活性であるような方法で修飾することができる。ベクターは次のように構築された。すなわち、JE1をコードする遺伝子（Ｄ１８３〜Ｇ１８４の欠失をもつSP722）を、E.coli複製開始点を含有する１．２ｋｂ断片によるSEQ ID NO: 4 : SP722の５′コード化領域中のPstI部位での遺伝子切断によってpJE1中で不活性化した。この断片をフォワードプライマー：5′-gacctgcagtcaggcaacta-3′およびリバースプライマー：5′-tagagtcgacctgcaggcat-3′を用いてpUC19（GenBank Accession #: XO2514）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲアンプリコンおよびpJE1ベクターをPstIで３７℃で２時間消化した。pJE1ベクター断片およびＰＣＲ断片を室温で１時間連結反応させ、E.coli中で電気形質転換法により形質転換した。得られたベクターをpDorK101と呼ぶ。

フィルタースクリーニング検定：
この検定は、親酵素と比べて高ｐＨで安定性の改良されたターマミル様αアミラーゼ変異体、およびスクリーニング温度の設定次第では親酵素と比べて高ｐＨかつ中位の温度で安定性の改良されたターマミル様αアミラーゼ変異体のスクリーニングに用いることができる。

高ｐＨフィルター検定：
Bacillusライブラリーを、ＴＹ寒天プレート上の酢酸セルロース（OE 67、Schleicher & Schuell, Dassel, Germany）とニトロセルロースフィルター（Protran-Ba 85、Schleicher & Schuell, Dassel, Germany）のサンドイッチ上で、カナマイシン 10μg/mlとともに３７℃で少なくとも２１時間培養する。酢酸セルロース層はＴＹ寒天プレート上に配置される。

各フィルターのサンドイッチにはフィルター上の陽性変異体の位置を突きとめるために培養後、インキュベーション前に針で特定の標識を付け、結合した変異体を含むニトロセルロースフィルターをグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．６〜１０．６）を含む容器に移し、室温（１０〜６０℃まで変えることができる）で１５分間インキュベートする。コロニーを含む酢酸セルロースフィルターは、使用するまでＴＹプレート上に室温で保管される。インキュベーション後、グリシン／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．６〜１０．６）中にアガロース１％、デンプン０．２％を含むプレート上で残留活性を検出する。ニトロセルロースフィルターを備えた検定プレートをフィルターサンドイッチと同じ方法で標識し、室温で２時間インキュベートする。フィルターを除去した後、検定プレートを１０％ルゴール液で染色する。デンプンを分解する変異体は、紺青色の背景上に白い斑点として検出され、次いで保存プレート上で同定される。陽性変異体を最初のスクリーニングと同じ条件で２回再スクリーニングする。

低カルシウム検定：
Bacillusライブラリーを、ＴＹ寒天プレート上の酢酸セルロース（OE 67、Schleicher & Schuell, Dassel, Germany）とニトロセルロースフィルター（Protran-Ba 85、Schleicher & Schnell, Dassel, Germany）のサンドイッチ上で、関連性のある抗生物質、例えばカナマイシンまたはクロラムフェニコールとともに３７℃で少なくとも２１時間培養する。酢酸セルロース層はＴＹ寒天プレート上に配置される。

各フィルターのサンドイッチにはフィルター上の陽性変異体の位置を突きとめるために培養後、インキュベーション前に針で特定の標識を付け、結合した変異体を含むニトロセルロースフィルターを炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ８．５〜１０）を含み、さまざまなＥＤＴＡ濃度（0.001〜100mM）を有する容器に移す。フィルターを室温で１時間インキュベートする。コロニーを含む酢酸セルロースフィルターは、使用するまでＴＹプレート上に室温で保管される。インキュベーション後、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ８．５〜１０）中にアガロース１％、デンプン０．２％を含有するプレート上で残留活性を検出する。ニトロセルロースフィルターを備えた検定プレートをフィルターサンドイッチと同じ方法で標識し、室温で２時間インキュベートする。フィルターを除去した後、検定プレートを１０％ルゴール液で染色する。デンプンを分解する変異体は、紺青色の背景上に白い斑点として検出され、次いで保存プレート上で同定される。陽性変異体を最初のスクリーニングと同じ条件で２回再スクリーニングする。

考察の対象となっている領域を得る方法：
細菌性αアミラーゼには３つのよく知られた３Ｄ構造がある。その２つはB. licheniformisαアミラーゼ、Brookhaven database 1BPL（Machius等の論文、J. Mol. Biol. 246, p.545~559 (1995)）および1VJS（Song等の著書、Enzymes for Carbohydrate 163 Engineering（Prog. Biotechnol. V 12 (1996)））である。これらの２つの構造は、２個のカルシウムイオンと１個のナトリウムイオンの結合部位周辺の領域で、いわゆるＢドメインから構造の重要な一片を欠いている。したがって本発明者等は、BAN(商標)（SEQ ID NO: 5）とB. lichenifomisαアミラーゼ（SEQ ID NO: 4）の間の雑種であるαアミラーゼBA2（国際特許公開第96/23874号）の３Ｄ構造を用いた。この構造に基づいてB. licheniformisαアミラーゼおよびSP722αアミラーゼのモデルを組み立てた。

αアミラーゼ変異体の発酵および精製：
発酵および精製は、当業界でよく知られいる方法によって行なうことができる。

安定性の決定：
すべての安定性試験は、同一の装置を用いて行なう。方法は下記のとおりである。酵素を関連する条件（１〜４）下でインキュベートする。試料をさまざまな時点で、例えば０、５、１０、１５、および３０分後に採取し、検定緩衝液（50mMブリトン緩衝液0.1ml、ｐＨ７．３）中で２５倍に希釈（採取したすべての試料について同じ希釈）し、ｐＨ７．３、３７℃の標準条件下でPhadebas検定法（Pharmacia）を用いて活性を測定する。

インキュベーションの前（０分）に測定した活性を基準（１００％）として使用する。低下％をインキュベーション時間の関数として計算する。表は、インキュベーションの例えば３０分後の残留活性を示いている。

比活性の決定：
比活性は、Phadebas検定法（Pharmacia）を用いて酵素１ｍｇ当たりの活性として決定される。製造業者の指示は下記のとおりである（また、下記の「αアミラーゼ活性の検定」も参照されたい）。

溶解度の決定Ｉ：
精製した酵素を選択された緩衝液に対して夜通し透析する。標準条件は、0.02MトリスHClおよび0.15M NaCl、ｐＨ７．５、室温である。ミリポア限外濾過膜、YM10、NMWL:10,000を用いて酵素約４０ｍｇを含有する配合物をアミコンセル上で濃縮する。酵素の濃縮に続いて、そのプロセスの前およびその間A₂₈₀を測定する。沈殿が起こり始めたら濃縮のステップを停止する。沈殿物が実際にアミラーゼであることを確かめるために上澄み中の活性の測定を行なう。次いで緩衝液を加えることによって室温で沈殿物を再度溶解し、タンパク質濃度を測定する。

溶解度の決定ＩＩ：
精製した酵素を再度、選択された緩衝液に対して夜通し透析する。標準条件は、0.01Mホウ酸、0.01M KCl、0.002M CaCl₂、および0.15M NaCl、ｐＨ７．５である。ミリポア限外濾過膜、YM10、NMWL:10,000を用いて酵素約４０ｍｇを含有する配合物をアミコンセル上で濃縮する。酵素の濃縮に続いて、そのプロセスの前およびその間A₂₈₀を測定する。沈殿が起こり始めたら濃縮のステップを停止する。沈殿物が実際にアミラーゼであることを確かめるために上澄み中の活性の測定を行なう。次いで緩衝液を加えることによって室温で沈殿物を再度溶解し、タンパク質濃度を測定する。

αアミラーゼ活性の検定法：
１．Phadebas検定法
αアミラーゼ活性は、基質としてPhadebas(登録商標)錠剤を使用する方法によって決定される。Phadebas錠剤(Phadebas(登録商標)アミラーゼ試験、Pharmacia Diagnosticにより提供される）は、架橋した不溶性の青色デンプンポリマーを含有しており、ウシ血清アルブミンおよび緩衝物質と混合して錠剤にしたものである。

一測定ごとに１個の錠剤を、50mMブリトン−ロビンソン緩衝液5 ml （50mM酢酸、50mMリン酸、50mMホウ酸、0.1mM CaCl₂、ｐＨはNaOHで検討の対象となっている値に調整）を含む管中で懸濁させる。試験は水浴中で検討の対象となっている温度で行なう。試験されるαアミラーゼは50mMブリトン−ロビンソン緩衝液xml中で希釈する。このαアミラーゼ溶液1 mlを50mMブリトン−ロビンソン5 mlに加える。デンプンを、可溶性の青色断片を生ずるαアミラーゼによって加水分解する。620nmで分光光度的に測定される得られた青色溶液の吸光度は、620nmで分光光度的に測定され、αアミラーゼ活性の関数である。

１０または１５分間のインキュベーション（試験時間）後の測定された620nm吸光度が、620nmで吸光度単位０．２〜２．０の範囲にあることが重要である。この吸光度の範囲で活性と吸光度の間には線形性がある（ランバート−ベールの法則）。したがって酵素の希釈は、この基準に合致するように調整されなければならない。特定の一組の条件（温度、ｐＨ，反応時間、緩衝液の条件）下で所与のαアミラーゼ1 mgは、一定量の基質を加水分解し、青色を生ずることになる。色の強度は620nmで測定する。測定された吸光度は、所与の一組の条件下での検討対象になっているαアミラーゼの比活性（純粋なαアミラーゼタンパク質1 mg当たりの活性）に正比例する。

２．他の選択可能な方法
αアミラーゼ活性は、PNP-G7基質を使用する方法によって決定される。ｐ−ニトロフェニル−α，Ｄ−マルトヘプタオシドの省略形であるPNP-G7は、エンド−アミラーゼによって切断することができるブロック化したオリゴ糖である。切断に続いてキット中に含まれるαグルコシダーゼが基質を消化して自由なPNP分子を遊離し、それは黄色を有し、したがってλ=405nm（400~420nm）で可視分光測定によって測定することができる。PNP-G7基質およびαグルコシダーゼを含有するキットは、Boehringer-Mannheimによって製造されている（カタログ番号1054635）。

基質を調製するには、基質（BM 1442309）１瓶を緩衝液（BM 1442309）5 mlに加える。αグルコシダーゼを調製するには、αグルコシダーゼ（BM 1462309）１瓶を緩衝液（BM 1442309）45 mlに加える。作業用溶液は、αグルコシダーゼ溶液5 mlを基質0.5 mlと混合することによって作成する。

検定は、酵素溶液20μlを９６ウェルのマイクロタイタープレートに移し、２５℃でインキュベートすることによって行なわれる。作業用溶液200μlを２５℃で加える。その溶液を混合し、１分間予備インキュベートし、吸収を３分間にわたって１５秒ごとにOD 405nmで測定する。

この時間依存性吸収曲線の傾斜は、所与の一組の条件下における検討対象になっているαアミラーゼの比活性（酵素1 mg当たりの活性）に正比例する。

ＤＯＰＥプログラムを用いたランダム突然変異誘発の一般的な方法：
ランダム突然変異誘発は下記のように行なうことができる。
１．親酵素中の修飾のために考察の対象となる領域を選択する。
２．選択された領域の突然変異部位と非突然変異部位を決める。
３．例えば、構築される変異体の所望の安定性および／または性能に関してどのような種類の突然変異を行なうべきかを決める。
４．構造的に妥当な突然変異を選択する。
５．ステップ３により選択された残基をステップ４に関して調整する。
６．ヌクレオチド分布を適切なドープ・アルゴリズムを使用して解析する。
７．必要ならば、求める残基を遺伝コードの現実に合わせる（例えば終止コドンの導入を避けるために、例えば遺伝コードに起因する制約を考慮にいれる）（幾つかのコドンの組合せは実際には使用できず、適応させる必要があることを当業者ならば気が付くはずである）。
８．プライマーを作成する。
９．プライマーを使用してランダム突然変異誘発を行なう。
１０．得られたαアミラーゼ変異体を所望の改良された特性に関してスクリーニングによって選択する。

ステップ６で使用する好適なドープ・アルゴリズムは、当業界でよく知られている。一つのアルゴリズムが、Tomandl, D. 等の論文、Journal of computer-Aided Molecular Design, 11 (1997), pp.29~38に記載されている。別のアルゴリズム、ＤＯＰＥを下記に記述する。

ドープ・プログラム：
「ＤＯＰＥ」プログラムは、求めるアミノ酸分布に最も似たアミノ酸分布をコードするようなやり方でコドン三重項のヌクレオチド組成を最適化するのに有用なコンピュータアルゴリズムである。実現可能な分布のどれが求めるアミノ酸分布に最も似ているかを評価するには、スコアリング関数が必要である。「ＤＯＰＥ」プログラムには下記の関数がふさわしいことが分かった。

上式でｘ_i′は、プログラムによって計算されるアミノ酸の得られる量およびアミノ酸基であり、ｙ_i′は、プログラムのユーザーによって規定される、アミノ酸の求める量およびアミノ酸基である（例えば２０個のアミノ酸または停止コドンのどれを、例えば或る割合で（例えばAla ９０％、Ile ３％、Val ７％）導入したいかを指定する）。またｗ_i′は、プログラムのユーザーによって規定される重み付け係数である（例えば、特定のアミノ酸残基を考察の対象の位置に挿入することの重要性に左右される）。Ｎは、プログラムのユーザーによって規定される、２１プラスアミノ酸基の数である。この関数０^oについては１と規定される。

モンテカルロアルゴリズム（一例は「Statistical Mechanics, Part A」Equilibrium Techniques, B. J. Berne編、New York: Plenum (1977) 中のValleau, J. P.およびWhittington, S. G.の記述；A guide to Mont Carlo for Statistical Mechanics: 1 Highwaysに記載のものである）は、この関数の最大値を見つけるために用いられる。各繰り返しにおいて下記のステップが行なわれる。

１．各ベースには新しいランダムヌクレオチド組成が選択され、現在の組成と新しい組成の間の絶対差はコドンのすべての３つの位置で４個のヌクレオチドＧ、Ａ、Ｔ、Ｃの各々についてｄ以下である（ｄの定義については下記を参照）。

２．現在の組成および新しい組成のスコアは、前述のように関数ｓを用いて比較される。もし新しいスコアが現在の組成のスコア以上ならば、新しい組成が保存され、現在の組成は新しい組成に代えられる。もし新しいスコアがそれより小さいならば、新しい組成を保存する確率は、exp (1000 (new_score - current_score))である。

１サイクルは前述のとおり通常１０００回の繰り返しからなり、ｄは１から０まで直線的に減少する。最適化プロセスでは１００サイクル以上を行なう。最高スコアで得られるヌクレオチド組成が最終的に与えられる。

実施例
実施例１．
改変された特性を有するSP722αアミラーゼ変異体を識別するための重要な領域およびアミノ酸残基を引き出す方法：

SP722αアミラーゼの三次構造はＵＮＩＸコンピュータステーションの実行用インサイト上に表示し、すべての水素および水分子は削除された。この最小化したαアミラーゼ構造について、ｐｄｂ構造ファイル（添付資料１）で決定された結晶パラメータおよび空間群に従ってすべての対称性に関係のあるアミラーゼ分子が表示された。母親のαアミラーゼ中の各原子から対称性に関係のあるアミラーゼ構造中の任意の原子までの距離を計算するために小規模のコンピュータプログラムが作成された。それぞれ３．５Åと６．０Åに距離制限を設定すると、下記のリストの結果となった。

最も近い隣りのアミラーゼ分子から６．０Å未満に存在するアミノ酸残基は、SP722 アミラーゼのモデル構造中で識別される下記の位置である。

最も近い隣りのアミラーゼ分子から３．５Å未満に存在するアミノ酸残基は、SP722 アミラーゼのモデル構造中で識別される下記の位置である。

実施例２．
改変された特性を有するSP722αアミラーゼ変異体を識別するための重要な領域およびアミノ酸残基を引き出す別の方法：
SP722αアミラーゼの三次構造はＵＮＩＸコンピュータステーションの実行用インサイト上に表示し、すべての水素および水分子は削除された。この最小化したαアミラーゼ構造をWHAT IFソフトウェア（G. Vriendの論文、J. Mol. Graph., 8, 52~56 (1990)）中にインポート（「getmol」）し、６Å以内のすべての対称性に関係のあるアミラーゼ分子をスープ（「symtry」、「symspg」、「sympar 6」、「soushl」、「soup」）に加えた。対称分子を含むSP722用の新しい座標ファイルが書き込まれた（makmol, tot 0）。次いで中心のSP722アミラーゼを構造ファイルから削除し、周囲の分子を含む新しいファイルを書き込んだ。母体αアミラーゼ（水分子および水素原子のない元のSP722構造ファイル）中の各原子から対称性に関係のあるアミラーゼファイル中の任意の原子までの距離を計算するために小規模のコンピュータプログラムが作成された。それぞれ３．５Åと６．０Åに距離制限を設定すると、説明で参照した位置が確認された。

What If コマンド：
>>Whatif<<；WHAT IFをスタートさせる
>>Getmol sp722_HOH.pdb<<；水およびＨを削除したSP722構造ファイルをWHAT IFソフトウェア中にインポートする
>>symtry<<；対称メニューに進む
>>symspg<<；構造ファイル中の対称性に関係のある情報を読み取る
>>sympar 6<<；６Åの距離以内に対称性に関係のある残基を組み立てる
>>soushl<<；対称分子をスープに加える
>>soup<<；スープメニューに進む
>> makmol,”SP722_wi6.pdb, tot 0”<<は、スープ中のすべての原子（SP722および６Å以内の対称分子）を含む「SP722_wi6」pdbファイルを書き込む。

実施例３．
SP722三次構造からAA560を相同関係により組み立てること：
前述のようにAA560αアミラーゼ（SEQ ID NO:12）のSP722（SEQ ID NO: 4）に対する全体的な相同性は約８７％である。AA560とSP722の配列のアラインメントの結果、そこに挿入または欠失が何もないことを示され、これはまた図１にも見ることができる。AA560αアミラーゼの三次構造は、「材料および方法」の項に記載した方法「モデルの組立て」を用いて添付資料１に開示した構造上にモデルを組み立てた。

SP722の構造は、ＵＮＩＸワークステーションの実行用インサイトおよびBIOSYM、MSIから得たホモロジーソフトウェア上に表示した。アミノ酸配列をアライニングし、同調したSP722をAA560アミノ酸に割り当てた。SP722構造中に見つからないAA560中の最初の４個のアミノ酸の座標は、「END REPAIR」関数によって割り当てた。AA560モデルは、「RELAX」コマンドを用いて始めにアミノ酸の側鎖を緩和させ、次いで分子動力学を実行して３Ｄモデルのエネルギーをできるだけ小さくすることによって精巧なものにした。Insight 95、MSIのデフォルトパラメータは、両者の緩和分子動力学について選択された。最後に、空間群と単位格子の寸法が、SP722 pdbからAA560モデルのファイルにコピーされる。

実施例４．
改変された特性を有するAA560αアミラーゼ変異体を識別するための重要な領域を引き出す方法：

モデルとして組み立てられたAA560の構造について実施例１のSP722と同じ計算を行なった。２つのαアミラーゼの相同性が約８７％もの高い同一性であるために、AA560の結晶の相互作用はSP722と同様であって、AA560はSP722と同じ空間群中で、かつ同様の単一の細胞パラメータで結晶化すると予想される。

AA560αアミラーゼの三次構造はＵＮＩＸコンピュータステーションの実行用インサイト上に表示し、すべての水素および水分子は削除された。この最小化されたαアミラーゼ構造に関して、SP722の結晶パラメータおよび空間群（添付資料１）に従ってすべての対称性に関係のあるアミラーゼ分子が表示された。「母親」αアミラーゼ中の各原子から対称性に関係のあるアミラーゼ構造中の任意の原子までの距離を計算するために小規模のコンピュータプログラムが作成された。それぞれ３．５Åと６．０Åに距離制限を設定すると、下記のリストの結果となった。

最も近い隣りのアミラーゼ分子から６．０Å未満に存在するアミノ酸残基は、AA560 アミラーゼのモデル構造中に識別される下記の位置である。

直近のアミラーゼ分子から３．５Å未満に存在するアミノ酸残基は、AA560 アミラーゼのモデル構造中に識別される下記の位置である。

実施例５．
局部ランダムドーピング突然変異誘発による、親酵素と比べて高い溶解度を有するAA560αアミラーゼ変異体の構築：

AA560αアミラーゼの溶解度を増加させるために、下記に記述するように予め選択した領域でランダム突然変異誘発を行なった。

領域；残基
ＳＡＩ；Ｒ１８１〜Ｗ１８９
ＤＯＰＥソフトウェア（「材料と方法」参照）を用いて、停止コドンの量をできるだけ少なくするＳＡＩ領域の提案された各変化に対するスパイク性コドンを決定した（表１参照）。提案されたアミノ酸変化の集団を得るためにヌクレオチドの正確な分布をコドンの３つの位置で計算した。所望の残基を得る大きなチャンスがあるように、しかしさらに他の可能性も与えるようにド−プ領域は指示された位置で特定してドープされた。

得られたドープされたオリゴヌクレオチド鎖は、野生型ヌクレオチド、アミノ酸配列、およびドープされた各位置のヌクレオチド分布と一緒にセンス鎖として表２に示す。

ランダム突然変異誘発：
表２から明らかなスパイク性オリゴヌクレオチド（一般用語ではＦＳＡと呼ばれる）、ＳＡ１領域のリバースプライマーＲＳＡ、およびSacII とDraIII 部位を有効範囲とする特異的SEQ ID NO:12: AA560プライマーは、２１塩基対の重複を有する、重なり伸長法（overlap extension method；Horton等の論文、Gene, 77 (1989), pp.61〜68）によるＰＣＲライブラリー断片を生むために使用される。プラスミドpJE1はポリメラーゼ連鎖反応用の鋳型である。ＰＣＲ断片は、E. coli / BacillusのシャトルベクターpDork101（「材料と方法」の項参照）中でクローン化され、E. coli中のアミラーゼの致死的蓄積を防ぐE. coli中の突然変異誘発およびBacillus subtilis中の速やかな発現を可能にする。クローン化されたＰＣＲ断片をE. coli 中に樹立した後、修飾されたpUC19断片をプラスミドおよびプロモーターの中から消化して除き、突然変異したターマミル遺伝子を物理的に結合させ、Bacillus中で発現を起こすことができる。

スクリーニング：
ライブラリーは、上記の「材料および方法」に記載した低カルシウムフィルター検定でスクリーニングすることができる。

実施例６．
AA560 SEQ ID NO:12の変異体の構築：
SEQ ID NO:12で示したAA560αアミラーゼをコードする遺伝子は、プラスミドpTVB223中に位置付けられる。そのアミラーゼは、Bacillus subtilis中のこの構築物中でamyLプロモーターから発現する。

DELTA（Ｄ１８３〜Ｇ１８４）突然変異を有する本発明の変異体は、SarkarおよびSommerの論文、BioTechniques, 8: 404〜407 (1990) に記載のようにメガプライマーによって構築された。

遺伝子特異的プライマーB1（SEQ ID NO:16）および突然変異誘発プライマー101458 （SEQ ID NO:18）が、SEQ ID NO:12で示されるAA560をコードするpTVB223プラスミドからＰＣＲによって約６４５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するために用いられた。

６４５ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルから精製し、同じ鋳型上で行なわれる二回目のＰＣＲでプライマーY2（SEQ ID NO:17）と一緒にメガプライマーとして用いた。

得られた約１０８０ｂｐの断片を制限酵素BstEIIおよびAflIIIで消化し、同じ酵素で消化したpTVB223プラスミドと連結反応させた。感応性Bacillus subtilis SHA273（低アミラーゼおよびプロテアーゼ）細胞を連結反応で形質転換し、クロラムフェニコール耐性形質転換細胞をＤＮＡ配列決定でチェックしてプラスミド上に正しい突然変異が存在していることを確かめた。

得られたDELTA（Ｄ１８３〜Ｇ１８４）＋Ｎ１９５Ｆを有するAA560アミラーゼをコードするプラスミドはpTVB232と命名した。

本発明のその他の変異体の構築は同様の方法で行なわれた。
実施例７．
AA560およびSP722変異体の溶解度の決定：
AA560変異体は上記のように構築した。溶解度は「材料および方法」の項で、溶解度の決定Ｉとして記述したように決定された。

濃縮ステップは、タンパク質の量40mgで開始され、一般に５０％のアミラーゼがプロセス中に失われた。このタンパク質の損失はプロセスの初期段階ですべての酵素について起こり、酵素の完全な回復は体積がきわめて限定されるようになる終了段階で得られた。酵素の損失は膜への吸着による。

実施例８．
AA560変異体の溶解度の決定：
AA560変異体は、鋳型として野生型AA560を用いて上記のように構築した。溶解度は「材料および方法」の項で、溶解度の決定ＩＩとして記述したように決定された。

【図１】５種類の親ターマミル様αアミラーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す図であり、一番左の番号は下記のようにそれぞれのアミノ酸配列を示す。
１：SEQ ID NO:4（SP722）
２：SEQ ID NO:2（SP690）
３：SEQ ID NO:10（BAN）
４：SEQ ID NO:8（BLA）
５：SEQ ID NO:6（BSG）
【図２】各々の分子が８つの相互作用する帯域を有する、４個の酵素分子の単位格子の側面図である。
【図３】４個の酵素分子の単位格子の上面図である。

Claims

配列番号１２のアミノ酸配列、又は配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列からなる親ターマミル様αアミラーゼの変異体であって、
アミラーゼ活性を有するとともに、
N125A、
N125R、
N306R、
Y298H＋N299A＋K302R＋S303Q＋N306G、
delta(D183＋G184)＋R181Q＋E345R、
delta(D183＋G184)＋R181Q＋W189R、
delta(D183＋G184)＋R181Q＋S94K＋W189R、
delta(D183＋G184)＋N195F＋R118K＋R320K＋R458K、
delta(D183＋G184)＋N195F＋W189K＋N306K＋N445K、
delta(D183＋G184)＋N195F＋W189K＋N445K、
delta(D183＋G184)＋N195F＋R400T、
delta(D183＋G184)＋N195F＋W439R、
delta(D183＋G184)＋N195F＋Q449E、
delta(D183＋G184)＋N195F＋N484Q、
delta(D183＋G184)＋N195F＋R181Q＋N445Q＋K446N＋N484E、
delta(D183＋G184)＋N195F＋R181E＋N445Q＋K446N、
delta(D183＋G184)＋N195F＋R181E＋K446N、
delta(D183＋G184)＋N195F＋R310A＋R181Q＋N445Q＋K446N、
delta(D183＋G184)＋N195F＋R320K＋R181Q＋N445Q＋K446N、
delta(D183＋G184)＋N195F＋Q319K＋R320D＋R181Q＋N445Q＋K446N、
delta(D183＋G184)＋N195F＋N306A＋R181Q＋N445Q＋K446N、
delta(D183＋G184)＋N195F＋K302N＋R181Q＋N445Q＋K446N、
delta(D183＋G184)＋N195F＋E345N＋R181Q＋N445Q＋K446N、
delta(D183＋G184)＋N195F＋Y298F＋R181Q＋N445Q＋K446N、
delta(D183＋G184)＋N195F＋R28N＋R181Q＋N445Q＋K446N、
delta(D183＋G184)＋N195F＋R28N＋R310A＋R181Q＋N445Q＋K446N、及び
delta(D183＋G184)＋N195F＋N128D＋N306D＋R181Q＋N445Q＋K446N、
から選択される１又は２以上の突然変異を有し、ここで、前記突然変異の各位置は、配列番号１２で表されるＡＡ５６０のアミノ酸配列を有する親ターマミル様αアミラーゼのアミノ酸配列の位置に対応する、変異体。
変異体が、洗濯、皿洗い、および硬表面洗浄条件下で、親ターマミル様αアミラーゼよりも高い溶解度を有する、請求項１に記載の変異体。
請求項１又は２に記載のαアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。
請求項３に記載のＤＮＡ構築物を担持する組換え発現ベクター。
請求項３に記載のＤＮＡ構築物または請求項４に記載のベクターで形質転換された細胞。
請求項１又は２に記載のαアミラーゼ変異体を含む洗剤組成物。