MXPA06000212A - Enzimas para procesar almidon. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con una enzima hibrida que comprende una secuencia de aminoacidos de un modulo de union de carbohidratos y una secuencia de aminoacidos de alfa-amilasa micotica y con una variante de la enzima natural micotica que comprende un modulo de union de carbohidratos y un modulo catalitico de alfa-amilasa. La invencion tambien se relaciona con el uso de la enzima hibrida o la variante en la licuefaccion de almidon.

Description

ENZIMAS PARA PROCESAR ALMIDON CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona, ínter alia, con una enzima que comprende un módulo de unión de carbohidrato ("CBM") y un dominio catalítico de alfa-amilasa. La enzima puede ser un híbrido entre un módulo de unión de carbohidrato ("CBM") y una alfa-amilasa y la enzima puede ser una variante de una enzima madre que comprende un módulo de unión de carbohidrato ("CBM") y un dominio catalítico de alfa-amilasa. La invención también se relaciona con el uso de la enzima en un proceso de licuefacción de almidón en el cual el almidón es degradado a fragmentos oligo- y/o polisacáridos más pequeños. ANTECEDENTES DE LA INVENCION Ha sido descrito un gran número de enzimas y procesos para convertir almidón a hidrolizados de almidón, como la maltosa, glucosa o jarabes especiales, ya sea para usarse como edulcorantes o como precursores para otros sacáridos como la fructosa. La glucosa también puede ser fermentada a etanol u otros productos de fermentación, como el ácido cítrico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato de sodio, gluconato de calcio, gluconato de potasio, glucono delta lactona o eritorbato de sodio, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico; acetonas; Ref.169203 aminoácidos, ácido glutámico (monoglutaminato de sodio) , penicilina, tetraciclina; enzimas; vitaminas, como la riboflavina, B12, beta-careteno u hormonas. El almidón es un polímero de peso molecular alto que consiste de cadenas de unidades de glucosa. Usualmente consiste de aproximadamente 80% de amilopectina y 20% de amilosa. La amilopectina es un polisacárido ramificado en el cual cadenas lineales de residuos de alfa-1,4 D-glucosa están unidos por enlaces glucosídicos alfa-1,6. La amilosa es un polisacárido lineal constituido de unidades de D-glucopiranosa enlazadas juntas por enlaces glucosídicos alfa-1,4. En el caso de la conversión del almidón en un hidrolizado de almidón soluble, el almidón es despolimerizado . El proceso de despolimerización convencional consiste de un paso de gelatinización y dos pasos de proceso consecutivos, a saber un proceso de licuefacción y un proceso de sacarificación. El almidón granular consiste de granulos microscópicos, los cuales son insolubles en agua a temperatura ambiente. Cuando es calentada una suspensión acuosa de almidón, los granulos se hinchan y eventualmente estalla, dispersando las moléculas de almidón en la solución. Durante este proceso de "gelatinización" existe un incremento dramático en la viscosidad. Puesto que el nivel de sólidos es de 30-40% en un proceso industrial típico, el almidón tiene que ser adelgazado o "licuado" , de modo que pueda ser manejado o manipulado. Esta reducción de la viscosidad es hoy en día obtenida principalmente por degradación enzim tica. Durante el paso de licuefacción, el almidón de cadena larga es degradado en unidades ramificadas y lineales más pequeñas (maltodextrinas) por una alfa-amilasa. El proceso de licuefacción se lleva a cabo típicamente a aproximadamente 105-110°C durante aproximadamente 5 a 10 minutos seguidos por aproximadamente 1-2 horas a aproximadamente 95°C. La temperatura se baja entonces a 60°C, se agrega una glucoamilasa o una beta-amilasa y opcionalmente una enzima desramificante, como una isoamilasa o una pululanasa, y el proceso de sacarificación procede durante aproximadamente 24 a 72 horas . Será evidente de la discusión anterior que el proceso de conversión de almidón convencional consume mucha energía debido a los diferentes requerimientos en términos de temperatura durante los diferentes pasos . De este modo es deseable poder seleccionar y/o diseñar las enzimas usadas en el proceso de modo que el proceso total pueda ser efectuado sin tener que gelatinizar el almidón. Esos procesos son el objeto de las patentes US4591560, US4727026 y US4009074 y EP0171218, y la solicitud de patente Danesa PA 2003 00949. La presente invención describe una enzima híbrida novedosa y una modificación genética de una enzima natural diseñada para esos procesos y que comprende una secuencia de aminoácidos de un CBM y una secuencia de aminoácidos de una enzima micótica que degrada almidón. Las enzimas híbridas son el objeto de las W09814601, W00077165 y la solicitud de patente Danesa PA 2003 00949. SUMARIO DE LA INVENCION La invención proporciona en un primer aspecto una enzima híbrida la cual comprende una secuencia de aminoácidos y un módulo catalítico que tiene actividad de alfa-amilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión de carbohidrato, donde el módulo catalítico es de origen micótico . La invención proporciona en un segundo aspecto una variante de la alfa-amilasa micótica mostrada como SEQ ID NO: 41 o variantes de una alfa-amilasa que tiene una homología de al menos el 60%, al menos una homología del 70%, al menos una homología del 80%, o aún una homología de al menos el 90% con la SEQ ID NO: 41, variante la cual comprende una alteración en una o más de las posiciones: 13, 15, 18, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 61, 63, 64, 68, 69, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 89, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 161, 162, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 216, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 242, 245, 250, 252, 253, 255, 256, 257, 259, 260, 275, 292, 295, 296, 297, 298, 299, 304, 328, 339, 344, 348, 378, 383, 386, 387, 405, 448 y 480 donde; (a) las alteraciones son independientemente, i) una inserción de un aminoácido corriente abajo del aminoácido que ocupa la posición, ii) una supresión del aminoácido que ocupa la posición, o iii) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición con un aminoácido diferente, (b) la variante tiene mayor actividad de alfa-amilasa acida y/o mejor estabilidad enzimatica en relación a la alfa-amilasa micótica original, y (c) cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la amilasa TA A mostrada en la SEQ ID NO: 43 y/o la alfa-amilasa de A. kawachii mostrada como SEQ ID NO: 41. En aspectos adicionales la invención proporciona una secuencia de ADN aislado que codifica para la enzima híbrida del primer aspecto o la variante del segundo aspecto, un plásmido reco binante de ADN que comprende la secuencia de ADN que codifica para la enzima híbrida del primer aspecto o la variante el segundo aspecto, un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN que codifica para la enzima híbrida del primer aspecto o la variante del segundo aspecto, y una célula hospedera transformada con un vector, célula hospedera la cual es capaz de expresar la secuencia de ADN que codifica para la enzima híbrida del primer aspecto o la variante del segundo aspecto.

En un octavo aspecto la invención proporciona un método para licuar almidón, donde un sustrato de almidón gelatinizado o granular es tratado en medio acuoso con la enzima híbrida del primer aspecto o la variante del segundo aspecto. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION El término "almidón granular" se comprende como almidón no cocido, crudo, es decir almidón que no ha sido sometido a una gelatinización. El almidón se forma en plantas como pequeños gránulos insolubles en agua. Esos gránulos son preservados en almidones a temperaturas inferiores a la temperatura de gelatinización inicial. Cuando se colocan en agua fría, los granos pueden absorber una pequeña cantidad del liquido. Hasta 50°C a 70°C el hinchamiento es irreversible, el grado de reversibilidad depende del almidón particular. Con temperaturas más altas comienza un hinchamiento llamado gelatinización. El término "temperatura de gelatinización inicial" se comprende como la temperatura más baja a la cual comienza la gelatinización del almidón. El almidón caliente en agua comienza a gelatinizar entre 50°C y 75°C; la temperatura exacta de la gelatinización depende del almidón especifico y puede ser determinada fácilmente por el experto. De este modo, la temperatura de gelatinización inicial puede variar de acuerdo a la especie de la planta, a la variedad particular de la especie de la planta, así como con las condiciones de crecimiento. En el contexto de esta invención la temperatura de gelatinización inicial de un almidón dado es la temperatura a la cual se pierde la birrefringencia en el 5% de los gránulos de almidón usando el método descrito por Gorinstein. S. y Lii. C. , Starch/Stárke, Vol . 44 (12) pp. 461-466 (1992) . El término "hidrolizado de almidón soluble" se comprende como los productos solubles de los procesos de la invención y puede comprender mono-, di-, y oligosacáridos , como la glucosa, maltosa, maltodextrinas, ciclodextrinas y cualquier mezcla de esas. Preferiblemente al menos . el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% o 98% de los sólidos secos del almidón granular es convertido en un hidrolizado de almidón soluble. El término "homología" de polipéptido se comprende como el grado idporción entre dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia de la segunda. La homología puede ser determinada de manera adecuada por medio de programas de computadora conocidos en la técnica como el GAP proporcionado en el paquete del programa GCG (Manual del Programa para el Paquete Wisconsin, Versión 8, Agosto 1994, Genetics Computer ¦ Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EUA 53711) (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453. Son usados los siguientes parámetros para la comparación de la secuencia de aminoácidos: penalización de creación del GAP de 3.0 y penalización de extensión del GAP de 0.1. La parte relevante de la secuencia de aminoácidos para la determinación de la homología es el polipéptido maduro, es decir sin el péptido señal . Enzimas híbridas Los números de clasificación de enzimas (números EC) referidos en la presente especificación con las reivindicaciones son de acuerdo con las Recomendaciones (1992) del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular, Academic Press Inc, 1992. Las enzimas híbridas o una enzima natural modificada genéticamente como la referida aquí incluyen especies que comprenden una secuencia de aminoácidos de una enzima alfa-amilolítica (EC 3.2.1.1) ligada (es decir unida covalentemente) a una secuencia de aminoácidos que comprende un módulo de unión de carbohidrato (CBM) . Las enzimas híbridas que contienen CBM, así como las descripciones detalladas de la preparación y purificación de las mismas, se conocen en la técnica [véanse, por ejemplo WO 90/00609, WO 94/24158 y WO 95/16782, así como Green ood et al. Biotechnology and Bioengineering 44 (1994) pp. 1295- 1305] . Ellas, por ejemplo pueden ser preparadas transformando en una célula hospedera un plásmido recombinante de ADN que comprende al menos un fragmento de ADN que codifica para el módulo de unión de carbohidrato ligado, con o sin un enlazador, a una secuencia de ADN que codifica para la enzima de interés, y haciendo crecer la célula hospedera transformada para expresar el gen fusionado. El producto recombinante resultante (enzima híbrida) - con frecuencia referido en la técnica como una "proteína de fusión" - puede ser descrito por la siguiente fórmula general : A-CBM-MR-X En la última fórmula, A-CBM es la región N-terminal o la C-terminal de una secuencia de amino ácidos que comprenden al menos el módulo de unión de carbohidratos (CBM) per se. MR es la región media (el "enlazador" ) , y X es la secuencia de aminoácidos residuales de un polipéptido codificado por una secuencia de AND que codifica para la enzima (u otra proteína) al cual se va a enlazar el CBM. La porción A puede estar ausente (de modo que haya un CDM sea un A-CBS per se, es decir que no comprende aminoácidos residuales diferentes a aquéllos que constituyen el CBM) o puede se una secuencia de uno o más aminoácidos residuales que funcionen como una extensión terminal del CBM per se) . El enlazador (MR) puede ser un enlace, o un grupo enlazador corto que comprende de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 100 átomos de carbono, en particular de 2 a 40 átomos de carbono. Sin embargo, el MR es preferiblemente una secuencia de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 100 aminoácidos residuales, de manera más preferible de 2 a 40 aminoácidos residuales, como de 2 a 15 aminoácidos residuales . La porción X puede constituir la N-terminal o la C-terminal de la enzima híbrida total . De este modo será evidente de lo anterior el CMB de una enzima híbrida del tipo en cuestión puede estar colocado C-terminal, N-terminal o internamente en la enzima híbrida. Secuencia enlazante La secuencia del enlazador puede ser cualquier secuencia de enlazador. En modalidades preferidas la secuencia del enlazador se deriva de AMG de Athelia rolfsii, la AMG de A. niger AMG o la alfa-amilasa A. kawa.ch.ii como una secuencia de enlazador seleccionada de la lista que consiste de enlazador de AMG A.niger: T G G T T T T A T P T G S G S V T S T S K T T A T A S K T S T S T S S T S A (SEQ ID NO : 26) , un enlazador de alfa-amilasa A. kawachii-. T T T T T T A A A T S T S K A T T S S S S S S A A A T T S S S (SEQ ID NO : 27) , enlazador de AMG de Athelia rolfsii: G A T S P G G S S G S (SEQ ID NO : 28) , y el enlazador de PEPT: P B P T P E P T (SEQID NO : 29) . En otra modalidad preferida, las enzimas híbridas tienen una secuencia de enlazador que difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQID NO -.26, SEQID NO: 27, SEQ ID NO: 28, o SEQ ID NO: 29 en no más de 10 posiciones, no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o aún no más de 1 posición. Módulos de unión de carbohidrato Un módulo de unión de carbohidrato (CBM) , o como es referido con frecuencia, un dominio de unión de carbohidrato (CBD) , en una secuencia de aminoácidos de polipéptido que se une preferiblemente a un poli- o oligosacárido (carbohidrato) , con frecuencia - pero no necesariamente de manera exclusiva - a una forma insoluble en agua (incluyendo la cristalina) del mismo. Los CBM derivados de enzimas de enzimas que degradan almidón son con frecuencia referidos como módulos de unión de almidón o SBMs (CBM que pueden ocurrir en ciertas enzimas a amiolíticas como, ciertas glucoamilasas , o en enzimas como la ciclodextringlucanotransferasas, o en alfa-amilasas) . De igual modo, otras subclases de CBM abarcarían por ejemplo módulos de unión de células (CBM de enzimas celulolíticas) , Módulos de unión de quitin (CBM los cuales típicamente ocurren en quitinasas) , módulos de unión de xilan (CBM que típicamente ocurren en xilanasas) , módulos de unión de manan (CBM que típicamente ocurren en manasas) . Los SBMs son con frecuencia referidos como SBDs (Dominios de unión de almidón) .

Los CBM se encuentran como partes integrales de polipéptidos o proteínas grandes que consisten de dos o más regiones de la secuencia de aminoácidos del polipeptido, especialmente en enzimas hidrolíticas (hidrolasas) las cuales típicamente comprenden un módulo catalítico que contiene un sitio activo para la hidrólisis del sustrato y un módulo de unión de carbohidrato (CBM) para unirse al sustrato carbohidrato en cuestión. Esas enzimas pueden comprender más de un modulo catalítico y uno, dos, o tres CBM, y opcionalmente comprenden uno o más regiones de la secuencia el aminoácidos del polipeptido que enlazan los CBM con los módulos catalíticos, y siendo una región del último tipo usualmente denotada como "enlazador" . Los ejemplos de enzimas hidrolíticas que comprenden CBM- algunas de las cuales han sido mencionadas anteriormente - son celulazas, xilanasas, manasas, arabinofuranosidasas, acetilesterasas y quitinasas . Los CBM también han sido encontrados en algas, por ejemplo, el alga roja Porphyra purpurea en forma de una proteína de unión de polisacárido no hidrolítico. En proteínas/polipéptidos en los cuales ocurren CBM (por ejemplo enzimas, típicamente enzimas hidrolíticas), un CBM puede localizarse en N o C terminal en una posición interna. Esa parte de un polipeptido o proteína (por ejemplo enzima hidrolítica) que constituye un CBM per se típicamente consiste de más de aproximadamente 30 y menos de aproximadamente 250 aminoácidos residuales. El "Módulo de Unión de Carbohidrato de la Familia 20" o un módulo CBM-20 es en el contexto de esta invención definido como una secuencia de aproximadamente 100 aminoácidos que tiene al menos 45% de homología con el módulo de unión carbohidrato (CBM) del polipéptido descrito en la figura 1 por Joergensen et al (1997) en Biotechnol . Lett . 19: 1027-1031. El CBM comprende los últimos 102 aminoácidos del polipéptido, es decir la subsecuencia del aminoácidos 582 al amino ácido 683. La liberación de las Familias de la Glicósido Hidrolasa aplicada en esta descripción sigue el concepto de Coutinho, P. M. & Henrissat, B. (1999) CAZy - Carbohydrafe-Active Enzymes server at URL: http://afmb. cnrs-mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html o de manera alternativa Coutinho, P. M. & Henrissat, B. 1999; La estructura modular de la celulosa y otros carbohidratos enzimas activas: una base de datos integrada amplia. En "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation" , K. Ohmiya, K. Hayas i, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. arita and Kimura eds . , Uni Publishers Co. , Tokyo, pp. 15-23, and Bourne, Y. & Henrissat, B. 2001; Glycoside hydrolases and glycosyltransferases : familias y módulos funcionales, Current Opinión in Structural Biology 11:593-600. Los ejemplos de enzimas que comprenden un CBM adecuado para usarse en el contexto de la invención sin alfa-amilasas, alfa-amilasas, mal ogénicas, celulasas, xilanasas, manasas, arabinofuranosidasas, acetilesterasas y quitinasas. Además los CBM de interés en relación con la presente invención incluyen CBM que se derivan de glucoamilasas (EC 3.2.1.3) o de CGTasas (EC 2.4.1.19). Los CBM derivados de Fuentes micóticas, bacterianas o plantas generalmente serán adecuados para usarse en el contexto de la invención. Los preferidos son CBM de origen micótico, de manera más preferible de Aspergillus sp. , bacillus sp. , Klebsiella sp. , o Rhizopus sp. En relación con esto, las técnicas adecuadas para el aislamiento de los genes relevantes son bien conocidos en la técnica. Preferidos para la invención son los CBM de la familia 20 de la unión de carbohidrato. Los CBM de la Familia 20 del módulo de unión de carbohidratos adecuados para la invención pueden ser derivados de glucoamilasas de Aspergillus awamori (SWISSPROT Q12537) , Aspergillus kawachii (SWISSPROT P23176) , Aspergillus niger (SWISSPROT P04064) , Aspergillus oryzae (SWISSPROT P36914) , de alfa-amilasas de Aspergillus kawachii (EMBL : #AB008370) , Aspergillus nidulans (NCBIAAF17100. 1), de beta-amilasas de Bacillus cereus (SWISSPROT P36924) , o de CGTasas de Bacillus circulans (SWISSPROT P43379) . El preferido es un CBM de la alfa-amilasa de Aspergillus kawachii (EMBL: #AB008370) así como CBM que tiene al menos 50%, 60%, 70%, 80% o aún al menos 90% de homología con el CBM de la alfa-amilasa de Aspergillus kawachii (EMBL :#AB008370) , es decir un CBM que tiene al menos 50%, 60%, 70%, 80% o aún al menos 90% de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. También preferidos para la invención son los CBM de la Familia 20 de los Módulos de unión de carbohidratos que tienen la secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO: 10, y SEQ ID NO: 11 y descritas en la solicitud de Patente Danesa PA 2003 00949 como SEQ ID NO:l, SEQ ID NO : 2 y SEQ ID NO: respectivamente. Los CBM preferidos incluyen los CBM de la glucoamilasa de Hormoconis sp. como de Hormoconis resinae (Sinómino de Creosote fungusor o Amorphotheca resinae) como el CBM de S ISSPROT :Q03045 (SEQ ID NO: 12), de Lentinula sp. como de Lentinula edodes (hongo de shiitake) como el CBM of SPTREMBL : Q9P4C5 (SEQ ID NO: 13) , de Neurospora sp. como de Neurospora crassa como el CBM de SWISSPRO : P14804 (SEQ ID NO: 14), de Talaromyces sp. como de Talaromycesbyssochlamydioides como el CBM de NN005220 (SEQ ID NO: 15), de Geos ithia sp como de Geosmithia cylindrospora, como el CBM de NN48286 (SEQ ID NO: 16), de Scorias sp. como Scorias spongiosa como el CBM de NN007096 (SEQ ID NO:17), de Eupenicillium sp. como de Eupenicillium ludwigiisuch como el CBM de NN005968 (SEQ ID NO:18), de Aspergillus sp. como de Aspergillus japonicus como el CBM de NN001136 (SEQ ID N0:19), de Penicillium sp. como de Penicillium cf. miczynskii como el CBM de NN48691 (SEQ ID NO :20) , de Mzl Penicillium sp. como el CBM de N48690 (SEQ ID NO: 21), de Thysanophora sp. como el CBM de NN48711 (SEQ ID NO :22), y de Humicolasp. como del Humicola grisea var. thermoidea como el CBM de SPTREMBL:Q12623 (SEQ ID NO: 23) . Los CBM más preferidos incluyen los CBM de la glucoamilasa de Aspergillus sp. Como de Aspergillus niger, como la SEQ ID NO: 24, y Athelia sp. Como de Athelia rolfsii, como SEQ ID NO :25. También preferidos por la invención son cualesquier CBD que tienen al menos 50%, 60%, 70%, 80% o aún al menos 90% de homología con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CBD mencionadas anteriormente . Los CBM adecuados adicionales de la Familia 20 del Módulo de Carbohidrato pueden encontrarse en URL:http : //afmb . cnrs-mrs . fr/-cazy/CAZY/index. html) . Una vez que ha sido identificada una secuencia nucleotídica que codifica para la región de unión del sustrato (unión de carbohidrato) , ya sea como ADNc o ADN cromosomal, esta puede entonces ser manipulada en una variedad de formas para fusionarse en una secuencia de ADN que codifique para la enzima de interés. El fragmento de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de unión de carbohidrato y el ADN que codifica para la enzima de interés son entonces ligadas con o sin enlazador. El ADN ligado resultante puede entonces ser manipulado en una variedad de formas para lograr la expresión. Secuencia Alfa-amiolítica Las alfa-amilasas (en particular las alfa-amilasas estables en ácido) que son apropiadas como la base para los híbridos de CBM/amilasa de los tipos empleados en el contexto de la presente invención incluyen aquéllos de origen micótico . Preferiblemente la alfa-amilasa es una enzima natural. De manera más preferible la alfa-amilasa es una variante de alfa-amilasas que comprende modificaciones de aminoácidos que conducen a un incremento de actividad, incremento a la estabilidad de la proteína a pH bajo, y/o pH alto, incremento en la estabilidad hacia el agotamiento de calcio y/o incrementa la estabilidad a temperatura elevada. Las mutantes modificadas química o genéticamente de esas alfa-amilasas están incluidas en este contexto. Las alfa-amilasas relevantes incluyen por ejemplo alfa-amilasas obtenibles de especies de Aspergillus, en particular de Aspergillus niger, como una alfa-amilasa estable en ácido (S ISSPROT P56271) , con descrita con mayor detalle en la WO 8901969 (ejemplo 3] y que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8 y/o codificada por la secuencia de ADN mostrada en la SEQ ID NO: 7. También preferidas son las secuencias de alfa-amilasas que tienen más de 50%, como 60%, o 70%, 80% o 90% de homología con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8 y/o codificada por la secuencia de ADN mostrada en la SEQ ID NO: 7. -- En otra modalidad preferida la secuencia alfa-amilolítica es derivada de la alfa-amilasa acida de A. oryzae (Fungamyl*®) . De manera más preferible la secuencia alfa-amilolítica que tienen más de 50%, tal como 60% o 70%, 80% o 90% de homología con la secuencia de aminoácido mostrado en la SEQ ID NO: 30 y/o la secuencia mostrada como aminoácido 21-498 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 30. Aún más preferida es una modalidad donde la enzima híbrida comprende una secuencia alfa-amilolítica derivada de alfa-amilasa ácida de A. Oryzae (Eungamyl" , SEQ ID NO: 30), y/o una secuencia enlazador derivada de alfa-amilasa de A. kawachii o la A. rolfsii y/o un CBM derivado de la alfa-amilasa de A. kawachii (SEQ ID NO: 5) o la AMG A. rolfsii (SEQ ID NO: 25) . En una modalidad particular la enzima híbrida tiene la secuencia de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 36 O en la SEQ ID NO:40. También preferida en una modalidad sonde la enzima híbrida comprende una secuencia alfa-amilolítica derivada de modulo catalítico de alfa-amilasa de A. Níger que tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 8, y/o una secuencia de enlazador derivada de la alfa-amilasa de A. kawachii o la AMG de A.rolfsii, y/o el CBM derivado de la alfa-amilasa de A.kawachii . La AMG de A. rolfsil o la AMG de A. Níger. En una modalidad particularmente preferida la enzima híbrida comprende un módulo catalítico de alfa-amilasa acida de A. niger que tiene una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 8 y el enlazador de alfa-amilasa de A. kawachii (SEQ ID NO: 6) . Preferiblemente la enzima híbrida comprende una secuencia de CBD que tiene al menos 50%, 60%, 70%, 80% o aún al menos 90% de homología con cualquiera de la secuencia de aminoácido mostradas en las SEQ ID NO: 9, SEQID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 12 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. De manera más preferida la enzima híbrida comprende una secuencia de CBD que tiene una secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0.-17, SEQ ID N0:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQID NO: 25. En otra modalidad preferida la secuencia del CBM tiene una secuencia de aminoácidos la cual difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25 en no más de 10 posiciones de aminoácido, no mas de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, jno más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o aún no más de 1 posición. En una modalidad más preferida, la enzima híbrida comprende un CBM derivado de una AMG de A. rolfsii, como la AMG de A.rolfsii 7AHU 9627 descrita en la Patente Estadounidense 4,727,026. En una modalidad particular la enzima híbrida tiene una secuencia de aminoácidos mostrado en SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34 o SEQID NO: 38 o la enzima híbrida tiene una secuencia de aminoácido que tiene al menos 50%, 60%, 70%, 80% o aún al menos 90% de homología con cualquiera de las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente. En otra modalidad preferida las enzimas híbridas tienen una secuencia de aminoácidos la cual difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO:34, SEQID N0:36, SEQ ID NO:38 o SEQ ID NO:40 en no más de 10 posiciones, no mas de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o aún no más de la posición.

En una modalidad preferida la enzima híbrida es una variante que comprende un dominio catalítico mostrado como los aminoácidos 21-498 de la SEQ ID NO:40 (y/o los aminoácidos 21-498 de SEQID NO: 30) con una o más sustituciones, de manera más preferible una sustitución en una o más posiciones seleccionadas de las lista que consiste de: 81, 158, 161, 163, 164, 175, 176, 177, 253, 264, 266, 466, 468, 470, y de manera más preferible una o más sustituciones seleccionadas de la lista que consiste de: Q81R, 158D, K158V, S161D, S161N, Q163S, Q163A, D164S, Y175 , E176D, D177N, D253N, N264 , N264E, 265L, G466D, D468S, y N470D. En una modalidad aún más preferida las enzimas híbridas son una de las variantes listadas en la Tabla 6. También preferidas son variantes que comprenden el dominio catalítico mostrado como aminoácidos 21-498 de SEQ ID NO:40 (y/o aminoácidos 21-498 de SEQ ID NO: 30) con una o más sustituciones o una combinación de sustituciones seleccionada de la lista que comprende: Y175W + E176D, 276 + P277Q, K380T + L381 , G62N, G62F, Y95D, D106K+ S109D, A140P, K158D + D164S, F171L + E182Q, K200E + V202A, K200E + V202A, K200E + V202A, T227S + K233P, L252D + D255N, N264K + 266L, 283E, N359K+ D360V,N390K + Y391 L, G466D + N470D, Y484L + S498S, Y484L + S498G. y Y484L + S498R. En una modalidad preferida la enzima híbrida comprende el modulo catalítico de acuerdo a los mostrado como aminoácidos 21-498 de SEQ ID NO -.40 (y/o aminoácidos 21-498 de la SEQ ID NO: 30) con una o más sustituciones seleccionadas de la lista que consiste de K158V, S161N, Q163A, D164S, N264K, M266L, G466D, D468S y N470D. En otra modalidad preferida la enzima híbrida comprende un módulo catalítico mostrado como aminoácidos 21-498 de la SEQ ID NO: 40 (y/o aminoácidos 21-498 de la SEQ ID NO: 30) con una o más sustituciones seleccionadas de la lista que consiste de: Q81 , K158V, S161N, Q163A, D164S, Y175W, E176D, D177N, N264K, M266L, G466D, D468S y N470D. Vectores de Expresión La presente invención también se relaciona con vectores de expresión recombinantes los cuales pueden comprender una secuencia de AND que codifique para la enzima híbrida o una enzima natural modificada genéticamente, un promotor, una secuencia de péptido señal, señales de interrupción transcripcional y trasnacional . Las diferentes secuencias de ADN y control descritas anteriormente pueden ser unidas para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de ADN que codifique para el péptido en esos sitios. De manera alternativa, la secuencia de ADN de la presente invención puede ser expresada insertado en la secuencia de ADN o un plásmido recombinante AND que comprenda la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificadora se localiza en el vector de modo que la secuencia codificadora esta ligada operativamente con las secuencias de control apropiadas para la expresión, posiblemente la secreción. El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo un plásmido o virus) , el cual puede ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y puede llevar a cabo la expresión de la secuencia de ADN. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula hospedera en la cual vaya a ser introducido el vector. Los vectores pueden ser pl smidos lineales o circulares cerrados. El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector que exista como una porción extracromosomal, la replicación del cual depende de la replicación cromosomal, por ejemplo un plásmido, un elemento extracromosomal, un minicromosoma, un cósmico o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualesquier medios para asegurar la autorreplicación. De manera alternativa, el vector puede ser uno el cual, cuando sea introducido en la célula hospedera, se integre en el genoma y se replique junto con los cromosomas en los cuales se haya integrado. El sistema vectorial puede ser un solo vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contengan el ADN total a ser introducido en el genoraa de la célula hospedera, o un transposión. Marcadores Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionables , los cuales permiten la fácil selección de células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen, el producto del cual proporciona resistencia biocida o viral, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos, y similares. Los ejemplos de marcadores seleccionables para usarse en una célula hospedera de hongo filamentoso pueden ser seleccionados del grupo que incluye, pero no se limita a, amdS (acetamidasa) , argB (ornitin carba oiltransferasa) , jbar (fosfinotricina acetiltransferasa) , hygB (higromicin fosfotransferasa) , niaD (nitrato reductasa) , pyrG (orotidin-5' -fosfato descarboxilasa) , sC (sulfato adeniltransferasa) , trpC (antranilato sint sa) , y marcadores de resistencia al glufosinato, así como equivalentes de otras especies. Preferidos para usarse en una célula de Aspergillus son los marcadores amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el marcador bar de Stre omyces hygroscopicus . Además, la selección puede ser lograda por cotransformación, por ejemplo como se describe en la WO 91/17243, donde el marcador seleccionable se encuentra sobre un vector separado.

Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen elementos que permiten la integración estable del vector en el genoma de la célula hospedera o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma de la célula. Los vectores de la presente invención pueden ser integrados en el genoma de la célula hospedera cuando se introduzca en una célula hospedera. Para la integración, el vector puede depender de la secuencia de ADN que codifique para el polipéptido de interés o cualquier otro elemento del vector para la integración estable del vector en el genoma por recombinación homologa o no homologa. De manera alternativa, el vector puede contener secuencias de ADN adicionales para dirigir la dirección o recombinación homologa en el genoma de la célula hospedera. Las secuencias de ADN adicionales permiten que el vector se integre en el genoma de la célula hospedera en un lugar preciso en los cromosomas . Para incrementar la probabilidad de integración en un lugar preciso, el elemento de integración preferiblemente contendrá un número suficiente de ADN, como de 100 a 1,500 pares de bases, preferiblemente 400 a 1,500 pares de bases, y de manera preferible de 800 a 1,500 pares de bases, los cuales son altamente homólogos con la secuencia blanco correspondiente para aumentar la probabilidad de recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homologa con la secuencia blanco en el genoma de la célula hospedera. Además, los elementos de integración pueden ser secuencias de ADN no codificadoras o codificadoras. Por otro lado, el vector puede ser integrado en el genoma de la célula hospedera por recombinación no homologa. Esas secuencias de ADN pueden ser cualquier secuencia que sea homologa como una secuencia blanco en el genoma de la célula hospedera, y, además, pueden ser secuencias no codificadoras o codificadoras. Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permita que el vector se replique de manera autónoma en la célula hospedera en cuestión. Puede ser usada la replicación episomal del vector plasmídico AMA1 descrito en la O 00/24883. Puede insertarse más de una copia de una secuencia de ADN que codifique para un polipéptido de interés en la célula hospedera para amplificar la expresión de la secuencia de ADN. La amplificación estable de la secuencia de ADN puede ser obtenida integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedera usando métodos bien conocidos en la técnica y seleccionando transformantes. Los procedimientos usados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinante de la presente invención son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica (véase, por ejemplo Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2da edición, Cold Spring Harbor, New York) . Células Anfitrionas Las células anfitrionas de la invención, ya sea que comprendan un plásmido recombinante de ADN o un vector de expresión que comprenda la secuencia de ADN que codifique para una enzima híbrida o una enzima natural modificada genéticamente, es usada, de manera ventajosa, como una célula hospedera en la reproducción recombinante de la enzima híbrida o una enzima natural modificada genéticamente. La célula puede ser transformada con un vector de expresión. De manera alternativa, la célula puede ser transformada con el constructo de ADN de la invención que codifique para la enzima híbrida o una enzima natural modificada genéticamen e, convencionalmente integrando el plásmido recombinante de ADN (en una o más copias) en el cromosoma anfitrión. La integración del plásmido recombinante de ADN en el cromosoma anfitrión puede ser efectuada de acuerdo a métodos convencionales, por ejemplo, por recombinación homologa o heteróloga . La célula hospedera puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica apropiada, por ejemplo una célula bacteriana, una célula de hongo filamentoso, una célula de planta o una célula de mamífero.

En una modalidad preferida, la célula hospedera es un hongo filamentoso representado por los siguientes grupos de Ascomycota, incluyendo, por ejemplo Neurospora, Eupeniillium (-Penicillium) , Emericella (=Aspergillus) , Burotium (=Aspergillus) . En una modalidad más preferida, el hongo filamentoso incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión de Eumycota y Oomycota (de acuerdo a lo definido por Hawksworth et al. In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of Thr Fungi, 8 a edición, 1995, CAB International, University Pre3S, Cambridge, RU. Los hongos filamentosos se caracterizan por un micelio vegetativo compuesto de quitina, celulosa, glucano, quitosan, mañano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es obligadamente aeróbico. En una modalidad aún más preferida, la célula hospedera de hongo filamentoso es una célula de una especie de, pero sin limitarse a una célula seleccionada del grupo que consiste de una cepa perteneciente a una especie de Aspergillus, preferiblemente Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus kawachii, o una cepa de Bacillus, o una cepa de Fusarium, como la cepa de Fusariu oxysporium, Fusarium graminearum (en el estado perfecto nombrada Gribberella zeae, previamente Sphaeria zeae, sinónimo de Gibberella roseum y Gibberella roseum f. sp.

Cereales) , o Fusarium sulphureum (en el estado perfecto nombrado Gibberella puricaris, sinónimo de Fusarium trichothecioid.es, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum y Fusarium roseum var. Graminearum) , Fusarium cereales (sinónimo con Fusarium crookwellensek) o Fusarium venenatum. En una modalidad más preferida, la célula hospedera de hongo filamentoso es una célula de una cepa perteneciente a una especie de Aspergillus, preferiblemente Aspergillus oryzae, o Aspergillus niger. La célula hospedera puede ser una célula hospedera de hongo filamentoso natural o una variante, una mutante o una célula hospedera de hongo filamentoso modificada genéticamente. En una modalidad preferida de la invención la célula hospedera es una cepa deficiente de proteasa o menos proteasa. También son contempladas de manera específica cepas de Aspergillus, como cepas de Aspergillus niger, modificadas o perturbadas genéticamente o de expresión reducida del grupo amilasa, alfa-amilasa estable en ácido, alfa-1,6 transglucosidasa y actividades de proteasa. Transformación de las células anfitrionas de hongo filamentoso Las células anfitrionas de hongo filamentoso pueden ser transformadas por un proceso que implica la formación de protoplastos , la transformación de los protoplastos , y la regeneración de la pared celular en una forma conocida en la técnica. Los procedimientos adecuados para la transformación de células anfitrionas de Aspergillus se describen en la EP 238 023, EP 184 438 y Yelton et al. 1984, Proceedings of the Nacional Academy of Sciences USA 81:1470-1474. Un método adecuado para transformar especies de Fusarium es descrito por Malardier et al. 1989, Gene 78:147-156 o US 6,060,305. Aislamiento y clonación de una secuencia de ADN que codifica para una alfa-amilasa madre Las técnicas usadas para aislar o clonar una secuencia de ADM que codifique para un polipéptido de interés son conocidas en la técnica e incluyen el aislamiento de ADN genómico, preparación de ADNc, o una combinación de los mismos. La clonación de las secuencias de ADN de la presente invención de ese ADN genómico puede ser efectuada, por ejemplo usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocida o la selección con anticuerpos de bibliotecas de detección para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Véase, por ejemplo Innis et al., 1990, PCR; A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Pueden ser usados otros procedimientos de amplificación de ADN como la reacción en cadena de la ligasa (LCR) , transcripción activada ligada (LAT) y amplificación basada en la secuencia de ADN (NASBA) . La secuencia de ADN que codifica para un alfa-amilasa madre puede ser aislada de cualquier célula o microorganismo que produzca la alfa-amilasa en cuestión, usando varios métodos bien conocidos en la técnica. Primero, deberá ser construida una biblioteca de ADN genómico y/o ADNc usando ADN cromosomal o ARN mensajero del organismo que produzca la alfa-amilasa a ser estudiada. Entonces, si la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa es conocida, pueden ser sintetizadas sondas oligonucleotídicas marcadas y usadas para identificar las clonas que codifiquen para la alfa-amilasa de una biblioteca genómica preparada del organismo en cuestión. De manera alternativa, podría ser usada una sonda oligonucleotídica marcada que contenga secuencias homologas a otros genes de alfa-amilasa conocidos como una sonda para identificar las clonas que codifiquen para alfa-amilasa, usando condiciones de hibridación y lavado de muy baja a muy alta rigurosidad. Incluso otro método más para identificar clonas que codifican para alfa-amilasa implicarían insertar fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, como un plásmido, transformar bacterias negativas a la alfa-amilasa con la biblioteca de ADN genómico resultante, y entonces cultivar las bacterias transformadas sobre agar que contiene un sustrato para alfa-amilasa (es decir maltosa) , permitiendo por lo tanto que las clonas expresen la alfa-amilasa a ser identificada.

De manera alternativa, la secuencia de ADN que codifique para una enzima puede ser preparada sintéticamente por métodos estándar establecidos, por ejemplo el método de la fosforoamidita descrito en S.L. Beaucage ? M.H. Caruthers, (1981), Tetrahedron Letters 22, p. 1859-1869 o el método descrito por Matthes et al. (1984), EMBO J. 3, p. 801-805. En el método de la fosforoamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, por ejemplo en un sintetizador de ADN automático, purificados, recocidos, ligados y clonados en vectores apropiados . Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen genómico o sintético mezclado, de origen sintético o ADNc mezclado u origen genómico y ADNc mezclado, preparada ligando fragmentos de origen sintético, genómico o ADNc (según sea apropiado, correspondiendo los fragmentos a varias partes de toda la secuencia de ADN) , de acuerdo con técnicas estándar. La secuencia de ADN también puede ser preparada por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo como se describe en la US 4,683,202 o R.K. Saiki et al. (1988), Science 239, 19-88, pp. 487-491.

Secuencia de ADN aislada La presente invención se relaciona, ínter alia, con una secuencia de ADN aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica para una enzima híbrida o una enzima natural modificada genéticamente que comprende una secuencia de aminoácidos y un modo no catalítico que tiene actividad de alfa-amilasa y una secuencia de aminoácidos y un módulo de unión de carbohidrato, donde el módulo catalítico es de origen micótico. El término "secuencia de ADN aislada" como se usa aquí se refiere a una secuencia de ADN, la cual está esencialmente libre de otras secuencias de ADN, por ejemplo al menos aproximadamente 20% pura, preferiblemente al menos aproximadamente 40% pura, de manera más preferible al menos aproximadamente 60% pura, de manera aún más preferible al menos aproximadamente 80% pura, y de manera más preferible al menos aproximadamente 90% pura, de acuerdo a lo determinado por electroforesis en agarosa. Por ejemplo, una secuencia de ADN aislada puede ser obtenida por los procedimientos de clonación estándar usados en ingeniería genética para reubicar la secuencia de ADN de su ubicación natural a un sitio diferente donde se reproducirá. Los procedimientos de clonación pueden implicar la separación y aislamiento de un fragmento de ADN deseado que comprenda la secuencia de ADN que codifique para el polipéptido de interés con la inserción del fragmento en una molécula de vector, e incorporación del vector recombinante en una célula hospedera donde se repliquen múltiples copias o clonas de la secuencia de. ADN. Una secuencia de ADN aislada puede ser manipulada en una variedad de formas para proporcionar la expresión del polipéptido de interés. La manipulación de la secuencia de ADN antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar las secuencias de ADN utilizando los métodos de ADN recombinantes son bien conocidas en la técnica. Plásmidos recombinantes o constructor de ADN La presente invención se relaciona, inter alia, con un plásmido recombinante de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica para una enzima híbrida o una enzima natural modificada genéticamente que comprende una secuencia de aminoácidos de un modo no catalítico que tiene actividad de alfa-amilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión de carbohidrato, donde el módulo catalítico es de origen micótico. El "plásmido recombinante o constructo de ADN" se define aquí como una molécula de ADN, ya sea de una sola o doble hebra, la cual es aislada de un gen natural o que ha sido modificada para contener segmentos de ADN, los cuales son combinados y yuxtapuestos, en una forma, la cual, no existiría en otras circunstancias en la naturaleza. El término plásmido recombinante de ADN es sinónimo del término cásete de expresión cuando el plásmido recombinante de ADN contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión y la secuencia codificadora de la presente invención.

Mutagénesis dirigida al sitio Una vez que ha sido aislada una secuencia de ADN que codifique para la alfa-amilasa madre, pueden ser introducidos sitios deseables para la mutación, mutaciones identificadas usando oligonucleótidos sintéticos. Esos oligonucleótidos contienen secuencias nucleotídicas que flanquean los sitios de mutación deseados. En un método específico, es creada una extensión de una sola hebra de ADN, la secuencia que codifica para alfa-amilasa, en un vector que contiene el gen de la alfa-amilasa. Entonces se recoce el nucleótido sintético, que contiene la mutación deseada, hasta una porción homologa del ADN de una sola hebra. La extensión restante es entonces llenada con ADN polimerasa (I) (fragmento de Klenow) y el plásmido recombinante es ligado usando ligasa T4. Un ejemplo específico de este método se describe en Morinaga et al. (1984), Biotechnology 2, p. 646- 639. La US 4,760,025 describe la introducción de oligonucleótidos que codifican para mutaciones múltiples efectuando alteraciones menores del cásete. Sin embargo, puede ser introducida una variedad aún más grande de mutaciones en cualquier momento por el método de Morinaga, debido a que puede ser introducida una multitud de oligonucleótidos, de varias longitudes. Otro método para introducir mutaciones en las secuencias de ADN que codifican para alfa-amilasa es descrito en Nelson y Long, (1989) , Analytical Biochemistry 180, p. 147-151. Este implica la generación de 3 pasos de un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada introducida usando una hebra de ADN sintetizada químicamente como uno de los cebadores en las reacciones de PCR. En el fragmento generado por PCR, puede ser aislado un fragmento de ADN que contenga la mutación escindiendo con endonucleasas de restricción y reinsertando en un plásmido de expresión. Mutagénesis aleatoria localizada La mutagénesis aleatoria puede ser localizada, de manera ventajosa, como una parte de la alfa-amilasa madre en cuestión. Esto puede, por ejemplo ser ventajoso cuando ciertas regiones de la enzima hayan sido identificadas como de importancia particular para una propiedad dada de la enzima, y cuando modificadas se espera den como resultado una variante que tenga propiedades mejoradas. Esas regiones pueden ser identificadas normalmente cuando haya sido determinada la estructura terciaria de la enzima madre y relacionada con la función de la enzima. La mutagénesis aleatoria localizada o específica de una región es efectuada convenientemente mediante el uso de técnicas de mutagénesis generada por PCR, como se describió anteriormente o cualquier otra técnica adecuada conocida en la técnica. De manera alternativa, la secuencia de ADN que codifica para la parte de la secuencia de ADN a ser modificada puede ser aislada, por ejemplo, por inserción en un vector adecuado, y esa parte puede ser sometida posteriormente a mutagénesis mediante el uso de cualquiera de los métodos de mutagénesis descritos anteriormente. Variantes de enzimas híbridas o naturales El desempeño en un proceso de degradación de almidón de una enzima natural o híbrida que comprende un módulo de unión de carbohidrato ("CBM") y un módulo catalítico alfa-amilasa puede ser mejorado a través de la modificación de la proteína, como por mutagénesis dirigida al sitio, por mutagénesis aleatoria localizada, preparando sintéticamente una nueva variante de la enzima natural madre o la enzima híbrida madre, o por cualesquier otras técnicas e ingeniería de proteínas adecuadas . La alfa-amilasa madre contemplada por la invención incluye alfa-amilasa micótica natural que tiene un CBM, en particular alfa-amilasa micótica obtenible de una cepa Aspergillus, como una alfa-amilasa ácida de Aspergillus kawachii y variantes y mutantes de la misma, alfa-amilasas homologas, y además alfa-amilasas naturales o artificiales que son estructural y/o funcionalmente similares a la alfa-amilasa ácida de Aspergillus kawachii mostrado en la SEQ ID NO: 41. Aunque la alfa-amilasa ácida de Aspergillus kawachii es un ejemplo de una alfa-amilasa natural que comprende un módulo de unión de carbohidrato ("CBM") , el módulo catalítico de alfa-amilasa ácida de Aspergillus kawachii tiene una actividad específica limitada, por ejemplo comparada con la actividad catalítica de la alfa-amilasa ácida de A. niger. Además, el CBM de la alfa-amilasa de Aspergillus kawachii es fácilmente escindido del módulo catalítico durante un proceso de fermentación convencional, reduciendo por lo tanto la idoneidad de la enzima para aplicación industrial. De este modo, la alfa-amilasa de Aspergillus kawachii tiene varias desventajas serias como una enzima industrial para la hidrólisis del almidón crudo. Las técnicas de modificación de proteínas pueden ser aplicadas para producir variantes más adecuadas de una alfa-amilasa ácida madre, donde la actividad catalítica y/o la estabilidad de la enzima han sido mejoradas. Las variantes preferidas son variantes de la alfa- amilasa micótica mostrada como SEQ ID NO: 41 o variantes de ¦ una alfa-amilasa que tiene al menos 60% de homología, al menos 70% de homología, al menos 80% de homología, o aún al menos 90% de homología con la SEQ ID NO: 41, variante la cual comprende una alteración en una o más de las posiciones : 13 , 15, 18, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 61, 63, 64, 68, 69, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 89, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 161, 162, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 216, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 242, 245, 250, 252, 253, 255, 256, 257, 259, 260, 275, 292, 295, 296, 297, 298, 299, 304, 328, 339, 344, 348, 378, 383, 386, 387, 405, 448 y 480 y de manera más preferida en una o más de las posiciones 31, 33, 36, 74, 75, 77, 84, 120, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 162, 166, 169, 170, 199, 232, 233, 235, 238, 239, 245, 256, 257, 331, 336, 339, 340, 342, 348, 378, 383, 386, 387, 405, 448 y 480 donde; (a) las alteraciones son independientemente, (i) una inserción de un aminoácido corriente abajo del aminoácido que ocupa la posición, (ii) una supresión del aminoácido que ocupa la posición, o (iii) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición con un aminoácido diferente, (b) la variante tiene mayor actividad de alfa-amilasa acida y/o mejor estabilidad enzimática en relación a la alfa-amilasa micótica madre, y (c) cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la amilasa ???? mostrada en la SEQ ID NO: 43 y/o la alfa-amilasa de A. kawachii mostrada como SEQ ID NO: 41. Las variantes más preferidas son variantes de la alfa-amilasa de A. kawachii mostrada como SEQ ID NO: 41 o variantes de una alfa-amilasa que tiene al menos 60% de homología, al menos 70% de homología, al menos 80% de homología, o aún al menos 90% de homología con la SEQ ID NO: 41 que comprende alteraciones en una o más de las siguientes posiciones : 13, 15, 18, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 61, 63, 64, 68, 69, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 , 84, 89, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 161, 162, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 216, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 242, 245, 250, 252, 253, 255, 256, 257, 259, 260, 275, 292, 295, 296, 297, 298, 299, 304, 328, 339, 344, 348, 378, 383, 386, 387, 405, 448 y 480 donde; (a) las alteracionesi son independientemente, (i) una inserción de un aminoácido corriente abajo del aminoácido que ocupa la posición, (ii) una supresión del aminoácido que ocupa la posición, o (iii) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición con un aminoácido diferente, (b) la variante tiene mayor actividad de alfa-amilasa ácida y/o mejor estabilidad enzimática en relación a la alfa-amilasa micótica madre, y (c) cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la amilasa ???? mostrada en la SEQ ID NO: 43 y/o la alfa-amilasa de A. kawachii mostrada como SEQ ID NO: 41. Las variantes más preferidas de la alfa-amilasa de A. kawachii mostrada como SEQ ID NO: 41 o variantes de una alfa-amilasa que tiene al menos 60% de homología, al menos 70% de homología, al menos 80% de homología, o aún al menos 90% de homología con la SEQ ID NO: 41 y que comprende alteraciones en una o más de las siguientes posiciones: 31, 33, 36, 74, 75, 77, 84, 120, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 162, 166, 169, 170, 199, 232, 233, 235, 238, 239, 245, 256, 257, 331, 336, 339, 340, 342, 348, 378, 383, 386, 387, 405, 448 y 480. Aún más preferidas son variantes de la alfa-amilasa de A. kawachii mostrada como SEQ ID NO: 41 o variantes de una alfa-amilasa que tiene al menos 60% de homología, al menos 70% de homología, al menos 80% de homología, o aún al menos 90% de homología con la SEQ ID NO: 41 que comprende una más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: G33A, 136K, S74A, D75Y, E77D, P120A, 1153D, D154N, 155Y, D156E, N157D, L158Q, Q162E, E166L, T169N, 1170T, E199K, E199L, D232L, N233D, N235D, L238Y, D239T, W256Y, Q257P, E331Q, S336A, D339 , D339N, V340D, y Y342A, y las variantes aún más preferidas comprenden una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos S74A, E166L, E199L, D339K, y D156E, como la variante que comprende la sustitución de aminoácidos múltiples: S74A/E166L/E199L, donde la variante tiene actividad y/o estabilidad enzimática mejorada con relación a la alfa-amilasa madre mostrada como SEQ ID NO: 41. Las variantes también pueden ser una variante de la alfa-amilasa de ü. kawachii mostrada como SEQ ID NO: 41 o variantes de una alfa-amilasa que tenga al menos 60% de homología, al menos 70% de homología, al menos 80% de homología, o aún al menos 90% de homología con la SEQ ID NO: 41 y que comprenda alteraciones en una o más de las siguientes posiciones: 31, 74, 89, 209, 245, 348, 378, 383, 386, 387, 405, 448, y 480, donde; (a) las alteraciones son independientemente, (i) una inserción de un aminoácido corriente abajo del aminoácido que ocupa la posición, (ii) una supresión del aminoácido que ocupa la posición, o (iii) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición con un aminoácido diferente, (b) la variante tiene mayor actividad de alfa-amilasa ácida y/o mejor estabilidad enzimática en relación a la alfa-amilasa micótica madre. Preferiblemente, las variantes son variantes de la alfa-amilasa de A. kawa.ch.ii mostrada como SEQ ID NO: 41 o variantes de una alfa-amilasa que tiene al menos 60% de homología, al menos 70% de homología, al menos 80% de homología, o aún al menos 90% de homología con la SEQ ID NO: 41 y que comprende una o más de las siguientes sustituciones: N31D, S74A, Y89D, E209L, Y245V, D348 , D378A, K383A, P386A, 1387F, 1405V, N448S, y N480R, donde la variante tiene actividad de alfa-amilasa ácida incrementada y/o estabilidad enzimática mejorada con relación a la alfa-amilasa micótica madre mostrada como SEQ ID NO: 41. La más preferida es una variante de alfa-amilasa de A. kawachii mostrada como SEQ ID NO: 41 y que comprende las siguientes sustituciones: N31D, S74A, Y89D, E209L, Y245V, D348 , D378A, ?383?, P386A, 1387F, 1405V, N448S, y N480R.

Las variantes pueden ser producidas usando técnicas de modificación de proteínas convencionales. Expresión de las enzimas en plantas La secuencia de ADN que codifica para una enzima de interés, como una enzima híbrida o una variante de una enzima natural o una híbrida de la presente invención, puede ser transformada y expresada en plantas transgénicas como se describe más adelante . La planta transgénica puede ser dicotiledónea o monocotiledónea, por brevedad dicot o monocot. Los ejemplos de plantas monocot son pastos, como el pasto de poradera (pasto azul, Poa) , pasto forrajero como Festuca, Lolium, pasto templado, como el Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avenas, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz. Los ejemplos de plantas dicot son el tabaco, legumbres, como lupinas, papas, betabel, guisantes, frijol y soya, y plantas cruciferas (de la familia Bxassicaceae) , como la coliflor, colza aceitera y el organismo modelo estrechamente relacionado Arabidopsis thaliana. Los ejemplos de partes de plantas son el tallo, cayo, hojas, raíz, frutos, semillas y tubérculos así como los tejidos individuales que comprenden esas partes, por ejemplo epidermis, mesófílo, parenquima, tejidos vasculares, meristemos. En el presente contexto, también compartimientos de células de plantas específicos, como los cloroplastos, apoplastos, mi icondrias, vacuolas, peroxisomas y citoplasmas son considerados parte de la planta. Además, cualquier célula de planta, cuando sea de origen tisular es considerada parte de la planta. De igual modo, partes de planta como tejidos específicos y células aislado es para facilitar la utilización de la invención también son consideradas partes de plantas, por ejemplo embriones, endospermas, aleuronas y recubrimientos de semillas. También se incluyen dentro del alcance de la invención la progenie de esas plantas, partes de plantas y células de plantas. La planta transgénica o célula de planta que expresa la enzima de interés puede ser construida con métodos conocidos en la técnica. De manera breve la planta o célula de planta es construida incorporando uno o más plásmidos recombinantes de expresión que codifican para la enzima de interés en el genoma anfitrión de la planta y propagando la planta o célula de planta modificada resultante en una planta o célula de planta transgénica. Convenientemente, el plásmido recombinante de expresión es un plásmido recombinante de ADN que comprende un gen que codifica para la enzima de interés en asociación operativa con secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión del gen en la planta o parte de planta de elección. Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar células anfitrionas en las cuales se ha integrado el plásmido recombinante de expresión y las secuencias de ADN necesarias para la introducción del plásmido recombinante en la planta en cuestión (lo último depende del método de introducción de ADN a ser usado) . La elección de las secuencias reguladoras, como las secuencias promotoras y terminadoras y opcionalmente las secuencias señal o de tránsito es determinada, por ejemplo sobre la base de cuando, donde y como se desee que sea expresada la enzima. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica para la enzima de la invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser desarrollística, específica de la etapa o el tejido, y el producto del gen puede ser dirigido a un compartimiento células específico, tejido o parte de células como las semillas u hojas. Las secuencias reguladoras son descritas, por ejemplo por Tague et al, Plant, Phys., 86, 506, 1988. Para la expresión constitutiva puede ser usado el promotor de 35S-CaMV, ubiquitina 1 del maíz y actina 1 del arroz (Franck et al. 1980. Cell 21: 285-294, Christensen AH, Sharrock RA y Quail 1992. Genes de poliubiquitina del maíz: estructura, perturbación térmica de la expresión y empalme de transcripción, y actividad del promotor después de la transferencia a protoplastos por electroporación. Plant Mo.

Biol. 18, 675-689.; Zhang , McElroy D. y Wu R 1991, Análisis de la Actividad de la región Actl 5' del arroz en plantas de arroz transgénicas . Plant Cell 3, 1155-1165). Los promotores especxficos del órgano pueden, por ejemplo ser un promotor de tejidos de recolección de almacenamiento como las semillas, tubérculos de papa, y" frutos (Edwards & Coruzzi, 1990. Annu. Rev. Genet. 24: 275-303), o de tejidos de reconexión metabólica como los meristemos (Ito et al., 1994. Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor específico de la semilla como el promotor de glutelina, prolamina, globulina o albúmina del arroz (Wu et al., Plant and Cell Physiology Vol . 39, No. 8 pp. 885-889 (1998)), un promotor de Vicia faba de la legumina B4 y el gen de la proteína de la semilla desconocido de Vicia faba descrito por Conrad U. et al, Journal of Plant Physiology Vol. 152, No. 6 pp. 708-711 (1998), un promotor de una proteína del cuerpo oleoso de la semilla (Chen et al . , Plant and cell physiology vol. 39, No. 9 pp. 935-941 (1998), el promotor napA de proteína de almacenamiento de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en la W0 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de la hoja como el promotor rbcs del arroz o el tomate (Kyozuka et al., Plant Physiology Vol. 102, No. 3 pp. 991-1000 (1993) , el promotor del gen de adenin metiltransferasa del virus clorella (Mitra, A. and Higgins, DW, Plant Molecular Biology Vol . 26, No. 1 pp. 85-93 (1994) , o el promotor del gen aldP del arroz ( agaya et al . , Molecular and General Genetics Vol. 248, No. 6 pp. 668-674 (1995), o un promotor inducible por heridas como el promotor pin2 de la papa (Xu et al, Plant Molecular Biology Vol. 22, No. 4 pp. 573-588 (1993) . De igual modo, el promotor puede ser inducible por tratamientos abióticos como la temperatura, sequía o alteraciones en la salinidad o inducido por sustancias aplicadas de manera exógena que activen al promotor por ejemplo etanol, estrógenos, hormonas de plantas como el etileno, ácido abscísico y ácido gibberélico y metales pesados . Puede ser usado un elemento mejorador del promotor para lograr una mayor expresión de la enzima en l planta. Por ejemplo, el elemento mej orador del promotor puede ser un intrón que esté colocado entre el promotor y la secuencia nucleotídica que codifique para la enzima. Por ejemplo, Xu et al. op cit describe el uso del primer intrón de gen de la actina 1 del arroz para mejorar la expresión. El gen marcador seleccionable y cualesquier otras partea del plásmido recombinante de expresión pueden ser elegidos de aquellos disponibles en la técnica. El plásmido recombinante o constructo de ADN es incorporado en el genoma de la planta de acuerdo a métodos convencionales conocidos en la técnica, incluyendo la transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística, y electroporación (Gasser et al, Science, 244, 1293; Potrykus, Bio/Techn. 8, 535, 1990; Shimamoto et al, Nature, 338, 274, 1989) . Actualmente, la transferencia genética mediada por Agrrojbacteriuzn tumefaciens es el método de elección para generar dicots transgénicas (para una revisión Hooykas & Schilperoort, 1992. Plant Mol. Biol . 19: 15-38), y también puede ser usado para transformar monocots, aunque con frecuencia son usados otros métodos de transformación para esas plantas. Actualmente, el método de elección para generar monocots transgénicas suplementando el método con Agrobacterium es el bombardeo de partículas (partículas de oro o tungsteno microscópicas recubiertas con ADN transformante) de callos embriónicos o embriones en desarrollo (Christou, 1992. Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994. Curr. Opin. Biotechnol . 5: 158-162; Vasil et al., 1992. Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para la transformación de monocots se basa en la transformación de los protoplastos de acuerdo a lo descrito por Omirulleh S, et al., Plant Molecular biology Vol . 21, No. 3 pp. 415-428 (1993) . Después de la transformación, las transformantes que han incorporado el constructo de expresión son seleccionadas y regeneradas en plantas completas de acuerdo a métodos ya conocidos en la técnica. Con frecuencia el procedimiento de transformación es diseñado para la eliminación selectiva de los genes de selección ya sea durante la generación o en las siguientes generaciones mediante el uso de, por ejemplo contransformación con dos plásmidos recombinantes de T-ADN separados o escisión específica del gen de selección por una recombinasa específica. Procesamiento del almidón La enzima híbrida del primer aspecto de la invención o la variante del segundo aspecto de la invención puede en un octavo aspecto ser usada en un proceso para licuar almidón, donde un sustrato de almidón gelatinizado o granular es tratado en un medio acuoso con una enzima híbrida. Preferiblemente el proceso que comprende la hidrólisis de una suspensión de un almidón gelatinizado o granular, en particular la hidrólisis de almidón granular en un hidrolizado de almidón soluble a una temperatura inferior a la temperatura de gelatinización inicial del almidón granular. En una modalidad preferida la suspensión de almidón además de ser puesta en contacto con la enzima híbrida del primer aspecto o la variante del segundo aspecto de la invención es puesta en contacto con una enzima seleccionada de la lista que consiste de; una alfa-amilasa nicótica (EC 3.2.1.1), una beta-amilasa (E.C. 3.2.1.2) y una glucoamilasa (E. C.3.2.1.3 ) . En una modalidad más es agregada alfa-amilasa similar a la Termamil o una enzima ramificada, como una isoamilasa (E.C. 3.2.1.68) o una pululanasa (E.C .3.2.1.41) .

En el contexto de la presente invención una alfa-amilasa similar a la Termamil es una alfa-amilasa como se define en la W099/19467 en la página 3, línea 18 hasta la página 6, línea 27. La suspensión de almidón a ser sometida al séptimo aspecto de la invención puede tener almidón granular con 20-55% de sólidos secos, preferiblemente 25-40% almidón granular, de manera más preferible 30-35% almidón granular con sólidos secos. Después ser sometido el proceso del séptimo aspecto de la invención al menos al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o de manera preferible al menos 99% de los sólidos secos del almidón granular son convertidos a hidrolizado de almidón soluble. De acuerdo a la invención el proceso del séptimo aspecto de la invención es conducido a una temperatura inferior a la temperatura de gelatinización inicial. Preferiblemente la temperatura a la cual son conducidos los procesos de al menos al menos 30°C, al menos 31°C, al menos 32°C, al menos 33°C, al menos 34°C, al menos 35°C, al menos 36°C, al menos 37°C, al menos 38°C, al menos 39°C, al menos 40°C, al menos 41°C, al menos 42°C, al menos 43°C, al menos 44°C, al menos 45°C, al menos 46°C, al menos 47°C, al menos 48°C, al menos 49°C, al menos 50°C, al menos 51°C, al menos 52°C, al menos 53°C, al menos 54°C, al menos 55°C, al menos 56°C, al menos 57°c, al menos 58°C, al menos 59 °C, o preferiblemente de al menos 60°C. El pH del cual el séptimo aspecto de la invención es conducido puede estar en el intervalo de 3.0 a 7.0, de manera preferible de 3.5 a 6.0, o de manera más preferible de 4.0-5.0. El almidón granular a ser procesado en el proceso de la invención puede ser obtenido en particular de tubérculos, raices, tallos, legumbres, cereales o granos completos. De manera más específica el almidón granular puede ser obtenido de maíz, mazorcas, trigo, cebada, centeno, sorbo, sago, mandioca, tapioca, sorbo, arroz, guisantes, frijol, banana o papas. Especialmente contemplados son ambos tipos sedoso y no sedoso de maíz o cebada. El almidón granular a ser procesado puede ser un almidón de calidad altamente refinado, preferiblemente a un 90%, al menos 95%, al menos 97% o al menos 99.5% puro o puede ser un almidón más crudo que contenga material que comprenda grano entero o molido incluyendo fracciones no almidonosas como residuos de germen o fibras. El material crudo como, el grano completo, es molido para abrir la 'estructura y permitir el procesamiento adicional. Dos procesos de molienda son preferidos de acuerdo a la invención: molienda en húmedo o en seco. En la molienda en seco la semilla completa es molida y usada. La molienda en húmedo da una buena separación del germen y la harina (gránulos y proteína de maíz) y es con unas cuantas excepciones aplicada en lugares donde el hidrolizado de almidón es usado en la producción de jarabes. Ambas moliendas en húmedo y en seco son bien conocidas en la técnica del procesamiento del almidón y son igualmente contempladas por el proceso de la invención. También pueden ser aplicados gránulos, y preferiblemente gránulos de maíz molido. En una modalidad del proceso del séptimo aspecto de la invención la enzima híbrida es usada en el proceso para la producción de etanol combustible o potable que comprenden poner en contacto el almidón tratado con una levadura. Preferiblemente el proceso comprende la fermentación con una levadura llevada a cabo simultáneamente o de manera separada/secuencial con la hidrólisis con la suspensión de almidón granular. Cuando la fermentación es efectuada simultáneamente con la hidrólisis la temperatura es, de manera preferible de entre 30°C y 35°C, y de manera más preferible de entre 31°C y 34°C. En otra modalidad la suspensión de almidón granular es puesta en contacto con un polipéptido que comprende una CBM, pero no el módulo catalítico, es decir la aplicación de CBM sueltos. Los CBM sueltos pueden ser módulos de unión de almidón, módulos de unión de celulosa, módulos de unión de quitina, módulos de unión de xilano, módulos de unión de mañano, y otros módulos de unión. Los CBM preferidos en el presente contexto son CBM microbianos, particularmente CBM bacterianos o nicóticos. Particularmente preferidos son los módulos de unión descritos en la solicitud de patente danesa ?? 2003 01568 como las secuencia polipeptídicas SEQ ID NO:l, SEQ ID NO : 2 , y SEQ ID NO: 3 o los módulos de unión de almidón mostrados en la presente descripción como SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQID NO: 15; SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19, SEQ ID N0:20,SEQ ID N0:21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23. Los CBM más preferidos incluyen los CBM descritos en la presente descripción como SEQID NO: 24 y como SEQID N0:25. También preferida por la invención es la aplicación de cualquier CBM que tenga al menos 50%, 60%, 70%, 80% o aún al menos 90% de homología con cualquiera de las secuencias de aminoácido de CBM mencionadas anteriormente. Los CBM sueltos pueden ser aplicados a la suspensión de almidón granular en cantidades efectivas. La glucosa también puede ser fermentada a otros productos de fermentación, como ácido cítrico, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico; cetonas; aminoácidos, como el ácido glut mico, (monoglutaminato de sodio) , pero también compuestos más complejos como antibióticos, como la penicilina, tetraciclina; enzimas; vitaminas; como la riboflavina, B12, beta-caroteno; hormonas, las cuales son difíciles de producir de manera sintética. Productos basados en masa La enzima híbrida puede ser usada para la preparación de un producto comestible basado en masa, particularmente una enzima híbrida que comprende un modulo amilolítico que comprende Aspergillus oryzae como la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 30. La enzima híbrida usada para la preparación de una producto comestible basado en masa es en particular una enzima híbrida que comprende la secuencia mostrada como SEQID NO: 30 y/o como lo aminoácidos 21-498 de la SEQID NO: 30 o cualquier variante de la misma, como una variante comprende uno o más sustituciones selecciona de la lista que consiste de: Q81R, K158D, K158V, S161D, S161N, Q163S, Q163A, D164S, Y175W, E176D, D177N, N264K, N264E, M266L, G466D, D468S, y N470D. La enzima híbrida usada para la preparación de un producto comestible basado en masa es en particular una enzima híbrida que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50% de homología, preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 85% o al menos 90%, por ejemplo al menos 95%, 97%, 98%, o al menos 99%, como 100% de homología con las secuencias expuestas en la SEQ ID NO: 30 aquí . La masa generalmente comprende harina (particularmente harina de trigo) y agua. La masa es fermentada por ejemplo agregando agentes fermentantes químicos o levadura, usualmente Saccharomyces cerevisiae (levadura para hornear) . El producto basado en masa es producido o fermentado tratado con vapor. Los ejemplos son el pan cocido al vapor u horneada (particularmente pan blanco, harina integral o centeno) , típicamente en forma de láminas o rollos. La masa puede comprender una o más enzimas adicionales, por ejemplo una segunda amilasa (por ejemplo una alfa-amilasa maltogénica) , una ciclodextrin glucanotransferasa, una proteasa o péptidasa, en particular una exopeptidasa, una transglutaminasa, una lipasa, una fosfolipasa, una celulasa, una semicelulasa (por ejemplo una pentosanasa o xilanasa) , una glicosiltransferasa, una enzima ramificante o una oxidasa como la glucosa oxidasa o una oxidasa con una actividad más alta sobre la maltosa que sobre la glucosa. La enzima híbrida puede ser usada a una dosis más baja que el módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa usado (en comparación sobre una base en peso) . MATERIALES Y METODOS Material comprado Las enzimas para manipulaciones de ADN (por ejemplo, endonucleasa de restricción, ligasas etc) son obtenibles de New England Biolabs, Inc. y se usaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los plásmidos amplificados fueron recuperados con el equipo de plásmidos Qiagen (Qiagen) . La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se llevo a cabo con el sistema de Expand" PCR (Roche) . El equipo de extracción en gel QlAquick™ (Qiagen) fue usado para la purificación de los fragmentos de la PCR y los fragmentos de ADN escindidos de los geles de agarosa. Cepas y plásmidos La cepa de Aspergillus kawachii IF04308 fue usada como donadora de CBM y secuencia de enlazador. La cepa de Aspergillus niger DSM 2761 donó la secuencia amilolitica (WO89/01969) . La cepa de Aspergillus niger MBinl20 descrita en la solicitud de patente provisional No. 60/459902 (10345.000-US) se usó como cepa anfitriona. El plásmido de expresión de Aspergillus pMT2188 descrito en la patente W0200295014 fue usado como vector. La cepa Escherichia coli DB6507 defectuosa en pyrF (ATCC 35673) fue usada para la propagación de pHUda381 y pHUda387. El plásmido pMT2188 consiste de un cásete de expresión basado en el promotor de amilasa II neutro de Aspergillus niger fusionada a la secuencia líder no traducida de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans (Pna2/tpi) y el terrainador de amiloglicosidasa de Aspergillus niger (Tamg) . También presentes sobre el plásmido esta el marcador selectivo de Aspergillus amds de Aspergillus nidulans que permite el crecimiento sobre acetamida como u única fuente de nitrógeno del marcador URA-3 Saccharomyces cerevisiae que permite el crecimientote la cepa Escherichia coli DB6507 defectuosa en pyrF (ATCC 35673) , la cual propaga pHUda381 y pHUda387. La transformación en E. coli DB6507 usando el gen del URA 3 de S. cerevisiae como marcador selectivo se efectúo de la siguiente manera: La E. coli DB6507 se hizo competente por el método de andel y Higa (Mandel, M. and A. Higa (1970) J. Mol. Biol, 45,154). Los transformantes fueron seleccionados sobre medio M9 sólido (Sambrook et . al (1989) clonación molecular, un manual de laboratorio, 2 edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press) suplementado con 1 g/1 de casaminoácidos , 500 µg/l tiamina y 10 mg/1 canamicina. Medios y sustratos El Cove estuvo compuestos de 342.3 g/L Sucrosa, 20ml/L solución de sal de COVE, Acetamida lOmM y 30 g/L de agar de noble. El Cove-2 estuvo compuesto de 30 g/L de Sucrosa, 20ml/L de solución de sal de COVE, lOmM Acetamida y 30 g/L de agar de noble. La solución de sal de COVE estuvo compuesta de 26 g/L KCI , 26 g/L MgSO4-7H20, 76 g/L H2P04 y 50mi/L de metales trazas de Cove. Los metales en trazas de COVE estuvieron compuestos de 0.04 g/L Na2B 07-10. ¾0, 0.4 g/L CuS04.5H20, 1.2 g/L FeS04-7H20, 1.0 g/L MnS0 -H20, 0.8 g/L Na2Mo02-¾0 y 10 g/L ZnS04.7H20. El YPG estuvo compuesto de 4 g/L de extracto de levadura como, 1 g/LK2HP04, 0.5 g/L MgS04-7H20 y 15 g/L glucosa, H 6.0. El STC estuvo compuesto de Sorbitol 0.8 M, Tris 25 mM pH 8 y 25 m CaCl2. El STPC estuvo compuesto de 40 % PEG4000en amortiguador STC. La agarosa superior de Cove estuvo compuesta de 342.3 g/L Sucrosa, 20ml/L de solución de sal de COVE, Acetanima lOmM y 10 g/L agarosa de bajo punto de fusión. El MLC estuvo compuesta de 40 g/L Glucosa, 50 g/L de polvo de soya, 4 g/L ácido cítrico, pH 5.0. El GO-50 estuvo compuesta de 50 g/L glucosa, 2 g/L KH2P04, 2 g/L MgS04-7ac, 3 g de K2S04/ 3 g/L de ácido cítrico, 50 g/L de ácido oxálico, 0.5 m/L de solución de metales en traza de A G y 3g/L de urea , pH 5.0. La Solución de metales en traza AMG estuvo compuesta de 6.8 g/L ZnCl2-7H20, 2.5 g/L CuS02-5H20, 0.24 g/L NiCI2-6H20, 13.9 g/L FeS04-7H20, 13.5 g/L MnS04¾0 y 3 g/L ácido cítrico. Actividad de la alfa-amilasa estable en ácido Cuando se ha usado de acuerdo a la presente invención la actividad de cualquier alfa-amilasa estable en ácido puede ser medida en AFAU (Unidades de Alfa-amilasa Micótica Acida) , las cuales son determinadas con relación a un estándar de enzima. 1 FAU se define como la cantidad de enzima que degrada 5.260 mg de materia seca de almidón por hora bajo las condiciones estándar mencionadas más adelante. La alfa-amilasa estable en cido, una endo-alfa-amilasa (1, 4-alfa-D-glucan-gulacano hidrolasa, E.C. 3.2.1.1) hidroliza enlaces alfa-1, 4-glucosídicos en las regiones internas de la molécula de almidón para formar dextrinas y oligosacáridos con diferentes longitudes de cadena. La intensidad del color formado con yodo es directamente proporcional a la concentración del almidón. La actividad de la amilasa es determinada usando colorimetría inversa como una reducción en la concentración del almidón bajo condiciones analíticas específicas. ALFA-AMILASA AL IDON + YODO DEXTRINAS+OLIGOSACARIDOS ?= 590nM 40°,pH2/5 azul/violeta t=23 sec . decoloración Condiciones est ndar/condiciones de reacción: Sustrato : Almidón soluble, aproximadamente 0.17 g/L Amortiguador Citrato, aproximadamente 0.03 Yodo (I2) : 0.03 g/L CaCl2: 1.85 mM pH: 2.50 ± 0.05 Temperatura de incubación: 40°C Tiempo de reacción: 23 segundos Longitud de onda : 90 nm Concentración de enzima : 0.025 AFAU/mL Intervalo de trabajo de la enzima: 0.01-0.04 AFAU/mL Una carpeta ES-SM-0259.02/01 que describe este método analítico con mayor detalle que está disponible a petición de Novozymes A/S, Dinamarca, carpeta al cual se incluye aquí como referencia. Actividad de la glucoamilasa La actividad de la glucoamilasa puede ser medida en unidades de AmiloGlucosidasa (AGU) . Las ÁGU se definen como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto bajo condiciones estándar de 37 °C, pH 4.3, sustrato: maltosa 23.2 mM, amortiguador: acetato 0.1 M, tiempo de reacción de 5 minutos. Puede ser usado un sistema autoanalizador. La mutarotosa es agregada al reactivo de glucosa deshidrogenasa de modo que cualquier alfa-D-glucosa presente sea convertida en beta-D-glucosa. La glucosa deshidrogenasa reacciona específicamente con la beta-D-glucosa en la reacción mencionada anteriormente, formando NADH el cual es determinado usando un promotor a 340 nm como una medida de la concentración de glucosa original. Incubación de AMG: Sustrato : maltosa 23.2 mM Amortiguador : acetato 0.1 M pH: 4.30 ± 0.05 Temperatura de incubación 37°C ± 1 Tiempo de reacción: 5 minutos Intervalo de trabajo de la enzima: 0.5-4.0 AGU/mL Reacción de color: GlucDH: 430 U/L Mutarotasa: 9 U/L NAD: 0.21 mM Amortiguador : fosfato 0.12 M; NaCl 0.15 M pH: 7.60 ± 0.05 Temperatura de incubación 37°C + 1 Tiempo de reacción: 5 minutos Longitud de onda: 340 nm Una carpeta (EB-SM-0131.02/01) que describe este método analítico con mayor detalle está disponible a petición de Novozymes A/S, Dinamarca, carpeta la cual se incorpora aquí como referencia. Manipulaciones de ADN Dicho de ¦ otro modo, las manipulaciones y transformaciones del ADN se efectuaron usando métodos estándar de biología molecular como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab. Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology" , John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. y Cutting, S. M. (eds.) Ejemplo 1: Clonación del módulo de unión de carbohidrato (CBM) de Aspergillus kawachíi Para clonar el módulo de unión de carbohidrato (CBM) con enlazador de A. kawachíi, se diseñaron los cebadores CBMl (SEQ ID NO: 1) y CBM2 (SEQ ID NO: 2) sobre la base de las secuencias nucleotídicas de alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus kawachíi en la base de datos EMBL (EMBL:#AB008370) . El CBMl y el CBM2 comprenden un sitio de BamHI y un sitio de Salí, respectivamente. CBMl : 5 ' -gaagggatccgatttttactagtacatccaaagccaccac-31 CBM2 : 51 -tttgtcgacctacctccacgtatcaaccaccgtctcc-3 ' La reacción PCR se llevo a cabo con los cebadores CBMl y CBM2 usando ADN genómico de A. kawachíi (IF04308) como molde o patrón. Los componentes de la reacción (1 ng/microL de ADN genómico, dNTP 250 mM cada uno, cebador 250 nM cada uno, O.lU/microL en polimerasa Taq IX amortiguador (Roche Diagnostics, Japón)) fueron mezclados y sustituidos por PCR bajo las siguientes condiciones.

Paso Temperatura Tiempo 1 94 °C 2 min 2 92 °C 1 min 3 55°C 1 min 4 72 °C 1 min 5 72°C 10 min 6 4°C por siempre Los pasos 2 a 4 se repitieron 30 veces. Se amplificó un fragmento de 0.4 kb que contiene el CBM con la región enlazador. El ADN amplificado fue cortado por Sal I y BamH I y ligado en pMT2188 digerido por Xho I y BamH I para crear pHUda381 que tiene CBM en la región enlazador de Aspergillus kawachii , promotor de amilasa neutra de Aspergillus niger, secuencias líder de TPI de Aspergillus nidulans, terminador de glucoamilasa de Aspergillus niger y el gen amdS de Aspergillus nidulans como marcador. El pHUda381 fue secuenciado para confirmar la presencia del CBM. correcto con la secuencia enlazador. El CBM con la secuencia enlazador se muestra en la SEQ ID NO: 5. Ejemplo 2: Expresión de la enzima híbrida en Aspergillus niger La producción de la secuencia de ADNc del gen de la alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger y la clona de ADNc de alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger se describe en la WO 8901969 (ejemplos 1 y 3) . La reacción de PCR con la clona de ADNc de alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger como moldeo o patrón se efectuó usando los cebadores (SEQ ID NO: 3) y (SEQ ID NO: 4) para introducir el sitio de BairiHI y un sitio de Spel, respectivamente. (SEQ ID NO: 3): 5 ' -tttggatccaccatgagattatcgacttcgagtctcttc-3 ' (SEQ ID NO : 4) : 51 -tttactagtagcagcagcagttgtggtcgtggttgttc-31 Los componentes de la reacción (1 ng/microL de ADN patrón, dNTP 250 mM cada uno, cebador 250 nM cada uno, O.lU/microL en polimerasa Taq en IX amortiguador (Roche Diagnostics, Japón)) fueron mezclados y sustituidos por la PCR bajo las siguientes condiciones. Temperatura Tiempo 9 °C 2 min 92 °C 1 min 55°C 1 min 72 °C 2 min 72°C 10 min 4°C por siempre Los pasos 2 a 4 se repitieron 30 veces. El fragmento de ADN amplificado de 1.5 kb fue cortado por Spe I y BamH I y ligado en pHUda381 digerido por Spe I y BamH I para crear el plásmido de expresión pHUda387 que comprende ADNc de alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger fusionado con el CBM de Aspergillus kawachii . El pHUda387 fue secuenciado para confirmar que no ocurrieron cambios en las secuencias de ADNc de alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger. La secuencia de ADNc de alfa-amilasa estable en Aspergillus niger se muestra en la SEQ ID NO: 7. El pHUda387 fue transformado en Binl20 de Aspergillus niger. La cepa anfitriona fue propagada en 100 mi de medio YPG no selectivo a 32°C durante 16 horas en un agitador giratorio a 120 rpm. Las células fueron recolectadas por filtración, lavadas por KCI 0.6 M y resuspendidas en 20 mi de KCI 0.6 M que contiene un producto de beta-glucanasa comercial (GLUCANEX™*, Novozymes A/S) a una concentración final de 600 microL/ml. La suspensión fue incubada a 32°C a 80 rpm hasta que se formaron protoplastos, entonces se lavó dos veces con amortiguador STC. Los protoplastos fueron contados con un hematómetro y resuspendidos y ajustados en una solución 8:2:0.1 de STC : STPC : DMSO hasta una concentración final de 2.5xl07 protoplastos/ml . Se agregaron aproximadamente 3 microgramos de ADN plasmídico a 100 microL de suspensión de protoplastos, se mezcló suavemente y se incubó sobre hielo durante 20 min. Se agregó un mi de SPTC y la suspensión de protoplastos fue incubada durante 30 a 37°C. Después de la adición de 10 mi de agarosa superior de Cove a 50 °C, la reacción se vació sobre placas de agar de Cove y las placas fueron incubadas a 32°C. Después de 5 días los transformantes fueron seleccionados del medio de Cove. Los transformantes seleccionados fueron inoculadas en 100 mi de medios LC y cultivados a 30°C durante 2 días. 10 mi del medio MLC fueron inoculados a 100 mi de medio GO-50 y cultivado a 30°C durante 5 días. El sobrenadante se obtuvo por centrifugación. La actividad de la alfa-amilasa estable en ácido en el sobrenadante fue determinada como la disminución del color azul del complejo almidón-yodo medido en DO590nm. Se disolvieron 25 microL de muestras de enzima en amortiguador de muestra (cloruro de calcio 51.4 mM en amortiguador de citrato 2 mM [pH 2.5]) fueron mezclados con 135 microL de solución de sustrato (0.6 g/L de almidón [Merck 1253] y 12 g/L de acetato de sodio en amortiguador de citrato 100 mM [pH 2.5]) y se incubó a 37°C durante 325 seg. 325 seg después, se agregaron 90 microL de solución de yodo (1.2 g/L de yoduro de potasio [Merck 5043] y 0.12 g/L de yodo [Merck 4761]) a la mezcla de reacción y se incubó a 37°C durante 25 seg. La actividad fue medida a 590 nm en un espectrofotómetro . Se usaron 25 microL de agua destilada en lugar de muestras de enzima en experimentos blanco. Ejemplo 3: Desempeño de la enzima híbrida en SSF de almidón no gelatinizado El desempeño relativo de alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger y alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger con un módulo de unión de carbohidrato unido fue evaluado vía la miniescala de fermentaciones SSF (Sacarificación y Fermentación Simultánea) . Las dosis usadas fueron de 0.3, 0.5 y 1.0 AFAU/g de DS de la alfa-amilasa respectiva complementados con una dosis de 0.5 AGU/g DS de glucosamilasa de Aspergillus niger purificada. De manera breve, se agregaron aproximadamente 1.9 g de maíz molido (maíz con dientes amarillo #2 molido en un molino de martillos de escala piloto y pasado a través de un tamiz de 2 mm, contenido de humedad del 11.2%) fueron agregados a tubos de poliestireno de 16 mi (Falcon 352025) . Se agregó una solución de H2S04 0.02 N con 3 mg/ml de penicilina en una cantidad apropiada para llevar el nivel de sólidos secos (DS) al 34% y el pH a 5.0. Los tratamientos se hicieron en seis replicas . Después de dosificar las enzimas, los tubos fueron inoculados con 4.74 x 108 células de levadura/ml. Los tubos fueron tapados con una tapa de rosca la cual había sido perforada con un agua muy pequeña para permitir la liberación de gas y se agitaron vorticialmente brevemente antes de ser pesadas e incubadas a 32 °C. El progreso de la fermentación fue seguido pesando los tubos con el tiempo. Los tubos fueron agitados vorticialmente poco antes de ser pesados. La relación usada entre la cantidad de pérdida de C02 y el peso de etanol fue: pérdida de C02 (g) x 1.045 = EtOH(g). Los resultados se muestran en la tabla 2.

Tabla 2: Rendimiento de etanol promedio como g de etanol/g de DS después de 50 horas. Dosis (AFAU/g alfa-amilasa de Aspergillus alfa-amilasa de Aspergillus niger DS) niger + CBM 0Í3 0.342 0.366 0.5 0.348 0.383 1.0 0.365 0.390 límites de confianza del 95%: +/- 0.008 Sobre una base de actividad igual, la alfa-amilasa estable al ácido de Aspergillus niger con un módulo de unión de carbohidrato unido (híbrido) produjo de manera significativa la alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger (nativa) a todas las dosis probadas. La enzima híbrida fue aproximadamente tres veces más efectiva que la enzima nativa (es decir aque el desempeño de la alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger pudo ser igualado con aproximadamente tres veces menos alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger con un módulo de unión de carbohidrato unido) . Ejemplo 4: Desempeño de las enzimas híbridas con diferentes combinaciones de CBM# secuencia de enlazador y módulo catalítico Se construyeron variantes de enzima híbrida que comprenden la alfa-amilasa estable en ácido (AA) de Aspergillus niger y un CBM de A. kawachii , AMG de A. niger, AMG de T. emersonii, AMG de Athelia rolfsii o alfa-amilasa maltogénica de Bacillus sp. (Novamyl) . La secuencia del enlazador de alfa-amilasa de A. kawachii (SEQ ID NO: 27) fue usada en todas las variantes. El desempeño de las variantes fue evaluado usando almidón de maíz (S1G A S-9679) como sustrato, 0.5 AGü/g DS de glucoamilasa G2 de Aspergillus niger, 1.0 AFAU/g DS de variante y la cuantificación de la glucosa liberada con el tipo de prueba de Glucosa B (Wako Puré Chemicals 271-3141) . Los resultados se muestran en la Tabla 3. Tabla 3. Desempeño de enzimas híbridas con diferentes CBM. Glucosa mg/ml después de 20, 48 y 68 horas (1.0 AFAU/gDS) Variante Módulo catalítico Enlazador SBD 20 hrs 48 hrs 68 hrs JA001 Aspergillus niger kawachii AA kawachii AA 0.18 0.51 1.07 JA002 Aspergillus niger kawachii AA niger AMG 0.38 1.08 1.88 JA003 Aspergillus niger kawachii AA emersonii AMG 0.04 0.19 0.43 JA004 Aspergillus niger kawachii AA rolfsii AMG 0.48 1.43 2.48 JA005 Aspergillus niger kawachii AA bacillus MA -0.03 -0.04 0.10 Se construyeron variantes de enzima híbrida que comprenden la alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger y un CBM de alfa-amilasa de A. kawachii, AMG de A. niger, o AMG de Athelia rolfsii. También se construyeron variantes con una secuencia de enlazador diferente. Las secuencias de enlazador usadas fueron el enlazador de AMG de A. niger (SEQ ID NO: 26) , enlazador alfa-amilasa de A. kawachii (SEQ ID NO: 27), enlazador AMG de Athelia rolfsii (SEQ ID NO: 28), y enlazador de PEPT (SEQ ID NO: 29). También se construyó una variante que tenía dos CBD en cascada (JA012) . El desempeño de las variantes fue evaluado como anteriormente, únicamente con glucoamilasa Gl de Aspergillus niger y la variante fue dosificada a 0.3 AFAU/g DA. Los resultados se muestran en la tabla 4. Tabla 4. Desempeño de enzimas híbridas con diferentes secuencias de enlazador y módulos catalíticos. Glucosa mg/ml después de 18, 24 y 42 horas.

Variante Módulo catalítico Enlazador SBD 18 hrs 24 hrs 42 hrs 68 hrs JA001 Aspergillus niger kawachii AA Kawachii AA 2.73 4.40 7.01 8.93 JA002 Aspergillus niger kawachii AA niger AMG 2.75 4.30 7.03 9.23 JA004 Aspergillus niger niger A G rolfsii AMG 2.91 4.35 7.16 9.11 JA008 Aspergillus niger rolfsii AMG niger AMG 3.01 4.26 7.31 8.76 JA009 Aspergillus niger PEPT niger AMG 3.02 4.69 7.60 9.11 JA010 Aspergillus niger rolfsii AMG niger AMG 3.18 4.66 7.82 9.38 JA011 Aspergillus niger kawachii AA rolfsii AMG 3.31 4.62 7.49 9.60 JA012 Aspergillus niger niger AMG + 2.99 4.10 6.97 8.85 rolfsii AMG Se construyeron variantes de enzima híbrida que comprende un enlazador CBM de alfa-amilasa de A. kawachii con diferentes módulos catalíticos. Los módulos catalíticos aplicados fueron de alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, alfa-amilasa de A. kawachii o alfa-amilasa de Aspergillus oryzae (Fungamyl15) . El desempeño de las variantes fue evaluado como anteriormente, con glucoamilasa Gl de Aspergillus niger y la variante dosificada a 0.3 AFAü/g DS. Los resultados se muestran en la tabla 5.

Tabla 5. Desempeño de enzimas híbridas con diferentes módulos catalíticos. Glucosa mg/ml después de 18, 24, 42 y 68 horas.

Variante Módulo Enlazador SBD 18 hrs 24 hrs 42 hrs 68 hrs catalítico JA001 A. niger AA kawachii AA kawachii AA 2.73 4.40 7.01 8.93 JA006 A. oryzae AA kawachii AA kawachii AA 3.39 5.10 7.99 9.77 JA007 A. kawachii AA kawachii AA kawachii AA 2.91 3.99 6.82 8.57 Las variantes de enzima híbrida comprenden el enlazador CBM de alfa-amilasa de A. kawachii o AMG de A. rolfsii con diferentes módulos catalíticos de alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, alfa-amilasa de Aspergillus oryzae (FungamylMR) . El desempeño de las variantes fue evaluado como anteriormente, con glucoamilasa Gl de Aspergillus niger y la variante dosificada como 0.3 AFAü/g DS . Los resultados se muestran en la tabla 6. Tabla 6. Desempeño de diferentes enzimas híbridas. Glucosa m.q/ml después de 18. 24 ó 42 horas.

Variante Módulo Enlazador SBD 18 hrs 24 hrs 42 hrs catalítico JA001 A. niger AA kawachii AA kawachii AA 4.64 5.61 8.38 JA006 A. oryzae AA kawachii AA kawachii AA 6.27 7.93 9.40 JA017 A. oryzae AA rolfsii AMG rolfsii AMG 6.68 8.87 9.80 Ejemplo 5: Variantes de JA017 con una o más sustituciones en el módulo catalítico . Las variantes de la enzima híbrida JA017 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SE ID NO: 40) que comprenden el CBm de AMG de A. rolfsii, secuencia enlazador de A. rolfsii y el módulo catalítico de alfa-amilasa de A. oryzae con una o más sustituciones en el módulo catalítico fueron construidas usando técnicas de modificación de proteínas convencionales. La Tabla 7 lista las sustituciones en las variantes. Tabla 7. Variantes de JA017 (SEQ ID NO: 40) con una o más sustituciones en el módulo catalítico. Na Sustitución J 019 ?175 /?1760 ??O30 264K 266L JAD56 D253 J/O57 158DS161DQ163SD164SG66DD468SM470D JWD59 G60NN264KM266L JAOdO D177N JW61 K158DS161DQ163SD16SY179WE176OG466DD68SN70D JA062 K158DS161DQ163SD164SY17WE176D 264KIV^ J 63 158VS161DQ163SD164SGO3OD68SW70D JWD69 K158DS161NQ163AD16SG466DD46ESN470D JA374 K158VS161NQ163AD164S N264 266LG466D D68S N70D Q81RK158VS161NQ163AP16^Y17SVE176DG466DI-M68S 470O Mm K158DS161DQ163SD16SY179A/E176D 264EM2S6LG66DD468S^ C-61RK158VS161NQ163¾D164SY17a/VE176Dm^ JAD93 Q81R K158VS161N Q163AD164S Y175WE176D D177N 26CM266LG6^D468S 470D JAD94 K158VS161NQ162AD1&4S Y179i/VE176D D177 N264KM266LG466D D468S N47CD JWD95 K158VS161NQ162AD164SY17WE176DD177N I264E 2e6LG466DD468Sm78 JW36 K158VS161NQ163AD164SD177 264KM266LG66DI¾68SN47aD JW7 K158VS161N Q163AD164S D177N 264EM266LG46SD D68S N470D Las variantes fueron expresadas en Aspergillus oryzae y caracterizadas por estabilidad al pH, termoestabilidad y desempeño hacia el almidón crudo por la prueba de liberación de glucosa. La JA085 mostró al menos una termoestabilidad mayor en 5°C que la JA017 a pH 4.5 y fue estable a una pH 3.0.

Las nuevas variantes JA085 y JA074 mostraron una alta actividad especifica en la prueba de liberación de glucosa. La JA085 continúo liberando glucosa a un pH 3.8 donde la JA017 fue inactivada rápidamente. La JA074 obtuvo los rendimientos de glucosa más altos a pH 4.0 pero fue inactivada a pH 3.8. Las Tablas 8-10 listan la estabilidad a la temperatura como actividad residual después de 30 minutos de incubación a 55°C y 60°C a pH 4.5, la actividad específica, la estabilidad al pH y la actividad en la prueba de liberación de glucosa de un número de variantes. Tabla 8. Estabilidad a la temperatura y actividad especifica de las variantes de PE seleccionadas . Estabilidad a la temperatura (%) Actividad específica en CaCI2 1 m Sin CaCI2 (mFAU/DO280) 55°C 60°C 55°C JA017 2 0 0 3157 JA057 12 0 0 JA061 51 0 16 JA063 18 0 0 JA069 16 0 0 JA074 19 0 0 JA085 68 20 12 3653 JA095 59 7 2 4240 JA096 53 0 0 JA097 40 0 0 Tabla 9a. Estabilidad a la temperatura (pH Tabla 9b. Estabilidad a la temperatura (32°C 1 4.5, 1 hora de incubación) hora de incubación) Temp°C JA017A JA085A pH JA017A JA085A 35 101 107 2ß Ó" 20 40 109 102 3,0 23 76 45 98 96 3,5 74 83 50 64 95 4,0 88 92 55 0 56 4,5 86 95 60 0 27 5,0 96 99 65 0 0 5,5 100 100 Tabla 10a. Desempeño en la prueba de liberación de glucosa con AMG G2 de A. niger purificada a pH 4.0. Glucosa mg/ml. 0 min 19 min 43 min 67 min 91 min JA001 0.48 3.48 5.67 8.26 10.79 JA017 0.46 6.45 7.97 8.71 8.98 JA074 0.44 8.85 14.69 18.24 20.29 JA085 0.41 5.87 10.62 13.92 17.34 Tabla 10b. Desempeño en la prueba de liberación de glucosa con AMG G2 de A. niger purificada a pH 3.8. Glucosa mg/ml. 0 min 19 min 43 min 67 min 91 min JA001 0.48 3.19 5.28 7.63 10.32 JA017 0.46 4.28 4.71 4.98 5.13 JA074 0.43 7.75 11.58 13.55 13.93 JA085 0.41 5.71 9.73 12.99 15.76 Tabla a. Desempeño en la prueba de Tabla 11 b. Desempeño en la prueba de liberación de glucosa con AMG G2 de A. liberación de glucosa con AMG G2 de A niger purificada a pH 3.9. Glucosa mg/ml. niger purificada a pH 3.6. Glucosa mg/ml. 0 min 18 min 90 min 0 min 18 min 90 min JA074 0.41 6.83 16.87 JA074 0.43 5.01 7.57 JA085 0.40 4.50 14.08 JA085 0.43 4.18 10.61 JA094 0.40 4.48 14.00 JA094 0.42 4.18 11.18 JA095 0.40 4.49 13.82 JA095 0.42 4.33 11.52 Ejemplo 6: Variantes de la alfa-amilasa ácida de Asperglllus kawachii Una variante de alfa-amilasa ácida de Aspergillus kawachii adecuada para la hidrólisis de almidón crudo puede ser producida por proteína convencional modificada de la secuencia que comprende el módulo catalítico. La posición específica donde las alteraciones pueden mejorar la actividad específica y/o estabilidad fueron predichas sobre la base de la similitud con una de las siguientes alfa-amilasas micóticas que tienen la secuencia de aminoácidos indicada y una estructura tridimensional encontrada bajo el identificador indicado en el banco de datos de proteínas RCSB (www. rcsb. org) : la alfa-amilasa ácida de A. niger (2aaa, SEQ ID NO: 42 aquí) y la alfa-amilasa (Taka amilasa) de Aspergillus oryzae (6taa o 7 taa, SEQ ID NO 43: aquí). Los dos modelos 3D fueron superpuestos alineando los aminoácidos residuales de cada triada catalítica. Esto se hizo por métodos conocidos en la técnica basados en las desviaciones de los tres pares de aminoácidos de átomos de C-alfa, por ejemplo minimizando la suma de los cuadrados de las tres desviaciones o alineando de modo que se mantenga cada desviación por debajo de 0.8 Á, por ejemplo por debajo de 0.6 Á, por debajo de 0.4 Á, por debajo de 0.3 A o por debajo de 0.2 Á. De manera alternativa, la superposición puede ser efectuada alineando las dos secuencias de aminoácidos por un método convencional y minizando la suma de cuadrados de las desviaciones de todos los pares correspondientes de aminoácidos residuales. La alineación de la secuencia puede ser efectuada por métodos convencionales, por ejemplo mediante el uso de los programas o sistemas de programación o software GAP de UWGCG Versión 8. En la alineación de las tres alfa-amilasas de A. kawachii , A. niger (aaa_ne ) y A. oryzae (7taa) se indican los residuos que están dentro de 10 Á de sustrato de acarbosa en la estructura de 7taa.pbd. Esos residuos son blancos para alteraciones que confieren una mejor actividad específica, kawachi MRVSTSSIAL AVSLFGKLAL GLSAAEWRTQ SIYFLLTDRF GRTDNSTTAT 50 aaa_new MRLSTSSLFL SVSLLGKLAL GLSAAEWRTQ SIYFLLTDRF GRTDNSTTAT 7taa ATPADWRSQ SIYFLLTDRF ARTDGSTTAT 29 * * * kawachi CNTGDQIYCG GSWQGIINHL DYIQGMGFTA IWISPITEQL PQDTSDGEAY 100 aaa_new CDTGDQIYCG GSWQGIINHL DYIQGMGFTA IWISPITEQL PQDTADGEAY 7taa CNTADQKYCG GTWQGIIDKL DYIQGMGFTA IWITPVTAQL PQTTAYGDAY 79 kawachi HGY QQKIYY VNSNFGTADD LKSLSDALHA RGMYLMVDW PNHMGYAGNG 150 aaa_new HGY QQKIYD VNSNFGTADD LKSLSDALHA RGMYLMVDW PNHMGYAGNG 7taa HGY QQDIYS LNENYGTADD LKALSSALHE RGMYLMVDW ANHMGYDGAG 129 ***** *** ****** kawachi NDVDYSVFDP FDSSSYFHPY CLITD DNLT MVQDCWEGDT IVSLPDLNTT 200 aaa_new NDVDYSVFDP FDSSSYFHPY CLITDWDNLT MVQDCWEGDT IVSLPDLNTT 7taa SSVDYSVFKP FSSQDYFHPF CFIQNYEDQT QVEDCWLGDN TVSLPDLDTT 179 ******* ** ***** ****** kawachi ETAVRTIWYD WVADLVSNYS VDGLRIDSVE EVEPDFFPGY QEAAGVYCVG 250 aaa_new ETAVRTIWYD WVADLVSNYS VDGLRIDSVL EVEPDFFPGY QEAAGVYCVG 7taa KDWKNEWYD WVGSLVSNYS IDGLRIDTVK HVQKDFWPGY NKAAGVYCIG 229 ****** ** * * kawachi EVDNGNPALD CPYQKYLDGV LNYPIYWQLL YAFESSSGSI SNLYNMI SV 300 aaa_new EVDNGNPALD CPYQKVLDGV LNYPIYWQLL YAFESSSGSI SNLY MIKSV 7taa EVLDGDPAYT CPYQNVMDGV LNYPIYYPLL NAFKSTSGSM DDLYNMINTV 279 ********** * * ** *** * * * kawachi ASDCSDPTLL GNFIENHDNP RFASYTSDYS QAKNVLSYIF LSDGIPIVYA 350 aaa__new ASDCSDPTLL GNFIENHDNP RFASYTSDYS QAKNVLSYIF LSDGIPIVYA 7taa KSDCPDSTLL GTFVENHDNP RFASYTNDIA LAKNVAAFII LNDGIPIIYA 329 * ***** * * kawachi GEEQHYSGGD VPYNREATWL SGYDTSAELY TWIATTNAIR KLAISADSDY 400 aaa_new GEEQHYSGGK VPYNREATWL SGYDTSAELY TWIATTNAIR KLAISADSAY 7taa GQEQHYAGGN DPANREATWL SGYPTDSELY KLIASANAIR NYAISKDTGF 379 * ***** kawachi ITYKNDPIYT DSNTIAMRKG TSGSQIITVL SNKGSSGSSY TLTLSGSGYT 450 aaa_new ITYANDAFYT DSNTIAMRKG TSGSQVITVL SNKGSSGSSY TLTLSGSGYT 7taa VTYKNWPIYK DDTTIAMRKG TDGSQIVTIL SNKGASGDSY TLSLSGAGYT 429 kawachi SGTKLIEAYT CTSVTVDSNG DIPVPMASGL PRVLLPASW DSSSLCGGSG 500 aaa_new SGTKLIEAYT CTSVTVDSSG DIPVPMASGL PRVLLPASW DSSSLCGGSG 7taa AGQQLTEVIG CTTVTVGSDG VPVPMAGGL PRVLYPTEKL AGSKICS... 474 kawachi NTTTTTTAAT STS ATTSSS SSSAAATTSS . SCTATSTTLP ITFEELVTTT 550 axa_new RLYVE 505 7taa kawachi YGEEVYLSGS ISQLGEWHTS DAVKLSADDY TSSNPEWSVT VSLPVGTTFE 600 aaa new 7taa 601 640 kawachi YKFI VDEGG SVTWESDPNR EYTVPECGSG SGETWDTWR 640 aaa_ne 7taa Las alteraciones específicas para el incremento de la actividad específica son una sustitución o una combinación de sustituciones en las siguientes posiciones dentro de la "distancia de 10Á del sustrato": 13,15, 18,32-36 (es decir 32, 33, 34, 35, 36), 61, 63-64, 68-69, 73-84 (por ejemplo 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84), 117-125 (por ejemplo 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125), 152-158 (por ejemplo 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158), 161-162, 165-175 (por ejemplo 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175), 204-211 (por ejemplo 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211), 216, 229-239 (229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239), 242, 250, 252-253, 255-257 (por ejemplo 255, 256, 257), 259-260, 275, 292, 295-299 (por ejemplo 295, 296, 297, 298, 299), 304, 328, 339-344 de acuerdo a la numeración 7taa en la alineación por encima de donde el N-termimal es ATPAD en 7taa (amilasa TA A) . Las posiciones más interesantes son: 33, 36, 74, 75, 77, 120, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 162, 166, 169, 170, 199, 232, 233, 235, 238, 239, 256, 257, 331, 336, 339, 340, y 342. Las sustituciones pueden ser en cualquier aminoácido residual. Pueden ser producidas variantes que comprendan una o más de las siguientes sustituciones o combinaciones de las mismas: G33A,136K, S74A, D75Y, E77D, P120A, 1153D, D154N, W155Y, D156E, N157D, L158Q, Q162E, E166L, T169N, 1170T, E199K, E199L, D232L, N233D, N235D, L238Y, D239T, 256Y, Q257P, E331Q, S336A, D339 , D339N, V340D, y Y342A. Las variantes más interesantes comprenden una o más de las siguientes sustituciones; S74A, E166L, E199L, D339K, y D156E. Aún más interesante es la variante que tiene las sustituciones múltiples S74A/E166L/E199L. Sobre la base de la similitud entre las alfa-amilasas ácidas de Aspergillus kawachii y A.niger se predijo que las siguientes sustituciones mejoran la actividad específica; N31D, S74A, Y89D, E209L, Y245Vr D348K, D378A, K383A, P386A, 1387F, 1405V, N448S, y N480R, y puede ser producida una variante nombrada WA01 que comprende esas sustituciones . Ejemplo 7: Desempeño de una variante de la alfa-amilasa ácida de Aspergillus kawa.ch.li Las secuencias de los híbridos JA007 y JA001 descritas en el ejemplo 4 son idénticas respectivamente a la secuencia de alfa-amilasa ácida de A. kawachii (SEQ ID NO: 41) y la secuencia de la variante WA01 descrita en el ejemplo anterior. Puesto que los dos híbridos JA001 y JA007 han sido comparados en varias pruebas la mejora de la actividad específica conferida por las sustituciones a la variante WA01 pueden ser predichas exactamente. La actividad específica de la variante WA01 será de 1.7 a 1.8 veces mayor que la actividad específica de la amilasa natural de A. kawachii. La producción se basa en los datos mostrados en la Tabla 12. Tabla 12. Desempeño del híbrido JA007 (idéntico a la alfa-amilasa ácida de A. kawachii) y el híbrido JA001 (idéntico a WA01 , una variante de la alfa-amilasa ácida de A. kawachii que comprende las sustituciones N31 D, S74A, Y89D, E209L, Y245V, D348K, D378A, K383A, P386A.1387F, 1405V, N448S, y N480R) AFAU/ml mg/ml AFAU/mg A280 AFAU/A280 JA001 1.41 0.67 2.11 1.22 1.15 JA007 0.56 0.46 1.22 0.89 0.63 Ejemplo 8: Hidrólisis de almidón crudo con una alfa-amilasa micótica acida con o sin CBD Este ejemplo ilustra la conversión de almidón de trigo granular o con gránulos de maíz en glucosa usando amilasa micótica acida sin un CBM (SEQ ID NO: 8) o el híbrido correspondiente con un CBM (JA001) . Se preparó una suspensión con almidón granular con 33% de sólidos secos (DS) agregando 247.5 g de almidón de trigo a granulos de maíz bajo agitación a 502.5 m de agua. El pH fue ajustado con HC1 a 4.5. La suspensión de almidón granular fue distribuida a matraces de tapa azul con 100 mi con 75 g en cada matraz. Los matraces fueron incubados con agitación magnética en un baño de agua a 60°C. A las cero horas las enzimas activas fueron dosificadas a los matraces; glucoamilasa (200 AGU/kg DS) , una amilasa micótica ácida (50 AFAU/kg DS) y la alfa-amilasa de Aspergillus niger natural (SEQ ID NO: 8) o la alfa-amilasa ácida de Aspergillus niger pero se fusionó a un enlazador CBM derivado de A. kawachii (SEQ ID NO: 8 fusionada a la SEQ ID NO: 6) . La alfa-amilasa ácida de Aspergillus niger con/sin CBM fue dosificada a 100 KNU/kg DS. Se tomaron muestras después de 24, 48, 72 y 96 horas. Los sólidos secos del almidón totales fueron determinados usando el siguiente método. El almidón fue hidrolizado completamente agregando una cantidad en exceso de alfa-amilasa (300 NU/Kg de sólidos secos) y colocando la muestra en un baño de aceite a 95°C durante 45 minutos. Posteriormente las muestras fueron empleadas a 60 °C y se agregó una cantidad en exceso de glucoamilasa (600 AGU/kg DS) seguida por incubación durante 2 horas a 60 °C. Los sólidos secos solubles en el hidrolizado de almidón fueron determinados por la medición del índice de refracción en muestras después de filtrar a través de un filtro de 0.22 microM. Los perfiles de azúcar fueron determinados por CLAP. La cantidad de glucosa fue calculada como DX . Los resultados se muestran en las tablas 13-14 (almidón de trigo) y 15-16 (gránulos de maíz) . Tabla 13. Sólidos secos solubles como porcentaje de la sustancia seca total del almidón de trigo. Enzimas: glucoamilasa, alfa-amilasa micótica ácida y más alfa-amilasa micótica ácida con el CBM o sin el CBM. 24 horas 46 horas 70 horas 90 horas Sin CBM 81,1 88,6 89,4 90,7 Con CBM 86,2 92,6 93,7 95,1 Tabla 14. La DX del hidrolisado soluble de almidón de trigo: Enzimas: glucoamilasa, alfa-amilasa micótica ácida y más alfa-amilasa micótica ácida con el CBM o sin el CBM. 24 horas 46 horas 70 horas 90 horas Sin CBM 78,1 84,9 85,6 86,7 Con CBM 82,3 88,4 89,5 90,5 Tabla 15. Sólidos secos solubles como porcentaje de sustancia seca total de gránulos de maíz: Enzimas: ucoamilasa, alfa-amilasa micótica ácida y más alfa-amilasa micótica ácida con el CBM o sin el CBM. 24 horas 46 horas 70 horas 90 horas Sin CBM 44,0 49,6 56,8 62,2 Con CBM 53,6 59,7 63,8 68,4 Tabla 16. La DX de hidrolisado soluble de gránulos de maiz: Enzimas: glucoamilasa, alfa-amilasa micótica ácida y más alfa-amilasa micótica ácida con el CBM o sin el CBM. 24 horas 46 horas 70 horas 90 horas Sin CBM 42,1 47,3 53,9 58,8 Con CBM 51 ,2 56,8 60,4 64,5 Se hace constar que con relación a esta fecha, mejor método conocido para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una enzima híbrida, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión de carbohidrato, a) donde el módulo catalítico es una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos 70% de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 o una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos 70% de homología para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30; b) donde el módulo de unión de carbohidratos es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50% de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. 2. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la enzima híbrida comprende además una secuencia enlazadora de aminoácidos que conecta la secuencia de aminoácidos del módulo catalítico y la secuencia de aminoácidos del módulo de unión de carbohidrato . 3. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la secuencia del enlazador es una secuencia del enlazador seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de enlazador de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, y SEQ ID NO: 29 o una secuencia del enlazador que difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, o SEQ ID NO: 29 en no más de 10 posiciones, no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o no más de 1 posición. 4. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el módulo catalítico es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. 5. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el módulo catalítico es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. 6. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el módulo catalítico es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. 7. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el módulo catalítico es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. 8. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el módulo catalítico es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30. 9. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el módulo catalítico es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30. 10. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el módulo catalítico es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30. 11. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el módulo catalítico es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30. 12. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el módulo de unión de carbohidratos es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de homología con cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25 13. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el módulo de unión de carbohidratos es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de homología con cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 O SEQ ID NO: 25. 14. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el módulo de unión de carbohidratos es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de homología con cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 , SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. 15. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porgue el módulo de unión de carbohidratos es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología con cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ. ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. 16. Una enzima híbrida, caracterizada porque comprende el dominio catalítico de alfa amilasa de A. oryzae mostrada como aminoácidos 21-498 de la secuencia SEQ ID NO: 40 y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de homología con la secuencia de aminoácidos mostrada como los aminoácidos 21-498 de la secuencia SEQ ID NO: 40. 17. Una alfa-amilasa variante que tiene al menos 80% de homología con la SEQ ID NO: 41, variante caracterizada porque comprende una alteración en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste de: 13, 15, 18, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 61, 63, 64, 68, 69, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 89, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 161, 162, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 216, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 242, 245, 250, 252, 253, 255, 256, 257, 259, 260, 275, 292, 295, 296, 297, 298, 299, 304, 328, 339, 344, 348, 378, 383, 386, 387, 405, 448 y 480 donde; a) las alteraciones son independientemente, i) una inserción de un aminoácido corriente abajo del aminoácido que ocupa la posición, ii) una supresión del aminoácido que ocupa la posición, o iii) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición con un aminoácido diferente, b) la variante tiene actividad de alfa-amilasa. 18. La variante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque comprende una o más de las siguientes sustituciones: G33A, 136K, S74A, D75Y, E77D, P120A, 1153D, D154N, W155Y, D156E, N157D, L158Q, Q162E, E166L, T169N, 1170T, E199K, E199L, D232L, N233D, M235D, L238Y, D239T, W256Y, Q257P, E331Q, S336A, D339K, D339N, V340D, y Y342A. 19. La variante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque comprende una alteración en una o más de las siguientes posiciones: 31, 74, 89, 209, 245, 348, 378, 383, 386, 387, 405, 448 y 480. 20. La variante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque comprende una o más de las siguientes sustituciones: N31D, S74A, Y89D, E209L, Y245V, D348K, D378A, K383A, P386A, 1387F, 1405V, N448S, N480 . 21. La variante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque comprende las siguientes sustituciones: N31D, S74A, Y89D, E209L, Y245V, D348K, D378A, 383A, P386A, 1387F, 1405V, N448S, N480R. 22. Una secuencia de ADN aislada, caracterizada porque codifica para la enzima híbrida o la variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes . 23. Un plásmido recombinante o constructo de ADN caracterizado porque comprende la secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 22. 24. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende la secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 22. 25. Una célula hospedera transformada con un vector de conformidad con la reivindicación 24, célula hospedera caracterizada porque es capaz de expresar la secuencia de ADN aislada de conformidad con la reivindicación 18. 26. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 25, célula hospedera caracterizada porque es un hongo, una bacteria, una planta o un mamífero. 27. Un método para licuar almidón, caracterizado porque un sustrato de almidón gelatinizado o granular es tratado en medio acuoso con enzima híbrida o la variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque comprende poner en contacto el almidón tratado con una levadura para producir etanol combustible o potable. 29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-28, caracterizado porque comprende fermentar el almidón tratado en un producto de fermentación, como el ácido cítrico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato de sodio, gluconato de calcio, gluconato de potasio, gluconol delta lactona, eritorbato de sodio, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico; acetonas; aminoácidos, ácido glutámico (monoglutaminato de sodio) , penicilina, tetraciclina; enzimas; vitaminas; como la riboflavina, B12, beta-caroteno u hormonas. 30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-28, caracterizado porque la suspensión de almidón es puesta en contacto con un polipéptido que comprende un módulo de unión de carbohidrato pero no un módulo catalítico. 31. Un proceso para preparar un producto basado en masa, caracterizado porque comprende agregar la enzima híbrida o la variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21 a una masa. 32. Una enzima híbrida, caracterizada porque comprende el dominio catalítico de la alfa-amilasa de A. oryzae mostrada como aminoácidos 21-498 de la secuencia SEQ ID NO: 40 o una secuencia que tiene al menos 50% de homología con la secuencia de aminoácidos mostrada como aminoácidos 21-498 de la secuencia SEQ ID NO: 40, y un dominio de unión de carbohidrato . 33. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque comprende una sustitución en una o más posiciones seleccionadas de la lista que comprende de: 81, 158, 161, 163, 164, 175, 176, 177, 264, 266, 466, 468, y 470. 34. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque comprende una o más sustituciones seleccionadas de la lista que consiste de Q81R, K158D, K158V, S161D, S161N, Q163S, Q163A, D164S, Y175W, E176D, D177N, N264K, N264E, M266L, G466D, D468S, y N470D. 35. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque comprende una o más sustituciones seleccionadas de la lista que consiste de: K158V S161N Q163A D164S N264K M266L G466D D468S N470D. 36. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque comprende una o más sustituciones seleccionadas de la lista que consiste de: Q81R K158V S161N Q163A D164S Y175 E176D D177N N264K M266L G466D D468S N470D.