JP4246384B2 - プロテアーゼ変異体及び組成物 - Google Patents

Description

【０００１】
技術分野
本発明は洗剤組成物の調合において有用であり、且つ洗剤において向上した洗浄性能を発揮する１又は複数の活性部位ループにおいて挿入を含んで成る新規の突然変異プロテアーゼ酵素又は酵素変異体；当該酵素を含む洗浄及び洗剤組成物；適当な宿主又は生物に挿入されたときに当該酵素の発現をコードする突然変異遺伝子；並びにその遺伝子により形質転換され、且つ当該酵素変異体を発現することのできる宿主細胞、に関連する。
【０００２】
発明の背景
洗剤産業において、酵素はこの３０年以上も洗浄製剤において利用されていた。かかる製剤に利用されている酵素にはプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、並びにその他の酵素又はそれらの混合物が含まれる。商業的に最も重要な酵素はプロテアーゼである。
【０００３】
数多くの商業的に利用されているプロテアーゼは天然の野生型プロテアーゼの工学的変異体である：例えば、ＤＵＲＡＺＹＭ（Novo Nordisk A/S），ＲＥＬＡＳＥ（Novo Nordisk A/S），ＭＡＸＡＰＥＭ（Gist-Brocades N.V.），ＰＵＲＡＦＥＣＴ（Genencor International, Inc.）。
【０００４】
また、数多くのプロテアーゼ変異体が当業界において発表されている。例えばＥＰ １３０７５６（GENENTECH ）（米国再発行特許No. ３４，６０６（GENENCOR））；ＥＰ ２１４４３５（HENKEL）；ＷＯ ８７／０４４６１（AMGEN ）；ＷＯ ８７／０５０５０（GENEX ）；ＥＰ ２６０１０５（GENENCOR）；Thomas, Russell, and Fersht (1985) Nature 318 375-376; Thomas, Russell, and Fersht (1987) J.Mol.Biol. 193 803-813; Russel and Fersht Nature 328 496-500 (1987)；ＷＯ ８８／０８０２８（Genex ）；ＷＯ ８８／０８０３３（Amgen ）；ＷＯ ９５／２７０４９（SOLVAY S.A. ）；ＷＯ ９５／３００１１（PROCTER & GAMBLE COMPANY）；ＷＯ ９５／３００１０（PROCTER & GAMBLE COMPANY）；ＷＯ ９５／２９９７９（PROCTER & GAMBLE COMPANY）；ＵＳ ５，５４３，３０２（SOLVAY S.A. ）；ＥＰ ２５１ ４４６（GENENCOR）；ＷＯ ８９／０６２７９（NOVO NORDISK A/S）；ＷＯ ９１／００３４５（NOVO NORDISK A/S）；ＥＰ ５２５ ６１０ Ａ１（SOLVAY）；及びＷＯ ９４／０２６１８（GIST-BROCADES N.V.）。
【０００５】
しかしながら、たとえ数多くの有用なプロテアーゼ変異体が発表されていようと、数多くの産業的利用のために新規の改良プロテアーゼ又はプロテアーゼ変異体についてのニーズがまだある。
【０００６】
従って、本発明の目的は、特に洗剤産業において利用するための改良プロテアーゼ又はプロテイン・エンジニアリングされたプロテアーゼ変異体の提供にある。
【０００７】
発明の概要
本発明者は親野生型ＢＬＳＡＶＩと比較して洗剤中で向上した洗浄性能を発揮するＢＬＳＡＶＩ（Ｓａｌｖｉｎａｓｅ（登録商標））の変異体を、当該ＢＬＳＡＶＩ内の少なくとも一の活性部位ループに少なくとも一の挿入を導入することにより構築することが可能であることを認定した。
【０００８】
その他のスブチラーゼにおいてＢＬＳＡＶＩと似た類似の変異体を作ることが可能であると推定される。
【０００９】
更に、ＢＬＳＡＶＩと比較して洗剤中で向上した洗浄性能を発揮する天然親又は野生型スブチラーゼを、ＢＬＳＡＶＩ内の対応の活性部位ループよりも長い少なくとも一の活性部位ループを含んで成るかかる親野生型スブチラーゼを特異的にスクリーニングすることにより自然から単離及び同定することが可能であると予測できた。
【００１０】
従って、第一の観点において、本発明は単離されたスブチラーゼ酵素であって、ＢＬＳＡＶＩと比べて洗剤中で向上した性能を発揮し、成熟ＢＬＳＡＶＩのアミノ酸配列と少なくとも４０％同一性であるアミノ酸配列を有し、そして当該単離されたスブチラーゼ内の少なくとも一の活性部位ループがＢＬＳＡＶＩ内の対応の活性部位ループよりも長いことを特徴とし、ここで当該単離されたスブチラーゼ内のかかる活性部位ループ領域は下記の事項を含んで成る群から特定される最小アミノ酸長さを有する、単離されたスブチラーゼ酵素：
（ａ）アミノ酸残基３３乃至４３間の領域（両端のアミノ酸を含む）が少なくとも１１個のアミノ酸の長さである（即ち、ＢＬＳＡＶＩと比較し、少なくとも１個のアミノ酸の挿入がある）；
（ｂ）アミノ酸残基９５乃至１０３間の領域（両端のアミノ酸を含む）が少なくとも９個のアミノ酸の長さである（即ち、ＢＬＳＡＶＩと比較して、少なくとも１個のアミノ酸挿入がある）；
（ｃ）アミノ酸残基１２５乃至１３２間の領域（両端のアミノ酸を含む）が少なくとも８個のアミノ酸の長さである（即ち、ＢＬＳＡＶＩと比較して、少なくとも１個のアミノ酸挿入がある）；
（ｄ）アミノ酸残基１５３乃至１７３間の領域（両端のアミノ酸を含む）が少なくとも２１個のアミノ酸の長さである（即ち、ＢＬＳＡＶＩと比較して、少なくとも１個のアミノ酸挿入がある）；
（ｅ）アミノ酸残基１８１乃至１９５の領域（両端のアミノ酸を含む）が少なくとも１５個のアミノ酸の長さである（即ち、ＢＬＳＡＶＩと比較して、少なくとも１個のアミノ酸挿入がある）；
（ｆ）アミノ酸残基２０２乃至２０４の領域（両端のアミノ酸を含む）が少なくとも３個のアミノ酸の長さである（即ち、ＢＬＳＡＶＩと比較して、少なくとも１個のアミノ酸挿入がある）；
（ｇ）アミノ酸残基２１８乃至２１９の領域（両端のアミノ酸を含む）が少なくとも３個のアミノ酸の長さである（即ち、ＢＬＳＡＶＩと比較して、少なくとも１個のアミノ酸挿入がある）。
【００１１】
第二の観点において、本発明は本発明のスブチラーゼ変異体をコードする単離されたＤＮＡ配列に関する。
【００１２】
第三の観点において、本発明は本発明のスブチラーゼ変異体をコードする単離されたＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターに関する。
【００１３】
第四の観点において、本発明は第三の観点に係る発現ベクターで形質転換された微生物宿主細胞に関する。
【００１４】
更なる観点において、本発明は第四の観点に係る発現ベクターを適当な微生物宿主に挿入し、その宿主を所望のスブチラーゼ酵素を発現させるように培養し、そしてその酵素生成物を回収することによる、本発明のスブチリシン酵素の製造に関する。
【００１５】
更に、本発明は本発明のスブチラーゼ変異体を含んで成る組成物に関する。
【００１６】
更には、本発明は数多くの産業関連用途、特に洗浄組成物及び突然変異酵素を含んで成る洗浄組成物、特に突然変異スブチリシン酵素を含んで成る洗浄組成物における当該突然変異酵素の利用に関する。
【００１７】
定義
本発明を更に詳細に説明する前に、下記の用語をまず定義づけする。
【００１８】
アミノ酸の命名
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン
Ｘ＝Ｘａａ＝任意のアミノ酸
【００１９】
核酸の命名
Ａ＝アデニン
Ｇ＝グアニン
Ｃ＝シトシン
Ｔ＝チミン（ＤＮＡのみ）
Ｕ＝ウラシル（ＲＮＡのみ）
【００２０】
変異体の命名
本発明に従って製造又は考慮される様々な酵素の説明において、下記の命名法を便宜上利用する：
もとのアミノ酸・位置・置換アミノ酸
【００２１】
もとのアミノ酸が任意のアミノ酸残基であってよい場合、位置及び置換化アミノ酸だけを示すのに用いる省略表示を時折り利用することがある：
位置・置換アミノ酸
【００２２】
かかる表示は相同スブチラーゼ（後掲）における関連の修飾に特に利用する。
【００２３】
同様に、置換アミノ酸残基の種類が本質的でないとき：
もとのアミノ酸・位置
【００２４】
もとのアミノ酸及び置換アミノ酸の双方が任意のアミノ酸であってよい場合、位置のみを表示する。例えば、１７０。
【００２５】
もとのアミノ酸及び／又は置換アミノ酸が、全てのアミノ酸ではないが、複数のアミノ酸を含んで成ってよい場合、選定のアミノ酸をかっこ｛ ｝内に示す：
もとのアミノ酸・位置・｛置換アミノ酸₁ 、…、置換アミノ酸_n ｝
【００２６】
特定の変異体に関し、任意のアミノ酸残基を表示するコードＸａａ及びＸを含む特定の３文字又は１文字コードを使用する。
【００２７】
置換
１９５位でのグリシンのグルタミン酸による置換は下記の通りに表示する：
Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ 又は Ｇ１９５Ｅ
又は１９５位でのグリシンの任意のアミノ酸残基による置換は下記の通りに表示する：
Ｇｌｕ１９５Ｘａａ もしくは Ｇ１９５Ｘ
又は Ｇｌｕ１９５ もしくは Ｇ１９５
【００２８】
１７０位での任意のアミノ酸残基のセリンによる置換は下記のように表示する：
Ｘａａ１７０Ｓｅ もしくは Ｘ１７０Ｓ
又は １７０Ｓｅｒ もしくは １７０Ｓ
【００２９】
かかる表示は相同性スブラーゼ（後掲）における関連の修飾に特に利用する。かくして、１７０Ｓｅｒは例えばＢＡＳＢＰＮにおけるＬｙｓ１７０Ｓｅｒ修飾体及びＢＬＳＡＶＩにおけるＡｒｇ１７０Ｓｅｒ修飾体の双方を含むことを意味する。これらの例に関しては図１を参照のこと。
【００３０】
もとのアミノ酸及び／又は置換アミノ酸が全てではないにしても複数のアミノ酸であり得る場合の修飾に関し、１７０位でのアルギニンのグリシン、アラニン、セリン又はスレオニンによる置換は下記の通りに表示され：
Ａｒｇ１７０｛Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ｝又はＲ１７０｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ｝
Ｒ１７０Ｇ，Ｒ１７０Ａ，Ｒ１７０Ｓ及びＲ１７０Ｔの変異体を意味する。
【００３１】
欠失：
１９５位でのグリシンの欠失は下記の通りに示されるであろう：
Ｇｌｙ１９５^* 又は Ｇ１９５^*
対応して、複数のアミノ酸残基の欠失、例えば１９５及び１９６位でのグリシン及びロイシンの欠失は下記の通りに表示される：
Ｇｌｙ１９５^* ＋Ｌｅｕ１９６^* 又は Ｇ１９５^* ＋Ｌ１９５^*
【００３２】
挿入：
追加のアミノ酸残基の挿入、例えばＧ１９５の後のリジンの挿入は、
Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ 又は Ｇ１９５ＧＫであり、又は複数のアミノ酸残基を挿入するとき、例えばＧ１９５の後にＬｙｓ，Ａｌａ及びＳｅｒを挿入すると、
Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａＳｅｒ 又は Ｇ１９５ＧＫＡＳ
となる。
【００３３】
このような場合、挿入されるアミノ酸残基は、挿入アミノ酸残基に先行するアミノ酸残基の位置番号に小文字を付与することにより番号付けする。上記の例では、配列１９４乃至１９６は以下の通りとなる：

【００３４】
現存のアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基を挿入する場合、命名におけるある種の縮重が生ずるのが明らかである。例えば上記の例においてグリシンをグリシンの後に挿入する場合、これはＧ１９５ＧＧと表示される。事実上同じ変更を、

に至る変更に関し、Ａ１９４ＡＧと表示できる。
【００３５】
これらは当業者に明らかであり、そして表示Ｇ１９５ＧＧ及びこのタイプの挿入についての対応の表示はかかる均等な縮重表示を含むことを意味する。
【００３６】
すき間の埋め
番号付けのために用いたスブチリシン酵素と比較して酵素の中に欠失がある場合、かかる位置での挿入は下記の通りに表示する：
^*３６Ａｓｐ 又は ^*３６Ｄ
３６位でのアスパラギン酸の挿入。
【００３７】
多重修飾
多重修飾を含んで成る変異体は＋で分ける。例えば
Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ 又は Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ
１７０及び１９５位でのアルギニン及びグリシンそれぞれのチロシン及びグルタミン酸による置換の修飾を表わす。
又は、例えばＴｙｒ１６７｛Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ｝＋Ａｒｇ１７０｛Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ｝は下記の変異体を表わす：
Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ，Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｓｅｒ，Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｔｈｒ，Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ，Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｓｅｒ，Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｔｈｒ，Ｔｙｒ１６７Ｓｅｒ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ｔｙｒ１６７Ｓｅｒ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ，Ｔｙｒ１６７Ｓｅｒ＋Ａｒｇ１７０Ｓｅｒ，Ｔｙｒ１６７Ｓｅｒ＋Ａｒｇ１７０Ｔｈｒ，Ｔｙｒ１６７Ｔｈｒ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ｔｙｒ１６７Ｔｈｒ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ，Ｔｙｒ１６７Ｔｈｒ＋Ａｒｇ１７０Ｓｅｒ、及びＴｙｒ１６７Ｔｈｒ＋Ａｒｇ１７０Ｔｈｒ。
【００３８】
この命名法は特定の共通の性質を有するアミノ酸残基、例えば正電荷（Ｋ，Ｒ，Ｈ）又は負電荷（Ｄ，Ｅ）の置換、交換、挿入もしくは欠失を狙いとする修飾、又は小アミノ酸の別の小アミノ酸による置換を示す例えば、
Ｔｒｙ１６７｛Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ｝＋Ａｒｇ１７０｛Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ｝
の保存性アミノ酸修飾に特に関連する。更なる詳細については「発明の詳細な説明」を参照のこと。
【００３９】
プロテアーゼ
タンパク質基質内のアミド結合を切断する酵素はプロテアーゼ又は（同義として）ペプチダーゼに分類される（Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H.Freeman and Company, San Francisco, Chapter 3 参照）。
【００４０】
アミノ酸の位置／残基の番号付け
何らかのことわりのない限り、本明細書において利用するアミノ酸の番号付けはスブチラーゼＢＰＮ′（ＢＡＳＢＰＮ）配列のそれに対応するＢＰＮ′配列の更なる説明はSiezenら、Protein Engng. 4 (1991) 719-737 及び図１参照のこと。
【００４１】
セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼはペプチド結合の加水分解を触媒する酵素であり、その中には活性部位において必須セリン残基がある（White, Handler and Smith, 1973「Principles of Biochemistry, 」Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, pp.271-272 ）。
【００４２】
細菌性セリンプロテアーゼは２０，０００〜４５，０００ダルトンの範囲の分子量を有する。これらはジイソプロピルフルオロホスフェートにより阻害される。これらは単純な末端エステルを加水分解し、そしてこれもセリンプロテアーゼである真核細胞キモトリプシンと似た活性を示す。より狭い観点で、サブグループを包括するアルカリ性プロテアーゼは一部のセリンプロテアーゼのpH９．０〜１１．０という高い至適pHを反映する。詳しくは、Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 711-753 参照。
【００４３】
スブチラーゼ
仮りにスブチラーゼと命名されているセリンプロテアーゼのサブグループがSiezenら、Protein Engng. 4 (1991) 719-737 により提唱されている。これらは相同分析によりスブチリシン様プロテアーゼと過去に呼ばれてきたセリンプロテアーゼの４０個以上のアミノ酸配列と特定された。スブチリシンは過去にグラム陽性菌又は菌類により産生されるセリンプロテアーゼとして特定され、そしてSiezenらにより、今はスブチラーゼのサブグループである。多種多様なスブチラーゼが同定されており、そしていくつかのスブチラーゼのアミノ酸配列が決定されている。かかるスブチラーゼ及びそのアミノ酸配列のより詳細な説明については、Siezenら及び本明細書の図１を参照されたい。
【００４４】
スブチラーゼの一のサブグループＩ−Ｓ１は「伝統的」なスブチリシン、例えばスブチリシン１６８、スブチリシンＢＰＮ′、スブチリシン・カールスバーグ（ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）NOVO NORDISK A/S）及びスブチリシンＤＹを含んで成る。
【００４５】
スブチラーゼＩ−Ｓ２の更なるサブグループがSiezenら（前掲）により認定されている。サブグループＩ−Ｓ２プロテアーゼは高アルカリ性スブチリシンと発表されており、そして酵素、例えばスブチリシンＰＢ９２（ＭＡＸＡＣＡＬ（登録商標）、Gist-Brocades NV）、スブチリシン３０９（ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、NOVO NORDISK A/S）、スブチリシン１４７（ＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、NOVO NORDISK A/S）及びアルカリエラスターゼＹａＢが含まれる。
【００４６】
「ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）」
ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）はNOVO NORDISK A/Sより販売されている。これはＢ．レンタス由来のスブチリシン３０９であり、そしてＢＡＢＰ９２とは一つの位置だけで相違する（Ｎ８７Ｓ、本明細書の図１）。ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）は、ＢＬＳＡＶＩと表示したアミノ酸配列を有する（本明細書の図１）。
【００４７】
親スブチラーゼ
「親スブチラーゼ」はSiezenら（Protein Engineering 4: 719-737 (1991) ）に従って規定されたスブチラーゼである。詳細については上記の「スブチラーゼ」の説明を参照のこと。親スブチラーゼは天然物から単離したスブチラーゼであってもよく、その後の修飾をスブチラーゼの特徴を保持しながら施す。
【００４８】
他方、「親スブチラーゼ」は「野生型スブチラーゼ」と呼ぶことがある。
【００４９】
スブチラーゼ変異体の修飾
本明細書で論じるスブチラーゼ変異体の修飾に関して用いる語「修飾」は化学修飾及び遺伝子操作を含むものと定義する。修飾は注目のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入でありうる。
【００５０】
スブチラーゼ変異体
本発明との関連で、スブチラーゼ変異体又は突然変異スブチラーゼとは、もとの又は親遺伝子を保有し、且つ対応の親酵素を産生する親微生物に由来する突然変異遺伝子を発現する生物により産生されるスブチラーゼを意味し、ここでこの親遺伝子は適当な宿主の中で発現されたときに突然変異遺伝子が産生され、それから突然変異スブチラーゼプロテアーゼが産生されるように突然変異されたものである。
【００５１】
相同スブチラーゼ配列
スブチラーゼＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）の特異的な活性部位ループ領域及びかかるループ内のアミノ酸挿入は、本発明のスブチラーゼ変異体を獲得するための本発明における修飾のために特定される。
【００５２】
しかしながら、本発明はこの特定のスブチラーゼの修飾体に限定されるのではなく、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）のそれと相同な一次構造を有するその他の親（野生型）スブチラーゼに及ぶ。
【００５３】
本発明の範囲に属するその他の相同スブチラーゼを同定するため、前記スブチラーゼと事前にアライニングされたスブチラーゼのグループとのアラインメントを、従来のアラインメント定数を保ちながら、実施する。スブチラーゼにおける１８個の高度に保存された残基に対する対比を実施する。１８個の高度に保存された残基を表Ｉに示す（この保存残基についての更なる説明についてはSiezenらを参照のこと）。

【００５４】
アラインメントを維持するための必須の挿入及び欠失を可能にするアライニングを行うと、適当な相同活性部位ループが同定される。かくして当該相同残基は本発明に従って修飾されうる。
【００５５】
デフォルトアラインメントパラメーターを利用してＣＬＵＳＴＡＬＷ（バージョン１．７、１９９７年６月）コンピューターアラインメントプログラム（Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 ）を用い、過去にアライニングしたスブチラーゼのグループに対する所定のスブチラーゼのアラインメントをこのプログラム中のプロファイル・アラインメント・オプションを利用して成し遂げる。本発明の範囲に属する所定のスブチラーゼに関し、好ましくは１８個の保存残基の１００％が保存されているべきである。しかしながら、１８残基のうちの１７残基以上のアラインメント、又はかかる保存残基のうちの１６ほどの少ないアラインメントも相同残基の同定に適当である。スブチラーゼにおける触媒性トリアドＡｓｐ３２／Ｈｉｓ６４／Ｓｅｒ２２１の保存は保たれるべきである。
【００５６】
規定の１０種のスブチラーゼのアラインメントを図１に示す。
【００５７】
更に、かかる方法において、本発明の範囲に属する相同性の親（野生型）スブチラーゼを同定するため、上記の１８個の保存残基を前記相同な親スブチラーゼの親（野生型）一次配列と相関させる。換言するなら、もし親スブチラーゼを上記のかかる１８個の保存残基のいずれかにおいて修飾するなら、もとの親スブチラーゼ及び上記のかかる１８個の保存残基のいずれかにおいて修飾された当該親スブチラーゼの考えられる変異体の双方が本発明の範囲に属する相同性スブチラーゼであるか否かを決定するのは前記１８個の保存残基内のもとの親野生型配列である。
【００５８】
この説明に基づき、当業者にとって本発明に従って修飾できうる適当な相同性スブチラーゼ及び対応の相同性活性部位ループ領域を同定することはルーチン作業となる。
【００５９】
洗浄性能
例えば洗濯の際に洗浄すべき物体上に存在する様々な天然物質の分解を触媒する酵素の能力は往々にしてその洗浄能力、浄化力、又は洗浄性能と称される。本願を通じて、洗浄性能なる語はこの性質を包含するように用いる。
【００６０】
単離されたＤＮＡ配列
「単離された」なる語は、ＤＮＡ配列分子に適用した場合、そのＤＮＡ配列が天然の遺伝子質から取り出され、それ故その他の外性又は不要なコード配列を含まず、そして遺伝子操作されたタンパク質生産系において利用するのに適当な形態にあることを意味する。かかる単離された分子はその天然の環境から分けられたものであり、そしてｃＤＮＡ及びゲノムクローンが含まれる。本発明の単離されたＤＮＡ分子はそれらが通常一体化している他の遺伝子を含まず、しかしながら天然の５′及び３′非翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターは含みうる。一体化した領域の同定は当業者に自明であろう（例えば、Dynan and Tijan, Nature 316 : 774-78, 1985を参照のこと）。「単離されたＤＮＡ配列」は「クローニングされたＤＮＡ配列」とも言う。
【００６１】
単離されたタンパク質
タンパク質に適用した場合、「単離された」なる語はそのタンパク質がその天然環境以外の条件にあることを意味する。好適な形態において、単離されたタンパク質とは実質的にその他のタンパク質を含まない、特にその他の同種タンパク質（即ち、「同種不純物」（以下参照）を含まない。単離されたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる決定に従い、純度１０％超、好ましくは純度２０％超、より好ましくは純度３０％超である。更に、タンパク質を高度精製形態、即ち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる決定に従い、純度４０％超、純度６０％超、純度８０％超、より好ましくは純度９５％超、そして更により好ましくは純度９９％超で供与するのが好ましい。
【００６２】
「単離されたタンパク質」は「純粋なタンパク質」とも言う。
【００６３】
同種不純物
「同種不純物」とは本発明のポリペプチドが本来由来する同種の細胞を起源とする任意の不純物（例えば、本発明のポリペプチド以外の別のポリペプチド）を意味する。
【００６４】
…から得られた
本明細書での特定の微生物起源との関連で用いる「…から得られた」とは、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドが特定の起源により生産されたか、又はその起源に由来する遺伝子の挿入された細胞により生産されたことを意味する。
【００６５】
基質
プロテアーゼのための基質との関連で本明細書において用いる「基質」とは、その最も広い意味で、プロテアーゼによる加水分解に感受性な少なくとも一本のペプチド結合を含む化合物を含んで成るものとして解釈されるべきである。
【００６６】
生成物
プロテアーゼ酵素反応に由来する生成物との関連で用いる「生成物」とは、本発明との関連で、スブチラーゼプロテアーゼの関与する加水分解反応の生成物を含むものと解釈されるべきである。生成物はその後の加水分解反応における基質であることもある。
【００６７】
発明の詳細な説明
向上した洗浄性能を有するスブチラーゼ酵素
本発明のスブチラーゼは一般に先の「本発明の概要」の欄で説明した。
【００６８】
本発明の第一の観点のスブチラーゼは天然において認められる親野生型スブチラーゼであってよい。
【００６９】
かかる親野生型スブチラーゼは当業界に公知の標準の技術により特異的にスクリーニングできる。
【００７０】
これを実施するための一の好適な方法は、多種多様な微生物、好ましくは種々のバチルス株からスブチラーゼにおける活性部位ループをコードすることで知られるＤＮＡ領域を特異的にＰＣＲ増幅させることによる。
【００７１】
スブチラーゼは、そのＤＮＡ及びアミノ酸配列が相同性であるとの観点で、保存酵素のグループである。従って、活性部位ループに隣接する比較的特異的なプライマーを構築することが可能である。
【００７２】
例えば、種々のスブチラーゼのアラインメントを検討することにより（例えば、Siezenら、Protein Science 6: 501-523 (1997) ）、当業者にとってＢＬＳＡＶＩ内のアミノ酸残基９５乃至１０３間の活性部位ループに対応する活性部位ループ等に隣接するＰＣＲプライマーを構築することはルーチン作業となる。多種多様な微生物、好ましくは種々のバチルス株からＤＮＡを増幅するのにかかるＰＣＲプライマーを用い、しかる後、当該増幅ＰＣＲフラグメントをＤＮＡ配列決定することにより、ＢＬＳＡＶＩにおける９５−１０３の活性部位領域に相当する、ＢＬＳＡＶＩと比べて長い活性部位領域を含んで成るスブチラーゼを産生する株を同定することが可能となる。かかる株及びかかる注目のスブチラーゼの部分ＤＮＡ配列が同定できたら、当業者にとって注目のかかるスブチラーゼのクローニング、発現及び精製を完了することはルーチン作業となる。
【００７３】
しかしながら、本発明のスブチラーゼ酵素は主として親スブチラーゼの変異体であると考えられる。
【００７４】
従って、本発明の態様は本発明の第一の観点に係る単離されたスブチラーゼ酵素に関連し、ここで当該スブチラーゼ酵素は構築された変異体であり、ここで当該変異体は本発明の第一の観点に係る少なくとも一の活性部位ループ内に少なくとも１個のアミノ酸の少なくとも一の挿入を含んで成る。
【００７５】
本発明のスブチラーゼ酵素は洗剤中で、ＢＬＳＡＶＩ（Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標））と比べ、向上した洗浄性能を発揮する。種々の市販のスブチラーゼプロテアーゼ製品は種々の洗浄組成物において様々な洗浄性能を発揮するであろう。本発明のスブチラーゼは大半の多種多様な洗浄組成物において、ＢＬＳＡＶＩと比べ、向上した洗浄性能を発揮する。
【００７６】
好ましくは、本発明のスブチラーゼ酵素は、本明細書の実施例３（後掲）に示す洗浄組成物において、ＢＬＳＡＶＩと比べ、向上した洗浄性能を発揮する。
【００７７】
所定のスブチラーゼアミノ酸配列（当該スブチラーゼ配列が自然から単離された野生型スブチラーゼ配列であろうとスブチラーゼ変異配列であろうと関係なく）が本発明のスブチラーゼ配列の範囲に属するか否かを同定するため、下記の工程を実施してよい：
ｉ）前記スブチラーゼ配列がスブチラーゼＢＬＳＡＶＩの１位乃至２７５位（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）のアミノ酸配列と少なくとも４０％，５０％，５５％，６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８５％，９０％又は更には９５％同一であるかを同定する；
ii）もし工程ｉ）が満たされているなら、前記スブチラーゼ配列の図１に特定した過去に規定されたスブチラーゼのアラインメントとのアラインメントを実施する（このアラインメントをどのようにして好適に実施すべきかを知るため、本明細書の「定義」を参照のこと）；
iii ）工程ii）で実施したアラインメントに基づき、ＢＬＳＡＶＩ内の活性部位ループ領域に対応する前記スブチラーゼ配列内の活性部位ループを同定する、ここで当該活性部位ループは下記の通りに特定される（ＢＡＳＢＰＮに従う（ＢＡＳＢＰＮ番号付け））
（ａ）アミノ酸残基３３乃至４３間の領域（両末端アミノ酸を含む）；
（ｂ）アミノ酸残基９５乃至１０３間の領域（両末端アミノ酸を含む）；
（ｃ）アミノ酸残基１２５乃至１３２間の領域（両末端アミノ酸を含む）；
（ｄ）アミノ酸残基１５３乃至１７３間の領域（両末端アミノ酸を含む）；
（ｅ）アミノ酸残基１８１乃至１９５間の領域（両末端アミノ酸を含む）；
（ｆ）アミノ酸残基２０２乃至２０４間の領域（両末端アミノ酸を含む）；
（ｇ）アミノ酸残基２１８乃至２１９間の領域（両末端アミノ酸を含む）；
iv）工程iii ）において同定された前記スブチラーゼ配列内の１又は複数の活性部位ループがＢＬＳＡＶＩ内の対応の活性部位ループより長いか否かを同定する。
【００７８】
もし上記の工程iv）における基準が満たされたら、所定のスブチラーゼ配列は本発明の範囲に属するスブチラーゼ配列である。
【００７９】
本発明のスブチラーゼとＢＬＳＡＶＩとの間での上記の工程ｉ）に特定する同一性は以下の説明に従って計算される。
【００８０】
ＢＬＳＡＶＩに対する本発明のスブチラーゼのアミノ酸配列の同一性
上記のポリペプチド同一性は第一配列の第二配列からの相違を示唆する２本の配列間の同一性の度合いとして決定される。この同一性は適切には当業界において公知のコンピュータープログラム、例えばＧＣＧプログラムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)(Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453に供与されているＧＡＰ等により決定されうる。ＧＡＰをポリペプチド配列対比のための下記の設定で利用して、３．０のＧＡＰ構築ペナルティー及び０．１のＧＡＰ伸長ペナルティー、本発明のスブチラーゼアミノ酸配列の成熟部はＢＬＳＡＶＩのアミノ酸配列１位乃至２７５位（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）の成熟部と少なくとも４０％，４５％，５０％，５５％，６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８５％，９０％、又は更には９５％の同一性度を示す。従って、この同一性は２６９で除した同一残基の数値と定義されるであろう（ＢＬＳＳＡＶＩ成熟部は２６９個のアミノ酸を有する）。
【００８１】
上記の工程ii）で実施するアラインメントは下記の通りに実施する。
【００８２】
本発明のスブチラーゼアミノ酸の、相同性スブチラーゼ配列の過去に規定され たアラインメントに対するアラインメント（上記工程 ii ）、及びＢＬＳＡＶＩ内の活性部位ループ領域に対応する前記スブチラーゼ内の適当な相同性活性部位ループの同定（上記工程 iii ）
本発明の範囲に属する他の相同性スブチラーゼを同定するため、前記スブチラーゼの過去にアライニングしたスブチラーゼのグループに対するアラインメントを、過去のアラインメント定数を保持しながら実施する（上記工程ii）。
【００８３】
デフォルト・アラインメント・パラメーターを利用し、ＣＬＵＳＴＡＷ（バージョン１．７、１９９７年６月）コンピューターアラインメントプログラム（Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 ）を用い、所定のスブチラーゼの過去にアラインニングしたスブチラーゼとのアラインメントをこのプログラム中のプロファイル・アラインメント・オプションを利用して成し遂げた。スブチラーゼ内の触媒トリアドＡｓｐ３２／Ｈｉｓ６４／Ｓｅｒ２２１の保存は保つべきである。
【００８４】
スブチラーゼのグループの上記のアラインメントを図１に示す。
【００８５】
アライニングの後、本発明の前記スブチラーゼ内での適当な相同性活性部位ループを保つために必要な挿入及び欠失を上記工程iii ）に記載の通りに同定される。
【００８６】
この説明に基づき、当業者にとって、適当な相同性スブチラーゼ及び当該スブチラーゼ内の対応の適当な相同活性部位ループを同定することはルーチン作業となる。
【００８７】
上記の本発明のスブチラーゼの好適な活性部位ループは下記の通りに定義されるループである：
（ｂ）アミノ酸残基９５乃至１０３間の領域（両端のアミノ酸を含む）が少なくとも１０個のアミノ酸の長さである（即ち、ＢＬＳＡＶＩと比較して、少なくとも１個のアミノ酸挿入がある）；及び
（ｃ）アミノ酸残基１２５乃至１３２間の領域（両端のアミノ酸を含む）が少なくとも９個のアミノ酸の長さである（即ち、ＢＬＳＡＶＩと比較して、少なくとも１個のアミノ酸挿入がある）。
【００８８】
スブチラーゼ変異体は当業界において公知の標準の技術、例えば部位特異的／ランダム突然変異誘発又は種々のスブチラーゼ配列のＤＮＡシャフルにより構築できうる。更に詳しくは本明細書の「スブチラーゼ変異体の製造」及び「材料と方法」を参照のこと（後掲）。
【００８９】
更なる態様において、本発明は以下に関連する：
１．前記少なくとも一の挿入されたアミノ酸残基がＴ，Ｇ，Ａ及びＳを含んで成る群から選ばれる、本発明に係る単離されたスブチラーゼ酵素；
２．前記少なくとも一の挿入されたアミノ酸残基がＤ，Ｅ，Ｈ，Ｋ及びＲ、より好ましくはＤ，Ｅ，Ｋ及びＲを含んで成る帯電アミノ酸残基の群から選ばれる、本発明に係る単離されたスブチラーゼ酵素；
３．前記少なくとも一の挿入されたアミノ酸残基がＣ，Ｎ，Ｑ，Ｓ及びＴ、より好ましくはＮ，Ｑ，Ｓ及びＴを含んで成る親水性アミノ酸残基の群から選ばれる、本発明に係る単離されたスブチラーゼ酵素；
４．前記少なくとも一の挿入されたアミノ酸残基がＡ，Ｇ及びＶを含んで成る小疎水性アミノ酸残基の群から選ばれる、本発明に係る単離されたスブチラーゼ酵素；
５．前記少なくとも一の挿入されたアミノ酸残基がＦ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｗ及びＹ、より好ましくはＦ，Ｉ，Ｌ，Ｍ及びＹを含んで成る大親水性アミノ酸残基の群から選ばれる、本発明に係る単離されたスブチラーゼ酵素。
【００９０】
更なる態様において、本発明は前記少なくとも一の活性部位ループ内の前記挿入が、ＢＬＳＡＶＩ内の対応の活性部位ループと比較して、少なくとも２個のアミノ酸残基を含んで成る、本発明に係る単離されたスブチラーゼ酵素に関する。
【００９１】
更なる態様において、本発明は前記スブチラーゼ酵素が
Ｇ９７ＧＡＳＧ；
Ｇ９７ＧＡＡ；及び
Ｇ９７ＧＡＳ
（ＢＡＳＢＰＮ番号表示）を含んで成る群から選ばれる少なくとも一の挿入を含んで成る、本発明に係る単離されたスブチラーゼ酵素に関する。
【００９２】
更には、本発明は前記スブチラーゼ酵素が
３７．０３：Ｇ９７ＧＡＳＧ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ＋Ｇ１００Ａ＋Ｓ１０１Ａ；
３７．０６：Ｇ９７ＧＡＡ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ＋Ｓ１０１Ｔ；及び
３７．０４：Ｇ９７ＧＡＳ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ
（ＢＡＳＢＰＮ番号表示）を含んで成る群から選ばれる少なくとも一の挿入／修飾を含んで成る、本発明に係る単離されたスブチラーゼ酵素に関する。
【００９３】
この最後の３つの変異体の残基９１乃至１０７のアラインメントを図２に示す。
【００９４】
一のアミノ酸の類似の保存性アミノ酸による置換はたいてい酵素の特徴のささいな変化しか供さないことが当業界において周知である。
【００９５】
表IIは保存性アミノ酸のグループを挙げる。

【００９６】
従って、スブチラーゼ変異体、例えばＧ９７ＧＧＧ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇが、変異体Ｇ９７ＧＡＡ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇと似た洗浄性能の向上を示すと予測される。例えば、かかるＧ９７ＧＡＡ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ変異体の特定の洗浄性能試験について本明細書の実施例を参照のこと。
【００９７】
開示の、そして特に本明細書に例示のスブチラーゼ変異体に基づき、当業者にとって、本発明の全ての観点及び態様に従い向上した洗浄性能を有するスブチラーゼ変異体を獲得するため、特に前述の例示変異体の更なる適当な保存修飾を同定することはルーチン作業となる。
【００９８】
本発明の態様において、注目のスブチラーゼは好ましくはサブグループＩ−Ｓ１及びＩ−Ｓ２に属するものである。
【００９９】
サブグループＩ−Ｓ１に関し、好適な親スブチラーゼはＡＢＳＳ１６８，ＢＡＳＢＰＮ，ＢＳＳＤＹ及びＢＬＳＣＡＲ又はサブグループＩ−Ｓ１の特徴を保持するそれらの機能性変異体を含んで成る群から選ばれる。
【０１００】
サブグループＩ−Ｓ２に関し、好適な親スブチラーゼはＢＬＳ１４７，ＢＬＳＡＶＩ，ＢＬＳ３０９，ＢＡＰＢ９２，ＴＶＴＨＥＲ及びＢＹＳＹＡＢ又はサブグループＩ−Ｓ２の特徴を保持するその機能性変異体を含んで成る群から選ばれる。
【０１０１】
詳しくは、前記親スブチラーゼはＢＬＳＡＶＩ（ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）NOVO NORDISK A/S）又はそれと９５％以上の同一性を有するスブチラーゼであり、従って本発明の好適なスブチラーゼ変異体はＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）の変異体又はそれと９５％以上の同一性を有するスブチラーゼである。
【０１０２】
本発明は更に上記の位置における任意の１又は複数の修飾を、親酵素のアミノ酸配列に対する任意のその他の修飾と組合さって含んで成る。特に、この酵素に向上した特性を与える当業界に公知のその他の修飾との組合せが考えられる。当業界では様々な向上した特性を有する数多くのスブチラーゼが発表されており、そしてその多くを本明細書の「発明の背景」（前掲）に記載した。これらの文献は、本発明のスブチラーゼ変異体に好適に組合せることのできるスブチラーゼ変異体を特定するための文献としてここで開示する。
【０１０３】
かかる組合せには２２２位（酸化安定性の向上）、２１８位（熱安定性の向上）、酵素を安定化するＣａ結合部位の置換、例えば７６位、及び従来技術から明白な数多くのその他の位置が挙げられる。
【０１０４】
更なる態様において、本発明のスブチラーゼ変異体は好都合には任意の下記の位置での１又は複数の修飾と組合せてよい：
２７，３６，５７，７６，８７，９７，１０１，１０４，１２０，１２３，１６７，１７０，２０６，２１８，２２２，２２４，２３５及び２７４。
【０１０５】
特に、下記のＢＬＳ３０９及びＢＡＰＢ９２変異体が組合せのために適切と考えられる：
Ｋ２７Ｒ， ^*３６Ｄ，Ｓ５７Ｐ，Ｎ７６Ｄ，Ｓ８７Ｎ，Ｇ９７Ｎ，Ｓ１０１Ｇ，Ｓ１０３Ａ，Ｖ１０４Ａ，Ｖ１０４Ｉ，Ｖ１０４Ｎ，Ｖ１０４Ｙ，Ｈ１２０Ｄ，Ｎ１２３Ｓ，Ｙ１６７，Ｒ１７０，Ｑ２０６Ｅ，Ｎ２１８Ｓ，Ｍ２２２Ｓ，Ｍ２２２Ａ，Ｔ２２４Ｓ，Ｋ２３５Ｌ及びＴ２７４Ａ。
【０１０６】
更なる変異体には上記の任意の１又は複数の修飾と組合された任意の下記の変異体が挙げられる：
Ｓ１０１Ｇ＋Ｖ１０４Ｎ，Ｓ８７Ｎ＋Ｓ１０１Ｇ＋Ｖ１０４Ｎ，Ｋ２７Ｒ＋Ｖ１０４Ｙ＋Ｎ１２３Ｓ＋Ｔ２７４Ａ，Ｎ７６Ｄ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４ＩもしくはＮ７６Ｄ＋Ｖ１０４Ａ又はその他のこれらの変異体の組合せ（Ｖ１０４Ｎ，Ｓ１０１Ｇ，Ｋ２７Ｒ，Ｖ１０４Ｙ，Ｎ１２３Ｓ，Ｔ２７４Ａ，Ｎ７６Ｄ，Ｖ１０４Ａ）。
【０１０７】
本発明の主たる観点の更なるスブチラーゼ変異体は好ましくは位置１２９，１３１，１３３及び１９４のいずれかにおける１又は複数の修飾と組合され、好ましくは１２９Ｋ，１３１Ｈ，１３３Ｐ，１３３Ｄ及び１９４Ｐ修飾、そして最も好ましくはＰ１２９Ｋ，Ｐ１３１Ｈ，Ａ１３３Ｐ，Ａ１３３Ｄ及びＡ１９４Ｐ修飾である。任意のこれらの修飾は本発明のスブチラーゼ変異体の高い発現レベルを供する。
【０１０８】
従って、本発明の更なる態様は、前記修飾が以下の群から選ばれる本発明に係る変異体に関する：
Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｓ＋Ａ１９４Ｐ
Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｌ＋Ａ１９４Ｐ
Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｎ＋Ａ１９４Ｐ
Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｓ＋Ｐ１２９Ｋ
Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｌ＋Ｐ１２９Ｋ
Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｎ＋Ｐ１２９Ｋ
Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｓ＋Ｐ１３１Ｈ
Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｌ＋Ｐ１３１Ｈ
Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｎ＋Ｐ１３１Ｈ
Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｓ＋Ａ１３３Ｐ
Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｌ＋Ａ１３３Ｐ
Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｎ＋Ａ１３３Ｐ
Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｓ＋Ａ１３３Ｄ
Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｌ＋Ａ１３３Ｄ
Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｎ＋Ａ１３３Ｄ
【０１０９】
スブチラーゼ変異体の製造
本発明のスブチラーゼをクローニングする及び遺伝子（例えば、スブチラーゼ遺伝子）への挿入体の導入のための数多くの方法が当業界において周知である。
【０１１０】
遺伝子のクローニング及び当該遺伝子への挿入体の導入（ランダム及び／又は部位特異的）のための一般的な標準手順が本発明のスブチラーゼ変異体を獲得するために利用されうる。適当な技術文献の更なる説明が本明細書の実施例（後掲）及び（Sambrookら (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M.ら (eds.) 「Current protocols in Molecular Biology」John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., and Cutting, S.M. (eds.)「Molecular Biological Methods for Bacillus 」John Wiley and Sons, 1990)；及びＷＯ ９６／３４９４６の中でされている。
【０１１１】
更に、本発明のスブチラーゼ変異体は様々なスブチラーゼ遺伝子のＤＮＡシャフルの標準技術により構築されうる（ＷＯ ９５／２２６２５；Stemmer WPC, Nature 370: 389-91 (1994)）。例えばＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標）の活性部位ループよりも長いものを含ませるためのＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標）と天然において同定された１又は複数の部分的スブチラーゼ配列とのＤＮＡシャフルは、向上した洗浄性能変異体のためのその後のスクリーニングを経て、本発明に係るスブチラーゼ変異体を供する。
【０１１２】
発現ベクター
本発明の酵素をコードするＤＮＡ構築体を含んで成る組換発現ベクターは組換ＤＮＡ手順に簡単にかけることができうる任意のベクターであってよく、そしてベクターの選定は往々にしてそれを導入すべき宿主細胞に依存するであろう。かくして、このベクターは自己複製式ベクター、即ち、その複製が染色体の複製とは独立したもの、例えばプラスミドであってよい。他方、このベクターは宿主細胞の中に導入されたとき、宿主細胞ゲノムの中にその一部又は全体が組込まれ、そしてそれの組込まれた染色体と一緒に複製できるものであってよい。
【０１１３】
このベクターは好ましくは発現ベクターであり、その中で本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列はＤＮＡの転写のために必要な追加のセグメントに作用可能式に連結されている。一般に、この発現ベクターはプラスミドもしくはウィルスＤＮＡに由来するか、又は双方の要素を含みうる。「作用可能式に連結」とは、複数のセグメントがその意図する目的のために協奏して機能するよう、例えば転写がプロモーターで開始され、そして当該酵素をコードするＤＮＡ配列を進むように配置されていることを意味する。
【０１１４】
このプロモーターは選定の宿主細胞内で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、そして宿主細胞と同種又は異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる。
【０１１５】
細菌宿主細胞内で利用するのに適当なプロモーターの例にはthe Bacillus stearothermophilus マルトジェニックアミラーゼ遺伝子、Bacillus licheniformisアルファ−アミラーゼ遺伝子、Bacillus amyloliquefaciensアルファ−アミラーゼ遺伝子、Bacillus subtilis アルカリホスファターゼ遺伝子、又はBacillus pumilusキシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又はラムダＰ_R もしくはＰ_L プロモーター、又はE. coli lac , trp もしくはtac プロモーターが挙げられる。
【０１１６】
本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列は更に、必要なら、適当なターミネーターに作用可能式に連結されていてよい。
【０１１７】
本発明の組換ベクターは更に当該ベクターを注目の宿主細胞内で複製させることを可能にするＤＮＡ配列を含んで成りうる。
【０１１８】
このベクターは更に選択マーカー、例えばその生成物が宿主細胞の欠陥を補うような遺伝子、又はカナマイシン、クロラムフェニコール、エリトロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン等の抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子、又は重金属もしくは農薬に対する耐性をコードする遺伝子を含んで成りうる。
【０１１９】
本発明の酵素を宿主細胞の分泌経路へと導くため、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られる）を組換ベクターの中に供してよい。この分泌シグナル配列は酵素をコードするＤＮＡ配列と適正なリーディングフレーム内で連結されている。分泌シグナル配列は一般にこの酵素をコードするＤＮＡ配列の５′側に配置される。この分泌シグナル配列は当該酵素と通常結合しているもの、又はその他の分泌タンパク質をコードする遺伝子に由来するものであってよい。
【０１２０】
本酵素をコードするＤＮＡ配列、プロモーター、及び任意的にターミネーター及び／又は分泌シグナル配列のそれぞれをライゲーションするための、又はこのような配列を適当なＰＣＲ増幅スキームにより集成し、そしてそれらを複製又は組込みのために必要な情報を含む適当なベクターに挿入するための手順は当業者に周知である（例えば、Sambrookら、前掲参照）。
【０１２１】
宿主細胞
宿主細胞の中に導入される本酵素をコードするＤＮＡ配列は注目の宿主と同種又は異種であってよい。もし宿主細胞と同種なら、即ち、宿主細胞により自然に産生されるなら、それは一般にその天然環境以外の別のプロモーター配列、又は適宜、別の分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列に作用可能式に連結されているであろう。「同種」なる語は、注目の宿主生物に天然な酵素をコードするＤＮＡ配列を含むことを意図する。「異種」なる語は宿主細胞により天然では発現されないＤＮＡ配列を含むことを意図する。かくして、このＤＮＡ配列は別の起源に由来するか、又は合成配列であってよい。
【０１２２】
本発明のＤＮＡ構築体又は組換ベクターの導入されうる宿主細胞は本酵素を生産できる任意の細胞であってよく、そして細菌、酵母、菌類及び高等真核細胞が含まれる。
【０１２３】
培養することで本発明の酵素を生産できる細菌宿主細胞の例はグラム陽性菌、例えばバチルスの株、例えばB. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megatheriumもしくはB. thuringiensisの株、又はStreptomyces、例えばS. lividans もしくはS. murinusの株、又はグラム陰性菌、例えばEcherichia coli である。細菌の形質転換はプロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、又は周知の態様でのコンピテント細胞の利用により行うことができうる（Sambrookら、前掲参照）。
【０１２４】
当該酵素を細菌、例えばE. coli 内で発現させる場合、この酵素は細胞質内に一般に不溶性顆粒（封入体として知られる）として保持されることがあり、又は細菌分泌配列によりペリプラズマ空間へと導かれることがある。前者の場合、細胞を溶菌し、そして顆粒を回収及び変性させ、しかる後酵素を変性剤の希釈によりリフォルディングさせる。後者の場合、ペリプラズマ空間の中身の放出のために例えば音波処理又は浸透圧ショックにより細胞を破壊し、そしてその酵素を回収することにより酵素はペリプラズマ空間から回収できうる。
【０１２５】
酵素をグラム陽性菌、例えばバチルス又はストレプトマイセス株で発現させる場合、酵素は細胞質内に保持されるか、又は細菌分泌配列により細胞外媒質へと導かれうる。後者の場合、酵素は以下に説明する通りに培地から回収されうる。
【０１２６】
スブチラーゼの製造方法
本発明は本発明に係る単離された酵素を製造する方法を提供し、それにおいては本酵素をコードするＤＮＡ配列で形質転換された適当な宿主細胞を当該酵素の製造を可能にする条件下で培養し、そして得られる酵素を培地から回収する。
【０１２７】
本酵素をコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターを異種宿主細胞に形質転換する場合、本発明の酵素の異種組換製造が可能となる。
【０１２８】
かくして、同種不純物を含まないことを特徴とする高純度なスブチラーゼ組成物を作ることが可能となる。
【０１２９】
尚、同種不純物とは本発明の酵素が本来由来する同種細胞に由来する任意の不純物（例えば、本発明の酵素以外のその他のポリペプチド）を意味する。
【０１３０】
形質転換宿主細胞を培養するのに利用する培地は注目の宿主細胞を増殖するために適当な任意の慣用の培地であってよい。発現されたスブチラーゼは好都合には培養培地の中に分泌され、そして周知の手順、例えば遠心分離もしくは濾過による培地から細胞の分離、硫酸アンモニウムの如き塩による培地のタンパク質性成分の沈殿、しかる後のクロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等によりそれから回収し得る。
【０１３１】
本発明のスブチラーゼ変異体の利用
本発明のスブチラーゼプロテアーゼ変異体は数多くの産業的用途、特に洗剤産業において利用されうる。
【０１３２】
更に、本発明は本発明のスブチラーゼ変異体を含んで成る酵素組成物に関する。
【０１３３】
好適な産業上の利用及び対応の好適な酵素組成物の概要を以下に記載する。
【０１３４】
この概要は本発明のスブチラーゼ変異体の適切な用途を完全に列挙するものではない。本発明のスブチラーゼ変異体はプロテアーゼ、特にスブチラーゼの利用を含む当業界において公知のその他の産業的用途に利用されうる。
【０１３５】
突然変異酵素を含んで成る洗剤組成物
本発明は洗浄及び洗剤組成物、並びに突然変異スブチリシン酵素を含んで成るかかる組成物における本発明の突然変異酵素の利用を含んで成る。かかる洗浄及び洗剤組成物は当業界にかなり発表されており、そして適当な洗浄及び洗剤組成物の更なる説明についてはＷＯ ９６／３４９４６；ＷＯ ９７／０７２０２；ＷＯ ９５／３００１１を参照されたい。
【０１３６】
本発明のいくつかのスブチラーゼ変異体についての洗浄性能の向上を示す実施例を更に参照されたい。
【０１３７】
洗剤の開示及び例
界面活性系
本発明に係る洗剤組成物は界面活性剤を含んで成り、ここでこの界面活性剤は非イオン性及び／又はアニオン性及び／又はカチオン性及び／又は両性及び／又は双イオン性及び／又は半極性界面活性剤から選ばれうる。
【０１３８】
当該界面活性剤は一般に０．１〜６０重量％のレベルで存在する。
【０１３９】
この界面活性剤は当該組成物の中に存在する酵素成分と適合するように配合するのが好ましい。液体又はゲル組成物では、この界面活性剤は最も好ましくはかかる組成物内の任意の酵素の安定性を促進する、又は少なくとも劣化させないように配合する。
【０１４０】
本発明に従って利用される好適な系は、界面活性剤として本明細書に記載する１又は複数種の非イオン性及び／又はアニオン性界面活性剤を含む。
【０１４１】
アルキルフェノール類のポリエチレン、ポリプロピレン及びポリブチレンオキシド縮合物は本発明の界面活性系の非イオン性界面活性剤として利用するのに適当であり、ポリエチレンオキシド縮合物が好ましい。このような化合物には、約６〜約１４個の炭素原子、好ましくは約８〜約１４個の炭素原子を有する直鎖もしくは枝分れ形態のアルキルフェノールと、アルキレンオキシドとの縮合生成物が挙げられる。好適な態様において、エチレンオキシドはアルキルフェノール１モル当り約２〜約２５モル、より好ましくは約３〜約１５モルのエチレンオキシドに相当する量で存在する。このタイプの市販の非イオン性界面活性剤にはGAF Corporation により市販のＩｇｅｐａｌ^TM ＣＯ−６３０、並びにRohm & Haas Company より市販のＴｒｉｔｏｎ^TM Ｘ−４５，Ｘ−１１４，Ｘ−１００及びＸ−１０２が挙げられる。これらの界面活性剤は一般にアルキルフェノールアルコキシレート類（例えばアルキルフェノールエトキシレート類）と称されている。
【０１４２】
約１〜約２５モルのエチレンオキシドを有する第一及び第二脂肪アルコールの縮合生成物が本発明の非イオン性界面活性系の非イオン界面活性剤として利用するのに適当である。この脂肪族アルコールのアルキル鎖は直鎖又は枝分れしていてよく、第一又は第二アルコールでよく、そして一般に約８〜約２２個の炭素原子を含む。好ましいのは約１０〜約２０個の炭素原子、より好ましくは約１０〜約１８個の炭素原子を含むアルキル基を有するアルコールの、アルコール１モル当り約２〜約１０モルのエチレンオキシドとの縮合生成物である。アルコール１モル当り約２〜約７モルのエチレンオキシド、そして最も好ましくは２〜５モルのエチレンオキシドがこの縮合生成物の中に存在する。このタイプの市販の非イオン性界面活性剤の例にはＴｅｒｇｉｔｏｌ^TM １５−Ｓ−９（Ｃ₁₁−Ｃ₁₅線形アルコールと９モルのエチレンオキシドとの縮合生成物）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ^TM ２４−Ｌ−６ ＮＭＷ（Ｃ_12-14 第一アルコールと６モルのエチレンオキシドとの縮合生成物：狭い分子量分布を有する）〔共に、Union Carbide Corporation より市販〕、Ｎｅｏｄｏｌ^TM ４５−９（Ｃ₁₄−Ｃ₁₅線形アルコールと９モルのエチレンオキシドとの縮合生成物）、Ｎｅｏｄｏｌ^TM ２３−３（Ｃ₁₂−Ｃ₁₃線形アルコールと３．０モルのエチレンオキシドとの縮合生成物）、Ｎｅｏｄｏｌ^TM ４５−７（Ｃ₁₄−Ｃ₁₅線形アルコールと７モルのエチレンオキシドとの縮合生成物）、Ｎｅｏｄｏｌ^TM ４５−５（Ｃ₁₄−Ｃ₁₅線形アルコールと５モルのエチレンオキシドとの縮合生成物）〔Shell Chemical Companyより市販〕、Ｋｙｒｏ^TM ＥＯＢ（Ｃ_13-15 アルコールと９モルのエチレンオキシドとの縮合生成物）〔The Procter & Gamble Companyより市販〕、及びＧｅｎａｐｏｌ ＬＡ０５０（Ｃ₁₂−Ｃ₁₄アルコールと５モルのエチレンオキシドとの縮合生成物）〔Hoechst より市販〕が挙げられる。このような生成物中のＨＬＢの好適な範囲は８〜１１、そして最も好ましくは８−１０である。
【０１４３】
本発明の界面活性系の非イオン性界面活性剤として更に有用なのは米国特許第４，５６５，６４７号に開示された、約６〜約３０個の炭素原子、好ましくは約１０〜約１６個の炭素原子を含む疎水性基と、約１．３〜約１０、好ましくは約１．３〜約３、最も好ましくは約１．３〜約２．７の糖単位を含む多糖、例えばポリグリシド親水性基とを有するアルキル多糖類である。５又は６個の炭素原子を含む任意の還元糖、例えばグルコース、ガラクトースを使用してよく、そしてガラクトシル成分がグルコシル成分を置換してよい（任意的に、疎水性基は、グルコース又はガラクトースをグルコシド又はガラクトシドと対向させる２−，３−，４−等の位置に付加されている）。糖間結合は例えば付加糖単位の１位と、先行の糖単位上の２−，３−，４−及び／又は６−位との間にあってよい。
【０１４４】
好適なアルキルポリグリコシドは次式を有する：
Ｒ² Ｏ（Ｃ_n Ｈ_2nＯ）_t （グリコシル）_x
（式中、Ｒ² はアルキル、アルキルフェニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルフェニル及びそれらの混合物から成る群から選ばれ、ここでそのアルキル基は約１０〜約１８個、好ましくは約１２〜約１４個の炭素原子を含み；ｎは２又は３、好ましくは２であり；ｔは０〜約１０、好ましくは０であり；そしてｘは約１．３〜約１０、好ましくは約１．３〜約３、最も好ましくは約１．３〜約２．７である。グリコシルは好ましくはグルコースに由来する）。かかる化合物を調製するため、アルコール又はアルキルポリエトキシアルコールをまず生成し、次いでグルコース又はグルコースの起源と反応させ、グルコシドを生成する（１位に付加）。追加のグリコシル単位はその１位と、先行のグリコシル単位の２−，３−，４−及び／又は６−位、好ましくは主に２−位との間に付加してよい。
【０１４５】
プロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合により生成されるエチレンオキシドと疎水性基材との縮合生成物も本発明の更なる非イオン界面活性系として利用するのに適当である。このような化合物の疎水性部分は好ましくは約１５００〜約１８００の分子量を有し、そして水不溶性を示すであろう。この疎水性部分へのポリオキシエチレン成分の付加は分子全体の水溶性を高める傾向にあり、そしてこの生成物の液体的特徴はそのポリオキシエチレン含有量が縮合生成物の総重量の約５０％に至る点にまで保持され、それは約４０モルに至るエチレンオキシドとの縮合に相当する。このタイプの化合物の例には、BASFにより販売されている所定の市販のＰｌｕｒｏｎｉｃ^TM界面活性剤が挙げられる。
【０１４６】
本発明の非イオン界面活性系の非イオン性界面活性剤として利用するのに更に適当なのはプロピレンオキシドとエチレンジアミンとの反応により得られる生成物とのエチレンオキシドの縮合生成物である。このような生成物の疎水性成分はエチレンジアミンと過剰量のプロピレンオキシドとの反応生成物から成り、そして一般に約２５００〜約３０００の分子量を有する。この疎水性成分はエチレンオキシドと、その縮合生成物が約４０〜８０重量％のポリオキシエチレンを有し、且つ約５，０００〜約１１，０００の分子量を有する程度に縮合されている。このタイプの非イオン界面活性剤の例には、BASFより販売されている所定の市販のＴｅｔｒｏｎｉｃ^TM化合物が挙げられる。
【０１４７】
本発明の界面活性系の非イオン界面活性剤として利用するのに好ましいのはアルキルフェノールのポリエチレンオキシド縮合物、第一及び第二脂肪族アルコールと約１〜約２５モルのエチレンオキシド、アルキル多糖及びそれらの混合物との縮合生成物である。最も好ましいのは３〜１５個のエトキシ基を有するＣ₈ −Ｃ₁₄アルキルフェノールエトキシレート、及び２〜１０個のエトキシ基を有するＣ₈ −Ｃ₁₈アルコールエトキシレート（好ましくは平均してＣ₁₀）、並びにそれらの混合物である。
【０１４８】
極めて好ましい非イオン性界面活性剤は次式のポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤である：
【化１】

（式中、Ｒ¹ はＨであるか、又はＲ¹ はＣ_1-4 ヒドロキシカルビル、２−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシプロピル又はそれらの混合物であり、Ｒ² はＣ_5-31ヒドロカルビルであり、そしてＺは鎖に連結した少なくとも３個のヒドロキシルを有する線形ヒドロカルビルを有するポリヒドロキシヒドロカルビルであるか、又はそのアルコキシル化誘導体である）。好ましくは、Ｒ¹ はメチルであり、Ｒ² は直鎖Ｃ_11-15 アルキル又はＣ_16-18 アルキルもしくはアルケニル鎖、例えばココナッツアルキル又はそれらの混合物であり、そしてＺは還元アミノ化反応において還元糖、例えばグルコース、フルクトース、マルトース又はラクトースに由来するものである。
【０１４９】
極めて好ましいアニオン性界面活性剤にはアルキルアルコキシル化スルフェート界面活性剤が挙げられる。その例は式ＲＯ（Ａ）_m ＳＯ₃ Ｍの水溶性塩又は酸であり、ミニでＲは未置換のＣ₁₀−Ｃ₂₄アルキルであるか、又はＣ₁₀−Ｃ₂₄アルキル成分を有するヒドロキシアルキル、好ましくはＣ₁₂−Ｃ₂₀アルキルもしくはヒドロキシアルキル、より好ましくはＣ₁₂−Ｃ₁₈アルキルもしくはヒドロキシアルキルであり、Ａはエトキシ又はプロポキシ単位であり、ｍは０より大であり、典型的には約０．５〜約６、より好ましくは約０．５〜約３であり、そしてＭはＨであるか、又は陽イオン、例えば金属陽イオン（例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム等）、アンモニウム又は置換化アンモニウム陽イオンでありうる。アルキルエトキシル化スルフェート及びアルキルプロポキシル化スルフェートがここでは考慮される。置換化アンモニウム陽イオンの特異的な例にはメチル−、ジメチル、トリメチル−アンモニウム陽イオン及び第四級アンモニウム陽イオン、例えばテトラメチル−アンモニウム及びジメチルピペリジニウム陽イオン、並びにアルキルアミン、例えばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、それらの混合物等に由来するもの、が挙げられる。典型的な界面活性剤はＣ₁₂−Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート（１．０）スルフェート（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈Ｅ（１．０）Ｍ）、Ｃ₁₂−Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート（２．２５）スルフェート（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈（２．２５）Ｍ）及びＣ₁₂−Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート（３．０）スルフェート（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈Ｅ（３．０）Ｍ）及びＣ₁₂−Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート（４．０）スルフェート（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈Ｅ（４．０）Ｍ）であり、ここでＭは好都合にはナトリウム及びカリウムから選ばれる。
【０１５０】
使用に適するアニオン性界面活性剤はアルキルエステルスルホネート界面活性剤、例えば「The Journal of the American Oil Chemiscs Society」52 (1975), pp.323 〜329 に従って気性ＳＯ₃ でスルホン化されたＣ₈ −Ｃ₂₀カルボン酸（即ち、脂肪酸）の線形エステルである。適当な出発材料には獣脂、パーム油、等に由来する天然脂肪物質が含まれるであろう。
【０１５１】
特に洗濯用途のために好適なアルキルエステルスルホネート界面活性剤は次の構造式のアルキルエステルスルホネート界面活性剤を含んで成る：
【化２】

（式中、Ｒ³ はＣ₈ −Ｃ₂₀ヒドロカルビル、好ましくはアルキル、又はそれらの組合せであり、Ｒ⁴ はＣ₁ −Ｃ₆ ヒドロカルビル、好ましくはアルキル、又はそれらの組合せであり、そしてＭはアルキルエステルスルホネートと水溶性の塩を形成する陽イオンである）。適当な塩形成陽イオンには金属、例えばナトリウム、カリウム及びリチウム、並びに置換又は未置換のアンモニウム陽イオン、例えばモノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンが挙げられる。好ましくは、Ｒ³ はＣ₁₀−Ｃ₁₆アルキル、そしてＲ⁴ はメチル、エチル又はイソプロピルである。特に好ましいのはメチルエステルスルホネートであって、Ｒ³ がＣ₁₀−Ｃ₁₆アルキルのものである。
【０１５２】
その他の適当なアニオン性界面活性剤にはアルキルスルフェート界面活性剤が挙げられ、それは式ＲＯＳＯ₃ Ｍの水溶性塩又は酸であり、ここでＲは好ましくはＣ₁₀−Ｃ₂₄ヒドロカルビル、好ましくはＣ₁₀−Ｃ₂₀アルキル成分を有するアルキル又はヒドロキシアルキル、より好ましくはＣ₁₂−Ｃ₁₈アルキル又はヒドロキシアルキルであり、そしてＭはＨ又は陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン（例えばナトリウム、カリウム、リチウム）又はアンモニウムもしくは置換化アンモニウム（例えばメチル−、ジメチル−及びトリメチルアンモニウム陽イオン、並びに第四級アンモニウム陽イオン、例えばテトラメチルアンモニウム及びジメチルピペリジウム陽イオン、並びにエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン及びそれらの混合物の如きアルキルアミンに由来する第四級アンモニウム陽イオン、等）である。典型的には、Ｃ₁₂−Ｃ₁₆のアルキル鎖が低温洗浄温度（例えば約５０℃未満）のために好ましく、そしてＣ₁₆−Ｃ₁₈アルキル鎖が高温洗浄温度（例えば約５０℃超）のために好ましい。
【０１５３】
洗浄目的のために有用なその他のアニオン性界面活性剤も本発明の洗濯洗剤組成物に含ませてよい。これらには石けんの塩（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム及び置換アンモニウム塩、例えばモノ−、ジ−、及びトリエタノールアミン塩等）、Ｃ₈ −Ｃ₂₂第一又は第二アルカンスルホネート、Ｃ₈ −Ｃ₂₄オレフィンスルホネート、アルカリ土類金属クエン酸塩の加熱分解生成物のスルホン化により調製されたスルホン化ポリカルボン酸；例えば英国特許明細書に記載されているＣ₈ −Ｃ₂₄アルキルポリグリコールエーテルスルフェート（１０モルまでのエチレンオキシドを含む）；アルキルグリセロールスルホネート、脂肪アルコールグリセロールスルホネート、脂肪オレイルグリセロールスルフェート、アルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルフェート、パラフィンスルホネート、アルキルホスフェート、イセチオネート、例えばアシルイセチオネート、Ｎ−アシルタウレート、アルキルスクシメート及びスルホスクシネート、スルホスクシネートのモノエステル（特に、飽和及び不飽和Ｃ₁₂−Ｃ₁₈モノエステル）、並びにスルホスクシネートのジエステル（特に、飽和及び不飽和Ｃ₅ −Ｃ₂₂ジエステル）、アシルサルコシネート、アルキル多糖のスルフェート、例えばアルキルポリグルコシドのスルフェート（非イオン性非スルホン化化合物は以下に説明）、枝分れ第一アルキルスルフェート及びアルキルポリエトキシカルボキシレート、例えば式ＲＯ（ＣＨ₂ ＣＨ₂ Ｏ）_k −ＣＨ₂ ＣＯＯ−Ｍ＋のもの（ここで、ＲはＣ₈ −Ｃ₂₂アルキル、ｋは１〜１０の整数、そしてＭは可溶性塩形成陽イオンである）が挙げられる。樹脂酸及び水素化樹脂酸、例えばロジン、水素化ロジン、並びに獣油（tall oil）の中に存在する又はそれに由来する樹脂酸及び水素化樹脂も適当である。
【０１５４】
アルキルベンゼンスルホネートが極めて好ましい。特に好ましいのは線形（直鎖）アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）であって、アルキル基が好ましくは１０〜１８個の炭素原子を含むものである。
【０１５５】
更なる例が「Surface Active Agents and Detergents」（Vol.I 及びII、Schwartz, Perry and Berch ）に記載されている。様々なかかる界面活性剤は米国特許第３，９２９，６７８号にも一般的に開示されている（引用することで本明細書に組入れる第２３欄行５８〜第２９欄行２３）。
【０１５６】
ここに含ませる場合、本発明の洗濯洗剤組成物は一般に約１〜４０重量％、好ましくは約３〜約２０重量％のかかるアニオン性界面活性剤を含んで成る。
【０１５７】
本発明の洗濯洗剤組成物は更にカチオン性、両性、双イオン性及び半極性界面活性剤、並びに本明細書において前述したもの以外の非イオン性及び／又はアニオン性界面活性剤を含みうる。
【０１５８】
本発明の洗濯洗剤組成物における利用に適するカチオン洗浄界面活性剤は一本の長鎖ヒドロカルビル基を有するものである。かかるカチオン性界面活性剤の例にはアンモニウム界面活性剤、例えばアルキルトリメチルアンモニウムハロゲニド、及び次式を有する界面活性剤が挙げられる：
〔Ｒ² （ＯＲ³)_y 〕〔Ｒ⁴ （ＯＲ³)_y 〕_z Ｒ⁵ Ｎ＋Ｘ^-
（式中、Ｒ² はアルキル鎖内に約８〜約１８個の炭素原子を有するアルキル又はアルキルベンジル基であり、各々のＲ³ は−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −，−ＣＨ₂ ＣＨ（ＣＨ₃ ）−，ＣＨ₂ ＣＨ（ＣＨ₂ ＯＨ）−，−ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＣＨ₂ −及びそれらの混合物から成る群から選ばれ；各々のＲ⁴ はＣ₁ −Ｃ₄ アルキル、Ｃ₁ −Ｃ₄ ヒドロキシアルキル、２つのＲ⁴ 基を連結することにより形成されるベンジル環構造、−ＣＨ₂ ＣＨＯＨＣＨＯＨＣＯＲ⁶ ＣＨＯＨＣＨ₂ ＯＨ（ここで、Ｒ⁶ は任意のヘキソース又は、約１０００未満の分子量を有するヘキソースポリマーである）から成る群から選ばれ、そしてｙが０でないときは水素であり；Ｒ⁵ はＲ⁴ と同一であるか又はアルキル鎖であり、その総炭素数又はＲ² ＋Ｒ⁵ は約１８以下であり；各々のｙは０〜約１６であり、そしてｙ値の合計は０〜約１５であり；そしてＸは任意の適合性アニオンである）。
【０１５９】
極めて好ましいカチオン性界面活性剤は次式を有する本組成物において有用な水溶性第四級アンモニウム化合物である：
Ｒ₁ Ｒ₂ Ｒ₃ Ｒ₄ Ｎ⁺ Ｘ^- （ｉ）
（式中、Ｒ₁ はＣ₈ −Ｃ₁₆アルキルであり、各々のＲ₂ ，Ｒ₃ 及びＲ₄ は独立してＣ₁ −Ｃ₄ アルキル、Ｃ₁ −Ｃ₄ ヒドロキシアルキル、ベンジル及び−（Ｃ₂ Ｈ₄ Ｏ）_x であり、ここでｘは２〜５の値を有し、そしてＸはアニオンである）。Ｒ₂ ，Ｒ₃ 又はＲ₄ の２個以上がベンジルであるべきではない。
【０１６０】
Ｒ₁ についての好適なアルキル鎖長は、特にアルキル基がココナッツ又はパーム・カーネル脂肪に由来する鎖長の混合物、又はオレフィン単位もしくはオキソアルコール合成により合成的に誘導されたものであるとき、Ｃ₁₂−Ｃ₁₅である。
【０１６１】
Ｒ₂ ，Ｒ₃ 及びＲ₄ の好適な基はメチル及びヒドロキシエチル基であり、そしてアニオンＸはハライド、メトスルフェート、アセテート及びホスフェートイオンから選ばれる。
【０１６２】
ここで使用するための式（Ｉ）の適当な第四級アンモニウム化合物の例は：
ココナッツトリメチルアンモニウムクロリド又はブロミド；
ココナッツメチルジヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はプロミド；
デシルトリエチルアンモニウムクロリド；
デシルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド；
Ｃ_12-15 ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド；
ココナッツジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド；
ミリスチルトリメチルアンモニウムメチルスルフェート；
ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロリド又はブロミド；
ラウリルジメチル（エテノキシ）₄ アンモニウムクロリド又はブロミド；
コリンエステル（Ｒ₁ が
【化３】

である式（ｉ）の化合物）；
ジアルキルイミダゾリン〔式（ｉ）の化合物〕である。
【０１６３】
ここで有用なその他のカチオン性界面活性剤は米国特許第４，２２８，０４４号及びＥＰ ０００，２２４号にも記載されている。
【０１６４】
ここに含ませるなら、本発明の洗濯洗剤組成物は一般にかかるカチオン性界面活性剤の０．２〜約２５重量％、好ましくは約１〜８重量％を占める。
【０１６５】
両性界面活性剤も本発明の洗濯洗剤組成物における使用に適する。このような界面活性剤は広義には第二又は第三アミンの脂肪族誘導体、又は複素環式第二及び第三アミンの脂肪族誘導体と記載することができ、その脂肪族基は直鎖でも枝分れしていてもよい。脂肪族置換基の一つは少なくとも約８個の炭素原子、典型的には約８〜約１８個の炭素原子を含み、そして少なくとも一つはアニオン性水可溶化性基、例えばカルボキシ、スルホネート、スルフェートを含む。両性界面活性剤の例については米国特許第３，９２９，６７８号（第１９欄、行１８−３５を参照のこと）。
【０１６６】
ここに含ませるとき、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には０．２〜約１５重量％、好ましくは約１〜約１０重量％のかかる両性界面活性剤を含んで成る。
【０１６７】
双イオン性界面活性剤も洗濯洗剤組成物において利用するのに適当である。このような界面活性剤は広義には第二及び第三アミンの誘導体、複素環式第二及び第三アミンの誘導体、又は第四アンモニウム、第四ホスホニウムもしくは第三スルホニウム化合物の誘導体である。双イオン性界面活性剤の例については米国特許第３，９２９，６７８号（第１９欄、行３８〜第２２欄、行４８を参照のこと。
【０１６８】
ここに含ませるなら、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には０．２〜約１５重量％、好ましくは約１〜約１０重量％のかかる双イオン性界面活性剤を含んで成る。
【０１６９】
半極性非イオン性界面活性剤は非イオン性界面活性剤の特殊なカテゴリーであり、それには約１０〜約１８個の炭素原子の１個のアルキル成分と、約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル基及びヒドロキシアルキル基から成る群から選ばれる２個の成分とを含む水溶性アミンオキシド；約１０〜約１８個の炭素原子の１個のアルキル成分と、約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル基及びヒドロキシアルキル基から成る群から選ばれる２個の成分とを含む水溶性ホスフィンオキシド；並びに約１０〜約１８個の炭素原子の１個のアルキル成分と、約１〜約３個の炭素原子のアルキル及びヒドロキシアルキル成分から成る群から選ばれる成分とを含む水溶性スルホキシドが挙げられる。
【０１７０】
半極性非イオン性洗浄界面活性剤には次式を有するアミンスルホキシドが含まれる：
【化４】

（式中、Ｒ³ は約８〜約２２個の炭素原子を含むアルキル、ヒドロキシアルキル又はアルキルフェニル基又はそれらの混合物であり；Ｒ⁴ は約２〜約３個の炭素原子又はそれらの混合物を含むアルキレン又はヒドロキシアルキレンであり；ｘは０〜約３であり；そして各Ｒ⁵ は約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル又はヒドロキシアルキル基であるか、又は約１〜約３個のエチレンオキシド基を含むポリエチレンオキシド基である）。Ｒ⁵ 基は互いに、例えば酵素又は窒素原子を介して付加されており、環構造を形成している。
【０１７１】
このようなアミンオキシド界面活性剤には特にＣ₁₀−Ｃ₁₈アルキルジメチルアミンオキシド及びＣ₈ 〜Ｃ₁₂アルコキシエチルジヒドロキシエチルアミンオキシドが含まれる。
【０１７２】
ここに含ませる場合、本発明の洗濯洗剤組成物は一緒に０．２〜約１５重量％、好ましくは約１〜約１０重量％のかかる半極性非イオン性界面活性剤を含んで成る。
【０１７３】
ビルダー系
本発明に係る組成物は更にビルダー系を含んで成りうる。ここで利用するのに適当な任意の慣用のビルダー系にはアルミノシリケート材料、シリケート、ポリカルボキシレート及び脂肪酸、エチレンジアミン四酢酸の如き物質、金属イオン封鎖剤、例えばアミノポリホスホネート、特にエチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸及びジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸が挙げられる。明白な環境的理由のためにあまり好ましくはないが、リン酸ビルダーもここで使用できる。
【０１７４】
適当なビルダーは無機イオン交換材料、一般には無機水和アルミノシリケート材料、より詳しくは水和合成ゼオライト、例えば水和ゼオライトＡ，Ｘ，Ｂ，ＨＳ又はＭＡＰでありうる。
【０１７５】
その他の適当な無機ビルダー材料は層状シリケート、例えばＳＫＳ−６（Ｈｏｅｃｈｓｔ）である。ＳＫＳ−６はケイ酸ナトリウム（Ｎａ₂ Ｓｉ₂ Ｏ₅ ）から成る結晶層状シリケートである。
【０１７６】
１個のカルボキシ基を含む適当なポリカルボキシレートは、ベルギー特許第８３１，３６８、８２１，３６９及び８２１，３７０号に開示の如き乳酸、グルコール酸及びそのエーテル誘導体を含む。２個のカルボキシ基を含むポリカルボキシレートにはコハク酸、マロン酸、（エチレンジオキシ）二酢酸、マレイン酸、ジグリコール酸、酒石酸、タルトロン酸及びフマル酸の水溶性塩、並びにドイツ国特許第２，４４６，６８６及び２，４４６，４８７号、米国特許第３，９３５，２５７号に記載のエーテルカルボキシレート、及びベルギー特許第８４０，６２３号に記載のスルフィニルカルボキシレートが挙げられる。３個のカルボキシ基を含むポリカルボキシレートには、特に、水溶性クエン酸塩、アコニトレート及びシトラコネート、並びにスクシネート誘導体、例えば英国特許第１，３７９，２４１号に記載のカルボキシメチルオキシスクシネート、オランダ出願第７２０５８７３号に記載のラクトキシスクシネート、並びに英国特許第１，３８７，４４７号に記載の２−オキサ−１，１，３−プロパントリカルボキシレートの如きオキシポリカルボキシレート材料が挙げられる。
【０１７７】
４個のカルボキシ基を含むポリカルボキシレートには英国特許第１，２６１，８２９号に開示のオキシジスクシネート、英国特許第１，３９８，４２１及び１，３９８，４２２号に開示のスルホスクシネート誘導体を含む１，１，２，２−エタンテトラカルボキシレート、スルホ置換基を含む１，１，３，３−プロパンテトラカルボキシレート、並びに英国特許第１，０８２，１７９号に記載のスルホン化加熱分解クエン酸塩が挙げられ、一方ホスホン置換基を含むポリカルボキシレートが英国特許第１，４３９，０００号に開示されている。
【０１７８】
脂環式及び複素環ポリカルボキシレートにはシクロペンタン−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラカルボキシレート、シクロペンタジエニドペンタカルボキシレート、２，３，４，５−テトラヒドロフラン−ｃｉｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ−テトラカルボキシレート、２，５−テトラヒドロ−フラン−ｃｉｓ，ジスカルボキシレート、２，２，５，５−テトラヒドロフラン−テトラカルボキシレート、１，２，３，４，５，６−ヘキサン−ヘキサカルボキシレート、並びに多価アルコール、例えばソルビトール、マンニトール及びキシリトールのカルボキシメチル誘導体が挙げられる。芳香族ポリカルボキシレートには英国特許第１，４２５，３４３号に開示のメリチン酸、ピロメリチン酸及びフタル酸誘導体が挙げられる。
【０１７９】
以上のうち、好適なポリカルボキシレートは１分子当り３個までのカルボキシ基を含むヒドロキシカルボキシレート、より詳しくはクエン酸塩である。
【０１８０】
本組成物において利用するのに好適なビルダー系は水不溶性アルミノシリケートビルダー、例えばゼオライトＡ又は層状シリケート（ＳＫＳ−６）と、水溶性カルボキシレートキレート化剤、例えばクエン酸との混合物を含む。
【０１８１】
本発明に係る洗剤組成物に含ませるのに適当なキレート剤はエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ′−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）又はそのアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム又は置換化アンモニウム塩、又はそれらの混合物である。好適なＥＤＤＳ化合物は遊離酸形態及びそのナトリウム又はマグネシウム塩である。ＥＤＤＳのかかる好適なナトリウム塩の例にはＮａ₂ ＥＤＤＳ及びＮａ₄ ＥＤＤＳが含まれる。ＥＤＤＳのかかる好適なマグネシウム塩の例にはＭｇＥＤＤＳ及びＭｇ₂ ＥＤＤＳが挙げられる。本発明に係る組成物に含ませるにはマグネシウム塩が最も好ましい。
【０１８２】
好適なビルダー系には水不溶性アルミノシリケートビルダー、例えばゼオライトＡ及び水溶性カルボキシレートキレート化剤、例えばクエン酸の混合物が含まれる。
【０１８３】
顆粒組成物において利用するためのビルダー系の一部を構成しうるその他のビルダー材料には無機材料、例えばアルカリ金属カーボネート、ビカーボネート、シリケート、並びに有機材料、例えば有機ホスホネート、アミノポリアルキレンホスホネート及びアミノポリカルボキシレートが挙げられる。
【０１８４】
その他の適当な水溶性有機塩はホモ又はコポリマー酸又はその塩であり、そのポリカルボン酸は２個以下の炭素原子により互いと隔てられた少なくとも２個のカルボキシル基を含んで成る。
【０１８５】
このタイプのポリマーはＧＢ−Ａ−１，５９６，７５６に開示されている。かかる塩の例はＭＷ２０００〜５０００のポリアクリレート及び無水マレイン酸とのそれらのコポリマーであり、かかるコポリマーは２０，０００〜７０，０００、特に約４０，０００の分子量を有する。
【０１８６】
洗浄ビルダー系は通常この組成物の５〜８０重量％の量で含まれている。液体洗剤のためのビルダーの好適なレベルは５〜３０重量％である。
【０１８７】
酵素
好適な洗剤組成物は、本発明の酵素製剤に加えて、洗浄性能及び／又は布帛ケアー長所を供するその他の酵素を含んで成る。
【０１８８】
かかる酵素にはその他のプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ（例えばラッカーゼ）が含まれる。
【０１８９】
プロテアーゼ： アルカリ溶液において利用するのに適当な任意のその他のプロテアーゼが利用できる。適当なプロテアーゼには動物、植物又は微生物起源のものが挙げられる。微生物起源が好ましい。化学的又は遺伝子的に修飾された突然変異体が含まれる。このプロテアーゼはセリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼであってよい。アルカリプロテアーゼの例はスブチリシン、特にバチルス由来のもの、例えばスブチリシンＮｏｖｏ、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシン３０９、スブチリシン１４７及びスブチリシン１６８（ＷＯ ８９／０６２７９に記載）である。トリプシン様プロテアーゼの例はトリプシン（例えばブタ又はウシ起源）、及びＷＯ ８９／０６２７０に記載のフサリウム（Fusarium）プロテアーゼである。
【０１９０】
好適な市販のプロテアーゼ酵素には、Novo Nordisk A/S（デンマーク）より商標Ａｌｃａｌａｓｅ，Ｓａｖｉｎａｓｅ，Ｐｒｉｍａｓｅ， Ｄｕｒａｚｙｍ及びＥｓｐｅｒａｓｅで販売されているもの、Genencor Internationalにより商標Ｍａｘａｔａｓｅ，Ｍａｘａｃａｌ，Ｍａｘａｐｅｍ，Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ，Ｐｕｒａｆｅｃｔ及びＰｕｒａｆｅｃｔ ＯＸＰで販売されているもの、並びにSolvay Enzymesより商標Opticlean and Optimaseで販売されているものが挙げられる。プロテアーゼ酵素は本発明に係る組成物の中に当該組成物の０．００００１〜２重量％の酵素タンパク質のレベル、好ましくは当該組成物の０．０００１〜１重量％の酵素タンパク質のレベル、より好ましくは当該組成物の０．００１〜０．５重量％の酵素タンパク質のレベル、更により好ましくは当該組成物の０．０１〜０．２重量％の酵素タンパク質のレベルで含ませてよい。
【０１９１】
リパーゼ： アルカリ溶液において利用するのに適当な任意のリパーゼを使用してよい。適当なリパーゼには細菌又は菌類起源のものが含まれる。化学的又は遺伝子的に修飾された突然変異体が含まれる。
【０１９２】
有用なリパーゼの例には、Humicola lanuqinosa リパーゼ（例えばＥＰ ２５８ ０６８及びＥＰ ３０５ ２１６に記載）、Rhizomucor miehei リパーゼ（例えばＥＰ ２３８ ０２３に記載）、Candida リパーゼ、例えばC. antarctica リパーゼ、例えばC. antarctica リパーゼＡ又はＢ（ＥＰ ２１４ ７６１に記載）、Pseudomonas リパーゼ、例えばP. alcaliqenes及びP. pseudoalcaliqenesリパーゼ（例えばＥＰ ２１８ ２７２に記載）、P. cepaciaリパーゼ（例えばＥＰ ３３１ ３７６に記載）、P. stutzeri リパーゼ（例えばＧＢ １，３７２，０３４に記載）、P. fluorescensリパーゼ、Bacillusリパーゼ、例えばB. subtilis リパーゼ（Dartois ら (1993), Biochemica et Biophysica acta 1131, 253-260）、B. stearothermophilus リパーゼ（ＪＰ ６４／７４４９９２）及びB. pumilusリパーゼ（ＷＯ ９１／１６４２２）が挙げられる。
【０１９３】
更に、いくつかのクローニングされたリパーゼ、例えばPenicillium camembertii リパーゼ（Yamaguchi ら (1991), Gene 103, 61-67）、Geotricum candidumリパーゼ（Schimada, Y.ら (1989), J.Biochem., 106, 383-388 ）及び様々なRhizopusリパーゼ、例えばR. delemarリパーゼ（Hass, M.J ら (1991), Gene 109, 117-113）、R. niveus リパーゼ（Kugimiyaら (1992), Biosci.Biotech.Biochem. 56, 716-719）及びR. oryzae リパーゼが有用でありうる。
【０１９４】
その他のタイプの脂質分解酵素、例えばクチナーゼ、例えばPseudomonas mendocina 由来のクチナーゼ（ＷＯ ８８／０９３６７）又はFusarium solani pisi由来のクチナーゼ（例えばＷＯ ９０／０９４４６に記載）も有用でありうる。
【０１９５】
特に適切なリパーゼはリパーゼ、例えばＭ１ Ｌｉｐａｓｅ^TM，Ｌｕｍａｆａｓｔ^TM及びＬｉｐｏｍａｘ^TM（Genecor ）、Ｌｉｐｏｌａｓｅ^TM及びＬｉｐｏｌａｓｅ Ｕｌｔｒａ^TM（Novo Nordisk A/S）及びＬｉｐａｓｅ Ｐ「Amano 」（Amano Pharmaceutical Co. Ltd. ）である。
【０１９６】
リパーゼは通常この洗剤組成物の中に、当該組成物の０．００００１〜２重量％の酵素タンパク質のレベル、好ましくは当該組成物の０．０００１〜１重量％の酵素タンパク質のレベル、より好ましくは当該組成物の０．００１〜０．５重量％の酵素タンパク質のレベル、更により好ましくは当該組成物の０．０１〜０．２重量％の酵素タンパク質のレベルで含ませる。
【０１９７】
アミラーゼ： アルカリ溶液に利用するのに適当な任意のアミラーゼ（α及び／又はβ）が利用できうる。適当なアミラーゼは細菌又は菌類起源のものが含まれる。化学的又は遺伝子的に修飾された突然変異体が含まれる。アミラーゼには、例えば、ＧＢ １，２９６，８３９号により詳細に記載されたB. licheniformisの特殊な株から得たα−アミラーゼが挙げられる。市販のアミラーゼはＤｕｒａｍｙｌ^TM，Ｔｅｒｍａｍｙｌ^TM，Ｆｕｎｇａｍｙｌ^TM及びＢＡＮ^TM（Novo Nordisk A/Sより入手可能）及びＲａｐｉｄａｓｅ^TM及びＭａｘａｍｙｌ Ｐ^TM（Genencorより入手可能）である。
【０１９８】
アミラーゼは通常この洗剤組成物の中に、当該組成物の０．００００１〜２重量％の酵素タンパク質のレベル、好ましくは当該組成物の０．０００１〜１重量％の酵素タンパク質のレベル、より好ましくは当該組成物の０．００１〜０．５重量％の酵素タンパク質のレベル、更により好ましくは当該組成物の０．０１〜０．２重量％の酵素タンパク質のレベルで含ませる。
【０１９９】
セルラーゼ： アルカリ溶液に利用できる任意のセルラーゼが利用できる。適当なセルラーゼは細菌又は菌類起源のものが含まれる。化学的又は遺伝子的に修飾した突然変異体が含まれる。適当なセルラーゼは米国特許第４，４３５，３０７号に開示され、それはHumicola insolens から生産された菌類セルラーゼを開示する。特に適切なセルラーゼはカラーケアー長所を有するセルラーゼである。かかるセルラーゼの例はヨーロッパ特許出願第０，４９５，２５７号に記載されている。
【０２００】
市販のセルラーゼにはHumicola insolens （Novo Nordisk A/S）の株により生産されるＣｅｌｌｕｚｙｍｅ^TM及びＫＡＣ−５００（Ｂ）^TM（Kao Corporation ）が挙げられる。
【０２０１】
セルラーゼは通常この洗剤組成物の中に、当該組成物の０．００００１〜２重量％の酵素タンパク質のレベル、好ましくは当該組成物の０．０００１〜１重量％の酵素タンパク質のレベル、より好ましくは当該組成物の０．００１〜０．５重量％の酵素タンパク質のレベル、更により好ましくは当該組成物の０．０１〜０．２重量％の酵素タンパク質のレベルで含ませる。
【０２０２】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ： ペルオキシダーゼ酵素は過酸化水素又はその起源（例えばパーカーボネート、パーボレート又はパースルフェート）と組合せて使用する。オキシダーゼ酵素は酸素と組合せて使用する。両タイプの酵素は、好ましくは例えばＷＯ ９４／１２６２１及びＷＯ ９５／０１４２６に記載の通り増強剤と一緒になって、「溶液の漂白」、即ち、繊維染料が染色布帛から別の布帛へとその布帛を洗浄液と一緒に洗濯するときに移るのを防ぐために利用する。適当なペルオキシダーゼ／オキシダーゼには植物、細菌又は菌類起源のものが含まれる。化学的又は遺伝子的に修飾された突然変異体が含まれる。
【０２０３】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼは通常この洗剤組成物の中に、当該組成物の０．００００１〜２重量％の酵素タンパク質のレベル、好ましくは当該組成物の０．０００１〜１重量％の酵素タンパク質のレベル、より好ましくは当該組成物の０．００１〜０．５重量％の酵素タンパク質のレベル、更により好ましくは当該組成物の０．０１〜０．２重量％の酵素タンパク質のレベルで含ませる。
【０２０４】
上記の酵素の混合物、特にプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ及び／又はセルラーゼの混合物が本発明に包含される。
【０２０５】
本発明の酵素又は任意のその他の酵素は通常この洗剤組成物の中に、当該組成物の０．００００１〜２重量％の酵素タンパク質のレベル、好ましくは当該組成物の０．０００１〜１重量％の酵素タンパク質のレベル、より好ましくは当該組成物の０．００１〜０．５重量％の酵素タンパク質のレベル、更により好ましくは当該組成物の０．０１〜０．２重量％の酵素タンパク質のレベルで含ませる。
【０２０６】
漂白剤
本発明の洗剤組成物の中に含ませることのできる更なる任意的な洗浄成分には漂白剤、例えばＰＢ１，ＰＢ４及び４００〜８００ミクロンの粒径を有するパーカーボネートが挙げられる。このような漂白剤成分には１又は複数種の酸素漂白剤と、選定の漂白剤に依存して、１又は複数の漂白活性化剤が含まれる。存在しているなら、酸素漂白化合物は一般に約１〜約２５重量％のレベルで存在するであろう。一般に、漂白化合物は非液体製剤、例えば顆粒洗剤の中に任意的に付加される成分である。
【０２０７】
ここで利用するための漂白剤成分は当業界に公知の酸素漂白剤及びその他を含む洗剤組成物に有用な任意の漂白剤であってよい。
ここで使用するために適当な漂白剤は活性化又は非活性化漂白剤でありうる。
【０２０８】
利用できうる酸素漂白剤の一のカテゴリーは過カルボン酸漂白剤及びその塩を包括しうる。このクラスの剤の適当な例にはマグネシウムモノペルオキシフタレート六水和物、メタクロロ過安息香酸のマグネシウム塩、４−ノニルアミノ−４−オキソペルオキシ酪酸及びジペルオキシドデカンジオン酸が挙げられる。かかる漂白剤は米国特許第４，４８３，７８１号、同７４０，４４６号、ＥＰ ０，１３３，３５４号及び米国特許第４，４１２，９３４号に開示されている。極めて好適な漂白剤には米国特許第４，６３４，５５１号に記載の６−ノニルアミノ−６−オキソペルオキシカプロン酸も含まれる。
【０２０９】
利用できうる漂白剤のその他のカテゴリーはハロゲン漂白剤を包含する。次亜ハロゲン化酸漂白剤の例は、例えばトリクロロイソシアヌル酸並びにナトリウム及びカリウムジクロロイソシアヌレート並びにＮ−クロロ及びＮ−ブロモアルカンスルホンアミドである。かかる材料は通常最終製品の０．５〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％で加えられる。
【０２１０】
過酸化水素放出剤を漂白活性化剤、例えばアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、ノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ、米国特許第４，４１２，９３４号に記載）、３，５−トリメチルヘキサノールオキシベンゼンスルホネート（ＩＳＯＮＯＢＳ、ＥＰ １２０ ５９１に記載）又はペンタアセチルグルコース（ＰＡＧ）と組合せて使用してよく、それらは過加水分解されて活性漂白物質としての過酸を生成し、向上した漂白効果が得られる。更に、極めて適切なのは漂白活性化剤Ｃ８（６−オクタンアミド−カプロイル）オキシベンゼン−スルホネート、Ｃ９（６−ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネート及びＣ１０（６−デカンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネート又はそれらの混合物である。更に適当な活性化剤はアシル化クエン酸エステル、例えばヨーロッパ特許出願第９１８７０２０７．７に開示のものである。
【０２１１】
本発明に係る洗浄組成物において利用するために有用な漂白剤、例えばペルオキシ酸、並びに漂白活性化剤及び過酸素漂白化合物を含んで成る漂白系は出願ＵＳＳＮ ０８／１３６，６２６号に記載されている。
【０２１２】
過酸化水素は洗浄及び／又はすすぎ工程の開始又は最中にて過酸化水素の発生できる酵素系（即ち、酵素とその基質）を加えることによって存在させることもできる。かかる酵素系はヨーロッパ特許出願ＥＰ ０，５３７，３８１号に開示されている。
【０２１３】
酸素漂白剤以外の漂白剤も当業界において公知であり、そして本明細書において利用できうる。特に注目の一のタイプの非酸素漂白剤には光活性化漂白剤、例えばスルホン化亜鉛及び／又はアルミニウムフタロシアニンが挙げられる。このような材料は洗浄工程の際には基材に沈着させることができる。光を照射することで、酸素の存在下で、例えば服を日光のもとで干して乾かすとき、このスルホン化亜鉛フタロシアニンは活性化され、その結果基材は漂白される。好適な亜鉛フタロシアニン及び光活性化漂白工程は米国特許第４，０３３，７１８号に記載されている。典型的には、洗剤組成物は約０．０２５〜約１．２５重量％のスルホン化亜鉛フタロシアニンを含むであろう。
【０２１４】
漂白剤は更にマンガン触媒も含んで成りうる。マンガン触媒は例えば「Efficient manganese catalysts for low temperature Heaching」, Nature 369 , 1994, pp.637-639に記載のもののいずれかであってよい。
【０２１５】
泡立抑制剤
別の任意の成分は泡立抑制剤であり、典型的にはシリコーン及びシリカ−シリコーン混合物である。シリコーンは一般にアルキル化ポリシロキサン材料であり、一方シリカは通常シリカエアロゲル及びキセロゲル、並びに様々なタイプの疎水性シリカにより例示の通り微細に分割された形態で利用される。これらの材料は粒子として組込んでよく、それにおいては泡立抑制剤は好都合には水溶性又は水分散性の実質的に非界面活性の洗剤不浸透性担体の中に解放式に組込まれる。他方、この泡立抑制剤は液体担体の中に溶解又は分散させ、次いで１又は複数のその他の成分上にスプレーすることにより塗布してよい。
【０２１６】
好適なシリコーン泡立抑制剤は米国特許第３，９３３，６７２号に開示されている。その他の極めて有用な泡立抑制剤はドイツ国特許出願ＤＴＯＳ ２，６４６，１２６号に記載の自己乳化シリコーン泡立抑制剤である。かかる化合物の例はDow Corning より市販のＤＣ−５４４であり、それはシロキサン−グリコールコポリマーである。特に好適な泡立抑制剤はシリコーン油と２−アルキルアルカノールとの混合物を含んで成る泡立抑制系である。適当な２−アルキル−アルカノールは２−ブチル−オクタノールであり、それは商標Ｉｓｏｆｏｌ １２Ｒで市販されている。
【０２１７】
かかる泡立抑制系はヨーロッパ特許出願ＥＰ ０，５９３，８４１号に記載されている。
【０２１８】
特に好適なシリコーン泡立抑制剤はヨーロッパ特許出願第９２２０１６４９．８に記載されている。前記組成物はヒュームド非孔質シリカ、例えばＡｅｒｏｓｉｌ^R と組合さったシリコーン／シリカ混合物を含んで成りうる。
【０２１９】
上記の泡立抑制剤は通常当該組成物の０．００１〜２重量％、好ましくは０．０１〜１重量％のレベルで使用する。
【０２２０】
その他の成分
洗剤組成物の中に使用されるその他の成分には、例えば汚れ懸濁剤、汚れ遊離剤、蛍光増白剤、研磨剤、殺菌剤、曇り阻害剤、着色剤、及び／又は封入もしくは非封入香料が挙げられうる。
【０２２１】
特に適当な封入材はＧＢ １，４６４，６１６号に記載の如き多糖とポリヒドロキシ化合物のマトリックスから成る水溶性カプセルである。
【０２２２】
その他の適当な水溶性封入材にはＵＳ ３，４５５，８３８号に記載の如き置換化ジカルボン酸の非糊化デンプン酸エステルに由来するデキストリンが含まれる。このような酸−エステルデキストリンは、好ましくは、デンプン、例えばモチトウモロコシ、モチモロコシ、サゴ、タピオカ及びポテトから調製される。かかる封入材料の適当な例にはNational Starch により製造されたＮ−ｌｏｋが挙げられる。このデンプンは一価の置換基、例えばオクテニル無水コハク酸を添加することにより修飾される。
【０２２３】
ここに適当な再付着防止剤及び汚れ懸濁剤にはセルロース誘導体、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロース、並びにホモ−又はコ−ポリマーポリカルボン酸又はその塩が挙げられる。このタイプのポリマーにはビルダーとして前述したポリアクリレート及び無水マレイン酸−アクリル酸コポリマー、並びに無水マレイン酸とエチレン、メチルビニルエーテル又はメタクリル酸とのコポリマーが挙げられ、ここでこの無水マレイン酸はこのコポリマーの少なくとも２０モル％を占める。このような材料は通常当該組成物の０．５〜１０重量％、より好ましくは０．７５〜８重量％、最も好ましくは１〜６重量％のレベルで使用する。
【０２２４】
好適な蛍光増白剤はアニオン性であり、その例は二ナトリウム４，４′−（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２′ジスルホネート、二ナトリウム４，−４′−ビス（２−モルホリノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ−スチルベン−２：２′−ジスルホネート、二ナトリウム４，４′−ビス（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２′ジスルホネート、一ナトリウム４′，４″−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２−スルホネート、二ナトリウム４，４′−ビス−（２−アニリノ−４−（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２′−ジスルホネート、二ナトリウム４，４′−ビス−（４−フェニル−２，１，３−トリアゾール−２−イル）−スチルベン−２，２′−ジスルホネート、二ナトリウム４，４′ビス（２−アニリノ−４−（１−メチル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２′ジスルホネート、ナトリウム２（スチルビル−４″−（ナフト−１′，２′：４，５）−１，２，３−トリアゾール−２″−スルホネート及び４，４′−ビス（２−スルホスチリル）ビフェニルである。
【０２２５】
その他の有用なポリマー材料はポリエチレングリコール、特に分子量１０００〜１００００、より特には２０００〜８０００、そして最も好ましくは約４０００のものである。これらは０．２０〜５重量％、より好ましくは０．２５〜２．５重量％のレベルで使用する。これらのポリマー及び前述のホモ又はコポリマーカルボキシレート塩は白色度の維持、布帛灰沈着、並びに遷移金属不純物の存在下での粘土、タンパク質性及び酸化性汚れに対する洗浄性能の改善に有用である。
【０２２６】
本発明の組成物において有用な汚れ遊離剤は様々な配列でのテレフタル酸とエチレングリコール及び／又はプロピレングリコール単位との慣用のコポリマー又はターポリマーである。かかるポリマーの例は米国特許４，１１６，８８５及び４，７１１，７３０、及びＥＰ ０，２７２，０３３号に開示されている。ＥＰ ０，２７２，０３３号に従う特に好適なポリマーは次式を有する
（ＣＨ₃ （ＰＥＧ）₄₃）_0.75（ＰＯＨ）_0.25〔（Ｔ−ＰＯ）_2.8 （Ｔ−ＰＥＧ）_0.4 〕Ｔ（ＰＯＨ）_0.25（（ＰＥＧ）₄₃ＣＨ₃ ）_0.75
ここでＰＥＧは−（ＯＣ₂ Ｈ₄ ）Ｏ−、ＰＯは（ＯＣ₃ Ｈ₆ Ｏ）そしてＴは（ｐＯＯＣ₆ Ｈ₄ ＣＯ）である。
【０２２７】
更に非常に有用なのはジメチルテレフタレート、ジメチルスルホイソフタレート、エチレングリコール及び１，２−プロパンジオールのランダムコポリマーとしての修飾ポリエステルであり、その末端基は第一にスルホベンゾエート、そして第二にエチレングリコール及び／又は１，２−プロパンジオールのモノエステルから成る。その狙いは両端においてスルホベンゾエート基によりキャッピングされているものの獲得であり、「主として」、本発明との関連で、かかるコポリマーのほとんどはスルホベンゾエート基によりエンドキャッピングされている。しかしながら、一部のコポリマーは完全にキャッピングされておらず、それ故その末端基はエチレングリコール及び／又は１，２−プロパンジオールのモノエステルから成ってよく、それ故「第二」のかかる物質から成ってよい。
【０２２８】
ここで特定のポリエステルは約４６重量％のジメチルテレフタル酸、約１６重量％の１，２−プロパンジオール、約１０重量％のエチレングリコール、約１３重量％のジメチルスルホ安息香酸及び約１５重量％のスルホイソフタル酸を含み、そして約３，０００の分子量を有する。このポリエステル及びその調製方法はＥＰ ３１１，３４２に詳細に記載されている。
【０２２９】
柔軟剤： 布帛柔軟剤も本発明に係る洗濯洗剤組成物の中に含ませることができる。これらの剤は無機又は有機のタイプであってよい。無機柔軟剤はＧＢ−Ａ−１ ４００８９８及びＵＳ ５，０１９，２９２に開示のスメクタイト粘土で例示される。有機布帛柔軟剤にはＧＢ−Ａ１ ５１４，２７６及びＥＰ ０，０１１，３４０に開示の水不溶性第三アミンが挙げられ、そしてモノＣ₁₂−Ｃ₁₄第四アンモニウム塩とのそれらの組合せがＥＰ−Ｂ ０，０２６，５２８に開示され、そしてジ長鎖アミドがＥＰ ０，２４２，９１９に開示されている。布帛柔軟系のその他の有用な有機成分にはＥＰ ０，２９９，５７５及び０，３１３，１４６号に開示の高分子量のポリエチレンオキシド材料が挙げられる。
【０２３０】
スメクタイト粘土のレベルは通常、５〜１５重量％、より好ましくは８〜１２重量％に範囲し、この材料は当該製剤の残りに乾燥混合成分として加える。有機布帛柔軟剤、例えば水不溶性第三アミン又はジ長鎖アミド材料は０．５〜５重量％、通常は１〜３重量％のレベルで組込まれ、一方高分子量ポリエチレンオキシド材料及び水溶性カチオン材料は０．１〜２重量％、通常は０．１５〜１．５重量％のレベルで加える。このような材料は通常当該組成物のスプレー乾燥部に加えられるが、ある状況では乾燥混合粒体としてそれらを加える方が好都合なときがあり、又は当該組成物のその他の固体成分に対して溶融液体としてスプレーする方が好都合なときがある。
【０２３１】
ポリマー染料転移阻害剤： 本発明に係る洗剤組成物は更に０．００１〜１０重量％、好ましくは０．０１〜２重量％、より好ましくは０．０５〜１重量％のポリマー染料転移阻害剤を含んで成りうる。かかるポリマー染料転移阻害剤は通常着色布帛からそれと一緒に洗濯する布帛上への染料の転移を阻害するために洗剤組成物に含ませる。このようなポリマーは、染料が洗浄液中のその他の物品に付着する機会をもつ前に染色布帛から洗い出される不堅牢染料と錯形成又はそれに収着する能力を有する。
【０２３２】
極めて適当なポリマー染料転移阻害剤はポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドン及びＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール、又はそれらの混合物である。
【０２３３】
かかるポリマーの添加は本発明に係る酵素の性能を更に高める。
【０２３４】
本発明に係る洗剤組成物は液体、ペースト、ゲル、バー又は顆粒形態であってよい。
【０２３５】
無塵顆粒は例えばＵＳ ４，１０６，９９１及び４，６６１，４５２（共にNovo Industri A/S ）に開示されるように製造でき、そして任意的に当業界公知の方法によりコーティングしてよい。ワキシコーティング材料の例は平均分子量１０００〜２００００のポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０個のエチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；エトキシル化脂肪アルコールであってそのアルコールが１２〜２０個の炭素原子を含み、且つ１５〜８０個のエチレンオキシド単位のあるもの；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−及びジ−及びトリグリセリドである。流動床技術による適用に適するフィルム形成コーティング材料の例がＧＢ １４８３５９１に示されている。
【０２３６】
本発明に係る顆粒組成物は「コンパクト形態」であってもよく、即ち、慣用の顆粒洗剤よりも比較的高い密度、即ち、５５０〜９５０ｇ／ｌを有し得るものであってよい。このような場合、本発明に係る顆粒洗剤組成物は慣用の顆粒洗剤と比べて少量の「無機充填塩」を含むであろう。典型的な充填塩は硫酸塩及び塩化物のアルカリ土類金属塩、典型的には硫酸ナトリウムである。「コンパクト」洗剤は一般に１０％以下の充填塩を含んで成るであろう。本発明に係る液体組成物は「濃縮形態」であってもよく、かかる場合、本発明に係る液体洗剤組成物は慣用の液体洗剤と比べ、少量の水を含むであろう。典型的には、この濃縮液体洗剤の水分含量は当該洗剤組成物の３０重量％未満、より好ましくは２０重量％未満、最も好ましくは１０重量％未満である。
【０２３７】
本発明の組成物は、例えば、手洗い及び洗濯機用の洗剤組成物、例えば洗濯添加組成物として、並びに染色布帛の予備処理、リンス付加布帛柔軟組成物において利用するのに適当な組成物、並びに一般の家庭用硬質面洗浄作業及び皿洗作業に利用するための組成物として配合されうる。
【０２３８】
以下の実施例は例示であり、本発明を限定するものではない。
【０２３９】
洗剤組成物において、略語成分表示は以下の意味を有する：
ＬＡＳ： ナトリウム線形Ｃ₁₂アルキルベンゼンスルフェート
ＴＡＳ： ナトリウム獣脂アルキルスルフェート
ＸＹＡＳ： ナトリウムＣ_1x−Ｃ_1yアルキルスルフェート
ＳＳ： 式２−ブチルオクタン酸の第二石けん界面活性剤
２５ＥＹ： 平均Ｙモルのエチレンオキシドと縮合したＣ₁₂−Ｃ₁₅の主として
線形な第一アルコール
４５ＥＹ： 平均Ｙモルのエチレンオキシドと縮合したＣ₁₄−Ｃ₁₅の主として
線形な第一アルコール
ＸＹＥＺＳ： モル当り平均Ｚモルのエチレンオキシドと縮合したＣ_1X−Ｃ_1Yナ
トリウムアルキルスルフェート
非イオン性： ３．８の平均エトキシル化度及び４．５の平均プロポキシル化度
を有するＣ₁₃−Ｃ₁₅複合エトキシル化／プロポキシル化脂肪アル
コール；BASF GmbH より商標名Ｐｌｕｒａ ｆａｘ ＬＦ４０４
で販売
ＣＦＡＡ： Ｃ₁₂−Ｃ₁₄アルキルＮ−メチルグルカミド
ＴＦＡＡ： Ｃ₁₆−Ｃ₁₈アルキルＮ−メチルグルカミド
シリケート： 非晶質珪酸ナトリウム（ＳｉＯ₂ ：Ｎａ₂ Ｏ比＝２．０）
【０２４０】
ＮａＳＫＳ−６：式δ−Ｎａ₂ Ｓｉ₂ Ｏ₃ の結晶層状シリケート
カーボネート：非晶質炭酸ナトリウム
ホスフェート：トリポリリン酸ナトリウム
ＭＡ／ＡＡ： １：４のマレイン酸／アクリル酸のコポリマー、平均分子量約８
０，０００
ポリアクリレート：平均分子量８，０００を有するポリアクリレートホモポリマ
ー、BASF GmbH により商標ＰＡ３０で販売
ゼオライトＡ：式Ｎａ₁₂（Ａｌ₂ ＳｉＯ₂ ）₁₂・２７Ｈ₂ Ｏの水和ナトリウムア
ルミノシリケート、１〜１０マイクロメーターの範囲の主要粒径
を有する
クエン酸塩： クエン酸三ナトリウム・二水和物
クエン酸： クエン酸
パーボレート：無水過硼酸ナトリウム一水和物漂白剤、実験式ＮａＢＯ₂ ・Ｈ₂
Ｏ₂
ＰＢ４： 無水過硼酸ナトリウム四水和物
パーカーボネート：無水過炭酸ナトリウム漂白剤、実験式２Ｎａ₂ ＣＯ₃ ・３Ｈ
₂ Ｏ₂
ＴＡＥＤ： テトラアセチルエチレンジアミン
ＣＭＣ： ナトリウムカルボキシメチルセルロース
ＤＥＴＰＭＰ：ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）、Monsato
より商標Ｄｅｑｕｅｓｔ ２０６０で販売
ＰＶＰ： ポリビニルピロリドンポリマー
ＥＤＤＳ： ナトリウム形態のエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ′−二コハク酸、
〔Ｓ，Ｓ〕異性体
泡立抑制剤： ２５％のパラフィンワックスmp５０℃、１７％の疎水性シリカ、
５８％のパラフィン油
顆粒泡立抑制剤：１２％のシリコーン／シリカ、１８％のステアロイルアルコー
ル、７０％のスターチ、顆粒形態
スルフェート： 無水硫酸ナトリウム
ＨＭＷＰＥＯ： 高分子量ポリエチレンオキシド
ＴＡＥ２５： 獣脂アルコールエトキシレート（２５）
【０２４１】
洗剤例Ｉ
本発明に係る顆粒布帛洗浄組成物は下記の通りに調製されうる：
ナトリウム線形Ｃ₁₂アルキル ６．５
ベンゼンスルホネート
硫酸ナトリウム １５．０
ゼオライトＡ ２６．０
ナトリウムニトリロトリアセテート ５．０
本発明の酵素 ０．１
ＰＶＰ ０．５
ＴＡＥＤ ３．０
硼酸 ４．０
パーボレート １８．０
フェノールスルホネート ０．１
微量成分 １００まで
【０２４２】
洗剤例 II
本発明に係るコンパクト顆粒布帛洗浄組成物（密度８００ｇ／ｌ）は下記の通りにして調製できうる：
４５ＡＳ ８．０
２５Ｅ３Ｓ ２．０
２５Ｅ５ ３．０
２５Ｅ３ ３．０
ＴＦＡＡ ２．５
ゼオライトＡ １７．０
ＮａＳＫＳ−６ １２．０
クエン酸 ３．０
カーボネート ７．０
ＭＡ／ＡＡ ５．０
ＣＭＣ ０．４
本発明の酵素 ０．１
ＴＡＥＤ ６．０
パーカーボネート ２２．０
ＥＤＤＳ ０．３
顆粒泡立抑制剤 ３．５
水／微量成分 １００％まで
【０２４３】
洗剤例 III
着色布帛の洗濯に極めて有用な本発明に係る顆粒布帛洗浄組成物は下記の通りにして調製し得る：
ＬＡＳ １０．７ −
ＴＡＳ ２．４ −
ＴＦＡＡ − ４．０
４５ＡＳ ３．１ １０．０
４５Ｅ７ ４．０ −
２５Ｅ３Ｓ − ３．０
６８Ｅ１１ １．８ −
２５Ｅ５ − ８．０
クエン酸塩 １５．０ ７．０
カーボネート − １０
クエン酸 ２．５ ３．０
ゼオライトＡ ３２．１ ２５．０
Ｎａ−ＳＫＳ−６ − ９．０
ＭＡ／ＡＡ ５．０ ５．０
ＤＥＴＰＭＰ ０．２ ０．８
本発明の酵素 ０．１０ ０．０５
シリケート ２．５ −
スルフェート ５．２ ３．０
ＰＶＰ ０．５ −
ポリ（４−ビニルピリジン）−Ｎ− − ０．２
オキシド／ビニルイミダゾールとビ
ニルピロリドンとのコポリマー
パーボレート １．０ −
フェノールスルホネート ０．２ −
水／微量成分 １００％まで
【０２４４】
洗剤例 IV
「洗浄柔軟仕上げ」能力を供する本発明に係る顆粒布帛洗浄組成物は下記のように調製し得る：
４５ＡＳ − １０．０
ＬＡＳ ７．６ −
６８ＡＳ １．３ −
４５Ｅ７ ４．０ −
２５Ｅ３ − ５．０
ココ−アルキル−ジメチルヒドロキ １．４ １．０
シ−エチルアンモニウムクロリド
クエン酸塩 ５．０ ３．０
Ｎａ−ＳＫＳ−６ − １１．０
ゼオライトＡ １５．０ １５．０
ＭＡ／ＡＡ ４．０ ４．０
ＤＥＴＰＭＰ ０．４ ０．４
パーボレート １５．０ −
パーカーボネート − １５．０
ＴＡＥＤ ５．０ ５．０
スメクタイト粘土 １０．０ １０．０
ＨＭＷＰＥＯ ． ０．１
本発明の酵素 ０．１０ ０．０５
シリケート ３．０ ５．０
カーボネート １０．０ １０．０
粒径泡立抑制剤 １．０ ４．０
ＣＭＣ ０．２ ０．１
水／微量成分 １００％まで
【０２４５】
洗浄剤Ｖ
本発明に係るヘビーデューティー布帛洗浄組成物は下記の通りにして調製し得る：
Ｉ II
ＬＡＳ酸形態 − ２５．０
クエン酸 ５．０ ２．０
２５ＡＳ酸形態 ８．０ −
２５ＡＥ２Ｓ酸形態 ３．０ −
２５ＡＥ７ ８．０ −
ＣＦＡＡ ５ −
ＤＥＴＰＭＰ １．０ １．０
脂肪酸 ８ −
オレイン酸 − １．０
エタノール ４．０ ６．０
プロパンジオール ２．０ ６．０
本発明の酵素 ０．１０ ０．０５
ココ−アルキルジメチルヒドロキシ − ２．０
エチルアンモニウムクロリド
スメクタイト粘土 − ５．０
ＰＶＰ ２．０ −
水／微量成分 １００％まで
【０２４６】
レザー産業用途
本発明に係るスブチラーゼはレザー産業、特に皮の脱毛において特に有用である。
かかる用途において、本発明に係るスブチラーゼ変異体は別のプロテアーゼを更に含んで成る酵素組成物において好適に利用される。
【０２４７】
適当なその他のプロテアーゼのより詳細な説明については、洗剤組成物に利用するために適当な酵素に関する章を参照された（前掲）。
【０２４８】
ウール産業用途
本発明に係るスブチラーゼはウール産業、特にウールを含む服において特に有用である。
かかる用途において、本発明に係るスブチラーゼ変異体は別のプロテアーゼを更に含んで成る酵素組成物において好適に利用される。
【０２４９】
適当なその他のプロテアーゼのより詳細な説明については、洗剤組成物に利用するために適当な酵素に関する章を参照された（前掲）。
本発明を以下の限定でない実施例で更に説明する。
【０２５０】
材料と方法
株：
Ｂ．スブチリスＤＮ１８８５（Diderichsen ら、1990）
Ｂ．レンタス３０９及び１４７はバチルス・レンタスの特殊な株であり、ＮＣＩＢに寄託され、受託番号ＮＣＩＢ１０３０９及び１０１４７が付され、そして引用することで本明細書に組入れる米国特許第３，７２３，２５０号に記載されている。
【０２５１】
Ｅ．コリＭＣ１０００（M.J.Casadaban and S.N.Cohen (1980); J.Mol.Biol. 138 179-207 ）は慣用の方法によりｒ^- ，ｍ^- にされ、そして米国特許出願第０３９，２９８号に記載されている。
【０２５２】
プラスミド：
ｐＪＳ３：Ｅ．コリ−Ｂ．スブチリスシャトルベクターであり、スブチラーゼ３０９をコードする合成遺伝子を含む（Jacob Schiodt ら、Protein and Peptide Letters 3: 39-44 (1996) に記載）。
ｐＳＸ２２２：Ｂ．スブチリス発現ベクター（ＷＯ ９６／３４９４６に記載）。
【０２５３】
一般分子生物方法：
何らかのことわりのない限り、ＤＮＡ操作及び形質転換は分子生物学の標準的な方法を利用して実施した（Sambrookら (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M.ら (eds.) 「Current protocols in Molecular Biology」John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., and Cutting, S.M. (eds.)「Molecular Biological Methods for Bacillus 」John Wiley and Sons, 1990 ）。
【０２５４】
ＤＮＡ操作のための酵素は供給者の仕様書に従って利用した。
【０２５５】
ＤＮＡ操作のための酵素
何らかのことわりのない限り、ＤＮＡ操作のための酵素、例えば制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、等は全てNew England Bolas, Inc. より入手した。
【０２５６】
タンパク質分解活性
本発明との関連で、タンパク質分解活性はキロＮＯＶＯプロテアーゼ単位（ＫＮＰＵ）で示す。この活性は酵素標準品（ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標））に対して決定しており、そしてその決定は標準の条件、即ち、５０℃、pH８．３、反応時間９分、測定時間３分でのタンパク質分解酵素によるジメチルカゼイン（ＤＭＣ）溶液の消化を基準とする。ホルダーＡＦ２２０／１はNovo Nordisk A/S, Denmark より注文により入手でき、かかるホルダーは引用することで本明細書に組入れる。
【０２５７】
ＧＵは標準条件のもとで、４０℃で１５分のインキュベーション時間の間で、基質としてのＮ−アセチルカゼインを用い、１moleのグリシンに相当する量のＮＨ₂ 基を供するタンパク質酵素活性と定義する。
【０２５８】
酵素活性は可溶性基質スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニル−アラニン−パラニトロフェノールとの反応に従うＰＮＡアッセイを利用して測定することもできる。これはJournal of American Oil Chemists Society, Rothgeb, T.M., Goodlander, B.D., Garrison, P.H., and Smith, L.A., (1988 ）に記載されている。
【０２５９】
発酵：
スブチラーゼ酵素の発酵は、１００mlのＢＰＸ培地を含む５００mlのバッフルエーレンマイヤーフラスコの中で、ロータリー振盪台上で３０℃５日実施した。
従って、例えば２リットル培養液を生成するため、２０本のエーレンマイヤーフラスコを同時に発酵させた。
【０２６０】
培地：

【０２６１】
デンプンを培地の中でα−アミラーゼにより液化し、そしてこの培地を１２０℃で４５分加熱することにより滅菌する。滅菌後、この培地のpHをＮａＨＣＯ₃ の０．１Ｍに至る添加により９に調整する。
【０２６２】
実施例１
酵素変異体の構築及び発現
部位特異的突然変異誘発：
本発明に従い特異的な挿入を一の活性部位ループに施したスブチラーゼ３０９部位特異的変異体はDengら（Anal.Biochem. 200: 81-88 (1992) ）及びMarkvardsen ら（BioTechniques 18 (3): 371-372 (1995)）に各々記載の「固有部位削除（ＵＳＥ）」又は「ウラシル−ＵＳＥ」技術により作った。
【０２６３】
鋳型プラスミドはｐＪＳ３、又はスブチラーゼ３０９の変異体を含むその類似体とした。例えばＵＳＥ突然変異誘発をＧ９７ＧＡＳＧ挿入変異体の構築に特異的なオリゴヌクレオチドで実施し、最終Ｇ９７ＧＡＳＧスブチラーゼ３０９変異体を得た。
【０２６４】
ｐＪＳ３において構築したスブチラーゼ３０９変異体を次いで制限酵素ＫｐｎＩ及びＭｌｕＩを用いてＢ．スブチリスｐＳＸ２２２発現プラスミドの中にサブクローニングした。
【０２６５】
ランダム挿入を局部領域に挿入するための局部ランダム突然変異誘発：
局部ランダム突然変異誘発を実施するために用いた全体的な戦略は下記の通りとした：
突然変異誘発プライマー（オリゴヌクレオチド）を合成し、それは挿入により修飾すべきアミノ酸コドンに対応するヌクレオチドを除く修飾すべきＤＮＡ配列の部分に対応する。
【０２６６】
次に、得られる突然変異誘発プライマーを適当な対立プライマーによりＰＣＲ反応に用いた。得られるＰＣＲフラグメントを精製し、そして消化し、そしてＥ．コリ−Ｂ．スブチリス シャトルベクターにクローニングした。
【０２６７】
他方、そして必要なら、得られるＰＣＲフラグメントを第二ＰＣＲ反応においてプライマーとして第二の適当な対立プライマーと共に用い、かくしてこの突然変異した領域の消化及びシャトルベクターへのクローニングを行えるようにする。ＰＣＲ反応は通常の条件下で実施する。
【０２６８】
この戦略の後、局部ランダムライブラリーをＳＡＶＩＮＡＳＥにおいて構築し、ここで挿入は活性部位ループ領域の９５−１０３に導入した。
【０２６９】
突然変異／挿入は突然変異誘発プライマー（下記参照）により導入し、かくして４つのアミノ酸、Ｔｈｒ，Ｇｌｙ，Ａｌａ及びＳｅｒだけが各々２つのコドンにより表わされる（Ｒ＝５０％のＡ及びＧ；Ｓ＝５０％のＣ及びＧ；そしてＹ＝５０％のＣ及びＴ）。得られるＰＣＲフラグメントをプラスミドｐＪＳ３のＡｖｒII及びＮｏｔＩ部位にクローニングし、そして１０個のランダムに選定したＥ．コリコロニーを配列決定し、設計の突然変異を確認した。
【０２７０】
突然変異誘発プライマー（５′−CTA TAC GCT AAA GTC CTA GGG GCG RSY RSY RSY RSY RSY RSY RSY GTC AGC TCG ATT GCC CAA GG−３′（センス））をＰＣＲ反応において、ｐＪＳ３におけるＭｌｕＩ部位の下流に配置される適当なアンチセンス対立プライマー（例えば５′−CCC TTT AAC CGC ACA GCG TTT −３′（アンチセンス））及び鋳型としてのプラスミドｐＪＳ３と共に用いた。この得られるＰＣＲ生成物を制限酵素ＡｖｒII及びＮｏｔＩを利用することによりｐＪＳ３シャトルベクターにクローニングした。
【０２７１】
ｐＪＳ３の中に構築された局部ランダムライブラリーを次に制限酵素ＫｐｎＩ及びＭｌｕＩを利用してＢ．スブチリスｐＳＸ２２２発現ベクターの中にサブクローニングした。
【０２７２】
調製したライブラリーは約１００，０００個の独立クローン／ライブラリーを含んだ。
１０個のランダムに選定したコロニーを配列決定して設計の突然変異を確認した。
【０２７３】
本発明のスブチラーゼ変異体を精製するため、本発明の変異体を含んで成るＢ．スブチリスｐＳＸ２２２発現プラスミドをコンピテントＢ．スブチリス株に形質転換し、そして発酵を上記の通りにして１０μｇ／mlのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含む培地の中で行った。
【０２７４】
実施例２
酵素変異体の精製
この手順はスブチリシン１４７酵素、スブチリシン３０９酵素又はそれらの突然変異体の２リッタースケール発酵の精製を述べる。
【０２７５】
約１．６リットルの発酵培養液を１リットルのビーカーの中で５０００rpm で３５分遠心分離した。その上清液を１０％の酢酸を用いてpH６．５に調整し、そしてＳｅｉｔｚ Ｓｕｐｒａ Ｓ１００濾過プレートで濾過した。
【０２７６】
その濾液をＡｍｉｃｏｎ Ｓ１Ｙ１０ ＵＦカートリッジの付いたＡｍｉｃｏｎ ＣＨ２Ａ ＵＦユニットを用いて約４００mlに濃縮した。このＵＦ濃縮物を遠心分離し、そして濾過し、それから室温でバシトラシンアフィニティーカラムにpH７で収着させた。プロテアーゼをこのバシトラシンカラムから室温で０．０１Ｍのジメチルグルタル酸、０．１Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化カルシウムpH７のバッファー溶液中の２５％の２−プロパノール及び１Ｍの塩化ナトリウムで溶出させた。
【０２７７】
このバシトラシン精製工程からのプロテアーゼ活性を有する画分を合わせ、そして０．０１Ｍのジメチルグルタル酸、０．２Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化カルシウムpH６．５を含むバッファーで平衡にした７５０mlのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（直径５cm）に載せた。
【０２７８】
このＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムからのタンパク質分解活性を有する画分を合わせ、そして０．０１Ｍのジメチルグルタル酸、０．２Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化カルシウム、pH６．５を含むバッファーで平衡にした１５０mlのＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ ６Ｂ陽イオン交換カラム（直径５cm）に載せた。
【０２７９】
プロテアーゼは同バッファー２リットル中の０〜０．１Ｍの塩化ナトリウムの線形勾配（スブチリシン１４７の場合は０−０．２Ｍの塩化ナトリウム）を利用して溶出させた。
【０２８０】
最終精製工程において、プロテアーゼ含有のＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの画分を合わせ、そしてＧＲ８１ＰＰ膜（Danish Sugar Factories, Inc.由来）の付いたＡｍｉｃｏｎ限外濾過セルで濃縮した。
【０２８１】
構築についての実施例１の技術及び上記の単離手順を利用することにより、下記のスブチリシン３０９変異体が製造、単離された：
３７．０３：Ｇ９７ＧＡＳＧ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ＋Ｇ１００Ａ＋Ｓ１０１Ａ；
３７．０６：Ｇ９７ＧＡＡ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ＋Ｓ１０１Ｔ；及び
３７．０４：Ｇ９７ＧＡＳ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ。
【０２８２】
実施例３
酵素変異体を含んで成る洗剤組成物の洗浄性能
下記の例は表示の条件下で実施したいくつかの洗浄試験の結果である。
【０２８３】
実験条件

【０２８４】
使用する洗剤は簡単なモデル製剤とする。pHは１０．５に調整し、それは粉末洗剤の通常の範囲内にある。モデル洗剤の組成は下記の通りである：
ＳＴＰ（Ｎａ₅ Ｐ₃ Ｏ₁₀） ２５％
Ｎａ₂ ＳＯ₄ ２５％
Ｎａ₂ ＣＯ₃ １０％
ＬＡＳ（Ｎａｎｓａ ８０Ｓ） ２０％
非イオン性界面活性剤（Ｄｏｂａｎｏｌ ２５−７） ５．０％
Ｎａ₂ Ｓｉ₂ Ｏ₅ ５．０％
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ） ０．５％
水 ９．５％
【０２８５】
水硬度はＣａＣｌ₂ 及びＭｇＣｌ₂ （Ｃａ²⁺：Ｍｇ²⁺＝２：１）を脱イオン水に加えることにより調整した（Surfactants in Consumer Products - Theory, Technology and Application, Springer Verlag 1986 を更に参照のこと）。洗剤溶液のpHはＨＣｌの添加によりpH１０．５に調整した。
【０２８６】
試験材料の反射率（Ｒ）の測定は４６０nmにて、Macbeth Color Eye 7000フォトメーターで行った。測定は製造者のプロトコールに従って行った。
【０２８７】
スブチリシン３０９変異体の洗浄性能は性能係数を計算することにより評価した：
【０２８８】
Ｐ＝Ｒ_VARIANT −Ｒ_BLANK ／Ｒ_SAVINASE−Ｒ_BLANK
Ｐ：性能係数
Ｒ_VARIANT ：変異体で洗浄した試験材料の反射率。
Ｒ_SAVINASE：Ｓａｖｉｎａｓｅで洗浄した試験材料の反射率。
Ｒ_BLANK ：酵素抜きで洗浄した試験材料の反射率。
【０２８９】
当該スブチリシン３０９変異体は全てＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標）と比べ向上した性能を有する。即ち、Ｐ＞１であった。これらの変異体を大文字で指定する以下の改善クラスに分けた：
クラスＡ：１＜Ｐ≦１．５
クラスＢ：１．５＜Ｐ≦２
クラスＣ：Ｐ＞２
【０２９０】

【０２９１】
表IVからわかる通り、本発明のＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）変異体は洗浄性能の向上を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 １０個の相同性スブチラーゼのアラインメントを示す。これらのスブチラーゼ内の前述の１８個の高度に保存された残基とアライニングさせた。１８個の高度に保存された残基は太字で示すＪＰ１７０を除く表示のスブチラーゼは全てこの保存残基内で１００％の同一性を有する。ＪＰ１７０は１４６位に保存グリシン残基「Ｇ」の代わりにアスパラギン「Ｎ」を有する。
【図２】 図１に示すアラインメントとの本発明の３つのＳａｖｉｎａｓｅ変異体のアラインメントを示す。各々の変異体３７．０３，３７．０４及び３７．０６を図１のアラインメントと個別にアライニングさせている。便宜上３つの変異体全て１つの図に示す。
【図３】 Ｓａｖｉｎａｓｅの三次元構造を示す（プロテインデーターバンク（ＰＤＢ）エントリーＩＳＶＮ）。この図で、本発明の注目の活性部位ループを表示する。

Claims (21)

1. 親スブチラーゼと比べて洗剤中で向上した性能を発揮する親スブチラーゼの変異体の作製方法であって、
   ａ）当該親スブチラーゼをコードするＤＮＡ配列を、アミノ酸残基９５乃至１０３の間における任意の位置における１〜３個のアミノ酸の挿入に委ね；
   ｂ）工程ａ）において得られた突然変異ＤＮＡ配列を発現させ；そして
   ｃ）当該親スブチラーゼと比べて洗剤中で向上した性能を発揮する突然変異スブチラーゼを発現する宿主細胞をスクリーニングする；
   ことを含んで成る方法。
2. 前記挿入されたアミノ酸残基がＴ，Ｇ，Ａ及びＳを含んで成る群から選ばれる、請求項１記載の方法。
3. 前記挿入されたアミノ酸残基がＤ，Ｅ，Ｈ，Ｋ及びＲを含んで成る帯電アミノ酸残基の群から選ばれる、請求項１記載の方法。
4. 前記挿入されたアミノ酸残基がＣ，Ｎ，Ｑ，Ｓ及びＴを含んで成る親水性アミノ酸残基の群から選ばれる、請求項１記載の方法。
5. 前記挿入されたアミノ酸残基がＡ，Ｇ及びＶを含んで成る小疎水性アミノ酸残基の群から選ばれる、請求項１記載の方法。
6. 前記挿入されたアミノ酸残基がＦ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｗ及びＹを含んで成る大親水性アミノ酸残基の群から選ばれる、請求項１記載の方法。
7. バチルス・レンタス由来の成熟スブチリシン309と比べて洗剤中で向上した性能を発揮する、バチルス・レンタス由来のスブチリシン309のスブチラーゼ変異体であって、当該スブチリシン309酵素がスブチリシンBPN’番号表示に従い、以下からなる群から選ばれる挿入を有する、スブチラーゼ変異体：
   Ｇ９７ＧＡＳＧ；
   Ｇ９７ＧＡＡ；及び
   Ｇ９７ＧＡＳ；並びに
   これら挿入の保存性置換、ここで残基Ａ、Ｓ、ＧはＴ、Ｇ、Ａ又はＳで置換され得る。
8. 前記スブチラーゼ変異体が、スブチリシンBPN’番号表示に従い、以下からなる群から選ばれる挿入又は修飾を有する、請求項７記載のスブチラーゼ変異体：
   ３７．０３：Ｇ９７ＧＡＳＧ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ＋Ｇ１００Ａ＋Ｓ１０１Ａ；
   ３７．０６：Ｇ９７ＧＡＡ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ＋Ｓ１０１Ｔ；及び
   ３７．０４：Ｇ９７ＧＡＳ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ。
9. 前記挿入が、Ｋ２７Ｒ， ^*３６Ｄ，Ｓ５７Ｐ，Ｎ７６Ｄ，Ｓ８７Ｎ，Ｇ９７Ｎ，Ｓ１０１Ｇ，Ｖ１０４Ａ，Ｖ１０４Ｎ，Ｖ１０４Ｙ，Ｈ１２０Ｄ，Ｎ１２３Ｓ，Ｙ１６７Ａ，Ｒ１７０Ｓ，Ｒ１７０Ｌ、Ｒ１７０Ｎ、Ｑ２０６Ｅ，Ｎ２１８Ｓ，Ｍ２２２Ｓ，Ｍ２２２Ａ，Ｔ２２４Ｓ，Ｋ２３５Ｌ及びＴ２７４Ａから成る群から選ばれるさらなる修飾と組み合わされている、請求項７記載のスブチラーゼ変異体。
10. 前記挿入が、Ｓ１０１Ｇ＋Ｖ１０４Ｎ，Ｓ８７Ｎ＋Ｓ１０１Ｇ＋Ｖ１０４Ｎ，Ｋ２７Ｒ＋Ｖ１０４Ｙ＋Ｎ１２３Ｓ＋Ｔ２７４Ａ，Ｎ７６Ｄ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４ＩもしくはＮ７６Ｄ＋Ｖ１０４Ａ、又はこれらの変異体、Ｖ１０４Ｎ，Ｓ１０１Ｇ，Ｋ２７Ｒ，Ｖ１０４Ｙ，Ｎ１２３Ｓ，Ｔ２７４Ａ，Ｎ７６Ｄ，Ｖ１０４Ａのその他の組み合わせから成る群から選ばれるさらなる修飾と組み合わされている、請求項９記載のスブチラーゼ変異体。
11. 前記修飾が、Ｐ１２９Ｋ，Ｐ１３１Ｈ，Ａ１３３Ｐ，Ａ１３３Ｄ及びＡ１９４Ｐから成る群から選ばれるさらなる修飾と組み合わされている、請求項９記載のスブチラーゼ変異体。
12. 以下の群から選ばれる修飾を有する、請求項１１記載のスブチラーゼ変異体：
    Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｓ＋Ａ１９４Ｐ
    Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｌ＋Ａ１９４Ｐ
    Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｎ＋Ａ１９４Ｐ
    Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｓ＋Ｐ１２９Ｋ
    Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｌ＋Ｐ１２９Ｋ
    Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｎ＋Ｐ１２９Ｋ
    Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｓ＋Ｐ１３１Ｈ
    Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｌ＋Ｐ１３１Ｈ
    Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｎ＋Ｐ１３１Ｈ
    Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｓ＋Ａ１３３Ｐ
    Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｌ＋Ａ１３３Ｐ
    Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｎ＋Ａ１３３Ｐ
    Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｓ＋Ａ１３３Ｄ
    Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｌ＋Ａ１３３Ｄ
    Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｎ＋Ａ１３３Ｄ。
13. 請求項７〜１２のいずれか１項記載のスブチラーゼ変異体をコードする単離されたＤＮＡ。
14. 請求項１３記載の単離されたＤＮＡを含んで成る発現ベクター。
15. 請求項１４記載の発現ベクターで形質転換された微生物宿主細胞。
16. 細菌である、請求項１５記載の微生物宿主細胞。
17. 菌類又は酵母である、請求項１５記載の微生物宿主細胞。
18. 請求項７〜１２のいずれか１項記載のスブチラーゼ変異体を製造するための方法であって、請求項１５〜１７のいずれか１項記載の宿主細胞を当該変異体の発現及び分泌を誘導する条件下で培養し、そしてこの変異体を回収する方法。
19. 請求項７〜１２のいずれか１項記載のスブチラーゼ変異体を含んで成る組成物。
20. 更にセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドリダクターゼ、他のプロテアーゼ又はアミラーゼを含んで成る、請求項１９記載の組成物。
21. 前記組成物が洗剤組成物である、請求項２０又は２１記載の組成物。

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