DE60310264T2

DE60310264T2 - Thermostabile alpha-amylase

Info

Publication number: DE60310264T2
Application number: DE60310264T
Authority: DE
Inventors: Lan Hai Dian District TANG; Wenping Shang Di Haidian Dist. WU; Junxin Hai Dian District DUAN; Francke Pia JOHANNESEN
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2002-12-17
Filing date: 2003-12-16
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2023-12-17
Also published as: US20100209996A1; US20070190608A1; JP4550587B2; US20140206045A1; JP2006509511A; DK1576152T3; US7189552B2; US20160208230A1; ES2278210T3; EP1576152B1; CN100412191C; WO2004055178A1; US20120003700A1; AU2003287900A1; WO2004055178A9; US20060051849A1; US9938512B2; CN1726280A; AU2003287900A8; US8039241B2

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft thermostabile alpha-Amylasen, insbesondere solche mit verbesserter thermischer Stabilität bei saurem pH. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung solcher alpha-Amylasen.
HINTERGRUND
Alpha-Amylasen (alpha-1,4-Glucan-4-glucanohydrolasen, EC. 3.2.1.1) bilden eine Gruppe von Enzymen, die die Hydrolyse von Stärke und anderen geraden oder verzweigten 1,4-glucosidischen Oligo- und Polysachariden katalysieren.
Es gibt eine sehr umfangreiche Menge an Patent- und wissenschaftlicher Literatur, die diese gewerblich sehr wichtige Klasse von Enzymen betrifft. Eine Anzahl von alpha-Amylasen, die als „Termamyl^®-artige alpha-Amylasen" bezeichnet werden, und Varianten hiervon, sind aus z. B. WO 90/11352, WO 95/10603, WO 95/26397, WO 96/23873 und WO 96/23874 bekannt. Termamyl^®-artige alpha-Amylasen sind sehr thermostabil und daher für Verfahren geeignet, die bei hohen Temperaturen durchgeführt werden, wie z. B. der Verflüssigung von Stärke in Dextrose-Herstellungsverfahren. Eine andere Gruppe von alpha-Amylasen wird mit „Fungamyl^TM-artige alpha-Amylasen" bezeichnet, die alpha-Amylasen sind, welche verwandt mit oder homolog zu der alpha-Amylase sind, die aus Aspergillus oryzae stammt. Die Fungamyl-artigen alpha-Amylasen haben eine relativ geringe Thermostabilität, das kommerzielle Produkt, das unter dem Handelsnamen FUNGAMYL^TM von Novozymes A/S, Dänemark verkauft wird, hat ein Optimum um 55°C und ist nicht geeignet für Verfahren, die bei hohen Temperaturen durchgeführt werden. Fungamyl^TM-artige alpha-Amylasen werden gegenwärtig zur Herstellung von Sirupen, z. B. im Brauereiwesen verwendet.
Es wäre eindeutig vorteilhaft, eine alpha-Amylase mit erhöhter Thermostabilität, vorzugsweise bei einem sauren pH, bereitzustellen. Das ist keine neue Erkenntnis, aber tatsächlich ein in der Technik lange bestehendes Bedürfnis. Schon 1980 beschrieben Somkuti und Steinberg eine thermoacidophile extrazelluläre alpha-Amylase von Rhizomucor pusillus (Mucor pusillus), die sie schafften zu isolieren und charakterisieren. Sie stellten fest, dass: „Since high temperature and acidic pH are optimum conditions for the economic hydrolysis of starch, the use of thermostable and acidstable amylases of microbial origin for industrial purposes has been recommended" (Da eine hohe Temperatur und ein saurer pH optimale Bedingungen für die wirtschaftliche Hydrolyse von Stärke sind, wurde die Verwendung von thermostabilen und säurestabilen Amylasen mikrobiellen Ursprungs für gewerbliche Zecke empfohlen) und sie fuhren fort, über die Amylase aus Rhizomucor schlusszufolgern, dass „it is apparently the first example of fungal alpha-amylase exhibiting both acidophily and thermophily simultaneously. Consequently, the alpha-amylase of M. pusillus should be of economic importance" (sie offenbar das erste Beispiel einer Pilz-alpha-Amylase ist, die gleichzeitig Acidophilie und Thermophilie zeigt. Folglich sollte die alpha-Amylase von M. pusillus wirtschaftlich wichtig sein) (Somkuti GA, Steinberg DH (1980) Thermoacidophilic extracellular amylase of Mucor pusillus. Dev Indust Microbiol 21: 327–337).
Allerdings wurde, trotz dieser sehr eindeutigen Schlussfolgerungen von Somkuti und Steinberg schon 1980, das die alpha-Amylase aus Rhizomucor pusillus kodierende Gen bis heute weder kloniert noch sequenziert und die alpha-Amylase wurde bis zum heutigen Zeitpunkt nicht rekombinant in industriell relevanten Mengen produziert. 1987 wurde von einem verbesserten Reinigungsverfahren berichtet, aber jedoch nur für das von dem Wildtyp Rhizomucor pusillus produzierte Enzym (Turchi SL und Becker T (1987) Curr Microbiol 15: 203–205).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Problem, das durch diese Erfindung gelöst werden sollte, ist es, eine rekombinante thermoacidophile alpha-Amylase bereitzustellen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung isolierten erfolgreich ein Gen aus Rhizomucor pusillus, das eine alpha-Amylase kodiert, die sie mit AM782 bezeichneten, sie fügten erfolgreich das kodierende Gen in ein rekombinantes industrielles Expressionssystem eines filamentösen Pilzes ein und stellten die alpha-Amylase her. Die Charakterisierung der alpha-Amylase zeigte, dass sie eine hochthermoacidophile alpha-Amylase ist, die eine hochinteressante Aktivität zeigt, was durch das Zuckerprofil aus der Maltodextrinhydrolyse durch Amylase AM782 gezeigt wurde.
Die Amylase AM782 kann bei sehr hoher Temperatur arbeiten, mindestens bis 70°C. Die Amylase AM782 hat eine sehr hohe Reaktionsgeschwindigkeit; wenn sie bei gleicher Dosis mit Fungamyl^TM 800 L verglichen wird, kann die Amylase AM782 in ungefähr drei Stunden erreichen, wozu Fungamyl^TM 24 bis 48 Stunden braucht. Darüber hinaus kann die Amylase AM782 DP3 in DP2 und DP1 abbauen, wodurch sie ein höheres DP1-Ergebnis liefert.
Folglich betrifft die Erfindung in einem ersten Aspekt ein isoliertes Polynukleotid enthaltend einen offenen Leserahmen, der für ein Polypeptid mit alpha-Amylase-Aktivität kodiert, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Polypeptid enthaltend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 70% Identität mit den Aminosäuren 22 bis 450 von SEQ ID Nr. 4, vorzugsweise 75%, weiter bevorzugt 80%, noch weiter bevorzugt 85%, sogar weiter bevorzugt 90%, weiter bevorzugt 95% und am meisten bevorzugt mindestens 97% Identität mit den Aminosäuren 22 bis 450 von SEQ ID Nr. 4 aufweist; b) einem Polypeptid enthaltend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 70% Identität mit dem Polypeptid aufweist, das von dem Amylase kodierenden Teil des Polynukleotids kodiert wird, das in ein Plasmid insertiert ist, das in dem E. coli-Wirt vorhanden ist, der nach dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Zugangsnummer DSM 15334 hinterlegt wurde, vorzugsweise 75%, weiter bevorzugt 80%, noch weiter bevorzugt 85%, sogar weiter bevorzugt 90%, weiter bevorzugt 95% und am meisten bevorzugt mindestens 97% Identität mit dem Polypeptid aufweist, das von dem alpha-Amylase kodierenden Teil des Polynukleotids kodiert wird, das in ein Plasmid insertiert ist, das in dem E. coli-Wirt vorhanden ist, der nach dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Zugangsnummer DSM 15334 hinterlegt wurde; c) einem Polypeptid kodiert wird, das von einem Polynukleotid enthaltend eine Nukleotidsequenz kodiert wird, die mindestens 70% Identität mit der Sequenz aufweist, die von Position 68 bis 1417 von SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist, vorzugsweise 75%, weiter bevorzugt 80%, noch weiter bevorzugt 85%, sogar weiter bevorzugt 90%, weiter bevorzugt 95% und am meisten bevorzugt mindestens 97% Identität mit der Sequenz aufweist, die von Position 68 bis 1417 in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist, und d) einem Fragment von (a), (b) oder (c), das alpha-Amylase-Aktivität aufweist.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt enthaltend ein wie in dem ersten Aspekt definiertes Polynukleotid, funktionsfähig mit einem oder mehreren Kontrollsequenzen verbunden, die die Herstellung des Polypeptides in einem geeigneten Wirt steuern.
Ein dritter Aspekt betrifft einen rekombinanten Expressionsvektor enthaltend ein Nukleinsäurekonstrukt, das wie im zweiten Aspekt definiert ist.
In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung eine rekombinante Wirtszelle enthaltend ein Nukleinsäurekonstrukt, das wie in dem zweiten Aspekt definiert ist, oder mindestens eine Kopie eines Expressionsvektors, der wie in dem dritten Aspekt definiert ist.
Die gewerbliche Herstellung der Amylase AM782, einschließlich Homologen und Varianten, ist selbstverständlich sehr interessant.
Folglich betrifft die Erfindung in einem fünften Aspekt ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids mit alpha-Amylase-Aktivität, das von einem wie in dem ersten Aspekt definierten Polynukleotid kodiert wird, wobei das Verfahren umfasst: (a) Kultivieren einer wie in einem beliebigen der Ansprüche 12–16 definierten rekombinanten Wirtszelle unter Bedingungen, die der Herstellung des Polypeptids zuträglich sind; und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Es gibt ziemlich viele Anwendungen für eine Amylase, wie z. B. der Amylase AM782, wobei ein Überblick über einige wichtige hierin gegeben wird, und dieser schließt ein – ohne darauf beschränkt zu sein – die Stärkeindustrie, die Lebensmittel verarbeitende Industrie, die Textilindustrie und die Waschmittelindustrie.
Folglich betreffen zusätzliche Aspekte der Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines enzymatisch modifizierten Stärkederivats, wobei ein Polypeptid mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in dem fünften Aspekt definierten Verfahren hergestellt wurde, zur Verflüssigung und/oder Sacharifizierung von Stärke verwendet wird; und ein Verfahren zum Herstellen von Sirupen mit hohem Maltosegehalt, wobei ein Polypeptid mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in dem fünften Aspekt definierten Verfahren hergestellt wurde, zum Verflüssigen von Stärke verwendet wird; ein Verfahren zum Entschlichten einer Textilie, wobei ein Polypeptid mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in dem fünften Aspekt definierten Verfahren hergestellt wurde, zum Behandeln der Textilie verwendet wird; und ein Brauverfahren, wobei ein Polypeptid mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in dem fünften Aspekt definierten Verfahren hergestellt wurde, während der Fermentation von Stammwürze zugegeben wird; und ein Alkoholherstellungsverfahren, wobei ein Polypeptid mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in dem fünften Aspekt definierten Verfahren hergestellt wurde, zur Verflüssigung von Stärke in einer Destilleriemaische verwendet wird; und ein Verfahren, wobei ein Teigprodukt enthaltend ein Polypeptid mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in dem fünften Aspekt definierten Verfahren hergestellt wurde, gebacken wird.
Verschiedene Verwendungen von alpha-Amylase AM782, einschließlich Homologer und Varianten, werden auch in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
Folglich betreffen eine Anzahl nicht einschränkender Aspekte der Erfindung die Verwendung eines Polypeptids mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in dem fünften Aspekt definierten Verfahren hergestellt wurde, in einem Stärke-Umwandlungsverfahren zur Verflüssigung und/oder Sacharifizierung; die Verwendung eines Polypeptids mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in dem fünften Aspekt definierten Verfahren hergestellt wurde, zum Verflüssigen von Stärke in einem Herstellungsverfahren für Sirupe mit hohem Maltosegehalt; die Verwendung eines Polypeptids mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in dem fünften Aspekt definierten Verfahren hergestellt wurde, zum Entschlichten einer Textilie; die Verwendung eines Polypeptids mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in dem fünften Aspekt definierten Verfahren hergestellt wurde, zum Herstellen von Alkohol; die Verwendung eines Polypeptids mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in dem fünften Aspekt definierten Verfahren hergestellt wurde, zum Brauen; und die Verwendung eines Polypeptids mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in dem fünften Aspekt definierten Verfahren hergestellt wurde, zum Backen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das pH-Profil der gereinigten Amylase AM782.
2 zeigt das Temperaturprofil der gereinigten Amylase AM782.
3-1 bis 3-3 zeigen die Restaktivität von AM782 bei pH 5 und 60°C, 70°C bzw. 80°C.
4-1 bis 4-3 zeigen die Restaktivität von AM782 bei pH 6 und 60°C, 70°C bzw. 80°C.
5-1 bis 5-3 zeigen die Restaktivität von AM782 bei pH 7 und 60°C, 70°C bzw. 80°C.
6 zeigt das Expressionsplasmid pDAu71.
7 zeigt das Expressionsplasmid pPFJo143.
8 zeigt die Ergebnisse von Beispiel 4.
DEFINITIONEN
Sequenzhomologie und Alignment
Für die vorliegende Erfindung können Alignments von Sequenzen und die Berechnung von Homologiewerten unter Verwendung eines vollständigen „Smith-Waterman-Alignments" durchgeführt werden, welches sowohl für Protein- als DNA-Alignments verwendbar ist. Die „Default"-Wertungsmatritzen BLOSUM50 und die Identitätsmatrix werden für Protein- bzw. DNA-Alignments verwendet. Das Strafmaß für den ersten Rest in einer Lücke beträgt –12 bei Proteinen und –16 bei DNA, wohingegen das Strafmaß für zusätzliche Reste in einer Lücke –2 für Proteine und –4 für DNA beträgt. Das Alignment kann mit der FASTA-Paketversion v20u6 vorgenommen werden (W. R. Pearson und D. J. Lipman (1988), „Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85: 2444–2448 und W. R. Pearson (1990) „Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 183: 63–98).
Mehrfache Alignments für Proteinsequenzen können unter Verwendung von „ClustalW" (Thompson, J. D., Higgins, D. G. und Gibson, T. J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: 4673–4680) durchgeführt werden. Mehrfache Alignments von DNA-Sequenzen können unter Verwendung des Proteinalignments als ein Template durchgeführt werden, wobei die Aminosäuren durch das entsprechenden Codon der DNA-Sequenz ersetzt werden.
Im Wesentlichen reines Polynukleotid
Der Begriff „im Wesentlichen reines Polynukleotid", wie er hierin verwendet wird, betrifft eine Polynukleotidzubereitung, wobei das Polynukleotid aus seiner natürlichen genetischen Umgebung entfernt wurde und so frei von anderen fremden oder unerwünschten kodierenden Sequenzen ist und in einer Form ist, die für die Verwendung innerhalb eines gentechnisch veränderten Proteinherstellungssystems geeignet ist. So enthält ein im Wesentlichen reines Polynukleotid höchstens 10 Gew.-% an einem anderen Polynukleotidmaterial, mit welchem es nativ assoziiert ist (niedrigere Prozentpunkte anderen Polynukleotidmaterials sind bevorzugt, z. B. höchstens 8 Gew.-%, höchstens 6 Gew.-%, höchstens 5 Gew.-%, höchstens 4 Gew.-%, höchstens 3 Gew.-%, höchstens 2 Gew.-%, höchstens 1 Gew.-% und höchstens ½ Gew.-%). Ein im Wesentlichen reines Polynukleotid kann allerdings natürlich vorkommende 5'- und 3'-untranslatierte Regionen, wie z. B. Promotoren und Terminatoren einschließen. Es ist bevorzugt, dass das im Wesentlichen reine Polynukleotid mindestens 92% rein ist, d. h., dass das Polynukleotid mindestens 92 Gew.-% des gesamten Polynukleotidmaterials, das in der Zubereitung vorhanden ist, beträgt und höhere Prozentzahlen, wie z. B. mindestens 94% rein, mindestens 95% rein, mindestens 96% rein, mindestens 97% rein, mindestens 98% rein, mindestens 99% und mindestens 99,5% rein, sind bevorzugt. Polynukleotide, die hierein offenbart sind, sind vorzugsweise in einer im Wesentlichen reinen Form. Insbesondere ist es bevorzugt, dass die Polynukleotide, die hierin offenbart sind, in „im Wesentlichen reiner Form" sind, d. h., dass die Polynukleotidzubereitung im Wesentlichen frei von anderem Polynukleotidmaterial ist, mit welchem sie natürlicherweise assoziiert ist. Hierein ist der Begriff „im Wesentlichen reines Polynukleotid" synonym mit den Begriffen „isoliertes Polynukleotid" und „Polynukleotid in isolierter Form".
cDNA
Von dem Begriff „cDNA", wenn er in dem vorliegenden Zusammenhang verwendet wird, ist beabsichtigt, dass er ein DNA-Molekül abdeckt, das durch reverse Transkription aus einem reifen, gespleißten mRNA-Molekül, das von einer eukaryotischen Zelle stammt, hergestellt werden kann. Der cDNA fehlen die Intronsequenzen, die für gewöhnlich in der entsprechenden genomischen DNA vorhanden sind. Das anfängliche primäre RNA-Transkript ist ein Vorläufer der mRNA und wird in einer Reihe von Ereignissen bearbeitet, bevor es als reife gespleißte mRNA erscheint. Diese Ereignisse schließen das Entfernen von Intronsequenzen durch einen Spleißen genannten Prozess ein. Wenn cDNA aus mRNA stammt, fehlen ihr daher Intronsequenzen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Der erste Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes Polynukleotid enthaltend einen offenen Leserahmen, der für ein Polypeptid mit alpha-Amylase-Aktivität kodiert, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Polypeptid enthaltend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 70% Identität mit den Aminosäuren 22 bis 450 von SEQ ID Nr. 4 aufweist; b) einem Polypeptid enthaltend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 70% Identität mit einem Polypeptid aufweist, das von dem Amylase kodierenden Teil des Polynukleotids kodiert wird, das in ein Plasmid insertiert ist, das in dem E. coli-Wirt vorhanden ist, der nach dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Zugangsnummer DSM 15334 hinterlegt wurde; c) einem Polypeptid, das von einem Polynukleotid enthaltend eine Nukleotidsequenz, die mindestens 70% Identität mit der Sequenz aufweist, die von Position 68 bis 1417 in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist, kodiert wird; und d) einem Fragment von (a), (b) oder (c), das alpha-Amylase-Aktivität aufweist.
Die Techniken, die verwendet wurden, um eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, zu isolieren oder zu klonieren, sind in der Technik bekannt und schließen die Isolierung aus genomischer DNA, Herstellung von cDNA und eine Kombination hiervon ein. Das Klonieren der Nukleotid-Sequenzen der vorliegenden Erfindung aus solcher genomischer DNA kann z. B. durch Verwenden der gut bekannten Polymerasekettenreaktion (PCR; polymerase chain reaction) oder Antikörperscreenen von Expressionsbibliotheken erreicht werden, um klonierte DNA-Fragmente mit gemeinsamen Strukturmerkmalen nachzuweisen. Siehe z. B. Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Andere Amplifikationsvorgehensweisen wie z. B. Ligasekettenreaktion (LCR; ligase chain reaction), ligierte aktivierte Transkription (LAT; ligated activated transcription) und Nukleotidsequenz-basierte Amplifikation (NASBA; nucleotide sequence-based amplification) können verwendet werden. Die Nukleotidsequenz kann aus einem Stamm von Rhizomucor oder anderen verwandten Organismen kloniert werden und kann daher z. B. eine allelische oder Speziesvariante des Polypeptids sein, das die Region der Nukleotidsequenz kodiert.
Die Nukleotidsequenz kann durch Standardklonierungsverfahren unter Verwendung von Vorgehensweisen erhalten werden, die in der Gentechnik verwendet werden, um die Nukleotidsequenz von ihrer natürlichen Lokalisation an eine andere Stelle, an welcher sie reproduziert werden soll, zu verschieben. Die Klonierungsvorgehensweisen können Ausschneiden und Isolierung eines gewünschten Fragments, das die Nukleotidsequenz umfasst, die das Polypeptid kodiert, Insertion des Fragments in ein Vektormolekül und Aufnahme des rekombinanten Vektors in eine Wirtszelle einbeziehen, wo mehrere Kopien oder Klone der Nukleotidsequenz repliziert werden. Die Nukleotidsequenz kann genomischen, cDNA-, RNA-, semisynthetischen, synthetischen Ursprungs oder jeder beliebigen Kombination hiervon sein.
Der Begriff „Polypeptidvariante", „Proteinvariante", „Enzymvariante" oder einfach „Variante" bezieht sich auf ein erfindungsgemäßes Polypeptid umfassend eine oder mehrere Änderung(en), wie z. B. Substitution(en), Insertion(en), Deletion(en) und/oder Trunkierung(en) eines oder mehrerer spezifischen/er Aminosäurerests/e an einer oder mehreren spezifischen Positionen) in dem Polypeptid. Die Gesamtzahl solcher Änderungen beträgt typischerweise nicht mehr als 10, z. B. eins, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht oder neun solcher Veränderungen. Zusätzlich kann die erfindungsgemäße Variante andere Modifikationen des Elternenzyms einschließen, typischerweise nicht mehr als 10, z. B. nicht mehr als 5 solcher Modifikationen. Die Variante hat im Allgemeinen einen Grad an Sequenzidentität mit dem Elternpolypeptid von mindestens 80%, z. B. mindestens 85%, typischerweise mindestens 90% oder mindestens 95%.
Der Begriff „Elternpolypeptid", „Elternprotein", „Elternenzym", „Standardenzym" oder einfach „elterlich" bezieht sich auf das Polypeptid, auf welchem die Variante basiert. Der Begriff bezieht sich auch auf das Polypeptid, mit welchem eine Variante verglichen und ein Alignment durchgeführt wird. Die elterliche Sequenz kann ein natürlich vorkommendes (Wildtyp-)Polypeptid sein oder kann umgekehrt eine Variante hiervon sein, welche durch jedes beliebige geeignete Mittel hergestellt wird. Zum Beispiel kann das elterliche Protein eine Variante eines natürlich vorkommenden Polypeptids sein, das in der Aminosäuresequenz modifiziert oder verändert wurde. Eine elterliche Sequenz kann auch eine allelische Variante sein, die jede beliebige von zwei oder mehr alternativen Formen eines Gens, das den gleichen chromosomalen Locus belegt, bildet. Allelische Varianten entstehen natürlicherweise durch Mutation und können innerhalb der Populationen in einem Polymorphismus resultieren, was im Stand der Technik gut beschrieben ist. Eine allelische Variante eines Polypeptids ist ein Polypeptid, das durch die entsprechende allelische Variante eines Gens kodiert wird.
Der Begriff „randomisierte Bibliothek", „Variantenbibliothek" oder einfach „Bibliothek" bezieht sich auf eine Bibliothek von varianten Polypeptiden. Eine Diversität in einer Variantenbibliothek kann auf DNA-Tripletebene durch Mutagenese der Gene, die die Variante kodieren, erzeugt werden, so dass einzelne Codons variegiert werden, z. B. durch Verwenden von Primern einer teilweise randomisierten Sequenz in einer PCR-Reaktion. Einige Techniken wurden beschrieben, durch die man eine facettenreiche kombinatorische Bibliothek durch Variegieren einiger Nukleotidpositionen in einem Gen und durch Rekombinieren dieser bildet, z. B., wenn diese Positionen zu weit voneinander entfernt sind, um durch einen einzelnen (mit Spikes versehenen oder dotierten) Oligonukleotidprimer abgedeckt zu werden. Diese Techniken schließen die Verwendung von In-vivo-Rekombination der individuell diversifizierten Genabschnitte, wie in WO 97/07205 auf Seite 3, Zeilen 8 bis 29 (Novozymes A/S) beschrieben, ein. Sie schließen auch die Verwendung von DNA-Shuffling-Techniken ein, um eine Bibliothek von Volllängen-Genen zu bilden, worin einige Genabschnitte kombiniert werden und worin jeder Abschnitt z. B. durch Mutagenese unter Verwendung von Spikes (spiked mutagenesis) diversifiziert werden kann (Stemmer, Nature 370, S. 389–391, 1994 und US 5,811,238 ; US 5,605,793 und US 5,830,721 ). Man kann ein Gen, das ein Protein-„Rückgrat" (elterliches Wildtyp-Polypeptid) kodiert, als ein Template-Polynukleotid verwenden und dieses mit einem oder mehreren einzel- oder doppelsträngigen Oligonukleotiden, wie in WO 98/41623 und in WO 98/41622 (Novozymes A/S) beschrieben, kombinieren. Die einzelsträngigen Oligonukleotide könnten teilweise während der Synthese randomisiert werden. Die doppelsträngigen Oligonukleotide könnten PCR-Produkte sein, die eine Diversität in einer spezifischen Region aufnehmen. In beiden Fällen kann man die Diversität durch die entsprechenden Abschnitte, die die Sequenz des Rückgratproteins kodieren, verdünnen, um die mittlere Anzahl von Veränderungen, die eingeführt werden, zu begrenzen.
Es wurden auch Verfahren etabliert, um Verhältnisse von Nukleotidmischungen (A; C; T; G), die in spezifischen Codonpositionen während der Oligo- oder Polynukleotidsynthese insertiert werden, vorzusehen, um eine systematische Abweichung einzuführen, um eine gewünschte Frequenzverteilung gegenüber einem Satz von einer oder mehreren gewünschten Aminosäuren anzunähern, die durch die bestimmten Codons kodiert werden. Es könnte von Interesse sein, eine Variantenbibliothek herzustellen, die Permutationen einer Anzahl bekannter Aminosäuremodifikationen an verschiedenen Orten in der Primärsequenz des Polypeptids umfasst. Diese könnten posttranslational oder durch chemische Modifikationsstellen eingeführt werden oder sie könnten durch Mutationen in kodierenden Genen eingeführt werden. Die Modifikationen an sich können sich zuvor bereits als aus dem einen oder anderen Grund (z. B. zum Abnehmen der Antigenität oder zum Verbessern der spezifischen Aktivität, der Effizienz, der Stabilität oder anderer Eigenschaften) als günstig erwiesen haben. In solchen Fällen kann es zunächst wünschenswert sein, eine Bibliothek von mannigfaltigen Kombinationen bekannter Sequenzen zu bilden. Zum Beispiel könnte man (mindestens) zwölf Abschnitte des das elterliche Protein kodierenden Gens kombinieren, wenn zwölf einzelne Mutationen bekannt sind, wobei jeder Abschnitt in zwei Formen vorhanden ist: Einer mit und einer ohne die gewünschte Mutation. Durch Variieren der relativen Mengen dieser Abschnitte könnte man eine Bibliothek (der Größe 212) entwickeln, für welche die mittlere Anzahl von Mutationen pro Gen vorhergesagt werden kann. Dies kann ein nützlicher Weg zum Kombinieren von Mutationen sein, die jede selbst einen gewissen aber keinen ausreichenden Effekt ergeben, ohne dass man auf sehr große Bibliotheken zurückgreifen muss, was häufig der Fall ist, wenn „Mutagenese unter Verwendung von Spikes" verwendet wird. Ein anderer Weg zur Kombination dieser „bekannten Mutationen" könnte die Verwendung von Familienshuffling von oligomerer DNA, die bekannte Mutationen kodiert, mit Fragmenten der Volllängen-Wildtypsequenz sein.
Folglich betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ein Polynukleotid des ersten Aspekts, worin das Polypeptid eine künstliche Variante enthaltend eine Aminosäuresequenz, die eine oder mehrere Trunkierung(en) und/oder mindestens eine Substitution, Deletion und/oder Insertion einer Aminosäure im Vergleich zu den Aminosäuren 22 bis 450 von SEQ ID Nr. 4 aufweist, ist.
Es wird für den Fachmann auf dem technischen Gebiet offensichtlich werden, dass solche Modifikationen außerhalb der für die Funktion des Moleküls kritischen Regionen durchgeführt werden können und noch in einem aktiven Polypeptid resultieren. Aminosäurereste, die für die Aktivität des Polypeptids essentiell sind, das von der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz kodiert wird, und daher vorzugsweise nicht Gegenstand einer Modifikation wie z. B. einer Substitution sind, können gemäß den in der Technik bekannten Vorgehensweisen identifiziert werden, wie z. B. ortsgerichtete Mutagenese oder Alaninscanning-Mutagenese (siehe z. B. Cunningham und Wells, 1989, Science 244: 1081–1085). In der letztgenannten Technik werden Mutationen an jedem positiv geladenen Rest in dem Molekül eingeführt und die resultierenden mutierten Moleküle werden auf Amylaseaktivität getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Die Orte der Substrat-Enzym-Wechselwirkung können auch durch Analyse der dreidimensionalen Struktur bestimmt werden, wie bestimmt durch Techniken wie Kernspin-Resonanzanalyse, Kristallographie oder Photoaffinitätsmarkierung (siehe z. B. de Vos et al., 1992, Science 255: 306–312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899–904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59–64).
Darüber hinaus kann eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, durch Einführen von Nukleotidsubstitutionen modifiziert werden, welche nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von der Nukleotidsequenz kodiert wird, führen, die aber der Codonverwendung des Wirtsorganismus, der für die Produktion des Enzyms beabsichtigt ist, entsprechen.
Die Einführung einer Mutation in die Nukleotidsequenz, um ein Nukleotid durch ein anderes zu ersetzen, kann durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung eines beliebigen der im Stand der Technik bekannten Verfahren erreicht werden. Insbesondere verwendbar ist eine Vorgehensweise, die einen supercoiled doppelsträngigen DNA-Vektor mit einem interessierenden Insert und zwei synthetischen Primern, die die gewünschte Mutation enthalten, verwendet. Die Oligonukleotidprimer, von denen jeder zu den Gegensträngen des Vektors komplementär ist, verlängern sich während des thermischen Zyklierens mittels der Pfu-DNA-Polymerase. Nach Einbau der Primer wird ein mutiertes Plasmid, das versetzte Knicke enthält, erzeugt. Nach dem thermischen Zyklieren wird das Produkt mit DpnI behandelt, welches spezifisch für methylierte und hemimethylierte DNA ist, um das elterliche DNA-Template zu verdauen und um auf mutationsenthaltende synthetisierte DNA zu selektionieren. Andere in der Technik bekannte Vorgehensweisen können auch verwendet werden. Für eine allgemeine Beschreibung der Nukleotidsubstitution siehe z. B. Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95–107.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Polynukleotid des ersten Aspekts, worin das Polypeptid eine Aminosäuresequenz enthält, die mindestens 70% Identität mit den Aminosäuren 22 bis 450 von SEQ ID Nr. 4 aufweist, vorzugsweise mindestens 75%, weiter bevorzugt 80%, noch weiter bevorzugt 85%, sogar noch weiter bevorzugt 90%, weiter bevorzugt 95% und am meisten bevorzugt mindestens 97% Identität mit den Aminosäuren 22 bis 450 von SEQ ID Nr. 4 aufweist.
Noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Polynukleotid des ersten Aspekts, worin das Polypeptid die Aminosäuren 22 bis 450 von SEQ ID Nr. 4 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Polynukleotid des ersten Aspekts, worin das Polypeptid aus den Aminosäuren 22 bis 450 von SEQ ID Nr. 4 besteht.
Noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Polynukleotid des ersten Aspekts, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz enthält, die mindestens 70% Identität mit dem Polypeptid aufweist, das von dem Amylase kodierenden Teil der Nukleotidsequenz kodiert wird, die in das Plasmid insertiert ist, das in dem E. coli-Wirt vorhanden ist, der nach dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Zugangsnummer DSM 15334 hinterlegt wurde, vorzugsweise mindestens 80% Identität, mindestens 85% Identität, mindestens 90% Identität, mindestens 95% Identität oder mindestens 97% Identität mit dem Polypeptid aufweist, das von dem Amylase kodierenden Teil der Nukleotidsequenz kodiert wird, die in ein Plasmid insertiert ist, das in dem E. coli-Wirt vorhanden ist, der nach dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Zugangsnummer DSM 15334 hinterlegt wurde; vorzugsweise enthält das Polypeptid die Aminosäuresequenz, die von dem Amylase kodierenden Teil der Nukleotidsequenz kodiert wird, die in ein Plasmid insertiert ist, das in dem E. coli-Wirt vorhanden ist, der nach dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Zugangsnummer DSM 15334 hinterlegt wurde; noch weiter bevorzugt besteht das Polypeptid aus der Aminosäuresequenz, die von dem im Amylase kodierenden Teil der Nukleotidsequenz kodiert wird, die in ein Plasmid insertiert ist, das in dem E. coli-Wirt vorhanden ist, der nach dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Zugangsnummer DSM 15334 hinterlegt wurde.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft das Polynukleotid des ersten Aspekts, wobei das Polypeptid eine künstliche Variante ist, die eine Aminosäuresequenz enthält, die eine oder mehrere Trunkierung(en) und/oder mindestens eine Substitution, Deletion und/oder Insertion einer Aminosäure im Vergleich zu der Aminosäuresequenz aufweist, die von dem Amylase kodierenden Teil der Nukleotidsequenz kodiert wird, die in ein Plasmid insertiert ist, das in dem E.-coli-Wirt vorhanden ist, der nach dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Zugangsnummer DSM 15334 hinterlegt wurde.
Nukleinsäurekonstrukt
Wenn hierin verwendet, meint der Begriff „Nukleinsäurekonstrukt" ein Nukleinsäuremolekül, entweder einzel- oder doppelsträngig, das aus einem natürlich vorkommenden Gen isoliert wurde oder das so modifiziert wurde, dass es Abschnitte von Nukleinsäuren in einer Weise enthält, die anderweitig in der Natur nicht existieren würden. Der Begriff Nukleinsäurekonstrukt ist synonym mit dem Begriff „Expressionskassette", wenn das Nukleinsäurekonstrukt die Kontrollsequenzen enthält, die für die Expression einer kodierenden Sequenz der vorliegenden Erfindung benötigt werden. Eine Polynukleotidsequenz, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, kann auf eine Vielzahl von Arten manipuliert werden, um eine Expression des Polypeptids bereitzustellen. Die Manipulation der Nukleotidsequenz vor ihrer Insertion in einen Vektor kann in Abhängigkeit von dem Expressionsvektor wünschenswert oder notwendig sein. Die Techniken zum Modifizieren von Nukleotidsequenzen, die Verfahren mit rekombinanter DNA verwenden, sind in der Technik gut bekannt.
Der Begriff „Kontrollsequenzen" wird hierin so definiert, dass er alle Bestandteile einbezieht, die zur Expression eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung notwendig oder vorteilhaft sind. Jede Kontrollsequenz kann für die Nukleotidsequenz, die das Polypeptid kodiert, nativ oder fremd sein. Solche Kontrollsequenzen schließen ein – ohne darauf beschränkt zu sein – einen Leader, eine Polyadenylierungssequenz, eine Propeptidsequenz, einen Promotor, eine Signalpeptidsequenz und einen Transkriptionsterminator. Die Kontrollsequenzen schließen zumindest einen Promotor und transkriptionale und translationale Stoppsignale ein. Die Kontrollsequenzen können mit Linkern zum Zwecke des Einführens spezifischer Restriktionsschnittstellen bereitgestellt werden, um die Ligation der Kontrollsequenzen mit der kodierenden Region der Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, zu erleichtern.
Der Begriff „funktionsfähig verbunden" wird hierin als eine Konfiguration definiert, in welcher eine Kontrollsequenz in geeigneter Weise an einer Position in Bezug auf die kodierende Sequenz der DNA-Sequenz platziert wird, so dass die Kontrollsequenz die Expression eines Polypeptids steuert.
Wenn hierin verwendet, ist von dem Begriff „kodierende Sequenz" beabsichtigt, dass er eine Nukleotidsequenz abdeckt, die die Aminosäuresequenz ihres Proteinprodukts direkt spezifiziert. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden allgemein von einem offenen Leserahmen bestimmt, der für gewöhnlich mit dem ATG-Startcodon beginnt. Die kodierende Sequenz schließt typischerweise DNA, cDNA und rekombinante Nukleotidsequenzen ein.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft ein Nukleinsäurekonstrukt enthaltend ein wie in dem ersten Aspekt definiertes Polynukleotid, das funktionsfähig mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen verbunden ist, die die Herstellung des Polypeptids in einem geeigneten Wirt steuern.
Expressionsvektor
In dem vorliegenden Zusammenhang schließt der Begriff „Expression" jeden beliebigen Schritt ein, der in die Herstellung des Polypeptids einbezogen ist, einschließlich – ohne darauf beschränkt zu sein – Transkription, posttranskriptionale Modifikation, Translation, posttranslationale Modifikation und Sekretion.
In dem vorliegenden Zusammenhang deckt der Begriff „Expressionsvektor" ein DNA-Molekül, linear oder zirkulär, ab, das einen Abschnitt enthält, der ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert, und das funktionsfähig mit zusätzlichen Abschnitten verbunden ist, die für seine Transkription sorgen.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft einen rekombinanten Expressionsvektor enthaltend ein wie in dem vorherigen Aspekt definiertes Nukleinsäurekonstrukt.
Gemäß der Erfindung kann ein Polynukleotid, das eine erfindungsgemäße Amylase kodiert, unter Verwendung eines Expressionsvektors exprimiert werden, der typischerweise Kontrollsequenzen wie z. B. einen Promotor, einen Operator, eine Ribosomenbindestelle, ein Translationsstartsignal und gegebenenfalls ein Repressor-Gen oder verschiedene Aktivator-Gene einschließt. Der rekombinante Expressionsvektor, der das Polynukleotid trägt, das die erfindungsgemäße alpha-Amylase kodiert, kann jeder beliebige Vektor sein, der rekombinanten DNA-Vorgehensweisen unterzogen werden kann, und die Wahl des Vektors wird oft von der Wirtszelle abhängen, in welche er eingeführt werden soll. Der Vektor kann ein solcher sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, in das Wirtszellgenom integriert und zusammen mit dem/den Chromosom(en), in welche(s) er integriert wurde, repliziert wird. Beispiele geeigneter Expressionsvektoren schließen pMT838 ein.
In dem Vektor sollte die DNA-Sequenz funktionsfähig mit einer geeigneten Promotorsequenz verbunden sein. Der Promotor kann jede beliebige DNA-Sequenz sein, die transkriptionale Aktivität in einer Wirtszelle der Wahl zeigt, und kann von Genen stammen, die Proteine kodieren, die entweder homolog oder heterolog für die Wirtszelle sind.
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor kann auch einen geeigneten Transkriptionsterminator und, in Eukaryonten, Polyadenylierungssequenzen enthalten, die funktionfähig mit der DNA-Sequenz verbunden sind, die die erfindungsgemäße alpha-Amylase-Variante kodiert. Terminations- und Polyadenylierungssequenzen können geeigneterweise aus der gleichen Quelle wie der Promotor stammen. Der Vektor kann weiterhin eine DNA-Sequenz enthalten, die den Vektor in die Lage versetzt, sich in der in Frage stehenden Wirtszelle zu replizieren. Beispiele solcher Sequenzen sind die Replikationsursprünge der Plasmide pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 und pIJ702.
Der Vektor kann einen selektierbaren Marker enthalten, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle ausgleicht, wie z. B. die dal-Gene aus B. subtilis oder B. licheniformis, oder einen, der Antibiotikaresistenz wie z. B. Ampicillin-, Kanamycin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclinresistenz verleiht. Darüber hinaus kann der Vektor Aspergillus-Selektionsmarker wie z. B. amdS, argB, niaD, und sC, einen Marker, der Hygromycinresistenz verleiht, enthalten, oder die Selektion kann durch Co-Transformation wie z. B. in WO 91/17243 beschrieben, erreicht werden.
Die Vorgehensweisen, die zur Ligation eines erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts, das eine Glucoamylase-Variante, den Promotor, Terminator bzw. andere Elemente kodiert und zu ihrer Insertion in geeignete Vektoren, die die zur Replikation notwendige Information enthalten, verwendet werden, sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt (vgl. z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor, 1989).
Beispiele geeigneter Promotoren zum Steuern der Transkription der DNA-Sequenz, die eine erfindungsgemäße alpha-Amylase-Variante kodiert, insbesondere in einem bakteriellen Wirt, sind der Promotor des lac-Operons von E. coli, die Promotoren des Agarase-Gens dagA von Streptomyces coelicolor, die Promotoren des alpha-Amylasegens (amyL) von Bacillus licheniformis, die Promotoren des maltogenen Amylase-Gens (amyM) von Bacillus stearothermophilus, die Promotoren der alpha-Amylase (amyQ) von Bacillus amyloliquefaciens, die Promotoren der xylA- und xylB-Gene von Bacillus subtilis usw. Zur Transkription in einem Pilzwirt sind nicht beschränkende Beispiele verwendbarer Promotoren jene, die von den Genen stammen, die die TAKA-Amylase in A. oryzae, den TPI-(Triosephosphatisomerase)-Promotor von S. cerevisiae (Alber et al., (1982), J. Mol. Appl. Genet 1, S. 419–434), die Aspartylproteinase aus Rhizomucor miehei, die neutrale alpha-Amylase aus A. niger, die säurestabile alpha-Amylase aus A. niger, die Glucoamylase aus A. niger, die Lipase aus Rhizomucor miehei, die alkalische Protease aus A. oryzae, die Triosephosphatisomerase aus A. oryzae oder die Acetamidase aus A. nidulans und mutierte, trunkierte und/oder Hybridpromotoren hiervon kodieren.
Beispiele bevorzugter Terminatoren für Wirtszellen filamentöser Pilze werden von den Genen für TAKA-Amylase aus Aspergillus oryzae, Glucoamylase aus Aspergillus niger, Anthranilatsynthase aus Aspergillus nidulans, alpha-Glucosidase aus Aspergillus niger und trypsinartiger Protease aus Fusarium oxysporum erhalten.
Die Kontrollsequenz kann auch eine geeignete Leadersequenz sein, eine nicht translatierte Region einer mRNA, die für die Translation durch die Wirtszelle wichtig ist. Die Leadersequenz ist funktionsfähig mit dem 5'-Terminus der Nukleotidsequenz verbunden, die das Polypeptid kodiert. Jede beliebige Leadersequenz, die in der Wirtszelle der Wahl funktional ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Bevorzugte Leader für Wirtszellen filamentöser Pilze werden aus den Genen für TAKA-Amylase aus Aspergillus oryzae und Triosephosphatisomerase aus Aspergillus nidulans erhalten.
Die Kontrollsequenz kann auch eine Polyadenylierungssequenz sein, eine Sequenz, die mit dem 3'-Terminus der Nukleotidsequenz funktionsfähig verbunden ist, und die, wenn sie transkribiert wird, von der Wirtszelle als ein Signal zur Hinzufügung von Polyadenosinresten an die transkribierte mRNA erkannt wird. Jede beliebige Polyadenylierungssequenz, die in der Wirtszelle der Wahl funktional ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssequenzen für Wirtszellen filamentöser Pilze werden von den Genen für TAKA-Amylase aus Aspergillus oryzae, Glucoamylase aus Aspergillus niger, Anthranilatsynthase aus Aspergillus nidulans, trypsinartige Protease aus Fusarium oxysporum und alpha-Glucosidase aus Aspergillus niger erhalten.
Die Kontrollsequenz kann auch eine ein Signalpeptid kodierende Region sein, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die mit dem Aminoterminus eines Polypeptids verbunden ist, und die das kodierte Polypeptid in den sekretorischen Weg der Zelle lenkt. Das 5'-Ende der kodierenden Sequenz der Nukleotidsequenz kann inhärent eine ein Signalpeptid kodierende Region enthalten, die natürlicherweise im Translations-Leserahmen mit dem Abschnitt der kodierenden Region verbunden ist, die das sekretierte Polypeptid kodiert. Alternativ kann das 5'-Ende der kodierenden Sequenz eine ein Signalpeptid kodierende Region enthalten, die für die kodierende Sequenz fremd ist. Die fremde, das Signalpeptid kodierende Region kann erforderlich sein, wo die kodierende Sequenz natürlicherweise keine ein Signalpeptid kodierende Region enthält. Alternativ kann die das Signalpeptid kodierende Region einfach die das natürliche Signalpeptid kodierende Region ersetzen, um die Sekretion des Polypeptids zu verstärken. Allerdings kann jede beliebige, das Signalpeptid kodierende Region, welche das exprimierte Polypeptid in den sekretorischen Weg der Wirtszelle der Wahl steuert, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Wirksame, das Signalpeptid kodierende Regionen für bakterielle Wirtszellen sind die das Signalpeptid kodierenden Regionen, die aus den Genen für maltogene Amylase aus Bacillus NCIB 11837, alpha-Amylase aus Baciullus stearothermophilus, Subtilisin aus Bacillus licheniformis, alpha-Amylase aus Bacillus licheniformis, neutrale Proteasen (nprT, nprS, nprM) aus Baciullus stearothermophilus und prsA aus Bacillus subtilis erhalten werden. Weitere Signalpeptide sind von Simonen und Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109–137 beschrieben.
Wirksame, das Signalpeptid kodierende Regionen für Wirtszellen filamentöser Pilze sind die das Signalpeptid kodierenden Regionen, die aus den Genen für TAKA-Amylase aus Aspergillus oryzae, neutrale Amylase aus Aspergillus niger, Glucoamylase aus Aspergillus niger, Aspartylproteinase aus Rhizomucor miehei, Cellulase aus Humicola insolens und Lipase aus Humicola lanuginosa erhalten werden.
Die Kontrollsequenz kann auch eine ein Propeptid kodierende Region sein, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die am Aminoterminus eines Polypeptids positioniert ist. Das resultierende Polypeptid ist als ein Proenzym oder Propolypeptid (oder ein Zymogen in einigen Fällen) bekannt. Ein Propolypeptid ist im Allgemeinen inaktiv und kann in ein reifes aktives Polypeptid durch katalytische oder autokatalytische Spaltung des Propeptids aus dem Propolypeptid umgewandelt werden. Die das Propeptid kodierende Region kann aus den Genen für alkalische Protease (aprE) aus Bacillus subtilis, neutrale Protease (nprT) aus Bacillus subtilis, alpha-Faktor aus Saccharomyces cerevisiae, Aspartylproteinase aus Rhizomucor miehei und Laccase aus Myceliophthora thermophila (WO 95/33836) erhalten werden. Wenn sowohl Signalpeptid- als auch Propeptidregionen am Aminoterminus eines Polypeptids vorhanden sind, wird die Propeptidregion in der Nähe des Aminoterminus eines Polypeptids positioniert und die Signalpeptidregion wird in der Nähe zum Aminoterminus der Propeptidregion positioniert.
Es kann auch wünschenswert sein, regulatorische Sequenzen hinzuzufügen, welche die Regulation der Expression des Polypeptids in Abhängigkeit vom Wachstum der Wirtszelle erlauben. Beispiele regulatorischer Systeme sind jene, die bewirken, dass die Expression des Gens in Antwort auf einen chemischen oder physikalischen Stimulus, einschließlich der Gegenwart einer regulatorischen Verbindung, an- oder abgeschaltet wird. Regulatorische Systeme in prokaryotischen Systemen schließen die lac-, tac- und trp-Operatorsysteme ein. In filamentösen Pilzen können der TAKA-alpha-Amylase-Promotor, der Glucoamylasepromotor aus Aspergillus niger und der Glucoamylasepromotor aus Aspergillus oryzae als regulatorische Sequenzen verwendet werden.
Andere Beispiele regulatorischer Sequenzen sind jene, die eine Genamplifikation erlauben. In eukaryotischen Systemen schließen diese das Dihydrofolatreduktase-Gen, das in Gegenwart von Methotrexat amplifiziert wird, und die Metallothionein-Gene, die mit Schwermetallen amplifiziert werden, ein. In diesen Fällen würde die Nukleotidsequenz, die das Polypeptid kodiert, funktionsfähig mit der regulatorischen Sequenz verbunden werden.
Der Vektor kann ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit existiert, deren Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, z. B. ein Plasmid, ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom.
Der Vektor kann jedes beliebige Mittel zur Sicherstellung der Selbstreplikation enthalten. Alternativ kann der Vektor ein solcher sein, der, wenn er in die Wirtszelle eingeführt wird, in das Genom integriert und zusammen mit dem/den Chromosom(en), in welches) er integriert wurde, repliziert wird. Darüber hinaus kann ein einzelner/s Vektor oder Plasmid oder zwei oder mehr Vektoren oder Plasmide, die zusammen die Gesamt-DNA enthalten, die in das Genom der Wirtszelle integriert werden soll, oder ein Transposon verwendet werden.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise einen oder mehrere selektierbare Marker, die eine leichte Selektion der transformierten Zellen erlauben. Ein selektierbarer Marker ist ein Gen, dessen Produkt für eine Biozid- oder virale Resistenz, Resistenz gegenüber Schwermetallen, Prototrophie für Auxotrophe und Ähnliches sorgt.
Beispiele von bakteriellen selektierbaren Markern sind die dal-Gene aus Bacillus subtilis oder Bacillus licheniformis oder Marker, die Antibiotikaresistenz, wie z. B. Ampicillin-, Kanamycin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclinresistenz verleihen. Selektierbare Marker zur Verwendung einer Wirtszelle eines filamentösen Pilzes schließen ein – ohne darauf beschränkt zu sein – amdS (Acetamidase), argB (Ornithincarbamoyltransferase), bar (Phosphinothricinacetyltransferase), hygB (Hygromycinphosphotransferase), niaD (Nitratreduktase), pyrG (Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase), sC (Sulfatadenyltransferase), trpC (Anthralinatsynthase) sowie Äquivalente hiervon. Bevorzugt zur Verwendung in einer Zelle von Aspergillus sind die amdS- und pyrG-Gene von Aspergillus nidulans oder Aspergillus oryzae und das bar-Gen von Streptomyces hygroscopicus.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise ein Element(e), das die stabile Integration des Vektors in das Wirtszellgenom oder die autonome Replikation des Vektors in der Zelle unabhängig von dem Genom erlaubt.
Zur Integration in das Wirtszellgenom kann der Vektor von der Nukleotidsequenz, die das Polypeptid kodiert, oder jedem anderen Element des Vektors für die stabile Integration des Vektors in das Genom durch homologe oder nicht homologe Rekombination abhängen. Alternativ kann der Vektor zusätzliche Nukleotidsequenzen zum Steuern der Integration durch homologe Rekombination in das Genom der Wirtszelle enthalten. Die zusätzlichen Nukleotidsequenzen ermöglichen es dem Vektor, in das Wirtszellgenom an einer genauen Stelle(n) in dem/den Chromosom(en) integriert zu werden. Um die Wahrscheinlichkeit zur Integration an einer genauen Stelle zu erhöhen, sollten die Integrationselemente vorzugsweise eine ausreichende Anzahl von Nukleotiden enthalten, wie z. B. 100 bis 1.500 Basenpaare, vorzugsweise 400 bis 1.500 Basenpaare und am meisten bevorzugt 800 bis 1.500 Basenpaare, die hochhomolog mit der entsprechenden Zielsequenz sind, um die Wahrscheinlichkeit der homologen Rekombination zu erhöhen. Die Integrationselemente können jede beliebige Sequenz sein, die mit der Zielsequenz in dem Genom der Wirtszelle homolog ist. Darüber hinaus können die Integrationselemente nicht kodierende oder kodierende Nukleotidsequenzen sein. Andererseits kann der Vektor in das Genom der Wirtszelle durch nicht homologe Rekombination integriert werden.
Zur autonomen Replikation kann der Vektor weiterhin einen Replikationsursprung enthalten, der es dem Vektor ermöglicht, sich autonom in der in Frage stehenden Wirtszelle zu replizieren. Beispiele von bakteriellen Replikationsurspüngen sind die Replikationsursprünge der Plasmide pBR322, pUC19, pACYC177 und pACYC184, die die Replikation in E. coli erlauben, und pUB110, pE194, pTA1060 und pAMβ1, die die Replikation in Bacillus erlauben. Ein Beispiel einer Sequenz, die den autonomen Erhalt in einer Wirtszelle eines filamentösen Pilzes sicherstellt, ist die AMA1-Sequenz. Der Replikationsursprung kann einer mit einer Mutation sein, welche ihn in der Wirtszelle temperatursensitiv arbeitend macht (siehe z. B. Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433).
Es können mehrere Kopien einer Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung in die Wirtszelle intertiert werden, um die Herstellung des Genprodukts zu erhöhen. Eine Erhöhung der Kopienzahl der Nukleotidsequenz kann durch Integrieren mindestens einer zusätzlichen Kopie der Sequenz in das Wirtszellgenom oder durch Einschließen eines amplifizierbaren selektierbaren Markergens mit der Nukleotidsequenz erhalten werden, wobei auf Zellen, die amplifizierte Kopien des selektierbaren Markergens und dadurch zusätzliche Kopien der Nukleotidsequenz enthalten, durch Kultivieren der Zellen in Gegenwart eines geeigneten selektionierbaren Mittels selektioniert werden kann.
Wirtszellen
Die erfindungsgemäße Zelle, die entweder ein DNA-Konstrukt oder einen Expressionsvektor der Erfindung wie oben definiert enthält, wird vorteilhafterweise als Wirtszelle bei der rekombinanten Herstellung einer erfindungsgemäßen alpha-Amylase-Variante verwendet. Die Zelle kann mit dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt, das die Variante kodiert, bequemerweise durch Integrieren des DNA-Konstrukts (einer oder mehrerer Kopien) in das Wirtschromosom, transfomiert werden. Diese Integration wird im Allgemeinen als ein Vorteil angesehen, da die DNA-Sequenz mit höherer Wahrscheinlichkeit stabil in der Zelle behalten wird. Die Integration der DNA-Konstrukte in das Wirtschromosom kann nach konventionellen Verfahren durchgeführt werden, z. B. durch homologe oder heterologe Rekombination. Alternativ kann die Zelle mit einem Ex pressionsvektor, wie oben im Zusammenhang mit den verschiedenen Arten von Wirtszellen beschrieben, transformiert werden.
Die erfindungsgemäße Zelle kann eine Zelle eines höheren Organismus, z. B. eines Säugers oder eines Insekts sein, aber sie ist vorzugsweise eine mikrobielle Zelle, z. B. eine bakterielle oder Pilzzelle (einschließlich Hefe).
Beispiele geeigneter Bakterien sind Gram-positive Bakterien wie z. B. Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulars, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis oder Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus oder Gram-negative Bakterien wie z. B. E. coli. Die Transformation der Bakterien kann z. B. durch Protoplastentransformation oder durch Verwenden kompetenter Zellen in an sich bekannter Weise bewirkt werden.
Die Wirtszelle kann auch ein filamentöser Pilz sein, z. B. ein Stamm, der zu einer Spezies von Aspergillus gehört, am meisten bevorzugt Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger, oder ein Stamm von Fusarium, wie z. B. ein Stamm von Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum (im perfekten Zustand Gibberella zeae genannt, früher Sphaeria zeae, synonym mit Gibberella roseum und Gibberella roseum f. sp. cerealis), oder Fusarium sulphureum (im perfekten Zustand Gibberella puricaris genannt, synonym mit Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum und Fusarium roseum var. graminearum), Fusarium cerealis (synonym mit Fusarium crokkwelinse) oder Fusarium venenatum.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle ein Protease-defizienter oder ein Protease-minus-Stamm. Dies kann z. B. der Protease-defiziente Stamm des Genus Aspergillus, insbesondere ein Stamm von A. oryzae wie z. B. A. oryzae JaL125 sein, in dem das Gen für die alkalische Protease, genannt „alp", deletiert ist. Dieser Stamm ist in WO 97/35956 (Novo Nordisc) beschrieben.
Zellen filamentöser Pilze können durch Verfahren transformiert werden, die Protoplastenbildung und Transformation des Protoplasten, gefolgt von Regeneration der Zellwand, in an sich bekannter Weise einbeziehen. Die Verwendung von Aspergillus als einen Wirtsmikroorganismus ist in EP 238 023 (Novo Nordisc) beschrieben, deren Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft eine rekombinante Wirtszelle enthaltend ein wie oben definiertes Nukleinsäurekonstrukt oder mindestens eine Kopie eines wie oben definierten Expressionsvektors.
Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft eine Zelle des vorherigen Aspekts, die ein Mirkoorganismus ist; vorzugsweise eine Zelle, die ein Bakterium oder ein Pilz ist; weiter bevorzugt eine Zelle, die ein Gram-positives Bakterium wie z. B. Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus oder Bacillus thuringiensis ist; oder am meisten bevorzugt eine Zelle, die ein Protease-defizienter Stamm des Pilzes Aspergillus, insbesondere A. oryzae, ist.
Verfahren zum Herstellen einer erfindungsgemäßen alpha-Amylase-Variante
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer erfindungsgemäßen alpha-Amylase-Variante, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle unter Bedingungen, die der Herstellung der Variante zuträglich sind, und das Gewinnen der Variante aus den Zellen und/oder dem Kulturmedium umfasst.
Das zum Kultivieren der Zellen verwendete Medium kann jedes beliebige konventionelle Medium sein, das für das Wachstum der in Frage stehenden Wirtszelle und zum Erhalt der Expression der erfindungsgemäßen alpha-Amylase-Variante geeignet ist. Geeignete Medien sind von kommerziellen Anbietern erhältlich oder können nach veröffentlichten Rezepten hergestellt werden (z. B. wie in den Katalogen der „American Type Culture Collection" beschrieben).
Die alpha-Amylase-Variante, die von den Wirtszellen sezerniert wird, kann angenehmerweise aus dem Kulturmedium durch gut bekannte Vorgehensweisen, einschließlich Trennen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration und Präzipitieren von Proteinbestandteilen des Mediums mittels Salz, wie z. B. Ammoniumsulfat, gefolgt durch die Verwendung von chromatographischen Vorgehensweisen wie z. B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und Ähnlichen gewonnen werden.
Verschiedene Verfahren zum Verwenden solcher hergestellter Amylasen wie auch spezifischere Verwendungen sind in anderen Aspekten der Erfindung, wie bereits in der Zusammenfassung dieser Erfindung erwähnt, umrissen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Verwenden von alpha-Amylase, die von einem erfindungsgemäßen Polynukleotid kodiert wird, zum Herstellen von Glucose oder Maltose oder Ähnlichem aus Stärke bereit.
Im Allgemeinen schließt das Verfahren die Schritte des teilweisen Hydrolysierens von Vorläuferstärke in Gegenwart von alpha-Amylase und dann des weiteren Hydrolisierens der Freisetzung von D-Glucose von den nicht reduzierenden Enden der Stärke oder verwandten Oligo- und Polysacharidmolekülen in Gegenwart von Glucoamylase durch Spaltung alpha-(1 ⌫ 4)- und alpha-(1 ⌫ 6)-glucosidischer Bindungen ein.
Die partielle Hydrolyse der Vorläuferstärke unter Verwendung von alpha-Amylase stellt einen anfänglichen Abbau der Stärkemoleküle durch Hydrolysieren interner alpha-(1 ⌫ 4)-Bindungen bereit. In kommerziellen Anwendungen wird diese anfängliche Hydrolyse unter Verwendung von alpha-Amylase bei einer Temperatur von ungefähr 105°C ablaufen gelassen. Eine sehr hohe Stärkekonzentration wird verarbeitet, für gewöhnlich 30% bis 40% Trockenmaterial. Die anfängliche Hydrolyse wird für gewöhnlich für ungefähr fünf Minuten bei dieser erhöhten Temperatur durchgeführt. Die partiell hydrolysierte Stärke kann dann auf einen zweiten Behälter übertragen und für ungefähr eine Stunde bei 85° bis 90°C inkubiert werden, um ein Dextroseäquivalent (D. E.) von 10 bis 15 zu erlangen.
Der Schritt der weiteren Hydrolyse der Freisetzung von D-Glucose aus den nicht reduzierenden Enden der Stärke oder verwandter Oligo- und Polysacharidmoleküle in Gegenwart von Glucoamylase wird normalerweise in einem separaten Behälter bei einer reduzierten Temperatur zwischen 30° und 60°C durchgeführt. Vorzugsweise wird die Temperatur der Substratflüssigkeit auf 55° bis 60°C gesenkt. Der pH der Lösung wird von 6–6,5 auf einen Bereich zwischen 3 und 5,5 gesenkt. Vorzugsweise ist der pH der Lösung 4 bis 4,5. Die Glucoamylase wird zu der Lösung zugefügt und die Reaktion wird für 24–72 Stunden, vorzugsweise 36–48 Stunden durchgeführt.
Die alpha-Amylasen, die durch die erfindungsgemäßen Polynukleotide kodiert werden, können auch in Brauverfahren verwendet werden. Darüber hinaus kann die alpha-Amylase, die von den erfindungsgemäßen Polynukleotiden kodiert wird, für die Maltoseherstellung verwendet werden. Sirup mit hohem Maltosegehalt wird typischerweise wie folgt hergestellt. Um „High Maltose Sirup" (enthaltend 50–55% Maltose) herzustellen, wird Stärke auf DE 10–20 verflüssigt. Die Temperatur und der pH der verflüssigten Stärke wird auf 65°C bzw. auf einen pH um 5,0 eingestellt und wird einer Aktivität einer maltogenen alpha-Amylase (z. B. Amylase von Bacillus stearothermophilus, wie z. B. Maltogenase^TM 4000 L, 0,4 l/t TM (Novozymes)), einer Pullulanaseaktivität (z. B. Bacillus pullulanase, wie z. B. Promozyme^TM 600 L, 0,3 l/t TM (Novozymes)) und einer alpha-Amylase-Aktivität (z. B. BAN 240 L oder Termamyl^TM 120 L, Typ LS, 0,4 kg/t TM (Novozymes)) für 24–41 Stunden unterzogen. Die spezifische Verarbeitungsdauer hängt von dem gewünschten Sacharidspektrum ab, das erreicht werden soll. Mit einem Ansteigen der Dosierung der maltogenen alpha-Amylase und Pullulanase kann der Maltosegehalt erhöht werden.
Alternativ kann „High Maltose Sirup" durch zunächst Verflüssigen von Stärke auf DE 10–20 und dann Einstellen des pHs und der Temperatur auf 55°C oder höher und einen pH um 5,5 oder niedriger und dann Unterziehen der verflüssigten Stärke einer Pilz-alpha-Amylase-Aktivität (z. B. Amylase aus Bacillus stearothermophilus, wie z. B. Fungamyl^TM 800 L (Novozymes)) für 22–44 Stunden hergestellt werden. Die Dosierung von Pilz-Fungamyl^TM 800 L hängt von der vorgesehenen Sacharifizierungsdauer, z. B. 200 g/t TM für 44 Stunden und 400 g/t TM für 22 Stunden ab. Die alpha-Amylasen, die von den erfindungsgemäßen Polynukleotiden kodiert werden, können das Fungamyl^TM 800 L in oben genanntem Verfahren ersetzen und die Temperatur kann dann sogar höher und der pH sogar niedriger sein, was in einer schnelleren Umwandlungsgeschwindigkeit und daher einer besseren Gesamtwirtschaftlichkeit resultiert.
Um „High Maltose Sirup" herzustellen, wird Stärke mit einem Maltosegehalt von 55–65% Stärke auf DE 10–20 verflüssigt. Die Temperatur und der pH der verflüssigten Stärke wird auf 60°C oder höher und auf einen pH um 6 oder niedriger eingestellt und dann einer Aktivität maltogener alpha-Amylase (z. B. Maltogenase^TM 4000 L, 0,25–1,0 l/t TM (Novozymes)) und Pilz-alpha-Amylase-Aktivität (z. B. Amylase aus Aspergillus wie z. B. Fungamyl^TM 800 L, 0,4–1,0 kg/t TM (Novo Nordisc)) für 24–48; oder der alpha-Amylase, die von dem erfindungsgemäßen Polynukleotid kodiert wird, für eine kürzere Zeitdauer unterzogen.
Die erfindungsgemäße alpha-Amylase-Varainte kann auch in Backverfahren verwendet werden. In einem Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Variante zur Stärkeumwandlung, Alkoholherstellung, zum Brauen und Backen. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Herstellen von Maltosesirup umfassend die Schritte: 1) Verflüssigen von Stärke in Gegenwart einer alpha-Amylase; 2) Dextrinieren in der Gegenwart einer erfindungsgemäßen Pilzvariante von alpha-Amylase; und 3) Gewinnen des Sirups; und gegebenenfalls Reinigung des Sirups.
Die zur Verflüssigung in Schritt 1) verwendete alpha-Amylase kann jede beliebige alpha-Amylase sein. Bevorzugte alpha-Amylasen sind alpha-Amylasen von Bacillus, wie z. B. eine Termamyl-artige alpha-Amylase, einschließlich der alpha-Amylase aus B. licheniformis (kommerziell erhältlich als Termamyl^TM (Novo Nordisc)), die alpha-Amylase aus B. amyloliquefaciens (vertrieben als BAN (Novo Nordisc)), die alpha-Amylase aus B. stearothermophilus (vertrieben als Termamyl^TM 120 L Typ S), die alpha-Amylasen, die aus einem Stamm von Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 oder DSM 9375 stammen, die alle ausführlich in WO 95/26397 beschrieben sind, und die alpha-Amylase, die von Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), S. 25–31, beschrieben wurde. Alpha-Amylasen im Sinne der Definition von „Termamyl-artigen alpha-Amylasen" sind z. B. in WO 96/23874 (Novo Nordisc) definiert.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von Maltose umfassend die Schritte: 1) Verflüssigen von Stärke bei einer Temperatur von 140–160°C bei einem pH von 4–6; 2) Dextrinieren bei einer Temperatur im Bereich von 60–95°C, insbesondere bei 65–85°C wie z. B. 70–80°C, bei einem pH 4–6 in Gegenwart einer erfindungsgemäßen Pilzvariante von alpha-Amylase; und 3) Gewinnung des Sirups; und gegebenenfalls Aufreinigung des Sirups.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine wirksame Menge Glucoamylase in Schritt 2) zugegeben. Der Sirup wird in dieser Ausführungsform (einschließlich Behandlung mit Glucoamylase) kein Maltosesirup, sondern Sirup mit einem anderen Zuckerprofil sein. Die Glucoamylase kann eine Glucoamylase aus Aspergillus, insbesondere eine Glucoamylase aus Aspergillus niger, sein.
Alternativ umfasst das Verfahren die Schritte: 1) Verflüssigen von Stärke bei einer Temperatur von 95–110°C bei einem pH von 4–6 in Gegenwart einer alpha-Amylase von Bacillus; 2) Verflüssigen bei einer Temperatur im Bereich von 70–95°C bei einem pH von 4–6 in Gegenwart einer alpha-Amylase, die von einem wie in dem ersten Aspekt der Erfindung definierten Polynukleotid kodiert wird, gefolgt von Gewinnung und/oder gegebenenfalls Aufreinigung des erhaltenen Produkts.
Schließlich betreffen einige Aspekte der Erfindung verschiedene Waschmittelanwendungen. Ein Aspekt betrifft einen Waschmittelzusatz enthaltend eine alpha-Amylase, die von einem wie in dem ersten Aspekt definierten Polynukleotid kodiert wird, gegebenenfalls in Form eines nicht staubenden Granulats, stabilisierter Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms. Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Aspekts betrifft einen Detergenszusatz, der 0,02–200 mg Enzymprotein/g Zusatz enthält. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft einen Waschmittelzusatz nach dem vorangegangenen Aspekt, welcher zusätzlich ein weiteres Enzym wie eine Protease, eine Lipase, eine Peroxidase, ein weiteres amylolytisches Enzym und/oder eine Cellulase umfasst. Ein weiterer Aspekt betrifft eine Waschmittelzusammensetzung enthaltend eine alpha-Amylase, die von einem wie in dem ersten Aspekt definierten Polynukleotid kodiert wird, und eine bevorzugte Ausführungsform dieses Aspekts betrifft eine Waschmittelzusammensetzung, die zusätzlich ein weiteres Enzym wie z. B. eine Protease, eine Lipase, eine Peroxidase, ein weiteres amylolytisches Enzym und/oder eine Cellulase enthält. Ein noch weiterer Aspekt betrifft eine Hand- oder Maschinen-Geschirrspülmittelzusammensetzung enthaltend eine alpha-Amylase-Variante, die von einem wie in dem ersten Aspekt definierten Polynukleotid kodiert wird. Eine bevorzugte Geschirrspülmittelzusammensetzung enthält zusätzlich ein weiteres Enzym wie z. B. eine Protease, eine Lipase, eine Peroxidase, ein weiteres amylolytisches Enzym und/oder eine Cellulase. Ein letzter waschmittelbezogener Aspekt ist eine Hand- oder Waschmaschinen-Waschmittelzusammensetzung enthaltend eine alpha-Amylase-Variante, die von einem wie in dem ersten Aspekt definierten Polynukleotid kodiert wird; und eine bevorzugte Waschmittelzusammensetzung enthält zusätzlich ein weiteres Enzym wie z. B. eine Protease, eine Lipase, eine Peroxidase, ein amylolytisches Enzym und/oder eine Cellulase.
BEISPIELE
Beispiel 1
Reinigung und Charakterisierung der alpha-Amylase aus Rhizomucor pusillus NN046782.

Diese mit AM782 bezeichnete alpha-Amylase wurde aus der Kulturbrühe des thermophilen Pilzstammes NN046782 gereinigt und sie wurde für stabiler als die BAN-(Bacillus amyloliquefaciens)-Amylase bei 60, 70 und 80°C, bei pH = 5,0, 6,0 und 7,0 befunden. Die Eigenschaften werden wie folgt zusammengefasst:

Molekulargewicht (SDS)	≈ 50 kDa (SDS-PAGE)
pI	pH 3,5
aktiver pH-Bereich	pH 3–9
optimaler pH-Bereich	pH 4–5
aktiver Temperaturbereich	30–80°C
optimale Temperatur	70°C
pH-Stabilität	stabil bei pH = 5, 6, 7.

Medium für Pilzwachstum YG: Hefe-Glucose-Agar

5,0 g Difco pulverförmiger Hefeextrakt	10,0 g Glucose
20,0 g Agar	1000 ml Leitungswasser

Autoklavieren bei 121°C für 15–20 min. FG-4-Medium 50 ml/Flasche:

30 g Sojamehl,	15 g Maltose
5 g Pepton,	1000 ml H₂O

1 g Olivenöl (2 Tropfen/Flasche)
50 ml in 500 ml Erlenmeyerflasche mit 2 Einbuchtungen. Autoklavieren bei 121°C für 30 min.

Die Pilze wurden auf einer YG-Agar-Platte (4,5 cm Durchm.) 3 Tage lang unter 45°C bei Dunkelheit wachsen gelassen und zur Inokulierung von Schüttelflaschen verwendet. Die Platten mit voll ausgewachsenen Kulturen wurden vor der Verwendung bei 4°C gelagert.
Zur Enzymherstellung wurden 4–6 Agar-Pfropfen (agar plugs) mit voll ausgewachsenen Pilzkulturen auf den vorstehenden Platten verwendet, um eine Schüttelflasche mit FG-4 zu inokulieren und unter von 45°C bei 160 Upm für 72 Stunden wachsen gelassen, dann durch Zentrifugation der Kulturbrühe bei 8000 Upm und 4°C für 30 Minuten geerntet. Der Überstand wurde gesammelt und zur Enzymaufreinigung verwendet.
Chemikalien und Reagenzien:
BAN-Standard und Fungamyl^TM 800 L (Novozymes A/S, Dänemark) wurden als Bezugsgrößen verwendet. AZCL-Amylose (Megazyme) wurde für den Enzymtest verwendet.
Andere Chemikalien und Puffer schließen ein:
25 mM Tris-HCl, pH 7,0; 25 mM Tris-HCl; 1 M NaCl, pH 7,0; 0,1 M Na₃PO₄/Zitronensäure, pH 5,5; Ammoniumsulfat; 0,1 M NaAc, pH 5,0; 0,1 M MES, pH 6,0; 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0 Puffer für pH-Profil: 100 mM Bernsteinsäure, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl₂, 150 mM KCl, 0,01% Triton X-100 eingestellt auf die pH-Werte 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 und 11,0 mit HCl oder NaOH.
Enzymaktivitätstests
Mikrotiterplattentest:
Die Überstände wurden durch Mikrotiterplattentest auf alpha-Amylase-Aktivität getestet.
Eine Lösung von 0,2% blauem Substrat AZCL-Amylose (Megazyme) wurde in einem 0,1 M Phosphatcitratpuffer (pH 5,5) oder Tris-HCl-Puffer (pH 7) unter Rühren suspendiert. Die Lösung wurde dann unter Rühren auf eine Mikrotiterplatte (200 μl pro Vertiefung), verteilt, 20 μl Enzymprobe wurden zugefügt und die Platten wurden in einem Eppendorf-Thermomixer für 15–30 Minuten bei 50°C und 650 Upm inkubiert. Die denaturierte Enzymprobe wurde durch 20-minütiges Kochen bei 100°C hergestellt und dann als Leerkontrollen verwendet. Nach Inkubation wurde die gefärbte Lösung von dem Feststoff durch Zentrifugation bei 3000 Upm für 5 Minuten bei 4°C getrennt. Dann wurden 150 μl Überstand auf eine Mikrotiterplatte übertragen und die Extinktion in einem „BioRad Microplate Reader" bei 595 nm gemessen.
Eppendorfgefäßtest:
Eine Lösung von 0,2% blauem Substrat AZCL-Amylose (Megazyme) wurde in Puffern verschiedener pH-Werte unter Rühren suspendiert. Die Lösungen wurden unter Rühren auf 1,5 ml-Eppendorfgefäße (900 μl in jedes) verteilt, 100 μl Enzymrobe wurden zu jedem Gefäß zugefügt und sie wurden dann in einem Wasserbad für 10–60 min. bei 50°C inkubiert. Proben mit denaturiertem Enzym (hergestellt durch 20-minütiges Kochen bei 100°C) wurden als Leerkontrollen verwendet. Nach Inkubation wurde die gefärbte Lösung von dem Feststoff durch Zentrifugation bei 5000 Upm für 10 Minuten bei 4°C getrennt. Dann wurden 200 μl Überstand in eine Mikrotiterplatte übertragen und die Extinktion wurde in einem „BioRad Microplate Reader" bei 595 nm gemessen.
Isoelektrische Fokussierung
Eine isoelektrische Fokussierung wurde in einer vorgefertigten Apholine-PAG-Platte, pH 3,5–9,5 (Pharmacia, Schweden) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Proben wurden in Triplikaten aufgetragen und das Gel wurde nach der Elektrophorese in drei Teile geteilt. Eine Überschichtung enthaltend 1% Agarose und 0,4% AZCL-Amylose in Puffer, pH 5–7, wurde auf jeden Teil des Gels gegossen, welches bei 45°C für 12–16 Stunden inkubiert wurde. Die Enzymaktivität und der pI des Enzymproteins wurden durch blaue Zonen identifiziert.
SDS-PAGE
Zum Überprüfen der Reinheit und zum Bestimmen des Molekulargewichts der gereinigten Amylase wurden 30 μl Enzymproben auf eine 12%-SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetragen. Das Gel wurde bei 100 V 1,5 h lang laufen gelassen und mit Coomassie-Blau gefärbt.
Enzymreinigung
300 ml Überstand des Stamms NN046782 wurden mit Ammoniumsulfat (80% Sättigung) präzipitiert und in 20 ml 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, wieder aufgelöst, dann gegen den gleichen Puffer einer Dialyse unterzogen und durch einen 0,45 mm-Filter filtriert; das Endvolumen betrug 200 ml. Die Lösung wurde auf eine 35 ml-„Source-15Q"-Säule (Pharmacia), die in 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, equilibriert war, aufgetragen und die Proteine wurden dann mit einem linearen NaCl-Gradienten (0–0,3 M) eluiert. Die Fraktionen aus der Säule wurden auf AZCL-Amylose bei pH 5,5 auf Amylaseaktivität analysiert. Die Fraktionen mit Amylaseaktivität wurden gepoolt. Dann wurde die gepoolte Lösung ultrazentrifugiert, die konzentrierte Lösung wurde auf eine 180 ml-Superdex75-Säule, die mit 25 mM Tris-HCl, pH 7,0, equilibriert war, aufgetragen, die Proteine wurden mit dem gleichen Puffer eluiert. Die Amylase enthaltenden Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert und die reinen Fraktionen wurden gepoolt.
Enzymcharakterisierung
pH-Profil:
20 μl Enzymprobe und 200 μl 0,2%-AZCL-Amylose in dem folgenden Puffersystem (100 mM Bernsteinsäure, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl₂, 150 mM KCl, 0,01% Triton X-100, eingestellt mit HCl oder NaOH auf die pH-Werte 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 und 11,0) mit verschiedenen pHs wurde in einer Mikrotiterplatte gemischt und vor der Reaktion auf Eis gestellt. Der Test wurde durch Überführen der Mikrotiterplatte auf einen Eppendorf-Thermomixer, welcher auf die Testtemperatur von 50°C eingestellt war, begonnen. Die Platte wurde für 20 Minuten auf dem Eppendorf-Thermomixer bei einer Schüttelgeschwindigkeit von 650 Upm inkubiert. Die Inkubation wurde durch Überführen des Plattenbodens auf ein Eisbad gestoppt. Dann wurde die Platte in einer eiskalten Zentrifuge für wenige Minuten zentrifugiert und 150 μl Überstand wurden auf eine neue Mikrotiterplatte überführt. Die Extinktion, OD₅₉₅, wurde als ein Maß der Amylaseaktivität abgelesen. Alle Reaktionen wurden in Triplikaten durchgeführt und eine Puffer-Blindprobe wurde in den Test eingeschlossen (an Stelle von Enzym). Die kommerziellen Enzyme BAN und Fungamyl^TM wurden als positive Kontrollen verwendet. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Temperaturprofil:
Eppendorfgefäße mit 200 μl 0,2%-AZCL-Amylose in 0,1 M Na₃PO₄/Zitronensäurepuffer, pH 5,5, wurden bei 20, 30, 40, 50, 55, 60, 70, 80°C vorinkubiert. Der Test wurde durch Mischen von 20 μl Enzymprobe mit dem Puffer gestartet. Die Gefäße wurden für 10 Minuten auf dem Eppendorf-Thermomixer bei seiner höchsten Schüttelgeschwindigkeit (1400 Upm) inkubiert. Die Inkubation wurde durch Überführen des Gefäßes auf ein Eisbad gestoppt. Dann wurden die Gefäße in einer eiskalten Zentrifuge für wenige Minuten zentrifugiert und 150 μl Überstand wurden auf eine Mikrotiterplatte übertragen. Die OD₅₉₅ wurde als ein Maß der Amylaseaktivität abgelesen. Alle Reaktionen wurden mit Triplikaten durchgeführt und eine Puffer-Blindprobe wurde in den Test eingeschlossen (an Stelle von Enzym). BAN und Fungamyl^TM wurden als Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
pH- und Temperaturstabilität:
80 μl Enzymprobe (verdünnt mit 0,1 M NaAc, pH 5,0, 0,1 M MES, pH 6,0, bzw. 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0) in einem Eppendorfgefäß wurde für 5, 10, 15 und 20 Minuten auf einem Eppendorf-Thermomixer bei 60, 70, 80°C und unter Schütteln mit 300 Upm inkubiert. Die Inkubation wurde durch Überführen des Gefäßbodens auf ein Eisbad gestoppt. Eine nicht inkubierte Probe wurde als Kontrolle verwendet. Die 20 μl der vorstehenden inkubierten Probe wurden auf eine Mikrotiterplatte überführt und 200 μl 0,2%-AZCL-Amylose in 0,1 M Na₃PO₄/Zitronensäurepuffer, pH 5,5, wurden zugegeben. Der Test wurde durch Überführen der Mikrotiterplatte auf einen Eppendorf-Thermomixer, der auf die Testtemperatur von 50°C eingestellt war, gestartet. Die Platte wurde für 30 Minuten auf dem Eppendorf-Thermomixer bei einer Schüttelgeschwindigkeit von 650 Upm inkubiert. Die Inkubation wurde durch Überführen des Plattenbodens auf ein Eisbad gestoppt. Dann wurde die Platte in einer eiskalten Zentrifuge für wenige Minuten zentrifugiert und 150 μl Überstand wurden auf eine neue Mikrotiterplatte überführt. Die OD₅₉₅ wurde als ein Maß der Amylaseaktivität abgelesen. Alle Reaktionen wurden mit Duplikaten durchgeführt und eine Puffer-Blindprobe wurde in den Test eingeschlossen (an Stelle von Enzym). BAN und Fungamyl^TM wurden als Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse sind in den 3–5 gezeigt.
Nebenaktivitätstest:
Die gereinigte Amylase wurde in den folgenden Substraten bei pH 7,0 getestet: AZCL-Galactomannan, AZCL-beta-Glucan, AZCL-Dextran, AZCL-Xyloglucan, AZCL-Kar toffelgalactan, AZCL-Arabinan, AZCL-Pullulan, AZCL-Xylan, AZCL-He-Cellulose, AZCL-Casein. Es wurde keine Nebenaktivität in irgendeinem der Substrate nachgewiesen.
Die Reinheit der gereinigten Amylase wurde in 12% SDS-PAGE überprüft, das Molekulargewicht des Enzyms ist um 500 KDa wie auf SDS-PAGE gesehen, der pI von AM782 ist um pH 3,5, wie durch IEF bestimmt.
Beispiel 2
Klonieren des Gens, das die AM782-alpha-Amylase von Rhizomucor pusillus NN046782 kodiert.
Pilzstamm und sein Wachstum
Rhizomucor pusillus NN046782 wurde bei 45°C, 165 Upm für 48 Stunden in FG4-Medium mit 2% Stärke wachsen gelassen. Das Mycelium wurde durch Zentrifugation bei 7000 Upm für 30 Minuten geerntet. Das geerntete Mycelium wurde bei –80°C vor seiner Verwendung in der RNA-Extraktion gelagert.
Extraktion der Gesamt-RNA
Die Gesamt-RNA wurde aus 100 mg Mycelium unter Verwendung des RNeasy-mini-Kits (Qiagen) extrahiert.
Spezifische Primer
Es wurde gefunden, dass die Amylase AM782 aus Rhizomucor pusillus NN046782 die gleiche N-terminale Sequenz wie eine Amylase besaß, die das Gen kodiert, das von uns in einem früheren Projekt aus einem anderen Rhizomucor pusillus NN101459 identfiziert und sequenziert worden war. Daher wurden zwei spezifische Primer aus der zuvor bestimmten DNA-Sequenz entwickelt und diese wurden zum Klonieren der Amylase aus NN046782 verwendet.
Primer AM298-CDSF (SEQ ID Nr. 1): 5' tat cat gaa att cag cat
Primer AM298-CDSR (SEQ ID Nr. 2): 5' agt tca aaa tgg aca aag t

Das folgende PCR-Reaktionssystem und die folgenden Bedingungen wurden verwendet:

Pfu-DNA-Polymerase 10 × PCR-Puffer mit MgSO₄	5 μl
10 mM dNTP-Mix	1 μl
Primer AM298-CDSF (10 μM)	1 μl
Primer AM298-CDSR (10 μM)	1 μl
Pfu-DNA-Polymerase (3 μ/μl)	0,5 μl
cDNA-Synthesereaktion (Template)	2 μl
Zufügen von autoklaviertem destilliertem Wasser auf	50 μl

Bedingungen:

95°C	3 min
95°C	30 sec
45 oder 50 oder 53°C	30 sec 40 Zyklen
72°C	3 min
72°C	7 min

Das PCR-Produkt wurde auf einem Agarose-Gel angesehen und eine spezifische Bande wurde identifiziert und gereinigt. So wurden 0,3 μl dieses PCR-Produkts als Template für eine zweite PCR-Runde bei den folgenden Bedingungen verwendet.

Pfu-DNA-Polymerase 10 × PCR-Puffer mit MgSO₄	5 μl
10 mM dNTP-Mix	1 μl
Primer AM298-CDSF (10 μM)	1 μl
Primer AM298-CDSR (10 μM)	1 μl
Pfu-DNA-Polymerase (3 μ/μl)	0,5 μl
cDNA-Synthesereaktion	0,3 μl
Zufügen von autoklaviertem destilliertem Wasser auf	50 μl

Bedingungen:

95°C	3 min
95°C	30 sec
55°C	30 sec 40 Zyklen
72°C	3 min
72°C	7 min

Eine spezifische Bande mit der Größe von ungefähr 1,5 kb war das Ergebnis dieser Amplifikation. Ein PolyA-Schwanz wurde unter Verwenden von Taq-DNA-Polymerase (PCR-Produkt 20 μl, 10 × Puffer 2 μl, Mg2+ 1 μl, dATP (10 mM) 0,5 μl, Taq-Polymerase (5 Einheiten/μl) 0,3 μl) und Inkubation bei 72°C für 30 min. hinzugefügt. Das Fragment mit dA-Schwanz wurde aus dem Gel mittels GFX-Kit wiedergewonnen und in 30 μl Wasser aufgelöst. Dann wurde das gereinigte Fragment in den pGEM-T-Vektor ligiert (durch Mischen von 2 × Puffer 10 μl, T-Vektor (50 ng/l) 1 μl, T4-Ligase (3 Einheiten/l) 1 μl und gereinigtem PCR-Produkt 8 μl; dann über Nacht bei 4 Grad stehen lassen), und in die kompetenten Zellen transformiert (Transformationsbedingung: 1 μl Ligationslösung und 40 μl DH10B kompetente Zellen in 0,1 cm Küvette, 1,8 KV). 8 positive Klone wurden durch Kolonie-PCR gescreent. Kolonie-PCR-System:

10 × PCR-Puffer 5 μl

25 mM MgCl₂ 3 μl

10 mM dNTP-Mix 1 μl

AM298-CDSF 1 μl

AM298-CDSR 1 μl

Pfu-Polymerase 1 μl

Zufügen von autoklaviertem destilliertem Wasser auf 50 μl
Eine weiße Kolonie wurde direkt in eine PCR-Mischung übertragen, wo sie als das Template diente. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt:

94°C 3 min

94°C 30 sec

55°C 30 sec 30 Zyklen

72°C 1 min

72°C 10 min
Nach der PCR-Reaktion wurden 10 μl PCR-Produkte in 1% Agarose in 0,5 × TBE-Puffer geladen und das Gel unter 90 V für eine Stunde laufen gelassen und dann unter UV-Licht sichtbar gemacht, wobei alle Kolonien ein positives Ergebnis ergaben.
Dann wurde das Plasmid aus 3 von 8 dieser Klone mit „Wizard Plus Minipreps DNA Purification System" (Promega) extrahiert. Die Plasmide wurden unter Verwendung des ET-Terminator-Kits (Amersham) mit den beiden Primern AM298-CDSF und AM298-CDSR sequenziert und die 3 Klone erwiesen sich als identisch, wobei die Volllängensequenz in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist.
Ein Plasmid enthaltend eine DNA-Sequenz, die für die alpha-Amylase AM782 kodiert, wurde in einen Stamm von Escherichia coli DH10B transformiert, welcher von den Erfindern nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, am 29. November 2002 unter der Hinterlegungsnummer DSM 15334 hinterlegt wurde. Die Hinterlegung wurde von Novozymes A/S durchgeführt. Es wird angenommen, dass die DNA-Sequenz dieses Plasmids die DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 3 enthält.
Eine weitere Sequenzanalyse des cDNA-Klons zeigte, dass die Sequenz eine kodierende Region von 1413 Nukleotiden enthält. Das Translationsprodukt der kodierenden Region ist ein Peptid von 471 Aminosäuren. Die abgeleitete Aminosäuresequenz, die von diesem Gen kodiert wird, mit einem Signalpeptid (von aa 1–21) und einem reifen Peptid (von aa 22–471) ist in SEQ ID Nr. 4 gezeigt.
Beispiel 3
Subklonieren und heterologe Expression von AM782-Amylase.
Stämme und Plasmide

Der A. oryzae-Stamm BECh2, der als Expressionswirt verwendet wurde, hat den folgenden Genotyp: amy^–, alp^–, Npl^–, CPA^–, KA^–. E. coli DH5alpha (Invitrogen^TM) wurde als Klonierungswirt bei der Konstruktion des Expressionsvektors verwendet. Das Expressionsplasmid pDAu71 (6), das das A. nidulans-amdS-Gen als Selektionsmarker in Aspergillus und das Ampicillinresistenz-Gen zur Selektion in E. coli, zwei Kopien des A. niger-NA2-Promotors (neutrale Amylase) mit 3 zusätzlichen amyR-Stellen + dem 5'-untranslatierten Teil des A. nidulans-TP1-Promotors zur heterologen Expression und den A. niger-AMG-Terminator enthält, wurde verwendet. PCR-Amplifikation:

10 × PCR-Puffer (einschl. MgCl₂)	5 μl
2,5 mM dNTP-Mix	5 μl
168/R.p. amy3-forw (10 μM)	5 μl
169/R.p. amy4-rev (10 μM)	5 μl
„Expand High Fidelity"-Polymerase (Roche)	0,5 μl
Template-DNA	1 μl
Zufügen von autoklaviertem destilliertem Wasser auf	50 μl

Bedingungen:
Konstruktion von Plasmid pPFJo143 (7): Ein DNA-Fragment, das das AM782-Gen enthielt, wurde aus einem Plasmid PCR-amplifiziert, das die Vollängen-cDNA mit Primern enthielt, die aus der vollständigen Sequenz entwickelt wurden:
Primer 168/R.p. amy3-forw (SEQ ID Nr. 5): gaagatctaccatgaaattcagcatctctctc
Primer 169/R.p. amy4-rev (SEQ ID Nr. 6): ccgctcgagttaagcagaggtgaagatagc
Die Primer haben an den Enden die Klonierungsrestriktions-Schnittstellen BglII bzw. XhoI. Ein Pool des PCR-Produkts aus einzelnen PCR-Reaktionen wurde zum Klonieren verwendet. Das PCR-Produkt wurde mit BglII und XhoI verdaut und in pDAu71 kloniert, welches mit BamHI und XhoI verdaut war. Das PCR-Produkt wurde sequenziert und es wurde verifiziert, dass es mit der Originalsequenz identisch war.
Die Transformation von BECh2 wurde durch ein Verfahren durchgeführt, das Protoplastenbildung und Transformation dieser einbezieht. Geeignete Vorgehensweisen zur Transformation von Aspergillus sind beschrieben in EP 0 238 023 und Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470–1474. Die Transformanten wurden isoliert und in kleinen Nunc-Gefäßen in 10 ml YPM (1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton und 2% Maltose) für 3 Tage bei 30°C (geschüttelt) wachsen gelassen.
SDS-PAGE-Gel-Elektrophorese: 10 μl Überstandsproben aus den vorstehend beschriebenen 10 ml-Kulturen wurden einer SDS-Gel-Elektrophorese unterzogen. Die Gele wurden mit „SYPRO Orange Protein Gel Stain" (Molecular Probes) gefärbt.
Die alpha-Amylase wurde durch PNP wie folgt getestet. Eine Arbeitslösung wurde hergestellt: 5 ml alpha-Glucosidaselösung + 1 ml Substratlösung (PNP-Substrat). Termamyl^TM wurde als Standard zugefügt (Konzentrationen von 0–100 NU/ml). Puffer zur Verdünnung: 50 mM Essigsäure, Borsäure und phosphorige Säure und 0,1 mM CaCl₂ + 0,25% BRIJ35. 20 μl Überstand in einer Mikrotiterplatte wurden für 2 min. inkubiert. 200 μl Arbeitslösung wurden hinzugefügt. Kinetiken bei 405 nm über 3 min.
Der PCR-amplifizierte ORF wurde wie in Material und Methoden beschrieben in den Expressionsvektor pDAu71 kloniert, was in pPFJo 143 resultierte (7). Das Plasmid wurde in BECh2 (A. oryzae) transformiert. 10 Transformanten wurden isoliert, in YPM für 3 Tage wachsen gelassen und der Überstand auf einer SDS-PAGE laufen gelassen. Dies zeigte verschiedene Expressionsniveaus im Bereich von sehr geringer bis ganz guter Expression. Das Molekulargewicht ist um 50 kDa, im Einklang mit dem, was für das Wildtypenzym gefunden wurde. Die Transformante BECh2/pPFJo143-9 wurde zur Fermentierung zur Aufreinigung der Amylase im kleinen Maßstab ausgewählt. Ein alpha-Amylase-Test wurde gemäß Material und Methoden durchgeführt (Tabelle 1). Er wurde mit Termamyl^TM als einem Standard durchgeführt – und die Einheiten sind NU/ml – was bedeutet, dass wir nur relative Zahlen erhielten, aber wir konnten sehen, dass es eine gute Korrelation zwischen Aktivität und Proteinmenge gab.
Tabelle 1: Überstände aus der Fermentation von 10 Transformanten 143-1 bis 143-10 wurden unter Verwendung eines PNP-Substrats einem alpha-Amylase-Test unterzogen. Die Zahlen sind relative Zahlen.
Beispiel 4
Untersuchung des Zuckerprofils von Maltodextrinhydrolyse durch die alpha-Amylase AM782.
Gerätschaft

Temperiertes Wasserbad Heto-Laborausrüstung DT1; pH-Meter (Mettler MP220); HPLC Waters System (A/P TSCN-QI-2411); elektronische Pipette; Spektrophotometer UV-1601; Waage (Mettler AG 204); Refraktometer.

Gläsgeräte

250 ml-Flasche mit Deckel; schwere Ringe für die Flasche; 500 ml-Messkolben; 500 ml-Becher; 10 ml-Glasröhrchen.

Enzyme

AM 782 alpha-Amylase mit 0,225 FAU/ml und als Kontrolle eine kommerziell erhältliche Pilzamylase Fungamyl^TM 800 L (Novozymes A/S, Dänemark; AFN-000515) mit 0,135 FAU/g TM.

Amylolytische Aktivität
Die alpha-Amylase-Aktivität kann in „Pilz-alpha-Amylase-Einheiten" (FAU; Fungal alpha-Amylase Units) ausgedrückt werden. Ein (1) FAU ist die Menge Enzym, die unter Standardbedingungen (d. h. bei 37°C und pH 4,7) 5260 mg feste Stärke (Amylum solubile, Merck) pro Stunde abbaut. Ein Ordner AF 9.1/3, der diesen FAU-Test ausführlicher beschreibt, ist auf Anfrage von Novozymes A/S, Dänemark, erhältlich, wobei dieser Ordner hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Substrat

DE 11 Maltodextrin FFS-99039

Protokoll
Zwei Wasserbäder wurden auf eine Temperatur von 55°C bzw. 70°C eingestellt. 53 g Maltodextrin wurden langsam in 397 g kochendes Milli-Q-Wasser im Glasbecher zugefügt und gleichzeitig mit einem elektrischen Rührer gerührt, bis das gesamte Maltodextrin in dem Wasser gelöst war. Das Gewicht der Maltodextrinlösung wurde aufgeschrieben und mehr kochendes Wasser wurde auf 450 g zugefügt. Die Maltodextrinlösung wurde in das Wasserbad überführt und auf die Hydrolysetemperatur abgekühlt. Dann wurde die Maltodextrinlösung in zwei gleiche Teile geteilt: Ein Teil wurde auf pH 5,0 mit 1 N HCl eingestellt, der Rest wurde bei seinem natürlichen pH (5,5) gehalten. Die Substratkonzentration wurde mittels Refraktometer überprüft (TM ungefähr 10%).
Die Maltodextrinlösungen wurden in vier 250 ml-Flaschen mit Deckel überführt: Flasche # 1 mit 90 g Lösung, pH 5,5; Flaschen #2 & #3 mit 90 g Lösung, pH 5,0; Flasche #4 mit 95 g Lösung, pH 5,5. Die Flaschen wurden in den Wasserbädern bei der Hydrolysetemperatur belassen, Flaschen #1–3 bei 70°C und Flasche #4 bei 5°C.
10 ml verdünntes AM782-Enzym (6 ml AM782-Probe mit 4 ml Milli-Q-Wasser) wurden zu jeder der Flaschen #1–3 zugefügt, die 90 g Lösung enthielten, und 5 ml verdünntes Fungamyl^TM (0,04 g Fungamyl in 100 ml Milli-Q-Wasser) wurden zu Flasche #4 zugefügt, die 95 g Lösung enthielt. Auf diese Weise wurden die AM782 und das Funagmyl^TM auf das gleiche Aktivitätsniveau d. h. 0,135 FAU/g TM dosiert.
Der pH jeder Flasche wurde überprüft und die TM jeder Flasche wurde durch Probennahme bei T = 0 Stunden gemessen. Danach wurden 4 ml-Proben aus jeder Schüttelflasche bei T = 3, 6, 9, 21, 24, 28, 45 und 48 Stunden nach Inkubation in den Wasserbädern genommen.
Die Enzyme in den Hydrolyseproben wurden sofort nach Probennahme durch Kochen der Proben für 15 Minuten und dann Abkühlen auf Raumtemperatur für die HPLC-Analyse inaktiviert. Nach dem Abkühlen wurden pH und TM jeder Probe gemessen, um die Probenverdünnung zu bestimmen und dann wurde die Probe mit Milli-Q-Wasser auf eine Konzentration von TM = 5% verdünnt. Die Proben wurden mit Mischbett-Ionenaustauschharz (BioRad AG 501/X8 (D)) vermischt und für 20 Minuten stehen gelassen, dies entfernt Asche und lösliches N aus den Proben. Die Proben wurden dann durch einen 0,2 μm-Filter (Sartorius MINISART^TM NML 0,2 Micron) filtriert und die filtrierten Proben wurden in HPLC-Flaschen gesammelt und durch HPLC analysiert. Die Ergebnisse sind nachfolgend in Tabellen 2–4 und in 8 angegeben.
Tabelle 2. Flasche #1 mit AM782 (0,135 FAU/g TM) bei 70°C und anfänglichem pH 5,5
Tabelle 3. Flasche #2 & #3 mit AM782 (0,135 FAU/g TM) bei 70°C und anfänglichem pH 5,
Tabelle 4. Flasche #4 mit Fungamyl^TM 800 L (0,135 FAU/g TM) bei 55°C und anfänglichem pH 5,5
Dieses Experiment zeigte, dass die Amylase AM782 bei einer sehr hohen Temperatur, mindestens bis zu 70°C, arbeiten kann. Die Amylase AM782 hat eine sehr hohe Reaktionsgeschwindigkeit; im Vergleich zur gleichen Dosis mit Fungamyl^TM 800 L kann die Amylase AM782 in ungefähr 3 Stunden das erreichen, wozu Fungamyl^TM 24 bis 48 Stunden braucht. Darüber hinaus kann die Amylase AM782 DP3 in DP2 und DP1 abbauen, so dass es ein höheres DP1-Ergebnis gibt.
SEQUNZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polynukleotid enthaltend einen offenen Leserahmen, der für ein Polypeptid mit alpha-Amylase-Aktivität kodiert, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Polypeptid enthaltend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 70% Identität mit den Aminosäuren 22 bis 450 von SEQ ID Nr. 4 aufweist; b) einem Polypeptid enthaltend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 70% Identität mit einem Polypeptid aufweist, das von dem Amylase kodierenden Teil des Polynukleotids kodiert wird, das in ein Plasmid insertiert ist, das in dem E. coli-Wirt vorhanden ist, der nach dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Zugangsnummer DSM 15334 hinterlegt wurde; c) einem Polypeptid, das von einem Polynukleotid enthaltend eine Nukleotidsequenz, die mindestens 70% Identität mit der Sequenz aufweist, die von Position 68 bis 1417 in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist, kodiert wird; und d) einem Fragment von (a), (b) oder (c), das alpha-Amylase-Aktivität aufweist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine künstliche Variante enthaltend eine Aminosäuresequenz, die eine oder mehrere Trunkierung(en) und/oder mindestens eine Substitution, Deletion und/oder Insertion einer Aminosäure im Vergleich zu den Aminosäuren 22 bis 450 von SEQ ID Nr. 4 aufweist, ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz enthält, die mindestens 70% Identität mit den Aminosäuren 22 bis 450 von SEQ ID Nr. 4 aufweist.
Polynukleotid nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polypeptid die Aminosäuren 22 bis 450 von SEQ ID Nr. 4 enthält.
Polynukleotid nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Polypeptid aus den Aminosäuren 22 bis 450 von SEQ ID Nr. 4 besteht.
Nukleinsäurekonstrukt enthaltend ein wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5 definiertes Polynukleotid, das funktionsfähig mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen verbunden ist, die die Herstellung des Polypeptids in einer geeigneten Wirtszelle steuern.
Rekombinanter Expressionsvektor enthaltend ein wie in Anspruch 6 definiertes Nukleinsäurekonstrukt.
Rekombinante Wirtszelle enthaltend ein wie in Anspruch 6 definiertes Nukleinsäurekonstrukt oder mindestens eine Kopie eines wie in Anspruch 7 definierten Expressionsvektors.
Zelle nach Anspruch 8, die ein Mikroorganismus ist.
Zelle nach Anspruch 9, die ein Bakterium oder ein Pilz ist.
Zelle nach Anspruch 10, die ein grampositives Bakterium wie Bacillus subtillis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulens, Bacillus circulans, Bacillus lautus oder Bacillus thuringiensis ist.
Zelle nach Anspruch 10, die ein Protease-defizienter Stamm des Pilzes Aspergillus, insbesondere A. oryzae, ist.
Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids mit alpha-Amylase-Aktivität, das von einem wie in den Ansprüchen 1 bis 5 definierten Polynukleotid kodiert wird, wobei das Verfahren umfasst: (a) Kultivieren einer wie in einem beliebigen der Ansprüche 8 bis 12 definierten rekombinanten Wirtszelle unter Bedingungen, die der Herstellung des Polypeptids zuträglich sind; und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Verfahren zum Herstellen eines enzymatisch modifizierten Stärkederivats, wobei ein Polypeptid mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in Anspruch 13 definierten Verfahren hergestellt wurde, zur Verflüssigung und/oder Saccharifizierung von Stärke verwendet wird.
Verfahren zum Herstellen von Sirupen mit hohem Maltosegehalt, wobei ein Polypeptid mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in Anspruch 13 definierten Verfahren hergestellt wurde, zum Verflüssigen von Stärke verwendet wird.
Verfahren zum Entschlichten einer Textilie, wobei ein Polypeptid mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in Anspruch 13 definierten Verfahren hergestellt wurde, zum Behandeln der Textilie verwendet wird.
Brauverfahren, wobei ein Polypeptid mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in Anspruch 13 definierten Verfahren hergestellt wurde, während der Fermentation von Stammwürze zugegeben wird.
Alkoholherstellungsverfahren, wobei ein Polypeptid mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in Anspruch 13 definierten Verfahren hergestellt wurde, zur Verflüssigung von Stärke in einer Distilleriemaische verwendet wird.
Verfahren, wobei ein Teigprodukt enthaltend ein Polypeptid mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in Anspruch 13 definierten Verfahren hergestellt wurde, gebacken wird.
Verwendung eines Polypeptids mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in Anspruch 13 definierten Verfahren hergestellt wurde, in einem Stärkeumwandlungsverfahren zur Verflüssigung und/oder Saccharifizierung.
Verwendung eines Polypeptids mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in Anspruch 13 definierten Verfahren hergestellt wurde, zum Verflüssigen von Stärke in einem Herstellungsverfahren für Sirup mit hohem Maltosegehalt.
Verwendung eines Polypeptids mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in Anspruch 13 definierten Verfahren hergestellt wurde, zum Entschlichten einer Textilie.
Verwendung eines Polypeptids mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in Anspruch 13 definierten Verfahren hergestellt wurde, zum Herstellen von Alkohol.
Verwendung eines Polypeptids mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in Anspruch 13 definierten Verfahren hergestellt wurde, zum Brauen.
Verwendung eines Polypeptids mit alpha-Amylase-Aktivität, das nach einem wie in Anspruch 13 definierten Verfahren hergestellt wurde, zum Backen.