CN106093426A - 一种测定胱抑素c的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测定胱抑素C的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒：试剂R1：缓冲液、无机盐离子、加速剂、稳定剂、防腐剂，试剂R2：缓冲液、稳定剂、助悬剂、表面活性剂、聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物、防腐剂、胶乳包被抗人胱抑素C抗体，制备方法为：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的胱抑素C的浓度。本发明具有准确度高等优点。

Description

一种测定胱抑素C的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定胱抑素C的试剂盒及其制备方法。
背景技术
胱抑素C(Cys-C)，是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，也被称为γ-微量蛋白及γ-后球蛋白，广泛存在于各种组织的有核细胞和体液中，是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质，分子量为13.3KD,由122个氨基酸残基组成,可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定,循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除，是一种反映肾小球滤过率变化的内源性标志物,并在近曲小管重吸收，但重吸收后被完全代谢分解，不返回血液，因此，其血中浓度由肾小球滤过决定，而不依赖任何外来因素，如性别、年龄、饮食的影响，是一种反映肾小球滤过率变化的理想同源性标志物。
正常情况下，胱抑素C(Cys-C)在血清和血浆中的浓度为0.51-1.09mg/L,当肾功能受损时，胱抑素C(Cys-C)在血液中的浓度随肾小球滤过率变化而变化,肾衰时, 肾小球滤过率下降，Cys-C在血液中浓度可增加10多倍；若肾小球滤过率正常,而肾小管功能失常时，会阻碍Cys-C在肾小管吸收并迅速分解,使尿中的浓度增加100多倍。
目前临床检测胱抑素C的主要方法有酶联免疫吸附法、胶体金法， 酶联免疫吸附法操作复杂、耗时长，且对操作者有一定的专业技能要求，且无法定量检测，胶体金法只能定性检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服操作复杂且不能定量检测的缺陷，而提供一种测定胱抑素C的试剂盒及其制备方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种测定胱抑素C的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 40~180 mmol/L
无机盐离子 50~100 mmol/L
加速剂 5~20 g/L
稳定剂 5~15 g/L
防腐剂 0.4~1.2 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 40~180 mmol/L
稳定剂 10~30 g/L
助悬剂 5~35 mmol/L
表面活性剂 0.5~2.0 mL/L
聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 0.2~1.2 g/L
防腐剂 0.4~1.2 g/L
胶乳包被抗人胱抑素C抗体 0.5~3.0 g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明公开了一种测定胱抑素C的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 110 mmol/L
无机盐离子 70 mmol/L
加速剂 12 g/L
稳定剂 10 g/L
防腐剂 0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 110 mmol/L
稳定剂 20 g/L
助悬剂 20 mmol/L
表面活性剂 1.5 mL/L
聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 0.7 g/L
防腐剂 0.8 g/L
胶乳包被抗人胱抑素C抗体 2.0 g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，所述的试剂R1中，所述的缓冲液采用MES缓冲液、MOPS缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，所述的无机盐离子采用氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中的一种或多种的组合，所述的加速剂采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种的组合，所述的稳定剂采用牛血清白蛋白、甘露糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠、果糖中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用苯酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种的组合。
作为优选，所述的试剂R2中，所述的缓冲液采用MES缓冲液、MOPS缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，所述的稳定剂采用牛血清白蛋白、甘露糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠、果糖中的一种或多种的组合，所述的助悬剂采用***胶、海藻酸钠、胶体二氧化硅、甘油中的一种或多种组合而成，所述的表面活性剂采用曲拉通X-100，所述的防腐剂采用苯酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种的组合。
作为优选，所述的试剂R2中，所述的胶乳包被抗人胱抑素C抗体的制备方法为：用50mmol/L的MES缓冲液将粒径为30~200nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1.5%的溶液，然后每毫升溶液中加入0.8 mg 的1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）碳化二亚胺盐酸盐，在20℃~37℃的条件下反应2小时，使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，然后将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散，再使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使得溶液中的聚苯乙烯微球的最终质量浓度为3.0%，超声分散，然后边分散边加入等体积的含8㎎/ml的抗人胱抑素C抗体的MES缓冲液，混合搅拌，在20℃~37℃的条件下反应2小时，直至溶液中的聚苯乙烯微球的最终质量浓度为1.5%为止，加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白的最终浓度为10 g/L为止，在4℃条件下封闭12~18小时，即可制备得到胶乳包被抗人胱抑素C抗体。
作为优选，所述的抗人胱抑素C抗体为含有能与人胱抑素C特异性结合的Fab功能部位的完整抗体或抗体片段。
作为优选，本发明还公开了上述测定胱抑素C的试剂盒的制备方法和使用方法，包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
本发明公开了一种测定胱抑素C的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 40~180 mmol/L
无机盐离子 50~100 mmol/L
加速剂 5~20 g/L
稳定剂 5~15 g/L
防腐剂 0.4~1.2 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 40~180 mmol/L
稳定剂 10~30 g/L
助悬剂 5~35 mmol/L
表面活性剂 0.5~2.0 mL/L
聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 0.2~1.2 g/L
防腐剂 0.4~1.2 g/L
胶乳包被抗人胱抑素C抗体 0.5~3.0 g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的胱抑素C的浓度。
作为优选，步骤（b）中，所述的试剂R1与试剂R2的体积比为9:2。
作为优选，步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:5到1:100之间。
本发明的检测原理是：样品中胱抑素C可与试剂中相应的特异性抗-Cys-C抗体结合形成抗原-抗体复合物，产生一定浊度，该浊度高低在一定抗体存在时与抗原的含量成正比，在一定波长下测定浊度并通过多点定标曲线可进行胱抑素C的定量测定。
样本中胱抑素C（Cys-C）活性（mg/L）= CS ×（mg/L）
式中：ΔAT 以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值
ΔAS 以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值
CS 校准液中Cys-C的浓度
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：本发明在试剂R2中添加了甘油作为助悬剂，在表面活性剂的作用下，使得胶乳包被抗人胱抑素C抗体可均匀悬浮于试剂R2中，同时在试剂R2中添加了聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物，该共聚物可使胶乳颗粒之间不相互聚集，大大提高了试剂R2的稳定性和抗体的效价，在加入样本后参与反应时，在试剂R1中加速剂的作用下，可迅速与胶乳包被抗人胱抑素C抗体发生反应，因胶乳包被抗人胱抑素C抗体悬浮分散均匀，即使在较低的浓度下，也可迅速发生反应，使得试剂的检测灵敏度也进一步提高，检测的准确度也就大大提高，而且操作方便。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
Tris缓冲液 110 mmol/L
氯化钾 70 mmol/L
聚乙二醇-6000 12 g/L
牛血清白蛋白 10 g/L
苯酚 0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
MES缓冲液 110 mmol/L
甘露糖 20 g/L
海藻酸钠 20 mmol/L
曲拉通X-100 1.5 mL/L
聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 0.7 g/L
苯酚 0.8 g/L
胶乳包被抗人胱抑素C抗体 2.0 g/L
其溶剂为纯化水。
实施例2
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
MOPS缓冲液 40 mmol/L
氯化钠 100 mmol/L
聚乙二醇-8000 20 g/L
山梨醇 5 g/L
苯甲酸钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
MOPS缓冲液 180 mmol/L
牛血清白蛋白 10 g/L
海藻酸钠 35 mmol/L
曲拉通X-100 0.5 mL/L
聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 1.2 g/L
叠氮钠 0.4 g/L
胶乳包被抗人胱抑素C抗体 3.0 g/L
其溶剂为纯化水。
实施例3
试剂盒的制备和使用方法
1、胶乳包被抗人胱抑素C抗体的制备：用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为120nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1.5%的溶液，然后每毫升溶液中加入0.8 mg 的1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）碳化二亚胺盐酸盐，在25℃的条件下反应2小时，使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，然后将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散，再使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使得溶液中的聚苯乙烯微球的最终质量浓度为3.0%，超声分散，然后边分散边加入等体积的含8㎎/ml的抗人胱抑素C抗体的MES缓冲液，混合搅拌，在25℃的条件下反应2小时，直至溶液中的聚苯乙烯微球的最终质量浓度为1.5%为止，加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白的最终浓度为10 g/L为止，在4℃条件下封闭15小时，即可制备得到胶乳包被抗人胱抑素C抗体；
2、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
Tris缓冲液 110 mmol/L
氯化钾 70 mmol/L
聚乙二醇-6000 12 g/L
牛血清白蛋白 10 g/L
苯酚 0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
MES缓冲液 110 mmol/L
甘露糖 20 g/L
海藻酸钠 20 mmol/L
曲拉通X-100 1.5 mL/L
聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 0.7 g/L
苯酚 0.8 g/L
胶乳包被抗人胱抑素C抗体 2.0 g/L
其溶剂为纯化水；
3、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长546nm，副波长800nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应；
4、检测步骤
（a）取225μl试剂R1与3μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入50μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 根据样本中胱抑素C（Cys-C）活性（mg/L）= CS × （mg/L）计算出样本中的胱抑素C的浓度。
实施例4
试剂盒的制备和使用方法
1、胶乳包被抗人胱抑素C抗体的制备：用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为70nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1.5%的溶液，然后每毫升溶液中加入0.8 mg 的1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）碳化二亚胺盐酸盐，在25℃的条件下反应2小时，使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，然后将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散，再使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使得溶液中的聚苯乙烯微球的最终质量浓度为3.0%，超声分散，然后边分散边加入等体积的含8㎎/ml的抗人胱抑素C抗体的MES缓冲液，混合搅拌，在25℃的条件下反应2小时，直至溶液中的聚苯乙烯微球的最终质量浓度为1.5%为止，加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白的最终浓度为10 g/L为止，在4℃条件下封闭15小时，即可制备得到胶乳包被抗人胱抑素C抗体；
2、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
MOPS缓冲液 40 mmol/L
氯化钠 100 mmol/L
聚乙二醇-8000 20 g/L
山梨醇 5 g/L
苯甲酸钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
MOPS缓冲液 180 mmol/L
牛血清白蛋白 10 g/L
海藻酸钠 35 mmol/L
曲拉通X-100 0.5 mL/L
聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 1.2 g/L
叠氮钠 0.4 g/L
胶乳包被抗人胱抑素C抗体 3.0 g/L
其溶剂为纯化水；
3、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长546nm，副波长800nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应；
4、检测步骤
（a）取225μl试剂R1与3μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入50μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 根据样本中胱抑素C（Cys-C）活性（mg/L）= CS × （mg/L）计算出样本中的胱抑素C的浓度。
表1为实施例1所制得的测定胱抑素C的试剂盒以及实施例2所制得的测定胱抑素C的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的胱抑素C的浓度为 1.00 mg/L，测定结果见表1：
表1
第1次（mg/L） 第2次（mg/L） 第3次（mg/L） 均值（mg/L） 偏差（%）
实施例1 0.98 1.02 0.98 0.99 1.00
实施例2 1.02 1.03 1.03 1.03 3.00
由表1可知，本发明所制得的测定胱抑素C的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表2为实施例1所制得的测定胱抑素C的试剂盒以及实施例2所制得的测定胱抑素C的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的胱抑素C的浓度为 2.40 mg/L，测定结果见表2：
表2
第1次（mg/L） 第2次（mg/L） 第3次（mg/L） 均值（mg/L） 偏差（%）
实施例1 2.37 2.39 2.48 2.41 0.42
实施例2 2.32 2.36 2.35 2.34 2.50
由表2可知，本发明所制得的测定胱抑素C的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表3为实施例3所制得的测定胱抑素C的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定胱抑素C的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：
表3
由表3可知本发明所制得的测定胱抑素C的试剂盒的精密度比较好，而且由表1可知，实施例3为最优的选择。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种测定胱抑素C的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 40~180 mmol/L
无机盐离子 50~100 mmol/L
加速剂 5~20 g/L
稳定剂 5~15 g/L
防腐剂 0.4~1.2 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 40~180 mmol/L
稳定剂 10~30 g/L
助悬剂 5~35 mmol/L
表面活性剂 0.5~2.0 mL/L
聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 0.2~1.2 g/L
防腐剂 0.4~1.2 g/L
胶乳包被抗人胱抑素C抗体 0.5~3.0 g/L
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种测定胱抑素C的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 110 mmol/L
无机盐离子 70 mmol/L
加速剂 12 g/L
稳定剂 10 g/L
防腐剂 0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 110 mmol/L
稳定剂 20 g/L
助悬剂 20 mmol/L
表面活性剂 1.5 mL/L
聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 0.7 g/L
防腐剂 0.8 g/L
胶乳包被抗人胱抑素C抗体 2.0 g/L
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1或2所述的一种测定胱抑素C的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1中，所述的缓冲液采用MES缓冲液、MOPS缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，所述的无机盐离子采用氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中的一种或多种的组合，所述的加速剂采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种的组合，所述的稳定剂采用牛血清白蛋白、甘露糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠、果糖中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用苯酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种的组合。
4.根据权利要求1或2所述的一种测定胱抑素C的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2中，所述的缓冲液采用MES缓冲液、MOPS缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，所述的稳定剂采用牛血清白蛋白、甘露糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠、果糖中的一种或多种的组合，所述的助悬剂采用***胶、海藻酸钠、胶体二氧化硅、甘油中的一种或多种组合而成，所述的表面活性剂采用曲拉通X-100，所述的防腐剂采用苯酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种的组合。
5.根据权利要求1或2所述的一种测定胱抑素C的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2中，所述的胶乳包被抗人胱抑素C抗体的制备方法为：用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为30~200nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1.5%的溶液，然后每毫升溶液中加入0.8 mg 的1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）碳化二亚胺盐酸盐，在20℃~37℃的条件下反应2小时，使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，然后将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散，再使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使得溶液中的聚苯乙烯微球的最终质量浓度为3.0%，超声分散，然后边分散边加入等体积的含8㎎/ml的抗人胱抑素C抗体的MES缓冲液，混合搅拌，在20℃~37℃的条件下反应2小时，直至溶液中的聚苯乙烯微球的最终质量浓度为1.5%为止，加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白的最终浓度为10 g/L为止，在4℃条件下封闭12~18小时，即可制备得到胶乳包被抗人胱抑素C抗体。
6.根据权利要求5所述的一种测定胱抑素C的试剂盒，其特征在于：所述的抗人胱抑素C抗体为含有能与人胱抑素C特异性结合的Fab功能部位的完整抗体或抗体片段。
7.根据权利要求1或2所述的一种测定胱抑素C的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
本发明公开了一种测定胱抑素C的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 40~180 mmol/L
无机盐离子 50~100 mmol/L
加速剂 5~20 g/L
稳定剂 5~15 g/L
防腐剂 0.4~1.2 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 40~180 mmol/L
稳定剂 10~30 g/L
助悬剂 5~35 mmol/L
表面活性剂 0.5~2.0 mL/L
聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 0.2~1.2 g/L
防腐剂 0.4~1.2 g/L
胶乳包被抗人胱抑素C抗体 0.5~3.0 g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的胱抑素C的浓度。
8.根据权利要求7所述的一种测定胱抑素C的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的试剂R1与试剂R2的体积比为9:2。
9.根据权利要求7所述的一种测定胱抑素C的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:5到1:100之间。
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