CN103792353B - 一种脂蛋白相关磷脂酶a2含量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脂蛋白相关磷脂酶A2含量检测试剂盒及其制备方法，属于脂蛋白相关磷脂酶A2含量的检测领域。试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、促凝剂、防腐剂、螯合剂和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂和水。本发明采用粒径为120～180nm的胶乳颗粒制备包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒，能有效保证试剂盒的稳定性、灵敏度以及较宽的检测线性范围，同时本发明中采用特定的方法制备包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒使得试剂盒的开瓶稳定性以及检测特异性更好，使产品更适合于临床检测的推广和应用。

Description

一种脂蛋白相关磷脂酶A2含量检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于脂蛋白相关磷脂酶A2含量的检测领域，特别涉及一种脂蛋白相关磷脂酶A2含量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
脂蛋白相关磷脂酶A2（Lipoprotein-associated Phospholipase A2，Lp-PLA2）是由PLA2G7基因编码，由于脂蛋白相关磷脂酶A2具有降解血小板活化因子的活性，因而也被称为降解血小板活化因子（platelet-activating factor acetylhydro-lase，PAF-AH）。脂蛋白相关磷脂酶A2是磷脂酶A2超家族成员之一，与磷脂酶A2家族其他成员不同的是，Lp-PLA2不需要钙离子维持其催化活性。迄今为止，已知Lp-PLA2有两种类型：血浆型Lp-PLA2、细胞型Lp-PLA2。血浆型Lp-PLA2由441个氨基酸组成的蛋白质，分子量为45kDa。细胞型Lp-PLA2包括两种不同的类型。人血浆Lp-PLA2主要由成熟的巨噬细胞、单核细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、干细胞等分泌产生，并受炎性介质的调节，如γ干扰素和脂多糖抑制其分泌，血小板活化因子（platelet-activating factor，PAF）促进其分泌。Lp-PLA2的主要作用包括：产生二十烷酸类炎性介质、参与磷脂重建及生物膜的稳定平衡、脂蛋白的代谢、细胞传递、宿主反应、促进机体坏死组织自体消失等。血小板活化因子有促进血小板聚集、中性粒细胞和单核细胞趋化以及促进白三烯等炎症介质释放，从而促进血栓形成和炎症反应。而Lp-PLA2能将PAF水解为无活性的溶血PAF，故能减少炎症和血栓的形成，具有抗炎和抗动脉粥样硬化作用。
Lp-PLA2似乎在血管炎症中发挥作用，且被认为促进动脉粥样硬化。最近的一些研究表明，Lp-PLA2是心血管病（CVD）、冠心病（CHD）以及缺血性脑卒中的独立危险因素。在这些研究中，我们可以在很多被诊断为冠心病和缺血性脑卒中的患者中看到Lp-PLA2浓度的增加。这些发现使这个相对较新的检测作为越来越多的心脏风险标志物之一是有用的，心脏风险标志物是用来帮助确定一个人发展心血管疾病的风险。当患者有冠心病，代谢综合症，和/或被认为有中度或更高的风险患冠心病或缺血性脑卒中时，医生会建议进行Lp-PLA2的测试。当患者有炎症，及高敏C反应蛋白检测无法进行时，这个测试是很有用的。
鉴于Lp-PLA2的检测可以作为评价心脏风险标志物的指标，开发该指标的检测试剂盒有利于该指标检测的临床应用。目前该指标常用的检测方法有酶联免疫吸附测定法、酶法以及免疫比浊法。酶联免疫法具有检测精确度高、灵敏度好等优良特性，但该检测方法操作繁琐、检测耗时长，且样本只能批量检测，不能满足医院对该检测指标的时效性、可重复性及操作简单等特性方面的需求；酶法检测的精确度不高，容易导致检测实验结果的误差，从而导致结果误判，对病人产生不利的影响。胶乳免疫比浊法也是测定Lp-PLA2的一种方法，它是基于普通的免疫比浊法，但它克服了普通免疫比浊法灵敏度不高的缺陷，同时还克服了ELISA方法的缺陷，具有操作简单、检测时间短、灵敏度高、线性范围宽等诸多优良的特性。目前，也有一些Lp-PLA2的胶乳免疫比浊法产品及试剂盒，但是这些试剂盒存在着线性范围窄、稳定性差以及检测灵敏度及特异性差等方面的问题，需要做进一步的改进，以使研发和生产出来的试剂盒能更好的满足临床检测的需求。
发明内容
本发明的目的是为解决上述问题而提供了一种稳定性好、灵敏度高、特异性强、操作简单、线性范围宽的脂蛋白相关磷脂酶A2含量检测试剂盒及其制备方法。
本发明所采用的技术方案是：
一种脂蛋白相关磷脂酶A2含量检测试剂盒，所述试剂盒由试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成，所述试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、促凝剂、防腐剂、螯合剂和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂和水。
优选地，所述包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒的粒径为120～180nm。
胶乳颗粒的粒径对试剂盒的稳定性、灵敏度以及检测结果的准确性等有着非常显著的影响，当选用的胶乳颗粒的粒径为120～180nm时，制备出的检测试剂盒的稳定性、灵敏度以及检测线性范围等特性要明显优于其它粒径的胶乳颗粒。
进一步地，所述包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒采用化学交联法制备得到，所述化学交联法制备包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒包括以下步骤：
（1）胶乳颗粒的洗涤活化：取粒径为120～180nm的聚苯乙烯胶乳颗粒分散于MES缓冲液中，缓冲液中胶乳颗粒的浓度为0.6%～3%，离心弃上清；将洗涤过的胶乳颗粒分散于MES缓冲液中，缓冲液中胶乳颗粒的浓度为0.6%～3%，取碳化二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺分别用MES缓冲液溶解后加入胶乳溶液中，混合均匀置于26～38℃恒温摇床上反应0.5～3h，得到活化的胶乳颗粒；
（2）胶乳颗粒的抗体致敏：向活化完成的胶乳溶液中加入脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，震荡混合均匀，置于26～38℃恒温摇床上反应8～12h，反应完成后向反应体系中加入甘氨酸溶液，混合均匀，并在室温下静置反应15～40min；
（3）致敏胶乳颗粒的封闭及洗涤：向步骤（2）得到的终止反应的体系中加入BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应10～30min，得到包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒。
包被脂蛋白相关磷脂酶A2致敏胶乳颗粒可以采用化学交联法或物理吸附法等本领域的常规方法制备得到。本发明采用化学交联法制备的致敏胶乳颗粒，抗体与胶乳颗粒通过化学键结合，从而使抗体不容易从胶乳颗粒上脱落下来，有利于维持试剂盒产品的稳定性，使产品的货架期能显著延长、开瓶稳定性更好。其中脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体或多克隆抗体能很好的识别样品中的脂蛋白相关磷脂酶A2抗原，从而能很好的提高检测试剂盒的特异性。
优选地，所述生物缓冲剂为3-(N-吗啉基）丙磺酸；所述促凝剂为聚乙二醇6000；所述防腐剂为叠氮化钠；所述表面活性剂为吐温-20；所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠；所述的助悬剂是海藻酸钠。
本发明所述的生物缓冲剂能够使反应体系维持一定的pH值，各种能是反应体系维持一定pH值的物质均能作为本发明的生物缓冲剂，例如三羟甲基氨基甲烷（Tris）、三羟甲基甲胺基乙磺酸（TES）、2-（N-***啉）乙磺酸（MES）、哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸（POPSO）、3-（N-吗啉）丙磺酸（MOPS）中的一种或几种混合物；为了使试剂盒的各项性能最佳，本发明试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中的生物缓冲剂优选为3-(N-吗啉基）丙磺酸。
本发明所述的防腐剂主要是为了防止微生物滋生导致的产品变质从而对检测结果带来不良影响，因此，任何一种能阻止微生物繁殖的物质均能适用于本发明的防腐剂，如：苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、叠氮钠等中的一种或几种的混合物；为了保证试剂盒的各项性能处于最佳状态，本发明试剂Ⅰ和试剂Ⅱ优选叠氮化钠作为防腐剂。
本发明试剂Ⅰ所述的促凝剂可以促进样本中的抗原与胶乳颗粒表面的抗体相结合，有利于胶乳颗粒相互之间的交联，提高检测试剂盒的灵敏度；常用的促凝剂为聚乙二醇系列；本发明中采用聚乙二醇6000可以很好的促进胶乳颗粒的形成，并且也能较好的控制胶乳颗粒形成的速度和大小，对检测结果的判读有很大的好处，本发明优选聚乙二醇6000作为促凝剂。
本发明试剂Ⅰ中所述的螯合剂能够络合检测样本中的金属离子，避免金属离子对检测结果造成不良影响，能络合金属离子的各种螯合剂均能够适用本发明，例如：乙二胺四乙酸二钠，氨基三乙酸等。本发明优选乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）作为螯合剂。
本发明试剂Ⅱ所述的表面活性剂有利于反应过程中各组分以及检测样本各物质的均匀分散，使反应体系能处于均相状态，达到减少样本浊度对测定结果的影响的目的；现有的具有增溶性质物质均可以作为本发明的表面活性剂如：吐温系列、曲拉通系列、乙基苯基聚乙二醇等。为了保证试剂盒的性能更优良，本发明优选吐温-20作为表面活性剂。
本发明试剂Ⅱ所述的助悬剂可以帮助胶乳颗粒维持良好的分散状态，防止胶乳颗粒下沉对检测试剂盒的稳定性及检测结果的可靠性带来不良影响，各种能增加反应体系黏度的物质均能作为本发明的助悬剂，本发明优选海藻酸钠作为助悬剂。
优选地，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂5～100g，促凝剂1～38g，防腐剂0.1～10g，螯合剂0.05～6g，余量为水。
更优选地，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂10～25g，促凝剂12～25g，防腐剂0.5～5g，螯合剂0.1～3g，余量为水。
优选地，每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒0.5～4g，生物缓冲剂5～100g，表面活性剂0.1～5mL，防腐剂0.1～10g，助悬剂5～50g，余量为水。
更优选地，每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒0.8～3g，生物缓冲剂10～30g，表面活性剂1～3mL，防腐剂0.5～5g，助悬剂10～30g，余量为水。
优选地，所述试剂Ⅰ和试剂Ⅱ的的pH值范围为6.5～8.5。
一种脂蛋白相关磷脂酶A2含量检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容得到试剂Ⅰ；
（2）制备试剂Ⅱ：首先制备脂蛋白相关磷脂酶A2抗体包被的胶乳颗粒溶液；将其余各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中得到混合溶液；将脂蛋白相关磷脂酶A2抗体包被的胶乳溶液与混合溶液混合均匀，定容，得到试剂Ⅱ；
（3）将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。
本发明具有以下优点：
本发明检测试剂盒采用粒径为120-180nm的胶乳颗粒制备包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒，能有效保证试剂盒的稳定性、灵敏度以及较宽的检测线性范围，同时本发明检测试剂盒抗体包被胶乳颗粒的工艺采用化学交联法保证了检测试剂盒具有良好的开瓶稳定性，包被胶乳颗粒的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体能很好的识别样本中的脂蛋白相关磷脂酶A2抗原，保证了试剂盒具有良好的特异性。本发明试剂盒具有稳定性好、灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，适合于推广和应用。
附图说明
图1为实施例1-5制备的脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂盒标准工作曲线图；
图2为本发明实施例1与对比实施例1-5制备的脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂盒标准工作曲线的比对图；
图3为实施例1检测试剂盒与酶联免疫检测试剂盒测定人血清中脂蛋白相关磷脂酶A2含量其结果的相关性图。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本发明做进一步详细的说明。
实施例1
包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒溶液的制备：
（1）胶乳颗粒的洗涤活化：取0.18g粒径为160nm的聚苯乙烯胶乳颗粒（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入15mLpH为7.0的MES缓冲液，震荡分散均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心20min，弃上清，重复洗涤两次；向洗涤过的胶乳颗粒中加入10mLpH为7.0的MES缓冲液重悬胶乳颗粒。准确称取35mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）和35mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）分别用1mLpH为7.0的MES缓冲液溶解，溶解完全后将各溶液加入胶乳溶液中，震荡混合均匀，置于30℃恒温摇床上，200转/min，反应1.5小时；
（2）胶乳颗粒的抗体致敏：向（1）步反应完成的溶液中加入2mL1mg/mL脂蛋白相关磷脂酶A2多克隆抗体（购自BiossInc.），震荡混合均匀，置于水平摇床上，30℃，200转/min，反应10h。反应完成后向反应体系中加入200μL2%浓度的甘氨酸溶液，混合均匀，并于室温下静置反应30min；
（3）致敏胶乳颗粒的封闭及洗涤：步骤（2）反应完成后，向反应体系中加入180μL5%浓度的BSA溶液，震荡，混合均匀，并在室温下静置反应30min。将反应体系置于12000转/min，离心30min，弃上清，并用pH为7.0的MES缓冲液洗涤沉淀两次，既得包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒，再用10mLpH为7.0的MES缓冲液复溶胶乳颗粒，即得包被抗体的胶乳颗粒溶液。
检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
3-（N-吗啉基）丙磺酸  15g
聚乙二醇6000          15g
叠氮化钠              3g
乙二胺四乙酸二钠      1g
将上述各组分溶解于900mL双蒸水中，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，后用蒸馏水定容至1L，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
3-（N-吗啉基）丙磺酸  15g
吐温-20               2mL
叠氮化钠              3g
海藻酸钠              20g
将上述各组分溶解于700mL双蒸水中，搅拌、充分溶解后加入10份上述步骤制备的包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒溶液，充分混匀之后，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，后用双蒸水定容至1L，密封4℃保存，备用。
实施例2
包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒溶液的制备：
（1）胶乳颗粒的洗涤活化：取0.1g粒径为120nm的聚苯乙烯胶乳颗粒（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入10mL pH为7.0的MES缓冲液，震荡分散均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清，重复洗涤两次；向洗涤过的胶乳颗粒中加入10mL pH为7.0的MES缓冲液重悬胶乳颗粒。准确称取50mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）和50mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）分别用1mL pH为7.0的MES缓冲液溶解，溶解完全后将各溶液加入胶乳溶液中，震荡混合均匀，置于30℃恒温摇床上，200转/min，反应2小时；
（2）胶乳颗粒的抗体致敏：向（1）步反应完成的溶液中加入2mL1mg/mL脂蛋白相关磷脂酶A2多克隆抗体（购自Bioss Inc.），震荡混合均匀，置于水平摇床上，30℃，200转/min，反应10h。反应完成后向反应体系中加入200μL2%浓度的甘氨酸溶液，混合均匀，并于室温下静置反应30min；
（3）致敏胶乳颗粒的封闭及洗涤：步骤（2）反应完成后，向反应体系中加入200μL5%浓度的BSA溶液，震荡，混合均匀，并在室温下静置反应30min。将反应体系置于12000转/min，离心30min，弃上清，并用pH为7.0的MES缓冲液洗涤沉淀两次，既得包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒，再用10mLpH为7.0的MES缓冲液复溶胶乳颗粒，即得包被抗体的胶乳颗粒溶液。
检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
3-（N-吗啉基）丙磺酸  20g
聚乙二醇6000          18g
叠氮化钠              2g
乙二胺四乙酸二钠      2g
将上述各组分溶解于900mL双蒸水中，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至8.0，后用蒸馏水定容至1L，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量量取各组分：
3-（N-吗啉基）丙磺酸  20g
吐温-20               2.5mL
叠氮化钠              2g
海藻酸钠              15g
将上述各组分溶解于700mL双蒸水中，搅拌、充分溶解后加入9份预上述步骤制备的包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒溶液，充分混匀之后，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至8.0，后用双蒸水定容至1L，密封4℃保存，备用。
实施例3
包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒溶液的制备：
（1）胶乳颗粒的洗涤活化：取0.15g粒径为180nm的聚苯乙烯胶乳颗粒（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入15mLpH为7.0的MES缓冲液，震荡分散均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心20min，弃上清，重复洗涤两次；向洗涤过的胶乳颗粒中加入10mL pH为7.0的MES缓冲液重悬胶乳颗粒。准确称取40mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）和40mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）分别用1mL pH为7.0的MES缓冲液溶解，溶解完全后将各溶液加入胶乳溶液中，震荡混合均匀，置于30℃恒温摇床上，200转/min，反应1.5小时；
（2）胶乳颗粒的抗体致敏：向（1）步反应完成的溶液中加入2mL1mg/mL脂蛋白相关磷脂酶A2多克隆抗体（购自Bioss Inc.），震荡混合均匀，置于水平摇床上，30℃，200转/min，反应10h。反应完成后向反应体系中加入200μL2%浓度的甘氨酸溶液，混合均匀，并于室温下静置反应30min；
（3）致敏胶乳颗粒的封闭及洗涤：步骤（2）反应完成后，向反应体系中加入150μL5%浓度的BSA溶液，震荡，混合均匀，并在室温下静置反应30min。将反应体系置于12000转/min，离心30min，弃上清，并用pH为7.0的MES缓冲液洗涤沉淀两次，既得包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒，再用10mL pH为7.0的MES缓冲液复溶胶乳颗粒，即得包被抗体的胶乳颗粒溶液。
检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
3-（N-吗啉基）丙磺酸  40g
聚乙二醇6000          25g
叠氮化钠              4g
乙二胺四乙酸二钠      3g
将上述各组分溶解于900mL双蒸水中，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0，后用蒸馏水定容至1L，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
3-（N-吗啉基）丙磺酸  40g
吐温-20               3mL
叠氮化钠              4g
海藻酸钠              30g
将上述各组分溶解于700mL双蒸水中，搅拌、充分溶解后加入12份上述步骤制备的包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒溶液，充分混匀之后，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0，后用双蒸水定容至1L，密封4℃保存，备用。
实施例4
包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒溶液的制备：
（1）胶乳颗粒的洗涤活化：取0.18g粒径为140nm的聚苯乙烯胶乳颗粒（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入15mL pH为7.0的MES缓冲液，震荡分散均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心20min，弃上清，重复洗涤两次；向洗涤过的胶乳颗粒中加入10mL pH为7.0的MES缓冲液重悬胶乳颗粒。准确称取35mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）和35mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）分别用1mL pH为7.0的MES缓冲液溶解，溶解完全后将各溶液加入胶乳溶液中，震荡混合均匀，置于30℃恒温摇床上，200转/min，反应1.5小时；
（2）胶乳颗粒的抗体致敏：向（1）步反应完成的溶液中加入2mL1mg/mL脂蛋白相关磷脂酶A2多克隆抗体（购自Bioss Inc.），震荡混合均匀，置于水平摇床上，30℃，200转/min，反应10h。反应完成后向反应体系中加入200μL2%浓度的甘氨酸溶液，混合均匀，并于室温下静置反应30min；
（3）致敏胶乳颗粒的封闭及洗涤：步骤（2）反应完成后，向反应体系中加入180μL5%浓度的BSA溶液，震荡，混合均匀，并在室温下静置反应30min。将反应体系置于12000转/min，离心30min，弃上清，并用pH为7.0的MES缓冲液洗涤沉淀两次，既得包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒，再用10mL pH为7.0的MES缓冲液复溶胶乳颗粒，即得包被抗体的胶乳颗粒溶液。
检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
3-（N-吗啉基）丙磺酸  10g
聚乙二醇6000          10g
叠氮化钠              2g
乙二胺四乙酸二钠      2g
将上述各组分溶解于900mL双蒸水中，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.8，后用蒸馏水定容至1L，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
3-（N-吗啉基）丙磺酸   10g
吐温-20                4mL
叠氮化钠               2g
海藻酸钠               40g
将上述各组分溶解于700mL双蒸水中，搅拌、充分溶解后加入11份上述步骤制备的包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒溶液，充分混匀之后，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.8，后用双蒸水定容至1L，密封4℃保存，备用。
实施例5
包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒溶液的制备：
（1）胶乳颗粒的洗涤活化：取0.18g粒径为170nm的聚苯乙烯胶乳颗粒（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入15mL pH为7.0的MES缓冲液，震荡分散均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心20min，弃上清，重复洗涤两次；向洗涤过的胶乳颗粒中加入10mL pH为7.0的MES缓冲液重悬胶乳颗粒。准确称取35mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）和35mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）分别用1mL pH为7.0的MES缓冲液溶解，溶解完全后将各溶液加入胶乳溶液中，震荡混合均匀，置于30℃恒温摇床上，200转/min，反应1.5小时；
（2）胶乳颗粒的抗体致敏：向（1）步反应完成的溶液中加入2mL1mg/mL脂蛋白相关磷脂酶A2多克隆抗体（购自Bioss Inc.），震荡混合均匀，置于水平摇床上，30℃，200转/min，反应10h。反应完成后向反应体系中加入200μL2%浓度的甘氨酸溶液，混合均匀，并于室温下静置反应30min；
（3）致敏胶乳颗粒的封闭及洗涤：步骤（2）反应完成后，向反应体系中加入180μL5%浓度的BSA溶液，震荡，混合均匀，并在室温下静置反应30min。将反应体系置于12000转/min，离心30min，弃上清，并用pH为7.0的MES缓冲液洗涤沉淀两次，既得包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒，再用10mL pH为7.0的MES缓冲液复溶胶乳颗粒，即得包被抗体的胶乳颗粒溶液。
检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
3-（N-吗啉基）丙磺酸  50g
聚乙二醇6000          25g
叠氮化钠              6g
乙二胺四乙酸二钠       2g
将上述各组分溶解于900mL双蒸水中，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.2，后用蒸馏水定容至1L，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
3-（N-吗啉基）丙磺酸  50g
吐温-20               4mL
叠氮化钠              6g
海藻酸钠              24g
将上述各组分溶解于700mL双蒸水中，搅拌、充分溶解后加入10份预备实施例5制备的包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒溶液，充分混匀之后，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.2，后用双蒸水定容至1L，密封4℃保存，备用。
对比实施例1
脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂盒的制备，除了胶乳颗粒的粒径为110nm外，其余均与实施例2完全相同。
对比实施例2
脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂盒的制备，除了胶乳颗粒的粒径为190nm外，其余均与实施例3完全相同。
对比实施例3
脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂盒的制备，除了胶乳颗粒的粒径为100nm外，其余均与实施例4完全相同。
对比实施例4
脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂盒的制备，除了胶乳颗粒的粒径为200nm外，其余均与实施例5完全相同。
对比实施例5
脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂盒的制备，除了胶乳颗粒的粒径为80nm外，其余均与实施例1完全相同。
试验例1试剂盒标准工作曲线的测定：
取浓度为0ng/mL，200ng/mL，400ng/mL，800ng/mL，1600ng/mL的脂蛋白相关磷脂酶A2标准品溶液，用本发明实施例1-5及对比实施例1-5所制备的脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂盒对其进行检测，绘制各检测试剂盒标准工作曲线。
测定结果见图1和图2。从图1可以看出本发明实施例1-5所制备的检测试剂盒具有良好的线性，另本发明采用最优化的条件制备出的试剂盒（实施例1），其标准工作曲线较其余优选条件制备出的试剂盒线性更优良；根据图2可以看出本发明实施例1-5所制备的检测试剂盒的线性范围要明显的优于对比实施例1-5所制备的检测试剂盒。
试验例2试剂盒与酶联免疫分析试剂盒测值的相关性试验
1.供试试剂盒：
实施例1所制备的试剂盒以及酶联免疫试剂盒（购自美国Diadexus公司）；
2.试验方法及结果：
通过用本发明实施例1所制备的试剂盒与购自Diadexus公司的酶联免疫试剂盒测定血清中脂蛋白相关磷脂酶A2的含量的测定值进行比较，试验结果为图3所示，并进行回归分析。从图3中可以看出本发明试剂盒与酶联试剂盒在血清中脂蛋白相关磷脂酶A2测定方面具有良好的相关性。
试验例3试剂盒的重复性和准确度试验
用购自英国Randox Life Sciences公司的脂蛋白相关磷脂酶A2粉末配制200ng/mL的校准品作为样本，用本发明实施例1、实施例4及实施例5制备的检测试剂盒测定校准品溶液，每个试剂盒重复测定10次，分别计算测定均值（M）和标准差（S），以S/M×100%计算变异系数进行重复性考察，以（1—M/样本浓度）×100%计算相对偏差进行准确度考察，实验结果见下表1，由表1的结果可知本发明实施例1采用最优粒径制备的检测试剂盒其准确度及精密度优于采用其他粒径制备的检测试剂盒。
表1实施例检测试剂盒的重复性及其准确度结果
试验例4试剂盒的灵敏度试验
以生理盐水为空白样本，重复测定20次，计算结果均值为0.0005，标准差S为0.00031，根据以空白均值加上两倍标准差的方法计算吸光度变化量为0.00112，用稀释后浓度分别为10ng/mL、20ng/mL和30ng/mL的脂蛋白相关磷脂酶A2校准品溶液，吸光度变化值为0.0004、0.0013和0.0032，其中20ng/mL脂蛋白相关磷脂酶A2校准品吸光度变化值与空白测值的计算结果0.00112近似，因此本发明检测试剂盒检测脂蛋白相关磷脂酶A2的灵敏度可达20ng/mL，适合低值样本的检测应用。
脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂盒检测样品中脂蛋白相关磷脂酶A2含量的检测方法。该方法为两点终点法，包括以下步骤：
向3uL待检测样本（校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品，校准品购自英国Randox Life Sciences公司）中加入120uL的试剂Ⅰ充分混匀，于37℃恒温5分钟，再向混合体系中加入40uL试剂Ⅱ，混匀，37℃恒温1分钟后，空白管调零，波长570nm，测定各管吸光度A1，4分钟后测定各管吸光度A2，计算ΔA＝A2-A1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
本发明检测试剂盒采用粒径为120-180nm的胶乳颗粒制备包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒，能有效保证试剂盒的稳定性、灵敏度以及较宽的检测线性范围，同时本发明检测试剂盒抗体包被胶乳颗粒的工艺采用化学交联法保证了检测试剂盒具有良好的开瓶稳定性，包被胶乳颗粒的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体能很好的识别样本中的脂蛋白相关磷脂酶A2抗原，保证了试剂盒具有良好的特异性。本发明试剂盒具有稳定性好、灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，适合于推广和应用。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.一种脂蛋白相关磷脂酶A2含量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；
试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于900mL双蒸水中，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，后用蒸馏水定容至1L，密封4℃保存，备用；
试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于700mL双蒸水中，搅拌、充分溶解后加入10份包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒溶液，充分混匀之后，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，后用双蒸水定容至1L，密封4℃保存，备用；
所述包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒溶液的制备：
(1)胶乳颗粒的洗涤活化：取0.18g粒径为160nm的聚苯乙烯胶乳颗粒于50mL离心管中，再向离心管中加入15mL pH为7.0的MES缓冲液，震荡分散均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心20min，弃上清，重复洗涤两次；向洗涤过的胶乳颗粒中加入10mL pH为7.0的MES缓冲液重悬胶乳颗粒；准确称取35mg EDC和35mg NHS分别用1mL pH为7.0的MES缓冲液溶解，溶解完全后将各溶液加入胶乳溶液中，震荡混合均匀，置于30℃恒温摇床上，200转/min，反应1.5小时；
(2)胶乳颗粒的抗体致敏：向(1)步反应完成的溶液中加入2mL 1mg/mL脂蛋白相关磷脂酶A2多克隆抗体，震荡混合均匀，置于水平摇床上，30℃，200转/min，反应10h；反应完成后向反应体系中加入200μL 2％浓度的甘氨酸溶液，混合均匀，并于室温下静置反应30min；
(3)致敏胶乳颗粒的封闭及洗涤：步骤(2)反应完成后，向反应体系中加入180μL 5％浓度的BSA溶液，震荡，混合均匀，并在室温下静置反应30min；将反应体系置于12000转/min，离心30min，弃上清，并用pH为7.0的MES缓冲液洗涤沉淀两次，既得包被脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒，再用10mL pH为7.0的MES缓冲液复溶胶乳颗粒，即得包被抗体的胶乳颗粒溶液。
2.一种权利要求1所述的脂蛋白相关磷脂酶A2含量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容得到试剂Ⅰ；
(2)制备试剂Ⅱ：首先制备脂蛋白相关磷脂酶A2抗体包被的胶乳颗粒溶液；将其余各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中得到混合溶液；将脂蛋白相关磷脂酶A2抗体包被的胶乳溶液与混合溶液混合均匀，定容，得到试剂Ⅱ；
(3)将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。
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