CN102128924A - 乳胶增强免疫比浊法测定尿液转铁蛋白试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种乳胶增强免疫比浊法测定尿液转铁蛋白试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的包括乳胶粒子、转铁蛋白抗体和缓冲液；转铁蛋白抗体和乳胶粒子共价结合的合适途径，建立低浓度转铁蛋白水平下和已结合乳胶粒子的转铁蛋白抗体反应形成在340nm-700nm检测的浊度反应体系。其制备方法，包括乳胶粒子的活化、转铁蛋白抗体和乳胶粒子的结合和保存。该试剂盒可用于检测尿液中浓度范围为0-12mg/L的尿液转铁蛋白水平，准确度可溯源到CRM470，精密度＜10％，从而满足临床的需要。

Description

乳胶增强免疫比浊法测定尿液转铁蛋白试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种乳胶增强免疫比浊法测定尿液转铁蛋白试剂盒，具体涉及一种应用乳胶粒子增强技术提高转铁蛋白浓度检测的灵敏度，可用于尿液中低浓度转铁蛋白的检测。

背景技术

肾小球滤过膜对蛋白质滤过有两种屏障，即体积屏障和电荷屏障。滤过膜滤过孔径的大小决定了体积屏障；电荷屏障的产生是由于肾小球滤过膜富含带负电荷的结构成分，使带负电荷的蛋白质难以滤过，转铁蛋白属此类蛋白质。已有证明一旦肾小球疾病，肾小球滤过膜中带负电荷成分涎酸和硫酸肝素含量减少，此时电荷屏障受损使带负电荷的蛋白质易于滤出，从而进入肾小囊并从尿能够***。

目前临床常用检测转铁蛋白的方法为免疫比浊法，此方法以其快速，简便可靠，可在各型自动生化分析仪上使用的特点而在临床广泛应用。但是其检测范围通常在2-15g/L，只能用于检测血清中转铁蛋白的浓度(参考范围：2-3.6g/L)，而难以检出尿中的转铁蛋白浓度水平(尿液转铁蛋白参考范围：0-0.2mg/L)。如能开发出可在自动生化分析仪上使用的免疫比浊试剂盒用于检测尿液中低浓度范围的转铁蛋白，将为临床早期检测肾病发生提供有力的实验依据。

发明内容

本发明就是为了解决上述问题，通过研究乳胶粒子增强的方法，提高检测的灵敏度，从而解决临床没有可常规检测尿液转铁蛋白手段的问题，提供一种乳胶增强免疫比浊法测定尿液转铁蛋白试剂盒。该发明适用于临床进行常规检测尿液转铁蛋白检测。

本发明研究选择合适的乳胶粒子，及转铁蛋白抗体和乳胶粒子共价结合的合适途径，建立低浓度转铁蛋白水平下和已结合乳胶粒子的转铁蛋白抗体反应形成340nm-700nm可检测的浊度反应体系，包括反应必需的合适的缓冲液，pH和离子强度等。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

一种乳胶增强免疫比浊法测定尿液转铁蛋白试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的包括乳胶粒子、转铁蛋白抗体和缓冲液；转铁蛋白抗体和乳胶粒子共价结合的合适途径，建立低浓度转铁蛋白水平下和已结合乳胶粒子的转铁蛋白抗体反应形成在340nm-700nm检测的浊度反应体系。

一种乳胶增强免疫比浊法测定尿液转铁蛋白试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、乳胶粒子的活化

①取1000μl兔抗人转铁蛋白抗体加入2000μl 20mM磷酸缓冲液，pH7.50，混匀备用；

②取600μl 10％20-40nm乳胶粒子，离心4℃21000rpm 90min，弃去滤液；

③加入1000μl 10mM磷酸缓冲液，pH6.00用超声清洗剂溶解粒子，离心清洗两次；

④用3000μl 10mM磷酸缓冲液，pH6.00溶解乳胶粒子，使乳胶粒子活化浓度为2％；加入0.036g N-羟基琥珀酰亚胺，使反应浓度达到12mg/ml；0.060g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，使反应浓度达到20mg/ml；

⑤室温振荡15min；

⑥4℃高速离心60min，弃去滤液；

⑦用3000μl 2mM盐酸冰浴溶解乳胶粒子，4℃高速离心清洗90min，立刻用于结合；

(2)、转铁蛋白抗体和乳胶粒子的结合

①加入兔抗人转铁蛋白抗体缓冲液，使乳胶粒子结合浓度为2％；

②室温振荡2hr；

③4℃高速离心60min，分离滤液，保存滤液；

④用3000μl 20mM磷酸缓冲液，pH7.50，溶解乳胶粒子，高速离心清洗，制成保存溶液，立刻用于保存；

(3)、保存

①加入3000μl保存溶液，pH7.50溶解乳胶粒子，使乳胶粒子保存浓度为2％；

②混匀，4℃保存，用于稳定。

所述高速离心是21000rpm离心。

其中，所述室温振荡的频率为2000次/分钟。

其中，所述室温是指温度不高于30℃。

本发明的有益效果：

此试剂盒可用于检测尿液中浓度范围为0-12mg/L的尿液转铁蛋白水平，准确度可溯源到CRM470【CRM是英语Certified Reference Material(认可的参考材料)的缩写，CRM 470是14个(血清)蛋白分析物的参考制品】，精密度＜10％，从而满足临床的需要。

具体实施方式

为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

(一)抗转铁蛋白抗体包被乳胶粒子

一种乳胶增强免疫比浊法测定尿液转铁蛋白试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的包括乳胶粒子、转铁蛋白抗体和缓冲液；转铁蛋白抗体和乳胶粒子共价结合的合适途径，建立低浓度转铁蛋白水平下和已结合乳胶粒子的转铁蛋白抗体反应形成340nm-700nm可检测的浊度反应体系，包括以下步骤：

1、乳胶粒子的活化

(1)取1000μlQ0327(兔抗人转铁蛋白抗体，丹麦Dako公司生产)加入2000μl 20mM磷酸缓冲液，pH7.50(编号20PS5)，混匀备用；

(2)取600μl 10％K1-0005乳胶粒子(Merck公司生产)，离心4℃21000rpm90min，弃去滤液；

(3)加入1000μl 10mM磷酸缓冲液，pH6.00(编号10PS)用超声清洗剂溶解粒子，离心清洗两次；

(4)用3000μl 10mM磷酸缓冲液，pH6.00(编号10PS)溶解乳胶粒子，使乳胶粒子活化浓度为2％；加入0.036g N-羟基琥珀酰亚胺，使反应浓度达到12mg/ml；0.060g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，使反应浓度达到20mg/ml；

(5)室温2000次/分钟频率振荡15min，室温不高于30℃；

(6)离心4℃21000rpm 60min，弃去滤液；

(7)用3000μl 2mM盐酸冰浴溶解乳胶粒子，4℃21000rpm 90min离心清洗，立刻用于结合；

2、转铁蛋白抗体和乳胶粒子的结合

(1)加入兔抗人转铁蛋白抗体缓冲液，使乳胶粒子结合浓度为2％；

(2)室温2000次/分钟频率振荡2hr；

(3)离心4℃21000rpm 60min，分离滤液，保存滤液；

(4)用3000μl 20mM磷酸缓冲液，pH7.50(编号20PS5)，溶解乳胶粒子，离心清洗，制成保存溶液，立刻用于保存；

3、保存

(1)加入3000μl保存溶液，pH7.50(编号SB)溶解乳胶粒子，使乳胶粒子保存浓度为2％；

(2)混匀，4℃保存，用于稳定。

(二)试剂盒制备

1.试剂1--反应缓冲液：200mM Tris缓冲液50ml，pH7.15，见表1。

表1试剂1的配方

Tris	High Pure	1.2110g
			PEG6000	CP	1.5000g
ProClin 300	N/A	25μl

2.试剂2的配制：

1)试剂稀释溶液：50mmol/l Tris 50ml，pH7.50，见表2。

表2试剂2的配方

Tris	High Pure	0.3027g
			牛血清白蛋白	高纯	0.2900g
ProClin 300	N/A	25μl

2)试剂2：取2％浓度的抗体结合粒子保存溶液和抗体稀释液按照2：25(2+23)比例配制。取2％浓度的抗体结合粒子保存溶液2ml+抗体稀释液23ml。

实施例2：尿转铁蛋白免疫浊度法检测试剂盒使用步骤及分析性能的检测

1检测条件

1.1仪器

Olympus全自动生化仪

1.2检测设定

波长：340nm

检测用量：30+150+50

反应缓冲液：200mmol/L，Tris溶液pH7.15(编号RB)

2.检测

2.1测定方法

a)标记试管：标准管、样品管、质控管。

b)用蒸馏水将分光光度计在340nm处调零。

c)分别加入30μL预稀释后的标准液，样品，质控液至各相应试管。

d)每管加入150μL转铁蛋白试剂1，混匀后37℃预温3～5分钟，测定吸光度A1。

e)每管加入30μL转铁蛋白试剂2，混匀后37℃反应5分钟，测定吸光度A2。

f)计算ΔA(A2-A1)，根据曲线查出相应的浓度值。

2.2结果的计算

用蛋白定标液按比例(1/2.5、1/4、1/6、1/11、1/31)用生理盐水稀释蛋白定标液，按上述步骤操作、绘制标准曲线。以ΔA为y轴，各定标液浓度值为x轴。从曲线上查找样品的浓度值。

2.3批内精密度

用一份血清样品，用试剂盒连续测定20次，按式(1)、(2)和(3)计算测定结果变异系数CV(％)。

CV(％)＝S/x×100(％)………………………………………………………(3)

2.4批间极差

取三个批号试剂盒，每个批号一套试剂，测定同一份血清样品，每盒试剂测3次。计算每批试剂测定的均值及三批试剂测定结果的总均值。三批均值中最大值与最小值之差与总均值的百分比为批间相对极差(％)。用相对极差(％)表示批间精密度。

2.5准确度

用待检试剂三管平行测定高、低两份质控品，计算每个浓度的均值，应符合性能和要求4.2中表1的第3项规定。

2.6最小检测限

用生理盐水作样品，用试剂盒连续测定20次，计算测定的平均值加2SD。

2.7检测范围

等比例(按20％、40％、60％、80％、100％配制)稀释一份高值血清样品，每点应重复测定3次。根据式(4)计算相关系数r。

式

r——相关系数；

中：

X_i——测定管溶液的浓度；

Y_i——3次重复测定的与测定管溶液浓度相对应的吸光度均值；

i——1，2，3，……，n；

n——测定样品数。

3检测数据

见表3。

表3检测数据

TRF浓度(mg/L)	2.02	3.86	10.48	21.9	51.7	125.2
							吸光度(Abs)	0.0157	0.0349	0.0639	0.0748	0.1007	0.1718

4检测结果

检测结果基本达到预期目标，如表4所示。

表4转铁蛋白试剂盒性能表

序号	项目名称	指标
			1	批内精密度	CV≤1.3％
2	批间极差	≤1.1％
			3	准确度	在标示范围内
6	最小检测限	≤0.04g/L
			8	检测范围	0.2-12g/L范围内，相关系数r＝0.9999

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (5)

1.一种乳胶增强免疫比浊法测定尿液转铁蛋白试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的包括乳胶粒子、转铁蛋白抗体和缓冲液；转铁蛋白抗体和乳胶粒子共价结合的合适途径，建立低浓度转铁蛋白水平下和已结合乳胶粒子的转铁蛋白抗体反应形成在340nm-700nm检测的浊度反应体系。

2.一种乳胶增强免疫比浊法测定尿液转铁蛋白试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、乳胶粒子的活化

①取1000μl兔抗人转铁蛋白抗体加入2000μl 20mM磷酸缓冲液，pH7.50，混匀备用；

②取600μl 10％20-40nm乳胶粒子，离心4℃21000rpm 90min，弃去滤液；

③加入1000μl 10mM磷酸缓冲液，pH6.00用超声清洗剂溶解粒子，离心清洗两次；

④用3000μl 10mM磷酸缓冲液，pH6.00溶解乳胶粒子，使乳胶粒子活化浓度为2％；加入0.036g N-羟基琥珀酰亚胺，使反应浓度达到12mg/ml；0.060g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，使反应浓度达到20mg/ml；

⑤室温振荡15min；

⑥4℃高速离心60min，弃去滤液；

⑦用3000μl 2mM盐酸冰浴溶解乳胶粒子，4℃高速离心清洗90min，立刻用于结合；

(2)、转铁蛋白抗体和乳胶粒子的结合

①加入兔抗人转铁蛋白抗体缓冲液，使乳胶粒子结合浓度为2％；

②室温振荡2hr；

③4℃高速离心60min，分离滤液，保存滤液；

④用3000μl 20mM磷酸缓冲液，pH7.50，溶解乳胶粒子，高速离心清洗，制成保存溶液，立刻用于保存；

(3)、保存

①加入3000μl保存溶液，pH7.50溶解乳胶粒子，使乳胶粒子保存浓度为2％；

②混匀，4℃保存，用于稳定。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述高速离心是21000rpm离心。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，其中，所述室温振荡的频率为2000次/分钟。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，其中，所述室温是指温度不高于30℃。