CN111879921A - 一种偶联抗体的荧光微球及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种偶联抗体的荧光微球及其制备方法与用途，将荧光微球溶液、NHS和EDC溶液在超声波条件下活化反应，后离心、分离、稀释分散获得活化荧光微球溶液；将活化荧光微球溶液与抗体溶液在超声波条件下进行偶联反应获得偶联反应液；将偶联反应液与封闭液在超声波条件下进行封闭反应，获得封闭反应液；将所述封闭反应液离心、分离，复溶后混匀获得偶联抗体的荧光微球；所述超声波条件均为：超声波频率20KHZ～80KHZ，采用多次超声方式，相邻两次超声之间存在间隔时间，其中，单次超声时间3～10s，间隔时间为3～10s，超声总时间为3min～30min。有效提升反应偶联效率，偶联抗体的荧光微球均一性与稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种偶联抗体的荧光微球及其制备方法与用途。
背景技术
免疫层析检测技术是基于免疫标记技术和色谱层析技术发展起来的一种可用于检测抗原、抗体的检测技术，其特点是基于抗原抗体的特异性免疫学反应和层析技术，通过试剂盒的形式，实现快速、准确、简单、特异性的检测目的。
时间分辨荧光免疫层析试纸是免疫层析检测技术中的一种重要的检测工具。将时间分辨荧光微球与相应的抗原抗体标记，基于抗原抗体的特异性免疫学反应，通过时间分辨荧光微球的特异性信号，实现对待测抗原抗体的准确定量检测。
目前常规使用的时间分辨荧光微球的标记，均是基于EDC/NHS等活化荧光微球，通过涡旋/振荡等混匀操作，提供微球的活化、微球与抗体的偶联反应环境。一般而言，通过涡旋/振荡等混匀操作，微球与抗原抗体的偶联，需要2小时至24小时，反应过程中，经常出现由于涡旋/振荡设备的规律性运转，导致反应溶液与容器器壁规律性接触，从而造成微球及抗原抗体与容器器壁的不均匀性吸附，导致荧光微球与抗体的偶联效率不高且耗时过长，制备得到的偶联抗体的荧光微球稳定性差。
因此，如何开发一种耗时短、荧光微球与抗体的偶联效率高与稳定性好的偶联抗体的荧光微球的制备方法，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明目的是提供一种偶联抗体的荧光微球及其制备方法与用途，偶联抗体的荧光微球溶液具有良好稳定性，能长时间稳定保存，偶联效率高有效提升反应偶联效率，显著减少荧光微球标记抗原抗体反应所需时间。本发明的偶联抗体的荧光微球溶液用于制备荧光免疫层析试剂盒，由于降低了抗原抗体在反应过程中活性下降的风险，提高反应信号强度，从而提高荧光免疫层析试剂盒的检测灵敏度及稳定性，降低了生产成本。
为了实现上述目的，本发明提供了一种偶联抗体的荧光微球的制备方法，所述方法包括：
获得荧光微球溶液、NHS溶液、EDC溶液和交联反应溶液；
将所述荧光微球溶液、所述NHS溶液和所述EDC溶液在第一超声波条件下进行活化反应，后进行离心和/或固液分离，获得第一固体，将所述第一固体使用所述交联反应溶液稀释，后分散，获得活化荧光微球溶液；
获得抗体溶液；将所述活化荧光微球溶液与所述抗体溶液混匀，后在第二超声波条件下进行偶联反应，获得偶联反应液；
获得封闭液；将所述偶联反应液与所述封闭液混匀，后在第三超声波条件下进行封闭反应，获得封闭反应液；
获得复溶溶液；将所述封闭反应液进行离心和/或固液分离，获得第二固体，将所述第二固体用所述复溶溶液重悬后混匀，获得偶联抗体的荧光微球；
所述第一超声波条件、所述第二超声波条件和所述第三超声波条件均为：超声波频率为20KHZ～80KHZ，采用多次超声方式，且相邻两次超声之间存在间隔时间，其中，单次超声时间为3～10s，单次间隔时间为3～10s，超声总时间为3min～30min。
进一步地，所述第一超声波中所述超声总时间为3min～10min。
进一步地，所述第二超声波中所述超声总时间为10min～20min。
进一步地，所述第三超声波条件中所述超声总时间为5min～15min。
进一步地，所述NHS溶液的浓度为1ug/mL～500ug/mL；所述EDC溶液的浓度为1ug/mL～500ug/mL；所述荧光微球溶液中荧光微球的质量分数为0.05％～1％；所述荧光微球的表面含有羧基或者氨基；所述荧光微球的粒径为50nm～500nm。
进一步地，所述交联反应溶液包括浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的第一缓冲液，所述第一缓冲液包括磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液、MES缓冲液中的一种或多种。
进一步地，所述的封闭液加入的体积与荧光微球溶液的体积比为1：5～50；所述封闭液包括甘氨酸溶液和/或BSA溶液。
进一步地，所述复溶溶液包括浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的第二缓冲液，所述第二缓冲液包括磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液、MES缓冲液中的一种或多种；所述复溶溶液还包括表面活性剂、多羟基化合物和蛋白中的一种或多种。
本发明还提供了所述方法制备得到的偶联抗体的荧光微球。
本发明还提供了所述的偶联抗体的荧光微球在制备荧光免疫层析试剂盒中的用途。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的一种偶联抗体的荧光微球及其制备方法，偶联抗体的荧光微球溶液具有良好稳定性，能长时间稳定保存，偶联效率高有效提升反应偶联效率，显著减少荧光微球标记抗原抗体反应所需时间。本发明的偶联抗体的荧光微球溶液用于制备荧光免疫层析试剂盒，由于降低了抗原抗体在反应过程中活性下降的风险，提高反应信号强度，从而提高荧光免疫层析试剂盒的检测灵敏度及稳定性，降低了生产成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明提供的一种偶联抗体的荧光微球的制备方法的流程图；
图2为本发明实施例提供的一种荧光免疫层析试剂盒的结构图；1、底板；11、第一端部；12、第二端部；2、加样孔；3、样品垫；4、荧光垫；5、硝酸纤维素膜；51、检测线；52、质控线；6、吸水垫。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。本发明中的“第一”、“第二”等词不代表顺序，可以理解为名词。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种偶联抗体的荧光微球的制备方法，如图1所示，包括：
S1、获得荧光微球溶液、NHS溶液、EDC溶液和交联反应溶液；
将所述荧光微球溶液、NHS溶液和EDC溶液在第一超声波条件下进行活化反应，后进行离心和/或固液分离，获得第一固体，将所述第一固体使用所述交联反应溶液稀释，后分散，获得活化荧光微球溶液；
S2、获得抗体溶液；将所述活化荧光微球溶液与所述抗体溶液混匀，后在第二超声波条件下进行偶联反应，获得偶联反应液；
S3、获得封闭液；将所述偶联反应液与所述封闭液混匀，后在第三超声波条件下进行封闭反应，获得封闭反应液；
S4、获得复溶溶液；将所述封闭反应液进行离心和/或固液分离，获得第二固体，将所述第二固体用所述复溶溶液重悬后混匀，获得偶联抗体的荧光微球。
所述第一超声波条件、所述第二超声波条件、所述第三超声波条件均为：超声波频率为20KHZ～80KHZ，采用多次超声方式，且相邻两次超声之间存在间隔时间，其中单次超声时间为3～10s，间隔时间为3～10s，超声总时间为3min～30min。
该实施方式中，
所述荧光微球：可以是掺杂/修饰有荧光素、铕离子等荧光信号的聚苯乙烯微球。所述荧光微球表面含有羧基或者氨基；所述荧光微球粒径介于50nm-500nm之间；荧光微球质量浓度可以是1％(W/W)至0.05％(W/W)；可以是预先用活化缓冲液清洗后再使用。
所述活化液：NHS浓度介于1ug/ml至500ug/ml，所述的NHS可以用纯水溶解，也可以用乙醇溶解，也可以用活化溶液溶解；EDC浓度介于1ug/ml至500ug/ml，所述的EDC可以用纯水溶解，也可以用乙醇溶解，也可以用活化溶液溶解。
所述活化缓冲液：MES溶液，所述的MES溶液浓度介于0.01M至0.2M之间。
所述抗原/抗体：终浓度介于10ug/ml-300ug/ml之间。所述的抗体可以是白介素6抗体、降钙素原抗体、D二聚体抗体、心肌钙蛋白抗体等；
所述交联反应溶液：磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液、MES缓冲液等；所述交联反应溶液浓度介于0.01M-0.2M之间；含有表面活性剂，一般包括但不限于曲拉通X-100、吐温20、brij-35、OP-10、Tetronic1307等；
所述封闭剂：含有10％BSA的溶液，或10％BSA和10％甘氨酸的溶液。所述溶液可以是水基质，也可以是缓冲液基质。所述缓冲液可以是磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液、MES缓冲液等；
所述复溶溶液：可以是磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液、MES缓冲液等。所述复溶溶液浓度介于0.01M-0.2M之间。复溶溶液中可以含有一定浓度的表面活性剂。所述的表面活性剂一般包括但不限于曲拉通X-100、吐温20、brij-35、OP-10、Tetronic1307等。所述表面活性剂的浓度是0.02％(W/W)-1％(W/W)。复溶溶液中可以含有一定浓度的多羟基化合物，多羟基化合物包括但不限于蔗糖、海藻糖、HPMC、壳聚糖等。所述的复溶溶液中可以含有一定浓度的蛋白，所述蛋白包括但不限于BSA、酪蛋白、明胶、脱脂奶粉等。
本申请的一种偶联抗体的荧光微球的制备方法，是基于以下原理：
本发明采用在超声波条件下进行活化反应、偶联反应、封闭反应，提高了微球与待标记抗原抗体的充分混匀及碰撞概率，也有效降低了微球在反应过程中的聚集而导致的反应不均一性，从而能够显著提高荧光微球与抗原抗体的偶联效率及偶联比例。同时荧光微球与抗原抗体的充分反应，能够有效提高标记后的荧光微球抗原抗体复合相应的，同比荧光微球与抗原抗体的常规偶联方法，本发明所述的新型荧光微球与抗原抗体的偶联方法，反应过程采用超声波加速化学反应，可以显著有效的降低羧基与氨基反应的时间，使得整个偶联反应过程可以从常规的几个小时甚至十几个小时显著的降至一个小时内完成。避免了过长的反应时间过程中，微球溶液的不均一性对反应的负面影响以及抗原抗体在长时间的非稳定环境下活性的下降风险。
现有技术中通常采用用旋转混匀的方式进行活化反应、偶联反应、封闭反应，存在荧光微球与抗体的偶联效率不高且耗时过长，制备得到的偶联抗体的荧光微球均一性与稳定性差的缺点。
虽然现有技术中也有超声，但是其超声所起的作用仅仅是混匀，主要是偶联结束之后微球会成块状物，为了把这种块状物打散，所以会超声一下。
本发明首次提出了采用在超声波条件下进行活化反应、偶联反应、封闭反应的技术方案，本申请采用在超声的目的是为了促进反应，加速抗体和微球的偶联反应，工艺里面时间减少了，蛋白随时间变化的影响也较小了，工艺更加可控。
现有技术中之所以没有这种技术方案，是因为对于本领域技术人员而言，在超声波条件下进行活化反应、偶联反应、封闭反应存在相当大的难度，通常会导致微球聚集、抗体失活以及抗体和微球偶联不上等。
因此如何控制超声条件使得活化反应、偶联反应、封闭反应更好的进行，有效提升反应偶联效率成为本发明技术方案的难点所在。本发明人通过实验发现采用下述的超声条件可以很好地解决所述技术问题：
所述第一超声波条件、第二超声波条件、第三超声波条件均为：超声波频率为20KHZ～80KHZ，所述超声包括多次超声，且相邻两次超声之间进行间隔，所述每次超声时间为3～10s，所述间隔时间为3～10s，所述超声总时间为3min～30min。在所述参数范围内能起到促进反应的作用，蛋白的偶联效果好。
若所述超声频率若低于20KHZ，每次超声时间小于3s，间隔时间小于3s会使得偶联效果不好，起不到促进反应的作用，会使得微球活化、偶联、封闭不充分，离心后测试微球溶液蛋白浓度偏低；制备试纸，反应强度显著偏弱。
若所述超声频率若高于80KHZ，每次超声时间大于10s，间隔时间大于10s会使得蛋白容易发生变化，蛋白的偶联效果变差，蛋白失活，离心后测试微球溶液蛋白浓度偏低，制备成试纸，反应强度显著偏弱。
优选地，对活化反应、偶联反应、封闭反应适用的超声条件进一步细化，具体地：
所述第一超声波中所述超声总时间为3min～10min(最佳为5min)；该范围是本申请发明人通过实验探索发现更更好地起到促进活化反应的作用。
所述第二超声波中所述超声总时间为10min～20min(最佳为15min)；该范围是本申请发明人通过实验探索发现更更好地起到促进偶联反应的作用。
所述第三超声波条件中所述超声总时间为5min～15min(最佳为10min)。该范围是本申请发明人通过实验探索发现更更好地起到促进封闭反应的作用。
根据本发明另一种典型的实施方式，提供了所述方法制备得到的偶联抗体的荧光微球，该偶联抗体的荧光微球溶液的均一性好，偶联效率高：在活化阶段采用本发明的方法超声活化5min，与现有技术中非超声方法活化20min，微球偶联抗体效率一样，说明超声5min就可以达到非超声法20min才能实现的活化程度，超声法活化微球效率显著提升。偶联效率如果用时间来度量的话即相同的偶联效率本发明的方法缩短的时间(15min)与现有技术所需时间(20min)的比值。
在偶联阶段，超声方法15min与常规非超声方法4小时，偶联后的微球抗原抗体反应强度才接近，说明超声15min蛋白偶联效率可以达到非超声方法4小时的效果，说明超声法微球偶联抗体效率显著提升。
且所述偶联抗体的荧光微球溶液制备成试剂条后灵敏度更高，稳定性更好。
根据本发明另一种典型的实施方式，本发明实施例还提供了所述的偶联抗体的荧光微球在制备荧光免疫层析试剂盒中的用途：
如图2所示，所述荧光免疫层析试剂盒包括：
底板1所述底板具有第一端部11和第二端部12；
沿所述底板1的第一端部向所述第二端部的方向上依次设置的加样孔2、样品垫3、荧光垫4、硝酸纤维素膜5和吸水垫6；
所述荧光垫4上喷涂有所述的偶联抗体的荧光微球；
所述硝酸纤维素膜5上沿所述底板的第一端部11向所述第二端部12的方向上依次设置有检测线51和质控线52，所述检测线51上固定化有固定抗体，所述质控线52上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
将所述的偶联抗体的荧光微球稀释至合适的体积，后喷涂在荧光垫4上，45℃烘干后，匹配预包被的NC膜、样品垫等组分，组装制备成荧光免疫层析试剂盒。
所述荧光免疫层析试剂盒可以针对多种抗体进行制备，包括但不限于：
白介素6荧光免疫层析试剂盒：
当所述抗体溶液为白介素6抗体，制备得到偶联白介素6抗体的荧光微球，所述荧光垫4上喷涂有所述的偶联白介素6抗体的荧光微球，所述检测线51上固化有固化抗体，所述质控线52上固化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗；
D二聚体荧光免疫层析试剂盒：
当所述抗体溶液为D二聚体抗体，制备得到偶联D二聚体抗体的荧光微球，所述荧光垫4上喷涂有所述的偶联D二聚体抗体的荧光微球，所述检测线51上固化有固化抗体，所述质控线52上固化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗；
所述荧光免疫层析试剂盒的灵敏度高，稳定性好，具体地：
白介素6荧光免疫层析试剂盒灵敏度为3.00pg/mL，可以稳定保存至18个月。
D二聚体荧光免疫层析试剂盒灵敏度为0.20mg/L，可以稳定保存至18个月。
通过上述内容可以看出，本发明提供的本发明提供的一种偶联抗体的荧光微球及其制备方法与用途，有效提升反应偶联效率，显著减少荧光微球标记抗原抗体反应所需时间，制备得到的偶联抗体的荧光微球均一性与稳定性好。偶联抗体的荧光微球用于制备荧光免疫层析试剂盒，由于降低了抗原抗体在反应过程中活性下降的风险，提高反应信号强度，从而提高荧光免疫层析试剂盒的检测灵敏度及稳定性，降低了生产成本。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的偶联抗体的荧光微球的制备方法进行详细说明。
实施例1-实施例5采用本发明方法制备偶联白介素6抗体的荧光微球
S1、获得荧光微球溶液：将粒径200nm的荧光微球用0.01M MES pH6.0的活化缓冲液稀释至0.1％(W/W)，体积为1ml；
NHS溶液：NHS用纯化水溶解至10mg/ml，NHS溶液的加入量为10ug/ml；
EDC溶液：EDC用纯化水溶解至10mg/ml，EDC溶液的加入量为20ug/ml；
交联反应溶液：0.01M PB，pH7.4的交联反应溶液；
S2、将所述荧光微球溶液、NHS溶液和EDC溶液在第一超声波条件下进行活化反应，后进行第一离心、第一固液分离，获得第一固体，将所述第一固体使用所述交联反应溶液稀释，后分散，获得活化荧光微球溶液；
S3、获得抗体溶液：所述抗体溶液为白介素6抗体，白介素6抗体的浓度为1mg/ml，抗体总量为100ug；
将所述活化荧光微球溶液与所述抗体溶液混匀，后在第二超声波条件下进行偶联反应，获得偶联反应液；
S4、获得封闭液：取100ul封闭剂；封闭剂为10％BSA溶液；
将所述偶联反应液与所述封闭液混匀，后在第三超声波条件下进行封闭反应，获得封闭反应液；
S5、获得复溶溶液：0.01M pH 8.0 tris-HCL、1％蔗糖和0.1％Triton X-100。；
将所述封闭反应液进行第二离心、第二固液分离，获得第二固体，将所述第二固体用所述复溶溶液重悬后混匀，获得偶联白介素6抗体的荧光微球。
所述第一超声波条件、第二超声波条件、第三超声波条件如表1所示。
同时将实施例1中获得的偶联白介素6抗体的荧光微球稀释5ml，喷涂在荧光垫上，45℃烘干后，匹配预包被的NC膜、样品垫等组分，组装制备成检测卡，即为白介素6荧光免疫层析试剂盒。
实施例6采用本发明方法制备偶联D二聚体抗体的荧光微球
S1、获得荧光微球溶液：粒径300nm的荧光微球用0.01M MES pH6.0的活化缓冲液稀释至0.1％(W/W)，体积为1ml；涡旋混匀后15000rpm，15min高速离心，去除上清，沉淀用0.01M MES pH6.0的活化缓冲液稀释至1ml
NHS溶液：NHS用纯化水溶解至10mg/ml；
EDC溶液：EDC用纯化水溶解至10mg/ml，EDC溶液的加入量为30ug/ml；
交联反应溶液：0.01M PB，pH7.4的交联反应溶液；
S2、将所述荧光微球溶液、NHS溶液和EDC溶液在第一超声波条件下进行活化反应，后进行第一离心、第一固液分离，获得第一固体，将所述第一固体使用所述交联反应溶液稀释，后分散，获得活化荧光微球溶液；
S3、获得抗体溶液：所述抗体溶液为D二聚体抗体；
将所述活化荧光微球溶液与所述抗体溶液混匀，后在第二超声波条件下进行偶联反应，获得偶联反应液；
S4、获得封闭液：含有10％BSA和10％甘氨酸的水溶液；
将所述偶联反应液与所述封闭液混匀，后在第三超声波条件下进行封闭反应，获得封闭反应液；
S5、获得复溶溶液：0.01M，pH 8.0 tris-HCL、1％蔗糖和0.1％Triton X-100；
将所述封闭反应液进行第二离心、第二固液分离，获得第二固体，将所述第二固体用所述复溶溶液重悬后混匀，获得偶联D二聚体抗体的荧光微球。
所述第一超声波条件、第二超声波条件、第三超声波条件如表1所示。
将所述偶联D二聚体抗体的荧光微球稀释5ml，喷涂在荧光垫上，45℃烘干后，匹配预包被的NC膜、样品垫等组分，组装制备成检测卡，即为D二聚体荧光免疫层析试剂盒。
对比例1-对比例6偶联白介素6抗体的荧光微球
对比例1-对比例6中除所述第一超声波条件、第二超声波条件、第三超声波条件与实施例1-6不同外，其余步骤均同实施例1-实施例5。所述第一超声波条件、第二超声波条件、第三超声波条件如表1所示。
表1各实施例和对比例的工艺参数
对比例7采用现有技术方法制备偶联白介素6抗体的荧光微球
(1)配制荧光微球溶液：将粒径200nm的荧光微球用0.01M MES pH6.0的活化缓冲液稀释至0.1％(W/W)，体积为1ml；
(2)将NHS用纯化水溶解至10mg/ml，然后快速加入到荧光微球溶液中，涡旋混匀，NHS溶液的加入量为10ug/ml；
(3)将EDC用纯化水溶解至10mg/ml，然后快速加入到荧光微球溶液中，涡旋混匀，EDC溶液的加入量为20ug/ml；
(4)将荧光微球溶液置于摇床中活化反应，转速控制在220rpm，活化30min，温度控制为30℃；
(5)15000rpm，20min高速离心，去除上清，沉淀用0.01M PB，pH7.4的交联反应溶液稀释至1ml，超声分散2min；超声反应参数为超声5秒/间隔5秒，持续12个循环即2min。
(6)将荧光微球溶液加入到白介素6抗体溶液中，其中白介素6抗体的浓度为1mg/ml，抗体总量为100ug，涡旋混匀；
(7)将荧光微球溶液置于摇床中偶联反应，转速控制在220rpm，偶联时间为8小时，温度控制为30℃。
(8)将100ul封闭剂加入到荧光微球溶液中，涡旋混匀；封闭剂为10％BSA溶液。
(9)将荧光微球溶液置于摇床中封闭反应，转速控制在220rpm，封闭时间为2小时，温度控制为30℃。
(10)15000rpm，20min高速离心，去除上清，沉淀用0.01M tris-HCL pH 8.0的复溶溶液重悬至1ml，涡旋混匀；复溶液中含有1％蔗糖和0.1％Triton X-100。
(11)将复溶后的荧光微球溶液稀释5ml；
(12)将荧光微球喷涂在结合垫上，45℃烘干后，匹配预包被的NC膜、样品垫等组分，组装制备成检测卡，即为白介素6荧光免疫层析试剂盒。
对比例8采用现有技术方法制备偶联D二聚体抗体的荧光微球
(1)配制荧光微球溶液：将粒径300nm的荧光微球用0.01M MES pH6.0的活化缓冲液稀释至0.1％(W/W)，体积为1ml；涡旋混匀后15000rpm，15min高速离心，去除上清，沉淀用0.01M MES pH6.0的活化缓冲液稀释至1ml；
(2)将NHS用纯化水溶解至10mg/ml，然后快速加入到荧光微球溶液中，涡旋混匀，NHS溶液的加入量为15ug/ml；
(3)将EDC用纯化水溶解至10mg/ml，然后快速加入到荧光微球溶液中，涡旋混匀，EDC溶液的加入量为30ug/ml
(4)将荧光微球溶液置于摇床中活化反应，转速控制在220rpm，活化30min，温度控制为30℃；
(5)15000rpm，15min高速离心，去除上清，沉淀用0.01MPB，pH7.4的交联反应溶液稀释至1ml，超声分散2min；超声反应参数为超声5秒/间隔5秒，持续12个循环即2min。
(6)将荧光微球溶液加入到D二聚体抗体溶液中，其中D二聚体抗体的浓度为1mg/ml，抗体总量为50ug，涡旋混匀
(7)将荧光微球溶液置于摇床中偶联反应，转速控制在220rpm，偶联时间为8小时，温度控制为30℃。
(8)将100ul封闭剂加入到荧光微球溶液中，涡旋混匀；封闭剂为含有10％BSA和10％甘氨酸的水溶液。
(9)将荧光微球溶液置于摇床中封闭反应，转速控制在220rpm，封闭时间为2小时，温度控制为30℃。
(10)15000rpm，15min高速离心，去除上清，沉淀用0.01M tris-HCL pH 8.0的复溶溶液重悬至1ml，涡旋混匀；复溶液中含有1％蔗糖和0.1％Triton X-100。
(11)将复溶后的荧光微球溶液稀释5ml；
(12)将荧光微球喷涂在结合垫上，45℃烘干后，匹配预包被的NC膜、样品垫等组分，组装制备成检测卡，即为D二聚体荧光免疫层析试剂盒。
试验例1偶联抗体的荧光微球溶液的稳定性
将实施例1-6以及对比例1-6制备得到的偶联抗体的荧光微球溶液于冰箱4℃静置保存7天，肉眼观察抗体-荧光微球偶联物状态，结果见表2。
表2-各组别偶联抗体的荧光微球性能
| 组别 | 稳定性 |
| 实施例1 | 7天之后无沉淀出现 |
| 实施例2 | 5天之后无沉淀出现 |
| 实施例3 | 6天之后无沉淀出现 |
| 实施例4 | 6天之后无沉淀出现 |
| 实施例5 | 7天之后无沉淀出现 |
| 实施例6 | 7天之后无沉淀出现 |
| 对比例1 | 3天之后可见有部分沉淀在底部 |
| 对比例2 | 3天之后可见有部分沉淀在底部 |
| 对比例3 | 3天之后可见有部分沉淀在底部 |
| 对比例4 | 2天之后可见有部分沉淀在底部 |
| 对比例5 | 1天之后可见有部分沉淀在底部 |
| 对比例6 | 1天之后可见有部分沉淀在底部 |
由表2的数据可知：
对比例1：超声波频率小于20KHZ，稳定性较差；会使得微球活化、偶联、封闭不充分，离心后测试微球溶液蛋白浓度偏低；此外，制备试纸后反应强度会显著偏弱。
对比例2：超声波频率大于80KHZ，蛋白的偶联效果变差，蛋白失活，稳定性较差；离心后测试微球溶液蛋白浓度偏低；此外，制备成试纸后反应强度会显著偏弱。
对比例3：每次超声时间小于3s，间隔时间小于3s，稳定性较差；会使得微球活化、偶联、封闭不充分，离心后测试微球溶液蛋白浓度偏低；此外，制备试纸后反应强度会显著偏弱。
对比例4：每次超声时间大于10s，间隔时间大于10s，蛋白的偶联效果变差，蛋白失活，稳定性较差；离心后测试微球溶液蛋白浓度偏低，此外，制备成试纸后反应强度会显著偏弱。
对比例5：超声总时间小于3min，稳定性较差；会使得微球活化、偶联、封闭不充分，离心后测试微球溶液蛋白浓度偏低；此外，制备试纸后反应强度会显著偏弱。
对比例6：超声总时间大于30min，蛋白的偶联效果变差，蛋白失活，稳定性较差；离心后测试微球溶液蛋白浓度偏低，此外，制备成试纸后反应强度会显著偏弱。
本发明的实施例1-6中，有效提升反应偶联效率，得到的偶联抗体的荧光微球稳定性好。
试验例2：荧光免疫层析试剂盒性能测定
本发明还将实施例1制备得到的白介素6荧光免疫层析试剂盒、实施例6的白介素6荧光免疫层析试剂盒、对比例7制备得到的白介素6荧光免疫层析试剂盒、对比例8的白介素6荧光免疫层析试剂盒的灵敏度和稳定性进行检测和统计。
(1)功能灵敏度：在规定的可接受精密度和正确度条件下，能定量测出样本中分析物的最小量。白介素6评价方法：测定空白样本、白介素6浓度为0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L的低浓度样本，每个样本测定10次；D二聚体评价方法：测定空白样本、D二聚体浓度为：0.1mg/L、0.25mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L
计算均值、标准差、偏差、变异系数，CV小于10％且偏差小于10％能满足使用需求；
表3白介素6灵敏度数据
由表3的数据可以看出，实施例1的功能灵敏度为3.00pg/mL，对比例7的功能灵敏度大于7pg/mL，对白介素6这个项目，参考范围一般为1-7pg/mL，7pg/mL这个浓度范围左右的精密度对阴阳性的判断很重要，所以试剂的功能灵敏度对试剂性能的影响很大
表4-D二聚体灵敏度数据
由表4的数据可以看出，实施例6的功能灵敏度为0.20mg/L，对比例8的功能灵敏度大于0.50mg/L，对于D二聚体这个项目，参考范围一般为0-0.5mg/L，0.5mg/L这个浓度范围左右的精密度对阴阳性的判断很重要，所以试剂的功能灵敏度对试剂性能的影响很大。
(2)稳定性：将试剂于2℃-8℃放置24个月，观察测第三方质控品数据的偏差；结果如下表所示。
表5-白介素6稳定性数据
表6-D二聚体稳定性数据
由以上数据看出，实施例1和实施例6的荧光免疫层析试剂盒稳定性更好，可以稳定保存至18个月，对比例7和对比例8的荧光免疫层析试剂盒随着留样时间的增长测值逐步下降直至超出允许范围，稳定性不如实施例1和6的荧光免疫层析试剂盒。
综上所知，本发明提供的本发明提供的一种偶联抗体的荧光微球及其制备方法与用途，有效提升反应偶联效率，显著减少荧光微球标记抗原抗体反应所需时间，制备得到的偶联抗体的荧光微球均一性与稳定性好。偶联抗体的荧光微球用于制备荧光免疫层析试剂盒，由于降低了抗原抗体在反应过程中活性下降的风险，提高反应信号强度，从而提高荧光免疫层析试剂盒的检测灵敏度及稳定性，降低了生产成本。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种偶联抗体的荧光微球的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
获得荧光微球溶液、NHS溶液、EDC溶液和交联反应溶液；
将所述荧光微球溶液、所述NHS溶液和所述EDC溶液在第一超声波条件下进行活化反应，后进行离心和/或固液分离，获得第一固体，将所述第一固体使用所述交联反应溶液稀释，后分散，获得活化荧光微球溶液；
获得抗体溶液；将所述活化荧光微球溶液与所述抗体溶液混匀，后在第二超声波条件下进行偶联反应，获得偶联反应液；
获得封闭液；将所述偶联反应液与所述封闭液混匀，后在第三超声波条件下进行封闭反应，获得封闭反应液；
获得复溶溶液；将所述封闭反应液进行离心和/或固液分离，获得第二固体，将所述第二固体用所述复溶溶液重悬后混匀，获得偶联抗体的荧光微球；
所述第一超声波条件、所述第二超声波条件和所述第三超声波条件均为：超声波频率为20KHZ～80KHZ，采用多次超声方式，且相邻两次超声之间存在间隔时间，其中，单次超声时间为3～10s，单次间隔时间为3～10s，超声总时间为3min～30min。
2.根据权利要求1所述的一种偶联抗体的荧光微球的制备方法，其特征在于，所述第一超声波中所述超声总时间为3min～10min。
3.根据权利要求1所述的一种偶联抗体的荧光微球的制备方法，其特征在于，所述第二超声波中所述超声总时间为10min～20min。
4.根据权利要求1所述的一种偶联抗体的荧光微球的制备方法，其特征在于，所述第三超声波条件中所述超声总时间为5min～15min。
5.根据权利要求1所述的一种偶联抗体的荧光微球的制备方法，其特征在于，所述NHS溶液的浓度为1ug/mL～500ug/mL；所述EDC溶液的浓度为1ug/mL～500ug/mL；所述荧光微球溶液中荧光微球的质量分数为0.05％～1％；所述荧光微球的表面含有羧基或者氨基；所述荧光微球的粒径为50nm～500nm。
6.根据权利要求1所述的一种偶联抗体的荧光微球的制备方法，其特征在于，所述交联反应溶液包括浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的第一缓冲液，所述第一缓冲液包括磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液、MES缓冲液中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的一种偶联抗体的荧光微球的制备方法，其特征在于，所述的封闭液加入的体积与荧光微球溶液的体积比为1：5～50；所述封闭液包括甘氨酸溶液和/或BSA溶液。
8.根据权利要求1所述的一种偶联抗体的荧光微球的制备方法，其特征在于，所述复溶溶液包括浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的第二缓冲液，所述第二缓冲液包括磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液、MES缓冲液中的一种或多种；所述复溶溶液还包括表面活性剂、多羟基化合物和蛋白中的一种或多种。
9.一种权利要求1-8任一所述方法制备得到的偶联抗体的荧光微球。
10.权利要求9所述的偶联抗体的荧光微球在制备荧光免疫层析试剂盒中的用途。
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