CN107904666A - 一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，包括以下步骤：S1，合成用于构建扩增子文库的引物组合；S2，合成用于构建最终待上机文库的Torrent接头引物；S3，对提取后的样本DNA进行磁珠纯化；S4，目标区域多重PCR扩增；S5，PCR添加测序接头序列；S6，链霉亲和素‑生物素捕获目的文库。本发明可以简便、快速的经过两轮PCR完成扩增子文库的构建，并且在缩短文库构建及文库定量的时间的同时极大的降低了文库构建及文库定量的成本。

Description

一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种基于Ion Torrent测序平台的一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法。
背景技术
随着大规模平行测序(二代测序)成本的不断降低以及目标区域捕获技术的不断成熟，基于二代测序技术的基因检测得到越来越多的应用。二代测序与传统检测方法相比，具有灵敏度高，准确性高，价格低廉，可以同时检测多种靶点的优势。市面上主流的测序平台主要有两个，分别是Illumina公司的荧光可逆性终止法测序以及Thermo Fisher公司的半导体离子流测序(Ion Torrent)。
Ion AmpliseqTM是Thermo Fisher公司开发的基于多重PCR对目标区域进行捕获的技术。其工作流程大致分成以下几步：1、目标区域捕获，采用扩增子技术及多重PCR技术，将感兴趣的目标区域捕获下来；2、引物的消化，通过核酸内切酶及UNG酶将多余的引物序列消化掉；3、接头连接，通过连接酶将Ion Proton的接头序列连接到目标区域两端；4、文库定量，通过标准品绘制标准曲线，对构建好的文库进行定量。
但是，传统的Ampliseq建库技术操作比较复杂，需要大约5个小时。并且，在连接接头的过程中通过连接酶进行连接，文库损失率高；文库构建完成后还需要进行qPCR定量，操作及仪器运行时间大约需要2个小时，因此，建库加定量的总体时间超过了7个小时，这对于对时间周期要求高的临床肿瘤基因检测而言是很难接受的。另外，在传统的Ampliseq构建扩增子文库的方法中，单个样品构建文库的成本较高，大约为400-600元/例；传统的Ampliseq定量方法为基于Taqman法的荧光实时定量，单个样品的定量成本也较高，大约为80元/例。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种基于Ion Torrent测序平台的应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，与传统方法相比，可以简便，快速的经过两轮PCR完成扩增子文库的构建，并且在第二轮PCR的同时完成文库的定量。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，包括以下步骤：
(1)合成用于构建扩增子文库的引物组合；
(2)合成用于构建最终待上机文库的Torrent接头引物；
(3)对提取后的样本DNA进行磁珠纯化；
(4)目标区域多重PCR扩增；
(5)PCR添加测序接头序列；
(6)链霉亲和素-生物素捕获目的文库。
具体，包括以下步骤：
(1)目标区域多重PCR，合成用于构建扩增子文库的引物组合
根据目标区域设计扩增子的上游特异性引物，上游引物包含按照5’到3’方向的依次排列的通用第一序列和根据目标区域扩增子设计的特异性上游引物序列；根据目标区域设计扩增子的下游特异性引物，下游引物包含按照5’到3’方向的依次排列的通用第二序列和根据目标区域扩增子设计的特异性下游引物序列；
(2)合成用于构建最终待上机文库的Torrent接头引物
根据Ion Proton测序平台P端接头序列设计上游通用引物序列；根据Ion Proton测序平台A端接头序列设计下游通用引物序列；上游引物5’端进行生物素标记修饰，用于后续的基于生物素-亲和素体系的文库定量；
(3)对提取后的DNA进行磁珠纯化
采用1.8倍的AMPure XP磁珠对提取后的样本DNA溶液进行纯化，有效去除小于100bp的DNA片段，提高模板的有效浓度；
(4)目标区域多重PCR扩增
1)配制用于目标区域扩增的PCR反应体系，将步骤(1)所述的含有第一、第二通用序列的目标区域特异性上下游引物按照相同的摩尔浓度进行混合，最终使得每一条引物的终浓度为200nM，以作为目标区域扩增的PCR反应体系中的引物组合；
第一步PCR反应体系包含以下组分：
PCR预混液 10ul
纯化后的DNA样品 20ng
目标区域扩增PCR引物组合 4ul，200nM
无酶水 补齐至20ul
所述PCR预混液为Platinum SuperFi Master Mix，Thermo Fisher，cat#12358010
PCR反应程序为：
2)1.0倍AMPure XP磁珠纯化PCR产物，纯化掉引物二聚体以及在上一步没有完全反应的多余引物组合；
(5)PCR添加测序接头序列
进行PCR添加测序接头反应，对目标区域扩增多重PCR反应完成后的目标区域进行富集，同时引入Ion Proton测序平台的测序接头序列；
PCR添加测序接头反应包含以下组分：
PCR预混液 25ul
纯化后的DNA样品 23ul
1uMPCR上游引物 1ul
1uMPCR下游引物 1ul
所述PCR预混液为KAPA HiFi Master Mix，KAPA，cat# kk2602
PCR反应程序为：
(6)链霉亲和素-生物素捕获目的文库
采用链霉亲和素磁珠DynabeadsMyone Streptavidin T1，Thermo，cat#65601对含有生物素标记的PCR产物进行捕获，最后采用1N的NaOH进行洗脱，将目标文库与磁珠分离，即得到均一化之后的文库。
所述样本DNA为基因组DNA。
所述基因组DNA提取自组织样本或***固定石蜡包埋组织。
用于构建扩增子文库的引物组合包含两部分，基因特异性引物和通用第一序列以及通用第二序列,通用第一序列和通用第二序列的核苷酸序列为：
第一通用序列：5’-CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’ SEQ ID NO:1
第二通用序列：5’-GATGCTCTTCCGATCT-3’ SEQ ID NO:2。
采用1.8倍的AMPure XP磁珠对提取后的样本DNA溶液进行纯化。
PCR添加测序接头时，所用的引物浓度为固定值，其中上游引物的5’端采用生物素标记；下游引物含有barcode序列,上下游引物序列为：
上游引物序列：5’-bio-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGT-3’ SEQ ID NO:3
下游引物序列：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATGCCATGGATCGATGCTCTTCCGATCT-3’ SEQID NO:4
其中下游引物31位至40位碱基序列做为barcode用于区分不同样本，可用不同序列取代。
本发明的有益效果：与传统方法相比，可以简便、快速的经过两轮PCR完成扩增子文库的构建，并且在PCR添加测序接头的同时完成文库的定量。从而大大减少文库构建及文库定量的时间，该方法还能将单个样品构建文库及文库定量的成本控制在30元/例。
附图说明
图1为本发明实施方式的Ion Torrent测序平台的文库构建和文库定量流程示意图；
图2为本发明实施方式的文库定量的原理示意图；
图3为实施例中每个文库的预期产出数据与实际产出数据的比较图；
图4为实施例中每个文库的所有扩增子的测序深度分布图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
如图1、2所示，本发明应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，包含以下步骤：
1.合成用于构建扩增子文库的引物组合(目标区域扩增)。包括：根据目标区域设计扩增子的上游特异性引物，所述上游引物包含按照5’到3’方向的依次排列的通用第一序列和根据目标区域扩增子设计的特异性上游引物序列；根据目标区域设计扩增子的下游特异性引物，所述下游引物包含按照5’到3’方向的依次排列的通用第二序列和根据目标区域扩增子设计的特异性下游引物序列。
2.合成用于构建最终待上机文库的Torrent接头引物(PCR添加测序接头序列)。包括：根据Ion Proton测序平台P端接头序列设计上游通用引物序列；根据Ion Proton测序平台A端接头序列设计下游通用引物序列。所述上游引物5’端进行生物素标记修饰，用于后续的基于生物素-亲和素体系的文库定量。
3.提取后的DNA进行磁珠纯化。包括：采用1.8倍的AMPure XP磁珠对提取后的样本DNA溶液进行纯化，该步骤的目的有三个，其一，提取后的DNA溶液，特别是过柱提取法提取的DNA往往会有杂质残留，影响下游的PCR反应；其二，通过磁珠纯化后的溶解，可以减少样的体积，从而提高样本的浓度，适应于下游的小体系PCR反应；其三，采用1.8倍的磁珠纯化DNA，可以有效去除一些小于100bp的DNA片段，提高模板的有效浓度。
4.配制用于目标区域扩增的PCR反应体系。将上文所述的含有第一、第二通用序列的目标区域特异性上下游引物按照相同的摩尔浓度进行混合，最终使得每一条引物的终浓度为200nM，以作为目标区域多重PCR反应体系中的引物组合。
5.目标区域多重PCR扩增
第一步PCR反应体系包含以下组分：
上表所述PCR预混液为Platinum SuperFi Master Mix(Thermo Fisher，cat#12358010)
PCR反应程序为：
6.1.0倍AMPure XP磁珠纯化PCR产物。此步骤的目的为纯化掉引物二聚体以及在上一步没有完全反应的多余引物组合。
7.进行第二步PCR反应，对第一步PCR反应完成后的目标区域进行富集，同时引入Ion Proton测序平台的测序接头序列。在本步骤中，同时还会将含有生物素标记的引物引入到扩增产物上，通过控制引物的投入量来控制产物的生物素标记量，最终将所得的文库控制在相对稳定的浓度范围内。
第二步PCR包含以下组分：
PCR预混液 25ul
纯化后的DNA样品 23ul
PCR上游引物(1uM) 1ul
PCR下游引物(1uM) 1ul
上表所述PCR预混液为KAPA HiFi Master Mix(KAPA，cat#kk2602)
PCR反应程序为：
8.链霉亲和素-生物素捕获目的文库。采用链霉亲和素磁珠(DynabeadsMyoneStreptavidin T1，Thermo，cat#65601)对含有生物素标记的PCR产物进行捕获。最后采用1N的NaOH进行洗脱，将目标文库与磁珠分离，即得到均一化之后的文库。
下面结合实例，进一步说明本发明
待测样本为非小细胞肺癌患者FFPE样本6例，按照本发明所提供的两步PCR建库及定量方法构建扩增子DNA文库，具体流程如下：
1、FFPE样本基因组DNA提取：采用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，货号：DP331)提取FFPE样本中的基因组DNA，具体操作步骤参照试剂盒说明书进行。提取后的DNA溶解于50ul的无酶水中。
2、采用1.8倍的AMPure XP beads(Beckman Coulter)对提取后的样本进行纯化，具体操作步骤如下：
(1)让AMPure XP bead在室温放置至少30min，充分混匀AMPure XP bead悬浮液；
(2)在1.5mL新管中加入90uL混匀的AMPure XP bead悬浮液和50ul提取后的DNA溶液，吹吸混匀10-15次，室温放置5min，期间再次手动混匀3次；
(3)短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置5min至溶液变澄清；
(4)在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠，保证废液中不能含有磁珠；
(5)在磁力架上，在每个管中分别加入200μL 80％乙醇，左右颠倒，不要让酒精沾到EP管管盖，放置30s，弃乙醇。
(6)重复步骤(5)，颠倒幅度加大，清洗EP管管盖；
(7)将EP管从磁力架上取下，桌面离心机瞬离10s，放上磁力架，使用枪头吸干EP管底剩余残液；
(8)保持EP管在磁力架上，在室温放置5min以上，使管中残留的乙醇完全蒸发，磁珠完全干透并刚刚出现细小裂纹；
(9)加入20μL无酶水，吹吸混匀10-15次以上，确保全部磁珠被悬起，吹吸混匀后室温放置5min；
(10)短暂离心，将EP管放在磁力架上，静置大约2-3min至溶液变澄清；
(11)吸取全部DNA上清样品到一个新的PCR管中，准备下一步实验。
3、设计并合成引物
根据非小细胞肺癌相关的肿瘤驱动基因的用药位点，设计目标区域扩增引物。涉及的基因名称见表1，引物序列分为两部分，包括：根据目标区域设计扩增子的上游特异性引物，所述上游引物包含按照5’到3’方向的依次排列的通用第一序列和根据目标区域扩增子设计的特异性上游引物序列；根据目标区域设计扩增子的下游特异性引物，所述下游引物包含按照5’到3’方向的依次排列的通用第二序列和根据目标区域扩增子设计的特异性下游引物序列。其中通用第一序列和通用第二序列为Ion Proton测序平台测序接头的一部分，序列见表3.特异性引物部分在Thermo Fisher公司网站的Ampliseq社区网站进行设计，设计出的引物序列见表2.最终形成“5’-通用第一序列+特异性上游引物-3’”和“5’-通用第二序列+特异性下游引物-3’”结构的引物，送交引物合成公司进行合成。
表1.本实施例中涉及到的基因列表
ALK BRAF EGFR HER2 KRAS MET
NRAS PIK3CA RET
表2.第一步PCR中使用的上下游特异性引物序列
表3.第一步PCR中使用的第一通用序列和第二通用序列(SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:2)
第一通用序列(5’-3’) CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT
第二通用序列(5’-3’) GATGCTCTTCCGATCT
4、形成PCR体系，具体PCR反应体系如下：
PCR预混液为Platinum SuperFi Master Mix(Thermo Fisher，cat#12358010)，第一步PCR引物组合采用以下方法配制：
将步骤3中合成的上下游引物，共计53对，106条，分别加水稀释到100uM。吸取等体积引物混合，形成终浓度为943nM的引物混合物，最后使用无酶水将该混合物稀释到200nM，形成最终的PCR引物组合。
进行PCR程序，PCR仪使用Thermo Fisher公司的2720Thermo Cycler，PCR反应程序如下：
5、采用1.0倍的AMPure XP beads(Beckman Coulter)对提取后的样本进行纯化，具体操作步骤如下：
(1)让AMPure XP bead在室温放置至少30min，充分混匀AMPure XP bead悬浮液；
(2)在步骤4中的PCR管中加入20uL混匀的AMPure XP bead悬浮液和50ul提取后的DNA溶液，吹吸混匀10-15次，室温放置5min，期间再次手动混匀3次；
(3)短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置5min至溶液变澄清；
(4)在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠，保证废液中不能含有磁珠；
(5)在磁力架上，在每个管中分别加入150μL 80％乙醇，左右颠倒，不要让酒精沾到EP管管盖，放置30s，弃乙醇。
(6)重复步骤(5)，颠倒幅度加大，清洗EP管管盖；
(7)将EP管从磁力架上取下，桌面离心机瞬离10s，放上磁力架，使用枪头吸干管底剩余残液；
(8)保持管在磁力架上，在室温放置5min以上，使管中残留的乙醇完全蒸发，磁珠完全干透并刚刚出现细小裂纹；
(9)加入23μL无酶水，吹吸混匀10-15次以上，确保全部磁珠被悬起，吹吸混匀后室温放置5min；
(10)短暂离心，将管放在磁力架上，静置大约2-3min至溶液变澄清；
(11)吸取全部上清样品到一个新的PCR管中，准备下一步实验。
6、PCR添加测序接头序列，具体PCR反应体系如下：
PCR预混液 25ul
纯化后的DNA样品 23ul
PCR上游引物(1uM) 1ul
PCR下游引物(1uM) 1ul
PCR预混液为KAPA HiFi Master Mix(KAPA，cat#kk2602)，PCR引物序列见表4
表4.PCR引物序列(SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:14)
进行PCR程序，PCR仪使用Thermo Fisher公司的2720Thermo Cycler，PCR反应程序如下：
7、生物素-链霉亲和素文库定量，具体操作步骤如下：
(1)从4℃拿出DynabeadsMyone Streptavidin C1磁珠(Thermo Fisher，cat#65002)，室温平衡30min，充分混匀DynabeadsMyone Streptavidin C1。
(2)吸取10ulDynabeadsMyone Streptavidin C1磁珠于0.2mlPCR管中，加入50ul磁珠激活液，经过混匀后用磁力架弃去上清，保留磁珠。磁珠激活液的配方见下表：
组分 终浓度
Tris-HCl 10mM
EDTA 5mM
NaCl 1M
(3)重复步骤(2)两次，最后用50ul磁珠激活液重悬磁珠。
(4)将步骤(3)中的磁珠加入到第二步PCR的反应产物中，室温孵育30min，让链霉亲和素磁珠与生物素标记的文库充分结合。
(5)采用200ul洗脱液对孵育后的磁珠-文库混合物进行洗涤，用磁力架弃去上清，保留磁珠。洗脱液的配方见下表：
组分 终浓度
20X SSC 1X
SDS 0.5％
(7)重复步骤(5)两次，最后一次吸取上清尽量保证吸取的足够干净，无洗脱液残留。
(8)采用200ul，1N的NaOH溶液对步骤(7)中的磁珠进行溶解，室温孵育3-5min，然后将200ul上清转移到一支新的1.5ml的EP管中，得到均一化后的文库，文库浓度大约为5nM。
8、上机测序及结果分析
上述获得的文库使用Ion Proton测序平台的P1芯片，按照步骤(7)文库定量的结果，进行上机测序，每个文库的数据量为100M，每个样本的平均测序深度不低于10000X，单个扩增子测序深度达到3000X。分析6个文库的产出均一性以及每个文库中各个扩增子的覆盖情况及均一度。图3反映了实际每个文库的数据产出与预期产出量的比较结果，可以看出，6个文库的产出数据量与预期产出量相差不大，并且每个文库的均一化结果良好，产出数据量差距不大。
此外，在本发明中，还采用了传统的qPCR方法对6个文库进行了定量，定量方法为Thermo Fisher的文库定量试剂盒Ion Library TaqMan Quantitation Kit(cat#4468802)，用于作为评估本发明中的均一化处理方法质量的标准。荧光定量结果如表5所示，经过均一化处理的文库，经过qPCR定量后的结果基本处于5nM附近，说明本发明中提供的均一化方法的文库定量结果良好。
表5.两种不同文库定量方法结果比较
样本 Sample1 Sample2 Sample3 Sample4 Sample5 Sample6
均一化结果 5nM 5nM 5nM 5nM 5nM 5nM
QPCR定量结果 4.2nM 4.75nM 5.2nM 4.47nM 4.91nM 5.01nM
根据每个文库中的53个扩增子的测序深度，经过取对数之后分析扩增子的覆盖情况及均一度，如图4所示，除去5号样本的均一度较差外，其他5例样本的均一度均符合要求。5号样本经过分析验证为EGFR扩增样本，导致了均一度较差。此外，还分析了小于平均测序深度20％的位点所占比例指标，结果如表6所示，可以看出，6例样本均小于10％，说明位点的覆盖均一性良好。(该指标为Ion Torrent测序平台推荐的评判测序均一度的指标)
表6.各样本目标区域覆盖度小于平均测序深度统计
样本 Sample1 Sample2 Sample3 Sample4 Sample5 Sample6
小于平均测序深度20％百分比 1.61％ 3.14％ 5.59％ 3.42％ 6.92％ 4.84％
测序的结果经过数据处理及生物信息学分析之后得到检测基因的突变情况。收集的6例受检者的FFPE样本的检测情况如下：Sample1检测到EGFR exon 19c.2236_2250delp.746_750del突变；Sample2检测到KRAS exon 2c.G35T p.G12V突变；Sample3检测到KRASexon2c.G35A p.G12D突变；Sample4检测到PIK3CA exon 9c.G1633A p.E545K突变；Sample5检测到EGFR基因扩增；Sample6检测到EGFR exon21c.T2573G p.L858R突变。该结果与采用RainDance数字PCR仪的检测结果相一致，说明了本发明提供方法的准确性和良好的应用性。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
序列表
<110> 中源协和基因科技有限公司
<120> 一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 1
ctctctatgg gcagtcggtg at 22
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 2
gatgctcttc cgatct 16
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 3
ccactacgcc tccgctttcc tctctatggg cagt 34
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 4
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag atgccatgga tcgatgctct tccgatct 58
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 5
ccactacgcc tccgctttcc tctctatggg cagt 34
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 6
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag ctgcatcgac tcgatgctct tccgatct 58
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 7
ccactacgcc tccgctttcc tctctatggg cagt 34
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 8
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tacgatgccg tcgatgctct tccgatct 58
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 9
ccactacgcc tccgctttcc tctctatggg cagt 34
<210> 10
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 10
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag gcagtctgca tcgatgctct tccgatct 58
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 11
ccactacgcc tccgctttcc tctctatggg cagt 34
<210> 12
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 12
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag actgtcagtc tcgatgctct tccgatct 58
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
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ccactacgcc tccgctttcc tctctatggg cagt 34
<210> 14
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 14
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tgactgacct tcgatgctct tccgatct 58

Claims (7)

1.一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成用于构建扩增子文库的引物组合；
(2)合成用于构建最终待上机文库的Torrent接头引物；
(3)对提取后的样本DNA进行磁珠纯化；
(4)目标区域多重PCR扩增；
(5)PCR添加测序接头序列；
(6)链霉亲和素-生物素捕获目的文库。
2.根据权利要求1所述应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)目标区域多重PCR，合成用于构建扩增子文库的引物组合
根据目标区域设计扩增子的上游特异性引物，上游引物包含按照5’到3’方向的依次排列的通用第一序列和根据目标区域扩增子设计的特异性上游引物序列；根据目标区域设计扩增子的下游特异性引物，下游引物包含按照5’到3’方向的依次排列的通用第二序列和根据目标区域扩增子设计的特异性下游引物序列；
(2)合成用于构建最终待上机文库的Torrent接头引物
根据Ion Proton测序平台P端接头序列设计上游通用引物序列；根据Ion Proton测序平台A端接头序列设计下游通用引物序列；上游引物5’端进行生物素标记修饰，用于后续的基于生物素-亲和素体系的文库定量；
(3)对提取后的DNA进行磁珠纯化
采用1.8倍的AMPure XP磁珠对提取后的样本DNA溶液进行纯化，有效去除小于100bp的DNA片段，提高模板的有效浓度；
(4)目标区域多重PCR扩增
1)配制用于目标区域扩增的PCR反应体系，将步骤(1)所述的含有第一、第二通用序列的目标区域特异性上下游引物按照相同的摩尔浓度进行混合，最终使得每一条引物的终浓度为200nM，以作为目标区域扩增的PCR反应体系中的引物组合；
第一步PCR反应体系包含以下组分：
PCR预混液 10ul 纯化后的DNA样品 20ng 目标区域扩增PCR引物组合 4ul，200nM 无酶水 补齐至20ul
所述PCR预混液为Platinum SuperFi Master Mix，Thermo Fisher，cat#12358010 PCR反应程序为：
2)1.0倍AMPure XP磁珠纯化PCR产物，纯化掉引物二聚体以及在上一步没有完全反应的多余引物组合；
(5)PCR添加测序接头序列
进行PCR添加测序接头反应，对目标区域扩增多重PCR反应完成后的目标区域进行富集，同时引入Ion Proton测序平台的测序接头序列；
PCR添加测序接头反应包含以下组分：
PCR预混液 25ul 纯化后的DNA样品 23ul 1uMPCR上游引物 1ul 1uMPCR下游引物 1ul
所述PCR预混液为KAPA HiFi Master Mix，KAPA，cat#kk2602 PCR反应程序为：
(6)链霉亲和素-生物素捕获目的文库
采用链霉亲和素磁珠DynabeadsMyone Streptavidin T1，Thermo，cat#65601对含有生物素标记的PCR产物进行捕获，最后采用1N的NaOH进行洗脱，将目标文库与磁珠分离，即得到均一化之后的文库。
3.根据权利要求1或2所述应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，其特征在于，所述样本DNA为基因组DNA。
4.根据权利要求3所述应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，其特征在于，所述基因组DNA提取自组织样本或***固定石蜡包埋组织。
5.根据权利要求1或2所述应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，其特征在于，用于构建扩增子文库的引物组合包含两部分，基因特异性引物和通用第一序列以及通用第二序列,通用第一序列和通用第二序列的核苷酸序列为：
第一通用序列：5’-CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’SEQ ID NO:1
第二通用序列：5’-GATGCTCTTCCGATCT-3’SEQ ID NO:2。
6.根据权利要求1所述应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，其特征在于，采用1.8倍的AMPure XP磁珠对提取后的样本DNA溶液进行纯化。
7.根据权利要求1或2所述应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，其特征在于，PCR添加测序接头时，所用的引物浓度为固定值，其中上游引物的5’端采用生物素标记；下游引物含有barcode序列,上下游引物序列为：上游引物序列：5’-bio-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGT-3’SEQ ID NO:3下游引物序列：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATGCCATGGATCGATGCTCTTCCGATCT-3’SEQ IDNO:4
其中下游引物31位至40位碱基序列做为barcode用于区分不同样本，可用不同序列取代。
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