CN112852918A - 两步pcr技术 - Google Patents
两步pcr技术 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112852918A CN112852918A CN202110074621.4A CN202110074621A CN112852918A CN 112852918 A CN112852918 A CN 112852918A CN 202110074621 A CN202110074621 A CN 202110074621A CN 112852918 A CN112852918 A CN 112852918A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- specific
- pcr
- target
- ligated
- library
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种两步PCR技术,包括如下步骤:第一步,扩增特异性靶点:在此部分混合DNA样品和特异性引物对混合液,使正反向引物的通用序列分别连接到由特异性引物所确定的特异性扩增子的两侧,这一部分反应也被称为第一步PCR;第二步,富集靶点:在富集靶点也就是第二步PCR部分,我们在第一步连接的通用序列后连接了接头。连接好的接头通过第二步PCR进行扩增并纯化,混合到单个试管中并进行纯化。本发明通过更简单的操作步骤造就了其高于市场上通过文库构建测序方法的数据利用率。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域,具体是一种两步PCR技术。
背景技术
聚合酶链式反应简称PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增, 具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方。PCR又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
DNA探针(DNA probe)是最常用的核酸探针,为长度在几十到几百甚至上千碱基对的单链或双链DNA,用特殊示踪剂(如同位素、酶或有;色基团)进行标记;在适当的p时值、温度和离子强度下,DNA探针利用分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性,能与待测样本中互补的非标记单链DNA或RNA以氢键结合(杂交),形成双链复合物(杂交体)。杂交捕获技术其原理是根据DNA序列互补原理,设计与目标序列互补的特异性探针,并合成在固相或液相芯片上,打断样品基因组DNA,加上测序接头后与探针杂交,最终将目标区域捕获下来,后续经过回收、构建文库并直接高通量测序。固相杂交法,即将探针固定在固体支持物上,典型代表是基因芯片。杂交后先洗脱未杂交上的DNA片段,再将与探针杂交的DNA洗脱下来,进行扩增,构建高通量测序文库。而液相杂交捕获技术,不难理解是在溶液环境中,让目标DNA与带有生物素标记的探针直接杂交,再通过生物素 -亲和素的反应使目标片段锚定在带有亲和素的微珠上,后面过程也是洗脱、富集、扩增、构建测序文库等,目前液相杂交***逐渐成为基因捕获主流。
但上述的目的片段捕获方法都需要进行建库步骤才能上机测序,文库构建往往是测序前最重要也是耗时最长的一步它的成功与否直接关系到测序的成功。构建文库的目的是在目的片段两端连接上想要的接头,文库结构需要符合不同种类测序仪的上机要求才能进行测序。
因此,本发明提供了一种两步PCR技术,以解决上述背景技术中提出的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种两步PCR技术,以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种两步PCR技术,包括如下步骤:
1.包括如下步骤:
第一步,扩增特异性靶点:在此部分混合DNA样品和特异性引物对混合液,使正反向引物的通用序列分别连接到由特异性引物所确定的特异性扩增子的两侧,这一部分反应也被称为第一步PCR。
第二步,富集靶点:在富集靶点也就是第二步PCR部分,我们在第一步连接的通用序列后连接了接头。
第三步,混合文库:本部分使用荧光定量方法量化富集产物,记录样本信息和浓度信息。
第四步,稀释文库:使用荧光定量方法量化混合文库产物并将其稀释至10ng/μL,按照不同测序平台的上机流程进行测序前准备。
作为本发明再进一步的方案:在扩增特异性靶点时DNA投入量为1-10ng。
作为本发明再进一步的方案:在富集靶点时连接好的接头通过第二步PCR进行扩增并纯化,混合到单个试管中并进行纯化。
作为本发明再进一步的方案:在混合文库时将定量后的样本按照等比进行混合
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
1、本发明操作简便,耗时短,适用于一些对时效性有特殊要求的情况:本发明通过引物融合技术使目的片段扩增和测序接头的添加在两步PCR中就得以完成,从而使操作步骤得以简化,耗费时间得以减少,从而得以适应对时效性要求比较高的情况。
2、本发明通过更简单的操作步骤造就了其高于市场上通过文库构建测序方法的数据利用率。
3、本发明成本低,适用于多种测序平台:本发明依托二代测序平台,且对各种测序平台具有普适性,这就赋予了其成本高适应性广泛等优势。
4、本发明的需求DNA量比较低,在低至78pg时也能实现精准分型,传统建库需要50-100ng。
附图说明
图1为一种两步PCR技术的技术路线图。
图2为一种两步PCR技术中原理示意图。
图3一种两步PCR技术中不同方法下的数据利用率占比图示。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例一
本发明实施例中,一种两步PCR技术,包括如下步骤:
第一步,扩增特异性靶点:在此部分混合DNA样品和特异性引物对混合液,使正反向引物的通用序列分别连接到由特异性引物所确定的特异性扩增子的两侧,这一部分反应也被称为第一步PCR。
第二步,富集靶点:在富集靶点也就是第二步PCR部分,我们在第一步连接的通用序列后连接了接头。
第三步,混合文库:本部分使用荧光定量方法量化富集产物,记录样本信息和浓度信息。
第四步,稀释文库:使用荧光定量方法量化混合文库产物并将其稀释至10ng/μL,按照不同测序平台的上机流程进行测序前准备。
进一步的,在扩增特异性靶点时DNA投入量为1-10ng,在富集靶点时连接好的接头通过第二步PCR进行扩增并纯化,混合到单个试管中并进行纯化,在混合文库时将定量后的样本按照等比进行混合
下表为不同方法/试剂盒上机前所需时间:
如上表格所示,采用2-step PCR技术时,其上机前总耗费时间少于“BGISEQ-500文库构建”,远少于“ForenSeqTMDNA特征制备”。
实施例二
图3为不同方法下的数据利用率占比图示,其中,noise表示测序噪音。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种两步PCR技术,其特征在于,包括如下步骤:
第一步,扩增特异性靶点:在此部分混合DNA样品和特异性引物对混合液,使正反向引物的通用序列分别连接到由特异性引物所确定的特异性扩增子的两侧,这一部分反应也被称为第一步PCR;
第二步,富集靶点:在富集靶点也就是第二步PCR部分,我们在第一步连接的通用序列后连接了接头;
第三步,混合文库:本部分使用荧光定量方法量化富集产物,记录样本信息和浓度信息;
第四步,稀释文库:使用荧光定量方法量化混合文库产物并将其稀释至10ng/μL,按照不同测序平台的上机流程进行测序前准备。
2.根据权利要求1所述的一种两步PCR技术,其特征在于,在扩增特异性靶点时DNA投入量为1-10ng。
3.根据权利要求1所述的一种两步PCR技术,其特征在于,在富集靶点时连接好的接头通过第二步PCR进行扩增并纯化,混合到单个试管中并进行纯化。
4.根据权利要求1所述的一种两步PCR技术,其特征在于,在混合文库时将定量后的样本按照等比进行混合。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110074621.4A CN112852918A (zh) | 2021-01-20 | 2021-01-20 | 两步pcr技术 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110074621.4A CN112852918A (zh) | 2021-01-20 | 2021-01-20 | 两步pcr技术 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112852918A true CN112852918A (zh) | 2021-05-28 |
Family
ID=76007604
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110074621.4A Pending CN112852918A (zh) | 2021-01-20 | 2021-01-20 | 两步pcr技术 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112852918A (zh) |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104153004A (zh) * | 2014-08-11 | 2014-11-19 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 一种用于扩增子测序的建库方法 |
CN106498504A (zh) * | 2016-12-13 | 2017-03-15 | 上海美迪维康生物科技有限公司 | 基于多重pcr的二代测序建库技术 |
CN107699957A (zh) * | 2017-05-27 | 2018-02-16 | 领星生物科技(上海)有限公司 | 基于dna的融合基因定量测序建库、检测方法及其应用 |
CN107904666A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-04-13 | 中源协和基因科技有限公司 | 一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法 |
CN109022559A (zh) * | 2018-08-21 | 2018-12-18 | 华中农业大学 | 一种基于二代测序技术的分子标记检测方法 |
CN109266744A (zh) * | 2018-09-14 | 2019-01-25 | 广州奇辉生物科技有限公司 | 基于umi单分子标签降噪技术的靶向测序检测肺癌基因的多重pcr引物、试剂盒及方法 |
CN109628440A (zh) * | 2018-12-05 | 2019-04-16 | 广州市达信智能科技有限公司 | 一种基于两步pcr的高通量建库方法 |
CN110878334A (zh) * | 2019-11-12 | 2020-03-13 | 北京康普森生物技术有限公司 | 用于扩增子测序的引物及两步pcr建库方法 |
CN111041563A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-21 | 广州精科医学检验所有限公司 | 一种靶向序列捕获及pcr建库方法 |
-
2021
- 2021-01-20 CN CN202110074621.4A patent/CN112852918A/zh active Pending
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104153004A (zh) * | 2014-08-11 | 2014-11-19 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 一种用于扩增子测序的建库方法 |
CN106498504A (zh) * | 2016-12-13 | 2017-03-15 | 上海美迪维康生物科技有限公司 | 基于多重pcr的二代测序建库技术 |
CN107699957A (zh) * | 2017-05-27 | 2018-02-16 | 领星生物科技(上海)有限公司 | 基于dna的融合基因定量测序建库、检测方法及其应用 |
CN107904666A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-04-13 | 中源协和基因科技有限公司 | 一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法 |
CN109022559A (zh) * | 2018-08-21 | 2018-12-18 | 华中农业大学 | 一种基于二代测序技术的分子标记检测方法 |
CN109266744A (zh) * | 2018-09-14 | 2019-01-25 | 广州奇辉生物科技有限公司 | 基于umi单分子标签降噪技术的靶向测序检测肺癌基因的多重pcr引物、试剂盒及方法 |
CN109628440A (zh) * | 2018-12-05 | 2019-04-16 | 广州市达信智能科技有限公司 | 一种基于两步pcr的高通量建库方法 |
CN110878334A (zh) * | 2019-11-12 | 2020-03-13 | 北京康普森生物技术有限公司 | 用于扩增子测序的引物及两步pcr建库方法 |
CN111041563A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-21 | 广州精科医学检验所有限公司 | 一种靶向序列捕获及pcr建库方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3252174B1 (en) | Compositions, methods, systems and kits for target nucleic acid enrichment | |
CN106434871B (zh) | 用于检测目标核酸的方法与组合物 | |
RU2698125C2 (ru) | Библиотеки для секвенирования нового поколения | |
EP0469755B1 (en) | Method producing a polynucleotide for use in single primer amplification | |
US20150247182A1 (en) | Single cell analysis using sequence tags | |
CN114096678A (zh) | 多种核酸共标记支持物及其制作方法与应用 | |
IL256444B2 (en) | Reagents, kits, and methods for molecular barcoding | |
JP2020536525A (ja) | プローブ及びこれをハイスループットシーケンシングに適用するターゲット領域の濃縮方法 | |
CN110643687A (zh) | 一种srda等温核酸扩增试剂盒及其应用 | |
WO2021232186A1 (zh) | 基于数字微流控平台富集核酸及构建测序文库的方法 | |
CN106834428B (zh) | 高通量多位点人类短片段串联重复序列检测试剂盒及其制备和应用 | |
CN115768884A (zh) | 用于全基因组扩增的单细胞工作流程 | |
CN113755558A (zh) | 一种基于液态芯片技术的核酸检测方法 | |
US10590451B2 (en) | Methods of constructing a circular template and detecting DNA molecules | |
WO2021253372A1 (zh) | 一种高兼容性的PCR-free建库和测序方法 | |
CN112852918A (zh) | 两步pcr技术 | |
WO2023138206A1 (zh) | 一种基于固相载体的dna分子信号扩增及核酸测序的方法 | |
CN116463408A (zh) | 一种abo基因扩增引物、扩增体系、扩增方法、测序文库构建方法及测序方法 | |
CN116445594A (zh) | 适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法及其应用 | |
CN114395618A (zh) | 一种测定酶连接效率的方法及试剂盒 | |
WO1995023245A1 (en) | Real time in-gel assay | |
CN109825519B (zh) | 一种基于血糖仪检测的检测载体 | |
CN114807325A (zh) | 单引物扩增建库技术在检测片段化dna分子断点信息中的应用及试剂盒 | |
KR102531590B1 (ko) | 절단효소 인식부위의 미러링 결합에 의한 표적핵산의 검출 방법 및 핵산 검출용 조성물 | |
CN117757895A (zh) | 一种单链dna文库构建试剂盒及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210528 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |