CN105986020A - 构建测序文库的方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了构建测序文库的方法及装置，所述方法包括：(a)在RNA分子的3’端连接第一接头，以便获得第一连接产物；(b)在第一连接产物的5’端连接第二接头，以便获得第二连接产物；(c)对第二连接产物进行反转录，以便获得反转录产物；(d)利用一对PCR引物对反转录产物进行扩增，以便获得PCR扩增产物，其中，一对PCR引物之一含有链霉亲和素；(e)从PCR扩增产物分离单链DNA分子；以及(f)将单链DNA分子进行环化处理，以便获得环化产物，环化产物构成测序文库。该方法可有效用于RNA分子测序文库构建，操作简单、效果好，具有较高的稳定性和可重复性。

Description

构建测序文库的方法及装置

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及构建测序文库的方法及装置。

背景技术

小分子RNA(small RNA)是生物体内一类长度在18～30nt的RNA分子，主要包括miRNA、siRNA和piRNA。Small RNA能够调控基因的表达，在细胞的生长、发育、代谢等基础生物学过程中扮演着重要的角色，甚至在癌症等相关疾病形成过程中起着关键的作用。

目前随着二代高通量测序技术的应用和发展，小分子RNA测序技术也日趋成熟。通常小分子RNA样品制备方法主要基于连接法，但是该方法在在连接过程中为了提高连接效率会投入过量的接头，这些过量的接头会给后续反应带来很多困扰。另外，现有技术构建的小分子RNA文库都是双链线性的文库，这种线性文库不能用于Complete Genomcis测序平台。目前，对于小分子RNA测序中单链环状文库的构建方法还是空白，没有文献和专利报道过这种方法。现有NGS测序平台提供的小分子RNA标准方法建库效果不错，但是并不适合Complete Genomcis测序平台。且小分子RNA标准建库流程中需要经过多步聚丙烯酰胺胶电泳切胶纯化去除过量的接头，该方法虽然有效的去除了多余的接头，但是需要多次切胶回收，目的产物损耗严重，周期长，也不利于自动化实现。此外，目前小分子RNA文库构建方法通常是在PCR的引物上含有标签，PCR之后每个标记上标签的样品才能进行混合测序。

因而，目前关于小分子RNA样品制备方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种操作简单、成本低廉的构建测序文库的方法。

在本发明的一个方面，本发明提供了一种构建测序文库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(a)在RNA分子的3’端连接第一接头，以便获得第一连接产物；(b)在所述第一连接产物的5’端连接第二接头，以便获得第二连接产物；(c)对所述第二连接产物进行反转录，以便获得反转录产物；(d)利用一对PCR引物对所述反转录产物进行扩增，以便获得PCR扩增产物，其中，所述一对PCR引物之一含有链霉亲和素；(e)从所述PCR扩增产物分离单链DNA分子；以及(f)将所述单链DNA分子进行环化处理，以便获得环化产物，所述环化产物构成所述测序文库。。发明人发现，该方法可有效用于RNA分子测序文库构建，操作简单、效果好，具有较高的稳定性和可重复性，且结果真实可靠。另外，该方法可以用于小分子RNA测序文库构建，且适用于Complete Genomcis测序平台，同时也能适用于其它需要单链环状文库的测序平台。

根据本发明的实施例，所述RNA分子的长度18～30nt。

根据本发明的实施例，所述第一接头和所述第二接头至少之一中包含标签序列。

根据本发明的实施例，所述标签序列为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8中的至少之一。

根据本发明的实施例，步骤(a)和(b)是在相同容器中进行的，其中，在步骤(a)中采用过量的所述第一接头，并且在进行步骤(b)之前，向步骤(a)所得到的反应产物中添加特异性识别所述第一接头的屏蔽序列，以便对剩余的所述第一接头进行屏蔽处理。

根据本发明的实施例，所述屏蔽序列包括双链区和5’突出端，其中，所述5’突出端能够与所述第一接头的至少一部分匹配。

根据本发明的实施例，向步骤(a)所得到的反应产物中添加特异性识别所述第一接头的屏蔽序列之前，预先对所述屏蔽序列进行预处理，所述预处理包括：将含有所述屏蔽序列和缓冲液的混合物置于95摄氏度下5分钟，然后以0.1摄氏度/秒的速率梯度降温至25摄氏度，所述缓冲液为含有0.05M NaCl的0.01M Tris-HCl溶液。

根据本发明的实施例，从所述PCR扩增产物分离单链DNA分子进一步包括：使所述PCR扩增产物与磁珠接触，以便形成磁珠-DNA复合物，其中，所述磁珠上连接有链霉亲和素；将所述磁珠-DNA复合物与pH高于7的溶液接触，以便获得所述单链DNA片段。

根据本发明的实施例，所述pH高于7的溶液为氢氧化钠溶液。

在本发明的另一方面，本发明提供了一种针对RNA分子构建测序文库的装置。根据本发明的实施例，该装置包括：连接单元，所述连接单元用于依次在RNA分子的3’端连接第一接头，以便获得第一连接产物；以及在所述第一连接产物的5’端连接第二接头，以便获得第二连接产物；反转录单元，所述反转录单元用于对所述第二连接产物进行反转录，以便获得反转录产物；扩增单元，所述扩增单元用于利用一对PCR引物对所述反转录产物进行扩增，以便获得PCR扩增产物，其中，所述一对PCR引物之一含有链霉亲和素；分离单元，所述分离单元用于从所述PCR扩增产物分离单链DNA分子；以及环化单元，所述环化单元用于将所述单链DNA分子进行环化处理，以便获得环化产物，所述环化产物构成所述测序文库。发明人发现，利用本发明的该装置，可以有效实施前面所述的构建测序文库的方法，用于RNA分子测序文库构建，且操作简单、效果好，成本低廉，且具有较高的稳定性和可重复性，结果真实可靠。

根据本发明的实施例，所述RNA分子的长度18～30nt。

根据本发明的实施例，所述第一接头和所述第二接头至少之一中包含标签序列。

根据本发明的实施例，所述标签序列为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8中的至少之一。

根据本发明的实施例，进一步包括：屏蔽单元，所述屏蔽单元用于在所述第一连接产物的5’端连接第二接头之前，向所述连接单元中添加特异性识别所述第一接头的屏蔽序列，以便对剩余的所述第一接头进行屏蔽处理。

根据本发明的实施例，所述屏蔽序列包括双链区和5’突出端，其中，所述5’突出端能够与所述第一接头的至少一部分匹配。

根据本发明的实施例，所述屏蔽单元进一步包括：预处理模块，所述预处理模块用于在向所述连接单元中添加特异性识别所述第一接头的屏蔽序列之前，预先对所述屏蔽序列进行预处理，所述预处理包括：将含有所述屏蔽序列和缓冲液的混合物置于95摄氏度下5分钟，然后以0.1摄氏度/秒的速率梯度降温至25摄氏度，所述缓冲液为含有0.05M NaCl的0.01M Tris-HCl溶液。

根据本发明的实施例，所述分离单元进一步包括：吸附模块，所述吸附模块用于使所述PCR扩增产物与磁珠接触，以便形成磁珠-DNA复合物，其中，所述磁珠上连接有链霉亲和素；洗脱模块，所述洗脱模块用于使所述磁珠-DNA复合物与pH高于7的溶液接触，以便获得所述单链DNA片段。

根据本发明的实施例，所述pH高于7的溶液为氢氧化钠溶液。

附图说明

图1显示了根据本发明的实施例，泡状结构示意图；

图2显示了根据本发明的实施例，温度条件(1)与三种缓冲溶液处理接头屏蔽子的电泳检测结果；

图3显示了根据本发明的实施例，温度条件(3)与缓冲溶液II和缓冲溶液III处理接头屏蔽子的电泳检测结果；

图4显示了根据本发明的实施例，PCR产物10％PAGE电泳胶图；以及

图5显示了根据本发明的实施例，构建获得的文库用6％的TBE变性胶检测电泳图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在本发明的一个方面，本发明提供了一种构建测序文库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：

(a)在RNA分子的3’端连接第一接头，以便获得第一连接产物。

根据本发明的实施例，所述RNA分子的长度18～30nt。

(b)在所述第一连接产物的5’端连接第二接头，以便获得第二连接产物。

根据本发明的实施例，所述第一接头和所述第二接头至少之一中可以包含标签序列。使用带标签(Barcode)的接头，在连接过程中可以将不同的样品标记上不同的barcode，然后这些不同的连接产物能够混合在一起进行下游反转录、PCR扩增、单链环化等操作，不仅大幅度提高了通量，而且减少了反转录等下游反应的成本。

根据本发明的实施例，所述标签序列为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8中的至少之一。

根据本发明的实施例，步骤(a)和(b)是在相同容器中进行的，其中，在步骤(a)中采用过量的所述第一接头，并且在进行步骤(b)之前，向步骤(a)所得到的反应产物中添加特异性识别所述第一接头的屏蔽序列，以便对剩余的所述第一接头进行屏蔽处理。通过接头屏蔽试剂屏蔽过量的第一接头，可以使得步骤(a)和(b)在同一个容器中进行，不仅可以简化多步切胶纯化的步骤，缩短文库构建的周期，且大大降低了文库构建的成本。

根据本发明的实施例，所述屏蔽序列包括双链区和5’突出端，其中，所述5’突出端能够与所述第一接头的至少一部分匹配。由此，能够有效屏蔽过量的第一接头，效果理想。

根据本发明的实施例，向步骤(a)所得到的反应产物中添加特异性识别所述第一接头的屏蔽序列之前，预先对所述屏蔽序列进行预处理，所述预处理包括：将含有所述屏蔽序列和缓冲液的混合物置于95摄氏度下5分钟，然后以0.1摄氏度/秒的速率梯度降温至25摄氏度，所述缓冲液为含有0.05M NaCl的0.01M Tris-HCl溶液。由此，能够有效提高屏蔽效率和屏蔽效果。

根据本发明的实施例，屏蔽序列和缓冲液的比例不受特别限制，本领域技术人员可以根据RNA分子、3’接头等的用量等灵活选择。

(c)对所述第二连接产物进行反转录，以便获得反转录产物。在该步骤中，可以将含有不同标签的第二连接产物混合在一起进行反转录，不仅大幅度提高了通量，且进一步简化操作、降低成本。

(d)利用一对PCR引物对所述反转录产物进行扩增，以便获得PCR扩增产物，其中，所述一对PCR引物之一含有链霉亲和素。由此，有利于在后续步骤分离纯化目标产物。

(e)从所述PCR扩增产物分离单链DNA分子。

根据本发明的实施例，从所述PCR扩增产物分离单链DNA分子进一步包括：使所述PCR扩增产物与磁珠接触，以便形成磁珠-DNA复合物，其中，所述磁珠上连接有链霉亲和素；将所述磁珠-DNA复合物与pH高于7的溶液接触，以便获得所述单链DNA片段。由此，能够有效分离获得单链DNA片段，操作简单方便，且收率高，目标产物损失小。

根据本发明的实施例，所述pH高于7的溶液为氢氧化钠溶液。由此，有利于提高分离效率。

(f)将所述单链DNA分子进行环化处理，以便获得环化产物，所述环化产物构成所述测序文库。

根据本发明的实施例，在从所述PCR扩增产物分离单链DNA分子之前，可以预先对PCR扩增产物进行电泳分离，以便获得小分子RNA，由此，能够快速有效地针对小分子RNA构建测序文库。

发明人发现，该方法可有效用于RNA分子测序文库构建，操作简单、效果好，具有较高的稳定性和可重复性，且结果真实可靠。另外，该方法可以用于小分子RNA测序文库构建，且适用于Complete Genomcis测序平台，同时也能适用于其它需要单链环状文库的测序平台。

在本发明的另一方面，本发明提供了一种针对RNA分子构建测序文库的装置。根据本发明的实施例，该装置包括：

连接单元，所述连接单元用于依次在RNA分子的3’端连接第一接头，以便获得第一连接产物；以及在所述第一连接产物的5’端连接第二接头，以便获得第二连接产物。

根据本发明的实施例，所述RNA分子的长度18～30nt。

根据本发明的实施例，所述第一接头和所述第二接头至少之一中包含标签序列。使用带标签(Barcode)的接头，在连接过程中将不同的样品标记上不同的barcode，然后这些不同的连接产物能够混合在一起进行下游反转录、PCR扩增、单链环化等操作，不仅大幅度提高了通量，而且减少了反转录等下游反应的成本。

根据本发明的实施例，所述标签序列为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8中的至少之一。

根据本发明的实施例，进一步包括：屏蔽单元，所述屏蔽单元用于在所述第一连接产物的5’端连接第二接头之前，向所述连接单元中添加特异性识别所述第一接头的屏蔽序列，以便对剩余的所述第一接头进行屏蔽处理。通过接头屏蔽试剂屏蔽过量的接头，可以连接单元中进行第一接头和第二接头的连接，能够简化多步切胶纯化的步骤，不仅缩短了文库构建的周期，且能够大大降低文库构建的成本。

根据本发明的实施例，所述屏蔽序列包括双链区和5’突出端，其中，所述5’突出端能够与所述第一接头的至少一部分匹配。由此，能够有效屏蔽过量的第一接头，效果理想。

根据本发明的实施例，所述屏蔽单元进一步包括：预处理模块，所述预处理模块用于在向所述连接单元中添加特异性识别所述第一接头的屏蔽序列之前，预先对所述屏蔽序列进行预处理，所述预处理包括：将含有所述屏蔽序列和缓冲液的混合物置于95摄氏度下5分钟，然后以0.1摄氏度/秒的速率梯度降温至25摄氏度，所述缓冲液为含有0.05M NaCl的0.01M Tris-HCl溶液。由此，能够有效提高屏蔽效率和屏蔽效果。

反转录单元，所述反转录单元用于对所述第二连接产物进行反转录，以便获得反转录产物。在反转录单元中，可以将含有不同标签的第二连接产物混合在一起进行反转录，不仅大幅度提高了通量，且进一步简化操作、降低成本。

扩增单元，所述扩增单元用于利用一对PCR引物对所述反转录产物进行扩增，以便获得PCR扩增产物，其中，所述一对PCR引物之一含有链霉亲和素。由此，有利于在后续步骤分离纯化目标产物。

分离单元，所述分离单元用于从所述PCR扩增产物分离单链DNA分子。

根据本发明的实施例，所述分离单元进一步包括：吸附模块，所述吸附模块用于使所述PCR扩增产物与磁珠接触，以便形成磁珠-DNA复合物，其中，所述磁珠上连接有链霉亲和素；洗脱模块，所述洗脱模块用于使所述磁珠-DNA复合物与pH高于7的溶液接触，以便获得所述单链DNA片段。由此，能够有效分离获得单链DNA片段，操作简单方便，且收率高，目标产物损失小。

根据本发明的实施例，所述pH高于7的溶液为氢氧化钠溶液。由此，有利于提高分离效率。

环化单元，所述环化单元用于将所述单链DNA分子进行环化处理，以便获得环化产物，所述环化产物构成所述测序文库。

根据本发明的实施例，可以进一步包括电泳分离单元，所述电泳分离单元用于在从所述PCR扩增产物分离单链DNA分子之前，预先对PCR扩增产物进行电泳分离，以便获得小分子RNA，由此，能够快速有效地针对小分子RNA构建测序文库。

发明人发现，利用本发明的该装置，可以有效实施前面所述的构建测序文库的方法，用于RNA分子测序文库构建，且操作简单、效果好，成本低廉，且具有较高的稳定性和可重复性，结果真实可靠。

实施例1

实验样本来源：有标准品universal human reference RNA(安捷伦)、human brain referenceRNA(Ambion)

按照如下实验步骤，进行四组平行试验：

1、3’接头连接

1)取总RNA 1μg(1110ng/μl，不小于200ng/μl)，补RNase-free水至2.5μl(不超过5μl)，加入1μl 10μM的腺苷酰化3’接头(3’接头的序列为：5’-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCNNNNNNNNNNGAGCTTGTCT-3’(SEQ ID NO.13)，其中，N表示标签序列，标签序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8中的任意一种)。PCR仪中70℃变性2min。

SEQ ID NO.	标签序列
		1	CTGTTTGGAC
2	AGTTGCCAAT
		3	TTATCAGGTC
4	TAAGAGACCC
		5	ACTCTCTACC
6	GGTCTAGTCA
		7	TAGCTAAGTG
8	TACAAAAGGA

2)在上步RNA及接头的管中加入如下反应混合液：

10×T4RNA连接酶缓冲液	1μl
		50％PEG8000	2.5μl
RNase抑制剂(40U/μl)	0.5μl
		T4RNA连接酶2，truncated(MCLAB)(200U/μl)	1μl
RNase-free水	1.5μl
		总体积	6.5μl

3)混匀离心后，PCR仪中25℃反应2h。

2、接头屏蔽

1)接头屏蔽试剂包括3部分组成(核苷酸序列即接头屏蔽子、缓冲溶液、经过一定的温度条件处理)，核苷酸序列可以为SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12中的任意一种，其包含一段互补序列，在5’端突出一段序列与3’接头全部序列互补配对或者部分序列互补配对，在一定条件下形成一个泡状结构(泡状结构见图1)。为了获得稳定的泡状结构，测试了3种不同缓冲溶液、3种不同温度处理条件。

SEQ ID NO.	屏蔽单元(接头屏蔽子序列)(5’-3’)
		9	CTGGAGACGTCGTGTCCAGTGCGGGGCGAGGTATTCGCACTGGACACGAC
10	CTGGAGACGTCAACTGGTGCCGTGGAGTCGGCACCAGTTGAC
		11	CrUrGrGrArGrArCrUrCrCrArCrGrUrUrCrGrCrGrUrGrGr
12	CTGGAGACTCCACGTTCGCGTGG

缓冲溶液I:1×TE缓冲液PH7.5

缓冲溶液II:0.05M NaCl、0.01M Tris-HCl、0.1mM EDTA

缓冲溶液III:0.05M NaCl、0.01M Tris-HCl

温度条件：(1)水浴95℃5min，关闭电源水浴自然降温至室温；(2)热循环仪95℃5min，关闭电源自然降温至室温；(3)热循环仪95℃5min，0.1℃/秒速率梯度降温至25℃。

温度条件(1)与三种缓冲溶液处理接头屏蔽子的电泳检测结果见图2，其中，泳道1为缓冲溶液II与温度条件(1)处理的接头屏蔽子，泳道2为缓冲溶液III与温度条件(1)处理的接头屏蔽子，泳道3为缓冲溶液I与温度条件(1)处理的接头屏蔽子，泳道4为10bpDNA ladder。温度条件(3)与缓冲溶液II和缓冲溶液III处理接头屏蔽子的电泳检测结果见图3，其中，泳道1为10bp DNA ladder，泳道2为缓冲溶液II与温度条件(3)处理的接头屏蔽子，泳道3为缓冲溶液III与温度条件(3)处理的接头屏蔽子。由图2和图3可知，缓冲溶液III和温度条件(3)组合能够获得稳定和单一的泡状结构，因此，选择缓冲溶液III和温度条件(3)组合作为接头屏蔽子进行后续实验。

2)在3’接头连接完成的反应管中加入接头屏蔽试剂(SEQ ID NO.11+缓冲溶液III+温度条件(3)得到的30μM屏蔽试剂)1μl，混匀离心。

3)PCR仪中30℃15min进行反应，使得过量的3’接头被屏蔽，避免其与后面加入的5’接头连接。

3、5’接头连接

1)取1μl 10μM的5’接头(5’接头的序列为：5’-UCCUAAGACCGCUUGGCCUCCGACUU-3’(SEQ ID NO.14)，70℃变性2min，冰上冷却1min后加入经接头屏蔽试剂处理的反应液。

2)上步的反应液中再加入下面的反应混合液：

10mM ATP	1μl
		RNase抑制剂(40U/μl)	0.5μl
T4RNA连接酶1(10U/μl)	1μl

3)混匀离心后，PCR仪中20℃反应1h。

4、样品混合(pooling)

将8个不同标签的5’接头连接连接产物样品混合在一起，乙醇沉淀纯化，最后溶解于10μl RNase-free水。

5、反转录

1)上步反应液中加入反应混合液：

其中，ON0639具有SEQ ID NO.15所示的序列，short反转录引物具有SEQ ID NO.16所示的序列。

2)反应程序：

42℃	30min
		70℃	15min
12℃	保持

6、PCR

1)取反转录产物10μl进行PCR，配制PCR反应混合液：

cDNA(反转录产物)	10
		20μM ON0639	2
20μM short反转录引物	2
		10×pfx缓冲液(invitrogen)	10
50mM MgSO4	3
		10mM dNTP	3
pfx(invitrogen)	1
		水	69

总体积

100

其中ON0639具有SEQ ID NO.15所示的序列，short反转录引物具有SEQ ID NO.16所示的序列，混匀后分为两管进行PCR，其中，引物ON0639含有生物标记素。

2)PCR仪中设置反应程序：

7、10％PAGE电泳分离miRNA

1)取10％TBE PAGE胶，卡好楔子加入缓冲液，拔出梳子，不用预电泳和冲洗胶孔。

2)向每50μl的PCR产物中加10μl 6×加样缓冲液(或10×)，分3个加样孔上样；另取2μl 20bp DNA梯状标志加样于中间一孔。

3)180V电泳约30分钟，溴酚蓝跑到距下沿约1/5处，即可停止电泳。染胶4－5分钟。，10％TBE PAGE电泳胶图见图4，其中，实线箭头所示为80～100bp目的片段大小，虚线箭头所示为67bp接头自连片段大小，泳道1为10bp DNA ladder，泳道2、3分别为反转录条件42摄氏度反应30分钟，70摄氏度反应15分钟后PCR产物，泳道4、5分别为反转录条件48摄氏度反应30分钟，70摄氏度反应15分钟后PCR产物。由图4可知，当反转录条件48摄氏度反应30分钟，70摄氏度反应15分钟时，获得相对集中的目的产物，且接头自连产物明显减少，非特异性扩增得到有效控制。

4)切下约85-97bp(80-100bp)的条带，将切下的主带胶块置于0.5ml已扎孔的离心管(套在2ml离心管上)，13600rpm离心2分钟，使胶块通过小孔挤成碎胶。

5)在碎胶中加入200-300μl 1×NEB 2(NEB2是10×的，用前稀释10倍)，室温下混匀器或thermomixer上2小时，洗脱DNA。用TE或水代替1×NEB2也可以。

6)将碎胶和缓冲液转入Spin－X滤器，13600rpm离心2分钟。

7)向洗脱液中加入2μl完全融化的糖原，20-30μl 3M醋酸钠(NaAC，NaAC的体积＝1/10倍的洗脱液体积)，650-975μl 100％乙醇(乙醇体积按照洗脱液的体积计算)。混匀后-80℃放置30分钟或更长，以提高回收效率，4℃13600rpm离心30分钟。

8)离心后会见到白色沉淀，弃上清，再用700μl 70％或75％乙醇洗涤沉淀，晾干，用30μl EB溶液溶解白色沉淀。

9)qubit HS染料定量检测浓度，每两个8pool后的样品取等量混合，总量不超过150ng，进行后续的单链分离及环化过程。

8、单链分离

在PCR的过程中，通过引物ON0639在PCR产物的一条链上的5’端引入了生物素标记，该生物素标记能够稳定结合到链霉素磁珠上，并在强碱性条件下解离出不带生物标记的一条链，获得单链DNA分子，具体步骤如下：

a)将上述EB溶液溶解的DNA样品补1×TE至总体积为60μl。

b)提前准备以下试剂：链亲和素磁珠，0.3M 3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)，0.1MNaOH，其中0.1M NaOH，链亲和素磁珠需现配现用。

c)提前15min配制0.1M NaOH

0.5M NaOH	6μl
		水	24μl
总体积	30.0μl

d)链亲和素磁珠洗涤方法如下：

1)每个样品取30μl链亲和素磁珠：加入3-5倍体积的1×BBB(磁珠结合缓冲液，110mMTris-HCl，200mM NaCl)，混匀后置于磁力架上静止吸附，调整不粘管的方向，使得磁珠在1×BBB洗液中前后游动，弃上清液后，重复上述操作一次，

2)取出不粘管加入1倍体积(30μl)1×BBB悬浮，混匀后室温静置。

e)向60μl上述步骤7中获得的产物样品中加入20μl 4×BBB混匀，然后转移到上步骤含有30μl 1×BBB溶解的磁珠的不粘管中混匀，此110μl混合物室温下结合15min，中间轻轻弹匀一次。

f)将上述不粘管磁力架放置3-5min，弃去上清液，用1ml的1×BWB(磁珠洗涤缓冲液，10mM Tris-HCl，40mM NaCl)洗涤2次，方法同链亲和素磁珠的洗涤方法

g)向上述磁珠中加入26μl 0.1M NaOH，吹打混匀后放置10min，再置于磁力架上3-5min，取上清到新的1.5ml EP管中。

h)向上述1.5ml EP管中加入13μl 0.3M MOPS，混匀备用。

i)此步骤产物可以冻存于-20℃。

9、环化

a)向上一步得到的39μl的样品中加入2.5μl的20μM ON1587(ON1587具有SEQ IDNO.17所示的序列)；

ON1587：5’-TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC-3’(SEQ ID NO.17)

b)提前5分钟准备连接酶反应混合液，配制如下：

水

11.7μl

10×TA缓冲液	6μl
		100mM ATP	0.6μl
600U/μl连接酶	0.2μl
		总体积	18.5μl

c)将连接酶反应混合液震荡充分混匀，离心后，向已经加入引物反应混合液的EP管中加入连接酶反应混合液18.5μl，震荡10s混匀，瞬时离心。

d)置于PCR仪中37℃孵育1.5h。

e)反应完成后，取出5μl样品，待6％变性胶电泳检测，剩余的约55μl体积，进入下一步酶反应。

10、酶切消化

a)提前5分钟左右准备引物反应混合液，配制如下：

10×TA缓冲液	1μl
		20U/μl Exo I	2.1μl
200U/μl Exo III	0.7μl
		总体积	3.8μl

b)将上述混合液震荡充分混匀，离心后，向上一步得到的55μl的样品中分别加入3.8μl的反应混合液；

c)震荡10s混匀离心，置于PCR仪中37℃孵育30min。

d)酶切30min完成后，向样品中加入2.5μl 500mM EDTA终止酶反应。

e)上述样品转移至一新的1.5ml离心管，补水40μl，再加入10μl NaAc，2μl糖原，300μl无水乙醇，混匀后-80℃沉淀30分钟以上，4℃13600rpm离心30分钟，弃上清，再用600μl 70％或75％乙醇洗涤沉淀。

f)室温下晾干后用27μl TE回溶，分别得到测序文库UHRR1、UHRR2、UHRR3和UHRR4；

g)将最终得到产物用Qubit^TMssDNA Assay Kit定量。

h)取5μl上述获得的测序文库样品至PCR管中与5μl 2×TBE加样缓冲液混匀，同时取1.5μl低倍率sRNA梯(ladder，已与等体积的2×RNA加样缓冲液混合)到PCR管，将样品与ladder置于PCR仪中70℃变性2min，迅速转移至冰上冷却2min，再进行6％的TBE变性胶检测，检测结果见图5，其中，泳道1和2是单链环状文库，泳道3是低范围ssRNA梯(low range ssRNA ladder)。

11.测序方法和下机数据

把上述步骤f)获得的四组单链环状文库分别进行滚环复制，制备成DNA纳米球

(DNB)，然后用复合探针-锚定分子连接(Combinatorial probe--anchor ligation,cPAL)方式进行测序，得到的数据进行过滤，接头自连比例在1.1％以下，结果见表1。

表1

文库名称	总reads数	接头自连数目	接头自连比例
				UHRR1	30388378	95448	0.31％
UHRR2	24285808	258431	1.06％
				UHRR3	34716036	106415	0.31％
UHRR4	37716188	128642	0.34％
				总计	127106410	588936	0.46％

从表1的结果可知，4个样品的接头自连比例控制在较低的水平，能有效的节约接头自连带来数据浪费。同时四个平行文库结果显示接头自连比例波动较小，该方法在控制接头自连作用稳定重复性好。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种针对RNA分子构建测序文库的方法，其特征在于，包括：

(a)在RNA分子的3’端连接第一接头，以便获得第一连接产物；

(b)在所述第一连接产物的5’端连接第二接头，以便获得第二连接产物；

(c)对所述第二连接产物进行反转录，以便获得反转录产物；

(d)利用一对PCR引物对所述反转录产物进行扩增，以便获得PCR扩增产物，其中，所述一对PCR引物之一含有链霉亲和素；

(e)从所述PCR扩增产物分离单链DNA分子；以及

(f)将所述单链DNA分子进行环化处理，以便获得环化产物，所述环化产物构成所述测序文库。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA分子的长度18～30nt。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一接头和所述第二接头至少之一中包含标签序列，

任选地，所述标签序列为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8中的至少之一。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)和(b)是在相同容器中进行的，

其中，在步骤(a)中采用过量的所述第一接头，并且在进行步骤(b)之前，向步骤(a)所得到的反应产物中添加特异性识别所述第一接头的屏蔽序列，以便对剩余的所述第一接头进行屏蔽处理，

任选地，所述屏蔽序列包括双链区和5’突出端，

其中，所述5’突出端能够与所述第一接头的至少一部分匹配，

任选地，向步骤(a)所得到的反应产物中添加特异性识别所述第一接头的屏蔽序列之前，预先对所述屏蔽序列进行预处理，所述预处理包括：

将含有所述屏蔽序列和缓冲液的混合物置于95摄氏度下5分钟，然后以0.1摄氏度/秒的速率梯度降温至25摄氏度，

所述缓冲液为含有0.05M NaCl的0.01M Tris-HCl溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，从所述PCR扩增产物分离单链DNA分子进一步包括：

使所述PCR扩增产物与磁珠接触，以便形成磁珠-DNA复合物，其中，所述磁珠上连接有链霉亲和素；

将所述磁珠-DNA复合物与pH高于7的溶液接触，以便获得所述单链DNA片段，

任选地，所述pH高于7的溶液为氢氧化钠溶液。

6.一种针对RNA分子构建测序文库的装置，其特征在于，包括：

连接单元，所述连接单元用于依次在RNA分子的3’端连接第一接头，以便获得第一连接产物；以及在所述第一连接产物的5’端连接第二接头，以便获得第二连接产物；

反转录单元，所述反转录单元用于对所述第二连接产物进行反转录，以便获得反转录产物；

扩增单元，所述扩增单元用于利用一对PCR引物对所述反转录产物进行扩增，以便获得PCR扩增产物，其中，所述一对PCR引物之一含有链霉亲和素；

分离单元，所述分离单元用于从所述PCR扩增产物分离单链DNA分子；以及

环化单元，所述环化单元用于将所述单链DNA分子进行环化处理，以便获得环化产物，所述环化产物构成所述测序文库。

7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，所述RNA分子的长度18～30nt。

8.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，所述第一接头和所述第二接头至少之一中包含标签序列，

任选地，所述标签序列为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8中的至少之一。

9.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，进一步包括：

屏蔽单元，所述屏蔽单元用于在所述第一连接产物的5’端连接第二接头之前，向所述连接单元中添加特异性识别所述第一接头的屏蔽序列，以便对剩余的所述第一接头进行屏蔽处理，

任选地，所述屏蔽序列包括双链区和5’突出端，

其中，所述5’突出端能够与所述第一接头的至少一部分匹配，

任选地，所述屏蔽单元进一步包括：

预处理模块，所述预处理模块用于在向所述连接单元中添加特异性识别所述第一接头的屏蔽序列之前，预先对所述屏蔽序列进行预处理，所述预处理包括：

将含有所述屏蔽序列和缓冲液的混合物置于95摄氏度下5分钟，然后以0.1摄氏度/秒的速率梯度降温至25摄氏度，

所述缓冲液为含有0.05M NaCl的0.01M Tris-HCl溶液。

10.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，所述分离单元进一步包括：

吸附模块，所述吸附模块用于使所述PCR扩增产物与磁珠接触，以便形成磁珠-DNA复合物，其中，所述磁珠上连接有链霉亲和素；

洗脱模块，所述洗脱模块用于使所述磁珠-DNA复合物与pH高于7的溶液接触，以便获得所述单链DNA片段，

任选地，所述pH高于7的溶液为氢氧化钠溶液。