CN104789687A - 用于多基因捕获测序的探针制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于多基因捕获测序的探针制备方法，该方法至少包括如下步骤：步骤1：制备探针。步骤2：捕获目标DNA。步骤3：进行洗脱程序。步骤4：用高保真酶的反应扩增体系进行捕获目标DNA后扩增。步骤5：扩增产物用磁珠纯化后，用Nanodrop定量至20ng/ul，分装保存。步骤6：用Real-time PCR方法对阳性对照序列进行检测，验证捕获效率。本发明利用芯片技术合成了一种单链DNA捕获探针，包括DNA芯片合成，探针切割，核苷酸扩增，DAN解链得到单链的生物素标记的寡核苷酸探针池。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种用于多基因捕获测序的探针制备方法。
背景技术
近年来，以二代测序技术为基础的研究得到快速发展，在二代测序技术领域里，以Illumina,Agilent,Roche,ABI为代表的第二代测序技术使测序成本大大降低，在临床和科研中占据着重要地位。第二代测序技术最大的特点是高通量，可以对数以亿计的DNA片段进行同时测序。尽管高通量的测序技术使测序成本大大降低，然而测序一个人的全基因组仍需数千美元，这对于需要大量临床样本进行疾病研究的项目来说，总测序成本仍然很高。更重要的是全基因组测序的巨大数据量使得数据分析也是一个沉重的负担。而且目前全基因组测序的深度一般为30X,很难达到一些临床应用的要求。对于研究人类某些疾病的科学家来说，他们并不需要对全基因组进行测序，他们感兴趣的往往只是小部分的基因组区域，例如全外显子区(相当于1％的人全基因组大小)，而选择性对某些区域进行测序，不仅使测序成本大大降低，同时也能缩短测序时间。序列捕获技术是一种对基因组特定区域进行选择性富集的技术，将目标区域从基因组中分离出来，然后再对该目标区域进行测序，这对于低成本地有针对性的进行基因组学研究有非常重要的意义。
目前常用的序列捕获方法主要有，多重PCR,液相杂交法。PCR法具有高灵敏性、高特异性和重复性好等优点。PCR富集法在二代测序技术平台目前主要用于捕获一些小的区域，特别是一些连续的区域。对于较大的非连续的区域，如全外显子，PCR富集法的适用性受到较大的限制。尽管微滴PCR等技术在一定程度上缓解了上述部分问题，然而实际上这些PCR反应由于在同一反应中使用多种引物，导致大量非特异性产物的扩增，并且容易出现部分区域无法扩增的情况，目前生产这类产品代表性的是ABI公司。
目前基于杂交的序列捕获技术是二代测序平台中使用较多的序列富集方法，主要分为固相杂交和液相杂交。固相杂交序列捕获技术是一种将寡核苷酸探针合成在芯片上，并在芯片上进行杂交的高通量序列捕获技术，可以在一个芯片上捕获整个外显子甚至更大的区域。但因为芯片上的寡核苷酸量较少，所以就需要较大的样本起始量来推动杂交的发生。而液相杂交技术是通过将芯片上合成的探针剪切回收后进行扩增富集而构建用于杂交目的的杂交探针库，液相杂交在动力学上相对固相杂交更具优势，能降低对于样品起始量的要求。相对于液相杂交而言，固相杂交已逐渐被淘汰，而液相杂交中的探针又可分为RNA探针和DNA探针。目前有代表性的两家公司分别为Agilent和IDT,Agilent主要生产RNA探针，而IDT主要生产DNA探针。RNA探针运输以及保存均不方便，相对于DNA来讲成本要更高一些。而IDT的DNA探针的合成是通过柱式合成而后混合到一起的，而非芯片式合成的，相对与全外显子的量，合成的的代价也是极其昂贵的，是极不易于推广的。虽然Agilent和IDT的探针都是单链，相对杂交的驱动力来讲几乎是一致的，但它们都极其昂贵。
发明内容
本发明的目的：提供一种用于多基因捕获测序的探针制备方法，包括捕获目标基因的探针制备技术及其在二代测序中的应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种用于多基因捕获测序的探针制备方法，该方法至少包括如下步骤：
步骤1：制备探针。
步骤2：捕获目标DNA。
步骤3：进行洗脱程序。
步骤4：用高保真酶的反应扩增体系进行捕获目标DNA后扩增。
步骤5：扩增产物用磁珠纯化后，用Nanodrop定量至20ng/ul，分装保存。
步骤6：用Real-time PCR方法对阳性对照序列进行检测，验证捕获效率。
上述的用于多基因捕获测序的探针制备方法，其中，在所述的步骤1中，至少包括如下分步骤：
步骤1.1：合成12K，60K，90K等不同寡核苷酸数量的芯片，所述的芯片包含120bp目标区域和通用的15个碱基末端：
5′-ATCGCACCAGCGTGTN120CACTGCGGCTCCTCA-3′。
步骤1.2：把合成的寡核苷酸库溶于400ul的低浓度TE中。
步骤1.3：每个寡核苷酸的浓度为fmol级别，扩增得到所需浓度。
步骤1.4：用4％胶跑PCR产物，然后回收150bp大小的PCR产物，溶解到100ul水中。
步骤1.5：为了得到带生物素的单链的寡核苷酸片段，需要把PCR进行解链。
上述的用于多基因捕获测序的探针制备方法，其中，在所述的步骤1.3中，
引物序列具体为：A 5′Biotin-CTGGGAATCGCACCAGCGTGT-3′
B 5′-CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG-3′。
上述的用于多基因捕获测序的探针制备方法，其中，在所述的步骤1.3中，扩增条件为：制备3个50ul PCR mix，模板分别为1ul，2ul，5ul
PCR反应条件如下：
上述的用于多基因捕获测序的探针制备方法，其中，在所述的步骤1.5中，还包括如下步骤：
步骤1.5.1：用1X binding buffer漂洗100ul3次，悬浮2X binding buffer，总体积是100ul。
步骤1.5.2：把100ul的加入到100ul PCR产物，涡旋震荡混匀，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5分钟。
步骤1.5.3：将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清5分钟，移除上清。
步骤1.5.4：保持PCR管始终处于磁力架中，用1X TE清洗2次，移除上清。
步骤1.5.5：加入100ul 0.1M的NaOH，涡旋震荡混匀，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5分钟。
步骤1.5.6：将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清5分钟，移除上清，移除的上清即为未标记生物素的DNA单链。
步骤1.5.7：保持PCR管始终处于磁力架中，用1X TE清洗2次。
步骤1.5.8：将反应管从磁力架中取出，加入100ul 95％甲酰胺，10mM EDTA，pH 8.2，65孵育2minutes，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。
步骤1.5.9：将反应管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后，吸取上清至灭菌EP管中，吸取的上清即为生物素标记的DNA单链。
步骤1.5.10：用基于特异性识别双链DNA的荧光染料法进行测定进行定量，DNA浓度一般为100-200ng/ul。
上述的用于多基因捕获测序的探针制备方法，其中，在所述的步骤2中，至少包括如下分步骤：
步骤2.1：制备如下混合液：3.5ul 500ng DNA库、1.5ul 200uM的Adaptor Block及5ul capture probe。
步骤2.2：在PCR仪中，95℃7min，65℃5min。
步骤2.3：加入10ul 65℃预热的2X杂交液。
步骤2.4：在PCR仪上65℃杂交24h。
上述的用于多基因捕获测序的探针制备方法，其中，在所述的步骤3中，至少包括如下分步骤：
步骤3.1：用1X binding buffer漂洗100ul3次，悬浮于200ul 1X binding buffer中。
步骤3.2：把20ul杂交产物加入到200ul1X bindingbuffer中，涡旋震荡混匀，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温摇动孵育30分钟。
步骤3.3：将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清5分钟，移除上清。
步骤3.4：保持1.5ml管始终处于磁力架中，用0.5ml 1X SSC/0.1％SDS清洗15min。
步骤3.5：用65℃温浴的0.5ml 0.1X SSC/0.1％SDS洗3次。
步骤3.6：将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清5分钟，移除上清。
步骤3.7：加入50μl灭菌超纯水，涡旋震荡混匀，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5分钟，捕获的DNA还在生物素结合的磁珠上。
上述的用于多基因捕获测序的探针制备方法，其中，在所述的步骤4中，所述的扩增条件为：
上述的用于多基因捕获测序的探针制备方法，其中，在所述的步骤4中，PCR反应条件如下。
本发明利用芯片技术合成了一种单链DNA捕获探针，包括DNA芯片合成，探针切割，核苷酸扩增，DAN解链得到单链的生物素标记的寡核苷酸探针池。
附图说明
图1是本发明用于多基因捕获测序的探针制备方法的EGFR，Her2，C-met及Alu序列在捕获前文库的定量结果图。
图2是本发明用于多基因捕获测序的探针制备方法的EGFR，Her2，C-met及Alu序列在捕获后文库的定量结果图。
具体实施方式
以下结合附图进一步说明本发明的实施例。
请参见附图1及附图2所示，一种用于多基因捕获测序的探针制备方法，该方法至少包括如下步骤：
步骤1：制备探针。
步骤2：捕获目标DNA。
步骤3：进行洗脱程序。
步骤4：用高保真酶的反应扩增体系进行捕获目标DNA后扩增。
步骤5：扩增产物用磁珠纯化后，用Nanodrop定量至20ng/ul，分装保存。
步骤6：用Real-time PCR方法对阳性对照序列进行检测，验证捕获效率。
在所述的步骤1中，至少包括如下分步骤：
步骤1.1：合成12K，60K，90K等不同寡核苷酸数量的芯片，所述的芯片包含120bp目标区域和通用的15个碱基末端：
5′-ATCGCACCAGCGTGTN120CACTGCGGCTCCTCA-3′。
步骤1.2：把合成的寡核苷酸库溶于400ul的低浓度TE(10mMTris-HCL，PH8，0.1mM EDTA)中。
步骤1.3：因为每个寡核苷酸的浓度为fmol级别的，所以需要扩增才能得到所需浓度。
引物序列具体为：A 5′Biotin-CTGGGAATCGCACCAGCGTGT-3′
B 5′-CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG-3′
扩增条件：(制备3个50ul PCR mix)，模板分别为1ul，2ul，5ul
PCR反应条件如下：
步骤1.4：用4％胶跑PCR产物，然后回收150bp大小的PCR产物，溶解到100ul水中。
步骤1.5：为了得到带生物素的单链的寡核苷酸片段，需要把PCR进行解链。
在所述的步骤1.5中，还包括如下步骤：
步骤1.5.1：用1X binding buffer(1M NaCl，10mM Tris-HCl，pH 7.5，and EDTA)漂洗100ul3次，最后悬浮2X binding buffer，总体积是100ul。
步骤1.5.2：把100ul的加入到100ul PCR产物，涡旋震荡混匀，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5分钟。
步骤1.5.3：将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清约5分钟，小心移除上清。
步骤1.5.4：保持PCR管始终处于磁力架中，用1X TE(10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA)清洗2次，移除上清。
步骤1.5.5：加入100ul 0.1M的NaOH，涡旋震荡混匀，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5分钟。
步骤1.5.6：将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清约5分钟，小心移除上清，移除的上清即为未标记生物素的DNA单链。
步骤1.5.7：保持PCR管始终处于磁力架中，用1X TE(10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA)清洗2次。
步骤1.5.8：将反应管从磁力架中取出，加入100ul 95％甲酰胺，10mMEDTA，pH 8.2，65孵育2minutes，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。
步骤1.5.9：将反应管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后，小心吸取上清至灭菌EP管中，吸取的上清即为生物素标记的DNA单链。
步骤1.5.10：用基于特异性识别双链DNA的荧光染料法进行测定(如)进行定量，总的来说，DNA浓度一般为100-200ng/ul。
在所述的步骤2中，至少包括如下分步骤：
步骤2.1：制备如下混合液：
3.5ul 500ng DNA库(用Illumina方法制备好的库)、
1.5ul 200uM的Adaptor Block及
5ul capture probe(200ng/ul)
步骤2.2：在PCR仪中，95℃7min，65℃5min。
步骤2.3：加入10ul 65℃预热的2X杂交液(终浓度1X)。
步骤2.4：在PCR仪上65℃杂交24h(设定热盖105℃)。
在所述的步骤3中，至少包括如下分步骤：
步骤3.1：用1X binding buffer(1M NaCl，10mM Tris-HCl，pH 7.5，and EDTA)漂洗100ul3次，最后悬浮于200ul 1X bindingbuffer中。
步骤3.2：把20ul杂交产物加入到200ul1X bindingbuffer中，涡旋震荡混匀，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温摇动孵育30分钟。
步骤3.3：将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清约5分钟，小心移除上清。
步骤3.4：保持1.5ml管始终处于磁力架中，用0.5ml 1X SSC/0.1％SDS清洗15min。
步骤3.5：用65℃温浴的0.5ml 0.1X SSC/0.1％SDS洗3次。
步骤3.6：将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清约5分钟，小心移除上清。
步骤3.7：加入50μl灭菌超纯水，涡旋震荡混匀，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5分钟，捕获的DNA还在生物素结合的磁珠上。
在所述的步骤4中，所述的扩增条件为：
在所述的步骤4中，PCR反应条件如下：
实施例1：
以癌症相关基因为目标靶点进行捕获探针制备。共制备319个相关基因(如附表1所示)的120bp+30bp的片段长度的混合物。
步骤1：制备探针。
步骤1.1：合成12K，60K，90K等不同寡核苷酸数量的芯片，这些芯片包含120bp目标区域和通用的15个碱基末端。
5′-ATCGCACCAGCGTGTN120CACTGCGGCTCCTCA-3′
步骤1.2：把合成的寡核苷酸库溶于400ul的低浓度TE(10mMTris-HCL，PH8，0.1mM EDTA)中。
步骤1.3：因为每个寡核苷酸的浓度为fmol级别的，所以需要扩增才能得到所需浓度。
引物序列：A 5′Biotin-CTGGGAATCGCACCAGCGTGT-3′
B 5′-CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG-3′
扩增条件：(制备3个50ul PCR mix)，模板分别为1ul，2ul，5ul，
PCR反应条件如下：
步骤1.4：用4％胶跑PCR产物，然后回收150bp大小的PCR产物，溶解到100ul水中。
步骤1.5：为了得到带生物素的单链的寡核苷酸片段，需要把PCR进行解链。
步骤1.5.1：用1X binding buffer(1M NaCl，10mM Tris-HCl，pH 7.5，and EDTA)漂洗100ul3次，最后悬浮2X binding buffer，总体积是100ul。
步骤1.5.2：把100ul的加入到100ul PCR产物。涡旋震荡混匀，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。室温孵育5分钟。
步骤1.5.3：将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清约5分钟，小心移除上清。
步骤1.5.4：保持PCR管始终处于磁力架中，用1X TE(10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA)清洗2次，移除上清。
步骤1.5.5：加入100ul 0.1M的NaOH，涡旋震荡混匀，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。室温孵育5分钟。
步骤1.5.6：将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清约5分钟，小心移除上清。移除的上清即为未标记生物素的DNA单链。
步骤1.5.7：保持PCR管始终处于磁力架中，用1X TE(10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA)清洗2次。
步骤1.5.8：将反应管从磁力架中取出，加入100ul 95％甲酰胺，10mMEDTA，pH 8.2，65孵育2minutes。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。
步骤1.5.9：将反应管置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清小心吸取上清至灭菌EP管中。吸取的上清即为生物素标记的DNA单链。
步骤1.5.10：用基于特异性识别双链DNA的荧光染料法进行测定(如)进行定量，总的来说，DNA浓度一般为100-200ng/ul。
步骤2：捕获目标DNA。
步骤2.1：制备如下混合液：
3.5ul 500ng DNA库(用Illumina方法制备好的库)、
1.5ul 200uM的Adaptor Block及
5ul capture probe(200ng/ul)。
步骤2.2：在PCR仪中，95℃7min，65℃5min。
步骤2.3：再加入10ul 65℃预热的2X杂交液(终浓度1X)。
步骤2.4：在PCR仪上65℃杂交24h(设定热盖105℃)。
步骤3：进行洗脱程序。
步骤3.1：用1X binding buffer(1M NaCl，10mM Tris-HCl，pH 7.5，and EDTA)漂洗100ul3次，最后悬浮于200ul 1X bindingbuffer中。
步骤3.2：把20ul杂交产物加入到200ul1X bindingbuffer中。涡旋震荡混匀，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。室温摇动孵育30分钟。
步骤3.3：将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清约5分钟，小心移除上清。
步骤3.4：保持1.5ml管始终处于磁力架中，用0.5ml 1X SSC/0.1％SDS清洗15min。
步骤3.5：再用65℃温浴的0.5ml 0.1X SSC/0.1％SDS洗3次。
步骤3.6：将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清约5分钟，小心移除上清。
步骤3.7：加入50μl灭菌超纯水，涡旋震荡混匀，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。室温孵育5分钟。捕获的DNA还在生物素结合的磁珠上。
步骤4：用高保真酶的反应扩增体系进行捕获目标DNA后扩增。
PCR反应条件如下：
步骤5：扩增产物用磁珠纯化后，用Nanodrop定量至20ng/ul，分装保存。
步骤6：用Real-time PCR方法对阳性对照序列(如EGFR，Her2，c-met)和阴性对照(如高度重复序列Alu原件，不再捕获目标内)进行检测，比较捕获前文库和捕获后文库阳性对照和阴性对的量来验证捕获效率(如附图1和附图2所示)。结果表明捕获后阴性对照序列的少量消耗和阳性对照序列高度富集表明了靶向目标的富集效率。
EGFR序列：
5-CCAAGGCACGAGTAACAAGCTCACGCAGTTGGGCACTTTTGAAGATCATTTTCTCAGCCTCCAGAGGATGTTCAATAACTGTGAGGTGGTCCTTGGGAATTT-3 SEQ ID NO 01
F-EGFR:5-CCAAGGCACGAGTAACAAGCT-3 SEQ ID NO 02
R-EGFR：5-AATTCCCAAGGACCACCTCAC-3 SEQ ID NO 03
Taqman：FAM-5-TCTCAGCCTCCAGAGGAT-3-BHQ-MGB SEQ ID NO 04
Her2序列：
5-ACATGACCCCAGCCCTCTACAGCGGTACAGTGAGGACCCCACAGTACCCCTGCCCTCTGAGACTGATGGCTACGTTGCC-3 SEQ ID NO 05
F-Her2:5-ACATGACCCCAGCCCTCTAC-3 SEQ ID NO 06
R-Her2:5-GGCAACGTAGCCATCAGTCT-3 SEQ ID NO 07
Taqman:FAM-5-CAGTGAGGACCCCACAG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO 08
c-MET序列：
5-CCATCCAGTGTCTCCAGAAGTGATTGTGGAGCATACATTAAACCAAAATGGCTACACACTGGTTATCACTGGGAA-3 SEQ ID NO 09
F-c-MET:5-CCATCCAGTGTCTCCAGAAGTG-3 SEQ ID NO 10
R-c-MET:5-TTCCCAGTGATAACCAGTGTGTAG-3 SEQ ID NO 11
Taqman:FAM-5-CATACATTAAACCAAAATG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO 12
Alu序列:
5-GACTAGCCTGGACAACATAGTGAGACCCCATCTTTACAAAAAAATTAAAAAAAATTAGTGGACATGGTGGCATGCACCTCTAGTCCCAGTTACTCAGGAGGCTGAGGTGGGAGGATCACCTGTGCCCAGGCTGAGGCTGCAGTGAGCCATGATCACGCCACTGCACTCCAGCCTGCGTGACAGAGCAAGACCCTGTCTCAAAAGAAAAGAAAAAAAAAGAAGAAAGAAAT-3 SEQ ID NO 13
F-Alu:5-GTGGCATGCACCTCTAGTCC-3 SEQ ID NO 14
R-Alu：5-TGAGACAGGGTCTTGCTCTG-3 SEQ ID NO 15
Taqman:FAM-5-ACTCAGGAGGCTGAGGTG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO 16
附表1：319个癌症相关基因列表：
综上所述，本发明利用芯片技术合成了一种单链DNA捕获探针，包括DNA芯片合成，探针切割，核苷酸扩增，DAN解链得到单链的生物素标记的寡核苷酸探针池。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用附属在其他相关产品的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
<110>上海允英医疗科技有限公司
<120>用于多基因捕获测序的探针制备方法
<160>16
<210>1
<211>102
<212>DNA
<213>人工合成
<726>1
CCAAGGCACGAGTAACAAGCTCACGCAGTTGGGCACTTTTGAAGATCATTTTCTCAGCCTCCAGAGGATGTTCAATAACTGTGAGGTGGTCCTTGGGAATTT 102
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<726>2
CCAAGGCACGAGTAACAAGCT 21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<726>3
AATTCCCAAGGACCACCTCAC 21
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<726>4
TCTCAGCCTCCAGAGGAT 18
<210>5
<211>79
<212>DNA
<213>人工合成
<726>5
ACATGACCCCAGCCCTCTACAGCGGTACAGTGAGGACCCCACAGTACCCCTGCCCTCTGAGACTGATGGCTACGTTGCC 79
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<726>6
ACATGACCCCAGCCCTCTAC 20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<726>7
GGCAACGTAGCCATCAGTCT 20
<210>8
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成
<726>8
CAGTGAGGACCCCACAG 17
<210>9
<211>75
<212>DNA
<213>人工合成
<726>9
CCATCCAGTGTCTCCAGAAGTGATTGTGGAGCATACATTAAACCAAAATGGCTACACACTGGTTATCACTGGGAA 75
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<726>10
CCATCCAGTGTCTCCAGAAGTG 22
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<726>11
TTCCCAGTGATAACCAGTGTGTAG 24
<210>12
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<726>12
CATACATTAAACCAAAATG 19
<210>13
<211>230
<212>DNA
<213>人工合成
<726>13
GACTAGCCTGGACAACATAGTGAGACCCCATCTTTACAAAAAAATTAAAAAAAATTAGTGGACATGGTGGCATGCACCTCTAGTCCCAGTTACTCAGGAGGCTGAGGTGGGAGGATCACCTGTGCCCAGGCTGAGGCTGCAGTGAGCCATGATCACGCCACTGCACTCCAGCCTGCGTGACAGAGCAAGACCCTGTCTCAAAAGAAAAGAAAAAAAAAGAAGAAAGAAAT 230
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<726>14
GTGGCATGCACCTCTAGTCC 20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<726>15
TGAGACAGGGTCTTGCTCTG 20
<210>16
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<726>16
ACTCAGGAGGCTGAGGTG 18
Claims (9)
1.一种用于多基因捕获测序的探针制备方法，其特征在于：该方法至少包括如下步骤：
步骤1：制备探针；
步骤2：捕获目标DNA；
步骤3：进行洗脱程序；
步骤4：用高保真酶的反应扩增体系进行捕获目标DNA后扩增；
步骤5：扩增产物用磁珠纯化后，用Nanodrop定量至20ng/ul，分装保存；
步骤6：用Real-time PCR方法对阳性对照序列进行检测，验证捕获效率。
2.根据权利要求1所述的用于多基因捕获测序的探针制备方法，其特征在于：在所述的步骤1中，至少包括如下分步骤：
步骤1.1：合成12K，60K，90K等不同寡核苷酸数量的芯片，所述的芯片包含120bp目标区域和通用的15个碱基末端：
5′-ATCGCACCAGCGTGTN120CACTGCGGCTCCTCA-3′；
步骤1.2：把合成的寡核苷酸库溶于400ul的低浓度TE中；
步骤1.3：每个寡核苷酸的浓度为fmol级别，扩增得到所需浓度；
步骤1.4：用4％胶跑PCR产物，然后回收150bp大小的PCR产物，溶解到100ul水中；
步骤1.5：为了得到带生物素的单链的寡核苷酸片段，需要把PCR进行解链。
3.根据权利要求2所述的用于多基因捕获测序的探针制备方法，其特征在于：在所述的步骤1.3中，
引物序列具体为：A 5′Biotin-CTGGGAATCGCACCAGCGTGT-3′
B 5′-CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG-3′。
4.根据权利要求2所述的用于多基因捕获测序的探针制备方法，其特征在于：在所述的步骤1.3中，扩增条件为：制备3个50ul PCR mix，模板分别为1ul，2ul，5ul
PCR反应条件如下。
。
5.根据权利要求2所述的用于多基因捕获测序的探针制备方法，其特征在于：在所述的步骤1.5中，还包括如下步骤：
步骤1.5.1：用1X binding buffer漂洗100ul 3次，悬浮2X binding buffer，总体积是100ul；
步骤1.5.2：把100ul的加入到100ul PCR产物，涡旋震荡混匀，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5分钟；
步骤1.5.3：将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清5分钟，移除上清；
步骤1.5.4：保持PCR管始终处于磁力架中，用1X TE清洗2次，移除上清；
步骤1.5.5：加入100ul 0.1M的NaOH，涡旋震荡混匀，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5分钟；
步骤1.5.6：将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清5分钟，移除上清，移除的上清即为未标记生物素的DNA单链；
步骤1.5.7：保持PCR管始终处于磁力架中，用1X TE清洗2次；
步骤1.5.8：将反应管从磁力架中取出，加入100ul 95％甲酰胺，10mM EDTA，pH 8.2，65孵育2minutes，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀；
步骤1.5.9：将反应管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后，吸取上清至灭菌EP管中，吸取的上清即为生物素标记的DNA单链；
步骤1.5.10：用基于特异性识别双链DNA的荧光染料法进行测定进行定量，DNA浓度一般为100-200ng/ul。
6.根据权利要求1所述的用于多基因捕获测序的探针制备方法，其特征在于：在所述的步骤2中，至少包括如下分步骤：
步骤2.1：制备如下混合液：3.5ul 500ng DNA库、1.5ul 200uM的Adaptor Block及5ul capture probe；
步骤2.2：在PCR仪中，95℃ 7min，65℃ 5min；
步骤2.3：加入10ul 65℃预热的2X杂交液；
步骤2.4：在PCR仪上65℃杂交24h。
7.根据权利要求1所述的用于多基因捕获测序的探针制备方法，其特征在于：在所述的步骤3中，至少包括如下分步骤：
步骤3.1：用1X binding buffer漂洗100ul3次，悬浮于200ul 1X binding buffer中；
步骤3.2：把20ul杂交产物加入到200ul1X binding buffer中，涡旋震荡混匀，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温摇动孵育30分钟；
步骤3.3：将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清5 分钟，移除上清；
步骤3.4：保持1.5ml管始终处于磁力架中，用0.5ml 1X SSC/0.1％SDS清洗15min；
步骤3.5：用65℃温浴的0.5ml 0.1X SSC/0.1％ SDS洗3次；
步骤3.6：将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清5分钟，移除上清；
步骤3.7：加入50μl灭菌超纯水，涡旋震荡混匀，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5分钟，捕获的DNA还在生物素结合的磁珠上。
8.根据权利要求1所述的用于多基因捕获测序的探针制备方法，其特征在于：在所述的步骤4中，所述的扩增条件为：
9.根据权利要求1所述的用于多基因捕获测序的探针制备方法，其特征在于：在所述的步骤4中，PCR反应条件如下。
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