CN105779636A - 用于扩增人乳腺癌易感基因brca1和brca2编码序列的pcr引物及应用 - Google Patents

用于扩增人乳腺癌易感基因brca1和brca2编码序列的pcr引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于NGS技术的人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物及应用。该人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物，包括至少一对捕获引物对，每对所述捕获引物对的正向引物与反向引物的序列均包括特异性序列及与所述特异性序列的5’端连接的接头序列。该基于NGS技术的用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物及应用，整个方法所涉及的实验操作简单、只涉及PCR试剂及引物组合、成本低，同时引入双标签测序接头序列用于区分不同的样本，可实现高通量样本测序检测，能有效地对人乳腺癌及其它BRCA易感基因相关遗传性肿瘤风险评估或者针对BRCA突变的靶向用药提供基因检测支持。

Description

用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物及应用
技术领域
本发明涉及医学分子生物学领域，尤其是涉及一种用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物及应用。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的癌症。据《2012中国肿瘤登记年报》数据显示，我国每年乳腺癌新发病例约22万，占到全世界乳腺癌新增病例(150万)的15％。在女性所有恶性肿瘤中，乳腺癌发病率高达16.8％，约每10万人中有43人发病，并且发病年龄呈现年轻化、发病率呈上升趋势。发病率在25岁时迅速上升，在50岁时达到高峰。因此，乳腺癌的高发病率已经严重威胁我国女性健康。
家族遗传性乳腺癌占到所有乳腺癌发病的10％～30％。在迄今为止已经发现的乳腺癌易感基因中，BRCA1和BRCA2是最直接的易感基因，这两个基因突变导致的乳腺癌占到家族性乳腺癌的5％～10％。BRCA1基因定位于17q21，包含24个外显子，编码1863个氨基酸；BRCA2基因定位于13q12-13，包含27个外显子，编码蛋白含3418个氨基酸。BRCA1和BRCA2抑制细胞生长、参与细胞周期调控、DNA损伤修复及细胞凋亡等多种重要细胞功能，在维持基因组稳定性中起很重要的作用。如果BRCA1/2基因的发生突变，那么它所具有的抑制肿瘤发生的功能就会受影响。BRCA1/2基因还是卵巢癌易感基因。据统计BRCA1基因突变携带者一生患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50％～85％和15％～45％；BRCA2基因突变携带者患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50％～85％和10％～20％。BRCA1/2突变还与胰腺癌、恶性黑色素瘤有关，并且与男性***癌风险也有关。因此，美国国家癌症研究所发布的《BRCA1andBRCA2:CancerRiskandGeneticTesting》指南指出：先对家族中罹患乳腺癌或卵巢癌的患者进行基因检测，如果发现该患者带有有害的BRCA1或BRCA2基因突变，那么家族中的其它成员可再进行基因检测，观察是否也有存在有害突变，此种做法有很高的临床价值。
BRCA1编码区已经发现有几百种突变，而BRCA2的突变多达上千种。针对BRCA1、BRCA2基因检测技术，传统的Sanger测序是主要的检测手段。从检测灵敏度上讲，Sanger测序一般只能检测20％以上突变率的变异，对BRCA1、BRCA2全部编码序列检测来说，检测通量比较低、周期较长，单样本检测费用也较高。随着新一代测序(NGS)技术的成熟及测序成本的持续降低，NGS取代Sanger测序技术进行乳腺癌BRCA基因检测是未来市场的趋势。
发明内容
基于此，有必要提供一种基于NGS技术的用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物及应用。
一种用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物，包括至少一对捕获引物对，每对所述捕获引物对的正向引物与反向引物的序列均包括特异性序列及与所述特异性序列的5’端连接的接头序列，每对所述捕获引物对的正向引物与反向引物中的所述特异性序列分别为SEQIDNO.m与SEQIDNO.(m+112)，其中m为1、2、3……或112。
一种用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物，包括测序引物对，所述测序引物对的正向引物包括序列如SEQIDNO.227～SEQIDNO.234所示的引物中的至少一种，所述测序引物对的反向引物包括序列如SEQIDNO.235～SEQIDNO.246所示的引物中的至少一种。
一种检测试剂盒，包括上述任一项所述的用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物。
一种捕获人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的方法，包括如下步骤：
以提取的人基因组DNA为模板，以上述PCR引物中的至少一种捕获引物对为引物进行单重PCR扩增，或者以上述PCR引物中的至少一种多重引物组合为引物进行多重PCR扩增，得到含有人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2全长编码序列的PCR产物文库。
采用上述捕获人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的方法得到的PCR产物文库。
一种构建人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的测序文库的方法，包括如下步骤：
使用上述捕获人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的方法，扩增得到人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR产物文库；
以所述PCR产物文库为模板，以如上述PCR引物中对应的至少一种测序引物对为引物进行二次PCR扩增，获得人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的测序文库。
采用上述构建人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的测序文库的方法构建得到的测序文库。
上述基于NGS技术的用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物及应用，整个方法所涉及的实验操作简单、只涉及PCR试剂及引物组合、成本低，同时引入双标签测序接头序列用于区分不同的样本，可实现高通量样本测序检测，能有效地对人乳腺癌及其它BRCA易感基因相关遗传性肿瘤风险评估或者针对BRCA突变的靶向用药提供基因检测支持。
附图说明
图1为多个样本多重PCR上样板示意图；
图2为针对BRCA1和BRCA2基因编码外显子序列设计全覆盖PCR引物的示意图；
图3为7组多重PCR扩增产物电泳图，G1-G7为产物，N为阴性对照，产物集中在200-300bp之间；
图4为对一个样本的BRCA1和BRCA2基因编码外显子序列进行多重PCR产物测序后，所得到的112个扩增子的均一性结果示意图；
图5为第二轮PCR产物电泳图，目的区域带上测序接头，产物大小在300-425bp之间；
图6为突变分析流程示意图，包括对得到原始测序数据将其转换成Fastq格式并去掉接头、低质量序列和引物；经过处理的序列通过比对工具bwa比对到人类参照基因组上；去除重复序列；使用三个准确率较高的变异检测工具寻找变异位点，各工具使用不同算法；比对千人基因组数据库过滤结果中的正常SNP位点；对剩余变异位点进行注释及分析以判断其是否有害变异；解读分析结果并评估受试体发病风险率等步骤。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
本实施例提供了一种用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物。该PCR引物包括至少一对针对人BRCA1和BRCA2的编码区设计全覆盖扩增子的特异性序列的捕获引物对。如图2所示，每对捕获引物对的正向引物与反向引物的序列均包括该特异性序列以及与该特异性序列的5’端连接的接头序列，其中，每对捕获引物对的正向引物与反向引物中的所述特异性序列分别为SEQIDNO.1与SEQIDNO.113、SEQIDNO.2与SEQIDNO.114、SEQIDNO.3与SEQIDNO.115……或SEQIDNO.112与SEQIDNO.224(即每对所述捕获引物对的正向引物与反向引物中的所述特异性序列的对应关系是SEQIDNO.m与SEQIDNO.(m+112)，其中m为1、2、3……或112)，具体如下表1所示：
表1
优选的，在本实施例中，该捕获引物对中正向引物的接头序列是GACGCTCTTCCGATCTCTG(如SEQIDNO.225所示)，该捕获引物对中反向引物的接头序列是TGTGCTCTTCCGATCTGAC(如SEQIDNO.226所示)，如SEQIDNO.1与SEQIDNO.113所示的特异性序列，其对应的捕获引物对的正向引物与反向引物的序列分别为GACGCTCTTCCGATCTCTGCTAATGTGTTAAAGTTCATTGGAACA及TGTGCTCTTCCGATCTGACAGTTCTTCAGTTAAGAAAATCAGCA，其他同理。
进一步优选的，在本实施例中，该PCR引物包括多对捕获引物对。该多对捕获引物对之间组合构成多重引物组合，且每组多重引物组合包括多对捕获引物对。本实施例的多重引物组合包括如下表2所示的7组组合中的至少一种：
表2
进一步，在本实施例中，该PCR引物还包括带有特征序列的测序引物对。测序引物对的正向引物包括序列如SEQIDNO.227～SEQIDNO.234所示的引物中的至少一种。测序引物对的反向引物包括序列如SEQIDNO.235～SEQIDNO.246所示的引物中的至少一种，具体如下表3所示。
表3
本实施例所述的各PCR引物可单独、成对或按照多重引物组合构成PCR引物试剂应用在检测试剂盒中，如本实施例还提供了一种检测试剂盒，其含有上述用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物。
在本实施例中，该检测试剂盒进一步还可含有PCR扩增相关试剂，如含有PCR缓冲液、dNTP溶液、DMSO以及DNA聚合酶的PCR扩增相关试剂等。其中，PCR缓冲液为10×缓冲液，其pH值为7.5～8.0，溶剂为水，溶质包括浓度为500～1000mM的Tris-HCl(pH8.0,25℃)、浓度为500～1000mM的NaCl、浓度为10～50mM的二硫苏糖醇、1～10mg/mLBSA、150～200mMMgCl2以及80～120mM的ATP；dNTP溶液是浓度为10mM的dNTPs混合液；DMSO是质量百分浓度为100％的二甲基亚砜；DNA聚合酶为热启动TagDNA聚合酶，DNA聚合酶保存在保存溶液中，保存溶液的pH值为8.0～8.5.0，组分包括浓度为10～30mM的Tris-HCl(pH8.0)、浓度为0.05M～0.20M的KCl、浓度为0.05mM～0.20mM的EDTA、体积百分浓度为0.1％～0.5％的Tween20、体积百分浓度为0.1％～0.5％的NonidetP40、浓度为0.05mM～0.15mM的二硫苏糖醇以及体积浓度为40％～60％的甘油。
本实施例还提供了一种捕获人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的方法及使用该方法得到的PCR产物文库。该方法包括如下步骤：
以提取的人基因组DNA为模板，以上述PCR引物中的至少一种捕获引物对为引物进行单重PCR扩增，或者以上述PCR引物中的至少一种多重引物组合进行多重PCR扩增，得到含有人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2全长编码序列的PCR产物文库。
其中，人基因组DNA可以是从人外周血、人体各组织和/或口腔脱落细胞中使用纯化柱提取和/或磁珠提取的方法提取人基因组DNA。PCR扩增过程中所使用的相关试剂为上述检测试剂盒中的PCR扩增相关试剂。
优选的，捕获人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的方法是以上述PCR引物中的至少一种多重引物组合进行多重PCR扩增，其PCR扩增的退火温度为56～60℃，条件为先90～100℃处理1.5～2.5min，再90～100℃下处理15～30秒、56～60℃下处理85～95秒以及68～75℃下处理55～65秒进行30～40个循环，接着在68～75℃处理3～5分钟后保存，优选的PCR条件为95℃处理2min，再以95℃下处理20秒、56～60℃(如58℃)下处理90秒以及72℃下处理60秒进行35个循环，接着在72℃处理4分钟后在16℃保存。在得到PCR产物文库之后还包括通过纯化柱纯化和/或磁珠纯化的方法分离提纯PCR产物文库的步骤。
此外，本实施例还提供了一种构建人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的测序文库的方法及使用该方法构建得到的测序文库。该构建测序文库的方法包括如下步骤：
使用上述捕获人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的方法，扩增得到人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR产物文库；
以PCR产物文库为模板，以上述PCR引物中的至少一种测序引物对为引物进行二次PCR扩增，获得人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的测序文库。
在本实施例中，该二次PCR扩增的条件是先90～100℃处理1.5～2.5min，再以90～100℃下处理8～12秒、60～70℃下处理25～35秒以及68～75℃下处理25～35秒进行12～18个循环，接着在68～75℃处理3～5分钟后保存，优选的是先95℃处理2min，再以95℃下处理10秒、65℃下处理30秒以及72℃下处理30秒进行15个循环，接着在72℃处理4分钟后在16℃保存。
在本实施例中，在得到测序文库之后还包括使用磁珠纯化和/或纯化柱纯化的方法分离纯化测序文库的步骤。
上述基于NGS技术的用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物及应用，整个方法所涉及的实验操作简单、只涉及PCR试剂及引物组合、成本低，同时引入双标签测序接头序列用于区分不同的样本，可实现高通量样本测序检测，能有效地对人乳腺癌及其它BRCA易感基因相关遗传性肿瘤风险评估或者针对BRCA突变的靶向用药提供基因检测支持。
以下结合具体实施例对本发明的人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物及应用予以说明。
以下实施例对未知BRCA1和BRCA2突变检测结果的45份的人外周血样本及对应的45份口腔唾液样本，进行了PCR捕获建库。另外，对已经过Sanger测序的2株乳腺癌细胞系和4份BRCA突变携带者进行相同的PCR捕获建库，具体包括如下步骤：
1、样品提取
分别使用天根的组织血液细胞DNA提取试剂盒和新百基口腔唾液磁珠提取试剂盒，从2株乳腺癌细胞、45份人外周血样本(200μl)及对应的45份口腔唾液样本(5ml)提取DNA。获得50μl左右的洗脱产物(提取的DNA)，经过Nanodrop检测提取DNA的质量，结果OD260/OD230＝1.8～2.5、OD260/OD280＝1.8～2.5，说明DNA提取合格，可用于下一步PCR扩增中的模板。
2、第一轮多重PCR捕获人乳腺癌易感基因BRCA1及BRCA2的编码序列
使用如图1所示的96孔板对样品进行PCR反应，其中每个样品进行7孔多重PCR反应，7孔所用的引物分别对应表2中所示的7组多重引物组合。另设置一个不添加模板的阴性对照，阴性对照所用的引物与样品第一孔多重PCR反应使用的引物一样。每个样本使用96孔板上的1排反应孔，标记并记录每个96孔板及样本对应的孔位置，如图1所示。
PCR反应体系为20μl，所用到PCR反应试剂是上述优化配置的PCR扩增相关试剂。具体该PCR反应体系如下表4所示：
表4
组分 体积8 -->
10×缓冲液 2μl
dNTPs溶液 0.4μl
DMSO 1μl
模板DNA (5～20ng) 1μl
热启动Taq DNA聚合酶 0.2μl
多重引物组合(10μM) 2μl
水(HPLC级别) 13.4
总共 20μl
使用如下表5所示的PCR参数进行PCR扩增：
表5
PCR扩增在ABI公司的ABI-2720PCR仪上运行。PCR完成后，取5μlPCR产物在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，结果见图3。
3、多重PCR捕获产物的混合和纯化
把上一步得到的PCR产物混合在一个1.5ml的EP管中，每管均取10μl，分别标记样本信息，并震荡混匀。使用1:1体积比例的Ampure磁珠进行纯化，得到50μl的DNA。
4、二次PCR扩增构建测序文库
把上一步得到的PCR产物用水稀释100倍后，用于第二轮PCR反应的模板，第二轮PCR使用上述带有标签接头的测序引物对进行扩增，所得PCR产物即为测序文库。所用到PCR反应试剂是上述优化配置的PCR扩增相关试剂。
PCR反应体系为20μl，如下表6所示：
表6
使用下表7所示的PCR参数进行PCR扩增：
表7
PCR反应在ABI公司的ABI-2720PCR仪上运行。PCR完成后，取5μlPCR产物在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，结果参见图5。
5、测序文库纯化、定量及混合
把来自不同样本的20μl测序文库，使用1:1体积比例的Ampure磁珠进行纯化，得到20μl的纯化后的测序文库。取纯化后的各个测序文库1μl，使用Qubit进行定量，并记录各个测序文库的浓度，结果见表7。根据所测的浓度，从每个测序文库中取100ng的DNA，混合在一个1.5ml的PE管中，并震荡混匀。
表7：测序文库浓度
样本91-92为细胞系样本，样本93-96为阳性样本。
6、混合测序文库上机测序
使用illumina测序仪(NextSeq500)及测序试剂(NextSeq500MidOutputKit，300cycles)，用PE150，双index程序进行测序。
7、结果分析
根据测序结果中的测序引物对中的标签序列特征序列的信息，将测序数据与每个样品一一对应。然后，使用测序领域已知常用的比对程序，例如BLAST和SOAP，将每个样品的测序序列与人基因组进行比对，并根据比对上基因组的测序序列进行目标区域(即BRCA1和BRCA2全部编码序列)覆盖率及多重PCR引物均一性评估，结果如图4所示。96个样本平均测序深度在2000X—3000X之间，平均目标区域覆盖率为99.5％(99.0％-99.9％)，测序深度不低于50X(达到较好的突变分析数据统计要求)的覆盖率为98.5％(97.2％-99.9％)，测序深度不低于0.1x平均测序深度的覆盖率为95％(93.1％-97.0％)，参见表8。这些目标区域覆盖率数据统计表明本实例所设计并优化的多重引物组合是非常有效的。另外，对于比对到人基因组中BRCA1和BRCA2编码序列的测序数据进行突变分析，所使用突变分析软件为samtools、GATK、varscans，参见图6。对于2株细胞系所得到的检测结果与已知的结果完全一致，其它30份全血样本和对应的口腔唾液样本分析所得到的突变结果，经Sanger测序也是全部正确的，另外来自同一个人的外周血全血和口腔唾液样本所得到的突变结果一致，参见表9的NGS测序的突变率和Sanger测序的突变率，表明本发明方法及试剂盒可以用于人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2全编码序列突变检测。
表8：样本测序深度统计
表9：阳性样本Sanger检测结果和NGS检测结果
样本91-92为细胞系样本，样本93-96为已知阳性样本，样本41-42分别是同一个人的唾液和血液样本。
结果发现：采用本发明的方法所得到的结果与已知BRCA1和BRCA2突变信息的2株细胞系和4份BRCA突变携带者的突变结果一致；对于未知突变信息的45份人外周血样本及对应的45份口腔唾液样本，经过illumina测序发现的一个BRCA2突变(同一个样本，在外周血及口腔唾液样本中同时检测出来)，突变结果经过Sanger验证也是100％准确的。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (13)

1.一种用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物，其特征在于，包括至少一对捕获引物对，每对所述捕获引物对的正向引物与反向引物的序列均包括特异性序列及与所述特异性序列的5’端连接的接头序列，每对所述捕获引物对的正向引物与反向引物中的所述特异性序列分别为SEQIDNO.m与SEQIDNO.(m+112)，其中m为1、2、3……或112。
2.如权利要求1所述的用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物，其特征在于，所述捕获引物对的正向引物中的接头序列如SEQIDNO.225所示，所述捕获引物对的反向引物中的接头序列如SEQIDNO.226所示。
3.如权利要求1或2所述的用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物，其特征在于，包括多对所述捕获引物对，多对所述捕获引物对之间组合构成多重引物组合，所述PCR引物包括如下7组多重引物组合中的至少一种：第一组包括序列为：SEQIDNO.13与125、25与137、77与189、18与130、9与121、91与203、97与209、3与115、108与220、64与176、103与215、93与205、68与180、98与210、59与171以及104与216的捕获引物对；
第二组包括序列为：SEQIDNO.37与149、111与223、10与122、26与138、20与132、86与198、7与119、61与173、74与186、24与136、39与151、42与154、44与156、109与221、105与217以及2与114的捕获引物对；
第三组包括序列为：SEQIDNO.95与207、112与224、83与195、19与131、28与140、41与153、53与165、17与129、30与142、71与183、22与134、6与118、11与123、106与218、60与172以及94与206的捕获引物对；
第四组包括序列为：SEQIDNO.36与148、14与126、57与169、5与117、21与133、16与128、87与199、27与139、23与135、45与157、40与152、92与204、110与222、89与201、65与177以及34与146的捕获引物对；
第五组包括序列为：SEQIDNO.50与162、69与181、29与141、51与163、32与144、63与175、75与187、81与193、66与178、55与167、79与191、84与196、72与184、1与113、43与155以及47与159的捕获引物对；
第六组包括序列为：SEQIDNO.49与161、12与124、76与188、38与150、56与168、52与164、62与174、102与214、90与202、31与143、15与127、107与219、8与120、35与147、99与211以及46与158的捕获引物对；
第七组包括序列为：SEQIDNO.82与194、70与182、88与200、85与197、78与190、4与116、58与170、80与192、101与213、48与160、54与166、96与208、100与212、33与145、73与185以及67与179的捕获引物对。
4.如权利要求1或2所述的用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物，其特征在于，还包括测序引物对，所述测序引物对的正向引物包括序列如SEQIDNO.227～SEQIDNO.234所示的引物中的至少一种，所述测序引物对的反向引物包括序列如SEQIDNO.235～SEQIDNO.246所示的引物中的至少一种。
5.一种用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物，其特征在于，包括测序引物对，所述测序引物对的正向引物包括序列如SEQIDNO.227～SEQIDNO.234所示的引物中的至少一种，所述测序引物对的反向引物包括序列如SEQIDNO.235～SEQIDNO.246所示的引物中的至少一种。
6.一种检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～4中任一项或权利要求5所述的用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物。
7.一种捕获人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以提取的人基因组DNA为模板，以如权利要求1或2所述的PCR引物中的至少一种捕获引物对为引物进行单重PCR扩增，或者以如权利要求3所述的PCR引物中的至少一种多重引物组合为引物进行多重PCR扩增，得到含有人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2全长编码序列的PCR产物文库。
8.如权利要求7所述的捕获人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的方法，其特征在于，是从人外周血、人体各组织和/或口腔脱落细胞中使用纯化柱提取和/或磁珠提取的方法提取人基因组DNA。
9.如权利要求7～8中任一项所述的捕获人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的方法，其特征在于，是以如权利要求3所述的PCR引物中的至少一种多重引物组合进行多重PCR扩增，其PCR扩增的退火温度为56～60℃，条件为先90～100℃处理1.5～2.5min，再90～100℃下处理15～30秒、56～60℃下处理85～95秒以及68～75℃下处理55～65秒进行30～40个循环，接着在68～75℃处理3～5分钟后保存。
10.如权利要求7～8中任一项所述的捕获人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的方法，其特征在于，还包括通过纯化柱纯化和/或磁珠纯化的方法分离提纯所述PCR产物文库的步骤。
11.一种构建人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的测序文库的方法，其特征在于，包括如下步骤：
使用如权利要求7～10中任一项所述的捕获人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的方法，扩增得到人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR产物文库；
以所述PCR产物文库为模板，以如权利要求4或5所述的PCR引物中对应的至少一种测序引物对为引物进行二次PCR扩增，获得人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的测序文库。
12.如权利要求11所述的构建人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的测序文库的方法，其特征在于，所述二次PCR扩增的条件是先90～100℃处理1.5～2.5min，再以90～100℃下处理8～12秒、60～70℃下处理25～35秒以及68～75℃下处理25～35秒进行12～18个循环，接着在68～75℃处理3～5分钟后保存。
13.如权利要求11或12所述的构建人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的测序文库的方法，其特征在于，还包括使用磁珠纯化和/或纯化柱纯化的方法分离纯化所述测序文库的步骤。
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