CN107447258A - 循环肿瘤dna靶向基因高通量检测文库及其检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因组学高通量测序领域，具体涉及以一种循环肿瘤DNA靶向基因高通量检测文库及其检测方法和应用。以肿瘤患者循环体液为生物样本，提取低浓度游离核酸，并以其生物样本的为样品模板，利用多重PCR形式扩增样品模板的靶向基因外显子，而后对获得的扩增子进行末端修复及3’端连接“A”碱基，修饰后扩增子连接Illumina测序接头，再利用含有index的引物进行文库PCR，扩增产物即为循环肿瘤DNA靶向基因突变多样化的文库。本发明以肿瘤患者离体循环体液为生物样本实现无创检测；以低浓度游离核酸为模板高灵敏检测；以多重PCR形式对多个靶向基因外显子同时扩增增加检测效率；构建扩增子文库、高通量测序及数据分析，可以极大的降低检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及基因组学高通量测序领域，具体涉及以一种循环肿瘤DNA靶向基因高通量检测文库及其检测方法和应用。
背景技术
循环DNA(circulating nucleic acid)是一种无细胞状态的胞外DNA，存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中，其主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在。
循环肿瘤DNA(circulating tumor nucleic acid，ctDNA)，是指肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环***。循环肿瘤DNA片段，ctDNA主要是死亡的肿瘤细胞破裂后释放出来、片段化的基因组DNA。理论上，所有的肿瘤都会产生ctDNA。ctDNA中能够检测到的遗传变异信息特别丰富，从简单的突变到复杂的结构变异，及染色体拷贝数变异都能够检测到。但是，ctDNA的检出率高度依赖于肿瘤发展阶段、肿瘤类型和检测手段。
ctDNA主要来源于坏死的肿瘤细胞、凋亡的肿瘤细胞和肿瘤细胞分泌的外泌体。在肿瘤发展阶段上，ctDNA浓度在早期或局限性肿瘤中含量较低，而在晚期或转移性肿瘤中较高。在不同类型肿瘤中，ctDNA水平也存在差异。目前，ctDNA可以作为肿瘤预后的标志物，而且也能够用来预测药物治疗的效果，这也是ctDNA作为肿瘤检测应用非常重要的一个方面。
ctDNA测序的临床意义：可以减少病人开刀的痛苦，只需要抽血，不必开刀就可以做检测。同时因为它只抽血，所以取样方便，可以用于肿瘤患者的病情随访，比可以多次取样。抽血就可以知道该患者的肿瘤突变信息，从而指导临床用药。
ctDNA测序的难点：首先由于ctDNA含量低，只占cf(cell free)DNA很小的比例，大约是几万分之一到千分之一。而且不同的病人，ctDNA含量差别很大，一般来说，癌症越晚期的患者，ctDNA的比例越高。其次是血液中游离的DNA很少，大约一毫升的血浆中，只有十几纳克的游离DNA。
ctDNA应用方向：肿瘤实施检测，以ctDNA作为肿瘤标志物，通过多次取样测序检测肿瘤负荷，反应药物疗效信息等。
ctDNA检测技术：数字PCR常被用于ctDNA的研究，它的特点是灵敏度高，但是只能针对确定的SNP位点，每个病人都要设计个性化的探针，而且同时检测的通量较低。运用高通量技术，可以同时检测几十个甚至上千个基因的各种突变，通量大。
发明内容
本发明目的在于提供一种循环肿瘤DNA靶向基因高通量检测文库及其检测方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种构建用于高通量检测目的基因循环肿瘤DNA靶向基因突变多样化的文库，以肿瘤患者循环体液为生物样本，提取低浓度游离核酸，并以其生物样本的为样品模板，利用多重PCR形式扩增样品模板的靶向基因外显子，而后对获得的扩增子进行末端修复及3’端连接“A”碱基，修饰后扩增子连接Illumina测序接头，再利用含有index的引物进行文库PCR，扩增产物即为循环肿瘤DNA靶向基因突变多样化的文库。
所述生物样本为肿瘤患者的离体体液为血液、尿液、胸腔积液、骨髓、腹水、盆腔积液、脊髓液或淋巴液唾液。
所述靶向基因为肿瘤热点突变基因、原癌基因、抑癌基因和靶向药物作用的基因。
所述靶向基因为ABL1、EGFR、GNAS、MLH1、RET、AKT1、ERBB2、HNF1A、MPLS、MAD4、ALK、ERBB4、HRAS、NOTCH1、SMARCB1、APC、FBXW7、IDH1、NPM1、SMO、ATM、FGFR1、JAK2、NRAS、SRC、BRAF、FGFR2、JAK3、PDGFRA、STK11、CDH1、FGFR3、KDR、PIK3CA、TP53、CDKN2A、FLT3KIT、PTEN、VHL、CSF1R、GNA11、KRAS、PTPN11、EZH2、TNNB1、GNAQ、MET、RB1和IDH2。
所述多重PCR反应体系为：DNA模板5ul；混合引物10ul；10X HiFi反应液5ul；2.5mMdNTPs 2.5ul；HiFi DNA聚合酶0.5ul；去离子水27ul；总共50ul反应体系；
多重PCR反应程序为：
其退火及延伸时间分别为30秒和1分钟，循环数为10-20循环；
所述混合引物为将多重PCR的引物等浓度混合，浓度为50-200nM；其中，引物的长度通常为20-40nt，GC含量通常为40-60％。
所述混合引物包括SEQ ID NO:1-4318。
所述多重PCR产物平末端DNA上修饰磷酸基团，使用T4多聚核苷酸激酶催化磷酸基团在ATP和寡核苷酸链的5′-羟基末端进行交换(5′-OH+ATP----5′-P+ADP)；而后再在3’端连接“A”碱基，修饰后在测序接头序列中，再利用含有index的引物进行文库PCR，扩增产物即为循环肿瘤DNA靶向基因突变多样化的文库。
所述接头序列为
上游序列：5'P-NNN……NNNGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA-3’
下游序列：5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCNNN……NNNT-3’。
具体循环肿瘤DNA样本核酸文库的构建方法，包括以下的步骤：
步骤一.提取生物样品循环肿瘤DNA，而后通过第一次3000rpm，5分钟离心，取样品上清，第二次对得到的上清进行14000rpm，10分钟离心，取上清，去除底部残留去，得到生物样本的上清。采用Circulating Nucleic Acid Kit游离核酸提取试剂盒对生物样本进行游离核酸的提取，使用Qubit 2.0对所提取的游离核酸进行精确定量。其中，生物样品包括血液、尿液、胸腔积液、骨髓、腹水、盆腔积液、脊髓液、淋巴液唾液；
步骤二.循环肿瘤DNA靶向基因的扩增，使用多重PCR的方式对靶向基因全部外显子进行多重扩增，获得靶向基因大量的扩增子。扩增子片段的大小约为150bp，并通过2％琼脂糖凝胶电泳验证扩增子片段大小的正确性。
步骤三.扩增子的片段的末端修复，主要包括补平粘性末端，并在扩增子片段的5’端加上磷酸基团。
步骤四.扩增子片段3’端连接“A”碱基。
步骤五.连接随机测序接头，将末端连接“A”碱基的扩增子与随机测序接头通过连接酶连接，形成双端含有测序接头的扩增子。
步骤六.文库PCR扩增，使用文库扩增引物，进行PCR扩增，得到测序文库；具体由于采用的是高通量测序，同时对多个样本同时测序，为了区分样本，每个样本使用现有含有index的文库PCR引物进行扩增。这样，测序完成后，对数据进行拆分，可以得到每个样本的独立数据。避免样本之间数据的交叉污染。
步骤七.文库质检，通过Agilent 2100 Bioanalyzer对文库片段大小精确定量，并通过Q-PCR步骤八.HiSeq4000上机测序，测序深度在1000-10000x。
步骤九.分析测序数据，进而生成检测报告。
一种用于高通量检测目的基因循环肿瘤DNA靶向基因突变多样化的高通量检测方法，以离体的肿瘤患者循环体液为生物样本，提取低浓度游离核酸，并以提取的生物样本低浓度游离核酸为样品模板，利用多重PCR形式扩增样品模板的靶向基因外显子，而后对获得的扩增子进行末端修复及3’端连接“A”碱基，修饰后扩增子连接Illumina测序接头，再利用含有index的引物进行PCR扩增，获得高通量检测。
所述方法为非治疗目、非疾病诊断的方法。
一种用于高通量检测目的基因循环肿瘤DNA靶向基因突变多样化的试剂盒，试剂盒包括混合引物SEQ ID NO:1-4318，以及接头序列引物和含有index的引物。
本法所具有的优点：
本发明以离体的肿瘤患者循环体液为生物样本，能够以低浓度游离核酸为模板，通过多重PCR形式对靶向基因外显子进行扩增，构建扩增子文库，测序及分析数据，建立了将核酸测序技术和目标序列捕获技术用于分析循环肿瘤DNA样本的方法。进而本发明提供无创的肿瘤基因突变高灵敏度检测方法，以低浓度游离核酸为模板高灵敏检测；以多重PCR形式对多个靶向基因外显子同时扩增增加检测效率；构建扩增子文库、高通量测序及数据分析，可以极大的降低检测成本，为肿瘤患者提供肿瘤基因突变的图谱，为肿瘤个体化医疗提供技术支持，适用于临床癌症患者基因突变的筛查。
附图说明
图1为本发明实施例提取的循环肿瘤DNA多重PCR扩增子2％琼脂糖凝胶电泳图，
图2为本发明实施例提取的循环肿瘤DNA构建的测序文库2％琼脂糖凝胶电泳图，
图3为本发明实施例提取的循环肿瘤DNA构建的测序文库Agilent 2100Bioanalyzer结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
本发明以生物样本为样品，从生物样本提取游离核酸并定量；多重PCR扩增靶向基因的全部外显子；扩增子的末端修复及3’端连接“A”碱基；扩增子连接Illumina测序接头及定量；文库PCR扩增；HiSeq4000平台测序；数据分析。实施例1：
1)以乳腺癌晚期IIIB期的血液为生物样本，取10ml；采血管为EDTA抗凝管，不能使用肝素抗凝管，血液在2小时内分离血清，第一次离心力3000rpm,5min,取血清，第一次取血清时，操作不应取到白细胞层；第二次离心力14000rpm,10min，第二次取血浆时，操作不应取到底部残留物。采到的血清及时提取游离核酸，或者在负80℃保存。使用Circulating Nucleic Acid Kit游离核酸提取试剂盒提取血清游离核酸，通过Qubit 2.0对所提取的游离核酸浓度进行精确定量。
2)循环肿瘤DNA 50个靶向基因的全部外显子通过多重PCR扩增的形式捕获。根据待测靶向基因的外显子序列设计引物，为SEQ ID NO:1-4318。
靶向基因列表
| ABL1 | EGFR | GNAS | MLH1 | RET |
| AKT1 | ERBB2 | HNF1A | MPL | SMAD4 |
| ALK | ERBB4 | HRAS | NOTCH1 | SMARCB1 |
| APC | FBXW7 | IDH1 | NPM1 | SMO |
| ATM | FGFR1 | JAK2 | NRAS | SRC |
| BRAF | FGFR2 | JAK3 | PDGFRA | STK11 |
| CDH1 | FGFR3 | KDR | PIK3CA | TP53 |
| CDKN2A | FLT3 | KIT | PTEN | VHL |
| CSF1R | GNA11 | KRAS | PTPN11 | EZH2 |
| CTNNB1 | GNAQ | MET | RB1 | IDH2 |
①多重PCR反应体系
②多重PCR反应程序
注意事项避免样品之间的交叉污染
③将混匀的PCR反应体系放在PCR仪中运行。
④磁珠纯化
(1)加入50ul AMPure XP beads，上下吸打10次，然后室温静置5分钟。
(2)放在磁力架上室温静置5分钟，去上清。
(3)加入200ul 80％乙醇，室温静置30秒，去除80％乙醇。该步骤重复一次。
(4)室温静置3分钟，干燥样品。
(5)加入39ul 10mM Tris-HCl进行洗脱，上下吸打10次，室温静置3分钟。放到磁力架上室温静置5分钟，转移34ul上清到新的PCR管中。
(6)1ul上清用于定量，4ul上清用于琼脂糖凝胶电泳检测(参见图1)。
3.DNA末端修复
①PCR反应体系
室温45分钟。
②磁珠纯化
(1)加入50ul AMPure XP beads，上下吸打10次，然后室温静置5分钟。
(2)放在磁力架上室温静置5分钟，去上清。
(3)加入200ul 80％乙醇，室温静置30秒，去除80％乙醇。该步骤重复一次。
(4)室温静置3分钟，干燥样品。
(5)加入46ul 10mM Tris-HCl进行洗脱，上下吸10次，室温静置3分钟。放到磁力架上室温静置5分钟，转移44ul上清到新的PCR管中。
(6)1ul上清用于定量，4ul上清用于琼脂糖凝胶电泳检测。
4.DNA加碱基“A”
37℃，1小时。而后经过磁珠纯化，具体：
(Ⅰ)加入50ul AMPure XP beads，上下吸打10次，然后室温静置5分钟。
(Ⅱ)放在磁力架上室温静置5分钟，去上清。
(Ⅲ)加入200ul 80％乙醇，室温静置30秒，去除80％乙醇。该步骤重复一次。
(Ⅳ)室温静置3分钟，干燥样品。
(Ⅴ)加入47ul 10mM Tris-HCl进行洗脱，上下吸10次，室温静置3分钟。放到磁力架上室温静置5分钟，转移42ul上清到新的PCR管中。
(Ⅵ)1ul上清用于定量，4ul上清用于琼脂糖凝胶电泳检测。
(Ⅶ)样品可以4℃保存。
5.接头连接
16℃，过夜。而后经过磁珠纯化，具体：
(Ⅰ)加入50ul AMPure XP beads，上下吸打10次，然后室温静置5分钟。
(Ⅱ)放在磁力架上室温静置5分钟，去上清。
(Ⅲ)加入200ul 80％乙醇，室温静置30秒，去除80％乙醇。该步骤重复一次。
(Ⅳ)室温静置3分钟，干燥样品。
(Ⅴ)加入40ul 10mM Tris-HCl进行洗脱，上下吸10次，室温静置3分钟。放到磁力架上室温静置5分钟，转移34.5ul上清到新的PCR管中。
(Ⅵ)1ul上清用于定量，4ul上清用于琼脂糖凝胶电泳检测。
(Ⅶ)样品可以4℃保存。
6.文库PCR
其中，PCR Amplification程序
PCR扩增后经磁珠纯化
(Ⅰ)加入45ul AMPure XP beads，上下吸打10次，然后室温静置5分钟。
(Ⅱ)放在磁力架上室温静置5分钟，去上清。
(Ⅲ)加入200ul 80％乙醇，室温静置30秒，去除80％乙醇。该步骤重复一次。
(Ⅳ)室温静置3分钟，干燥样品。
(Ⅴ)加入30ul 10mM Tris-HCl进行洗脱，上下吸10次，室温静置3分钟。放到磁力架上室温静置5分钟，转移28ul上清到新的PCR管中。
(Ⅵ)1ul上清用于定量，4ul上清用于琼脂糖凝胶电泳检测。
(Ⅶ)样品可以4℃保存。
7.扩增纯化后经Agilent 2100 Bioanalyzer检测、HiSeq2000测序、分析测序数据和生成检测报告。
8.使用上述的实验方法，构建肿瘤靶向基因的测序文库。
实施例2
以晚期肺癌的胸水生物为样品，共96份样品，每份样品为10ml，采集管为EDTA抗凝管，不能使用肝素抗凝管，胸水在2小时内分离，第一次离心力3000rpm,5min,取上清；第二次离心力14000rpm,10min，第二次取上清时，操作不应取到底部残留物。使用Circulating Nucleic Acid Kit游离核酸提取试剂盒提取血清游离核酸，通过Qubit 2.0对所提取的游离核酸浓度进行精确定量。
循环肿瘤DNA 50个靶向基因的全部外显子通过多重PCR扩增的形式捕获，多重PCR反应体系为：DNA模板5ul；混合引物(10uM)10ul；10X HiFi反应液5ul；2.5mM dNTPs 2.5ul；HiFi DNA聚合酶0.5ul；去离子水27ul；总共50ul反应体系。
多重PCR反应程序为：
其退火及延伸时间分别为30秒和1分钟，循环数为10-20循环。
1)模板：使用高质量、高纯度的DNA模板可以提高PCR反应的成功率。50ul反应体系建议的DNA模板使用量为100ng。
2)引物：寡核苷酸引物的长度通常为20-40nt，GC含量通常为40～60％。将多重PCR引物等浓度混合，工作浓度为200nM。
3)dNTP的浓度：通常dNTP的反应终浓度是各200uM。由于是多重PCR反应，多个基因同步扩增，故在该反应中提高dNTP的反应终浓度到400uM。
4)变性：该反应模板的预变性温度是94摄氏度，变性时间是2-5分钟。对于需要延长变性时间的模板，初始变性时间可以增加到5分钟。
5)退火：与普通PCR反应相比，基本的退火原则是：退火温度在引物TM的基础上以TM-5℃复性10-30秒，该反应中为了提高多重PCR各对引物的扩增效率，故提高复性时间到60秒。
6)延伸：延伸过程在72℃中进行，延伸时间一般是1分钟，最后一步延伸时间为72℃，5-10分钟。
7)循环数：通常25-35个循环可以产生足够的PCR产物，该试验根据模板浓度的不同，使用10-20个循环。
PCR产物：该聚合酶扩增产物的产物是平末端，为平末端模板加A可以使用Klenowexo-聚合酶来实现。
1)多重PCR产物纯化：去除PCR反应中多余的引物，使用AMPure XP beads进行纯化，加入75ul AMPure XP beads，上下吹打10次，室温静置孵育5分钟，放在磁力架上室温静置5分钟，去除上清；加入200ul，80％的乙醇，漂洗磁珠30秒，该步骤重复一次；室温静置5分钟，晾干；加入40ul 10mm Tris-Hcl洗脱液，上下吹打10次，室温静置3分钟，放在磁力架上室温静置5分钟，转移出38ul上清到一个新的0.2mlPCR管中，供下一步使用。
2)DNA末端修复：由于多重PCR产物是平末端的DNA片段，只需要在平末端DNA上修饰磷酸基团，使用T4多聚核苷酸激酶催化磷酸基团在ATP和寡核苷酸链的5′-羟基末端进行交换。
37℃,30分钟。
3)DNA末端修复纯化；使用天根通用型DNA纯化回收试剂盒(DP214)进行纯化，具体步骤：
a)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(-13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
b)估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入等倍体积溶液PC，充分混匀。
c)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温放2min，12,000rpm(-13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
d)向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm(-13,400×g)，静置2-5min，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。重复操作该步骤。
e)将吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm(-13,400×g)离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干。
f)将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm(-13,400×g)离心2min收集DNA溶液。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm(-13,400×g)离心2min，将DNA溶液收集到离心管中。
4)dA-Tailing DNA
使用dA-Tailing Module(E6053L)试剂盒对DNA片段加A，反应体系如下：
末端修复后的DNA 42ul
NEBNext dA-Tailing缓冲液(10X) 5μl
Klenow Fragment(3′→5′exo–)聚合酶 3μl
总体积 50μl
孵育37℃，30分钟。使用天根通用型DNA纯化回收试剂盒(DP214)进行纯化，具体步骤：
a)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(-13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
b)估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入等倍体积溶液PC，充分混匀。
c)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温放2min，12,000rpm(-13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
d)向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm(-13,400×g)，静置2-5min，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。重复操作该步骤。
e)将吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm(-13,400×g)离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干。
f)将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm(-13,400×g)离心2min收集DNA溶液。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将DNA溶液收集到离心管中。
接头序列：连接测序接头，为了减少文库PCR引起的误差，并能够检测到低频突变，在测序接头重新设计，引入6-20个随机碱基序列用来区分不同read的序列，有效去除重复read带来的数据浪费，并能准确区分来自不同模板的分子，能够精确检测到稀有突变。
接头序列:
上游序列：5'P-NNN……NNNGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA-3’
下游序列：5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCNNN……NNNT-3’
反应体系如下：
孵育60分钟。
连接纯化：去除连接反应中多余的接头，使用AMPure XP beads进行纯化，加入65ul AMPure XP beads，上下吹打10次，室温静置孵育5分钟，放在磁力架上室温静置5分钟，去除上清；加入200ul，80％的乙醇，漂洗磁珠30秒，该步骤重复一次；室温静置5分钟，晾干；加入40ul 10mm Tris-Hcl洗脱液，上下吹打10次，室温静置3分钟，放在磁力架上室温静置5分钟，转移出38ul上清到一个新的0.2mlPCR管中，供下一步使用。
文库PCR：使用KAPA HiFi HotStart PCR kit对文库进行扩增，增加文库浓度，引入index序列用于区分样本，以达到测序要求，i5和i7是含有index的引物，具体序列：
文库PCR反应体系如下：
PCR反应程序：
根据模板起始量的不同，文库PCR循环数在6-15之间。
文库纯化：去除文库PCR反应中多余的引物和反应体系的其他物质，使用AMPureXP beads进行纯化，加入65ul AMPure XP beads，上下吹打10次，室温静置孵育5分钟，放在磁力架上室温静置5分钟，去除上清；加入200ul，80％的乙醇，漂洗磁珠30秒，该步骤重复一次；室温静置5分钟，晾干；加入40ul 10mm Tris-Hcl洗脱液，上下吹打10次，室温静置3分钟，放在磁力架上室温静置5分钟，转移出30ul上清到一个新的0.2mlPCR管中。
文库质检：通过琼脂糖凝胶电泳来检测文库质量，使用2％的琼脂糖凝胶，120v，30分钟，凝胶成像，目标条带为270bp(参见图2)。
实施例3肿瘤患者血液样本高通量测序文库构建
以晚期肺癌血液生物为样品，共96份样品，每份样品10ml，采集管为EDTA抗凝管，不能使用肝素抗凝管，胸水在2小时内分离，第一次离心力3000rpm,5min,取上清；第二次离心力14000rpm,10min，第二次取上清时，操作不应取到底部残留物。使用Circulating Nucleic Acid Kit游离核酸提取试剂盒提取血清游离核酸，通过Qubit 2.0对所提取的游离核酸浓度进行精确定量。
循环肿瘤DNA 50个靶向基因的全部外显子通过多重PCR扩增的形式捕获，多重PCR反应体系为：
DNA模板5ul；混合引物(10uM)10ul；10X HiFi反应液5ul；2.5mM dNTPs 2.5ul；HiFi DNA聚合酶0.5ul；去离子水27ul；总共50ul反应体系。多重PCR反应程序为：
其退火及延伸时间分别为30秒和1分钟，循环数为10-20循环。
1)模板：使用高质量、高纯度的DNA模板可以提高PCR反应的成功率。50ul反应体系建议的DNA模板使用量为100ng。
2)引物：寡核苷酸引物的长度通常为20～40nt，GC含量通常为40～60％。将多重PCR引物等浓度混合，工作浓度为200nM。
3)dNTP的浓度：通常dNTP的反应终浓度是各200uM。由于是多重PCR反应，多个基因同步扩增，故在该反应中提高dNTP的反应终浓度到400uM。
4)变性：该反应模板的预变性温度是94摄氏度，变性时间是2-5分钟。对于需要延长变性时间的模板，初始变性时间可以增加到5分钟。
5)退火：与普通PCR反应相比，基本的退火原则是：退火温度在引物TM的基础上以TM-5℃复性10-30秒，该反应中为了提高多重PCR各对引物的扩增效率，故提高复性时间到60秒。
6)延伸：延伸过程在72℃中进行，延伸时间一般是1分钟，最后一步延伸时间为72℃，5-10分钟。
7)循环数：通常25-35个循环可以产生足够的PCR产物，该试验根据模板浓度的不同，使用10-20个循环。
PCR产物：该聚合酶扩增产物的产物是平末端，为平末端模板加A可以使用Klenowexo-聚合酶来实现。
1)多重PCR产物纯化：去除PCR反应中多余的引物，使用AMPure XP beads进行纯化，加入75ul AMPure XP beads，上下吹打10次，室温静置孵育5分钟，放在磁力架上室温静置5分钟，去除上清；加入200ul，80％的乙醇，漂洗磁珠30秒，该步骤重复一次；室温静置5分钟，晾干；加入40ul 10mm Tris-Hcl洗脱液，上下吹打10次，室温静置3分钟，放在磁力架上室温静置5分钟，转移出38ul上清到一个新的0.2mlPCR管中，供下一步使用。
2)DNA末端修复：由于多重PCR产物是平末端的DNA片段，只需要在平末端DNA上修饰磷酸基团，使用T4多聚核苷酸激酶催化磷酸基团在ATP和寡核苷酸链的5′-羟基末端进行交换，即：5′-OH+ATP----5′-P+ADP，反应体系：
37℃,30分钟。
3)DNA末端修复纯化：使用天根通用型DNA纯化回收试剂盒(DP214)进行纯化，具体步骤：
a)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(-13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
b)估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入等倍体积溶液PC，充分混匀。
c)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温放2min，12,000rpm(-13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
d)向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm(-13,400×g)，静置2-5min，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。重复操作该步骤。
e)将吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm(-13,400×g)离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干。
f)将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm(-13,400×g)离心2min收集DNA溶液。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm(-13,400×g)离心2min，将DNA溶液收集到离心管中。
4)dA-Tailing DNA:使用dA-Tailing Module(E6053L)试剂盒对DNA片段加A，反应体系如下：
末端修复后的DNA 42ul
NEBNext dA-Tailing缓冲液(10X) 5μl
Klenow Fragment(3′→5′exo–)聚合酶 3μl
总体积 50μl
孵育37℃，30分钟。使用天根通用型DNA纯化回收试剂盒(DP214)进行纯化，具体步骤：
a)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
b)估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入等倍体积溶液PC，充分混匀。
c)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温放2min，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
d)向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)，静置2-5min，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。重复操作该步骤。
e)将吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干。
f)将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm(～13,400×g)离心2min收集DNA溶液。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将DNA溶液收集到离心管中。
5)连接测序接头。
接头序列
上游序列：5'P-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAA-3’
下游序列：5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
反应体系如下：
20孵育60分钟。
6)连接纯化：去除连接反应中多余的接头，使用AMPure XP beads进行纯化，加入65ul AMPure XP beads，上下吹打10次，室温静置孵育5分钟，放在磁力架上室温静置5分钟，去除上清；加入200ul，80％的乙醇，漂洗磁珠30秒，该步骤重复一次；室温静置5分钟，晾干；加入40ul 10mm Tris-Hcl洗脱液，上下吹打10次，室温静置3分钟，放在磁力架上室温静置5分钟，转移出38ul上清到一个新的0.2mlPCR管中，供下一步使用。
7)文库PCR：高通量测序同时进行96个样本的测序文库构建，为了区分样本，使用现有的双端index的文库PCR引物，具体为i5有8种，i7有12种，按照排列组合的方式，故共有96种组合方式，每个样本使用一种组合，如1至12号晚期肺癌血液样本的双端Index编号为，1号：i501,i701；2号:i501,i702；3号:i501,i703；4号:i501,i704；5号:i501,i705；6号:i501,i706；7号:i501,i707；8号:i501,i708；9号:i501,i709；10号:i501,i710；11号:i501,i711；12号:i501,i712。
使用KAPA HiFi HotStart PCR kit对文库进行扩增，增加文库浓度，引入index序列用于区分样本，以达到测序要求，i5和i7是含有index的引物，
文库PCR反应体系如下：
PCR反应程序：
根据模板起始量的不同，文库PCR循环数在6-15之间。
8)文库纯化：
去除文库PCR反应中多余的引物和反应体系的其他物质，使用AMPure XP beads进行纯化，加入65ul AMPure XP beads，上下吹打10次，室温静置孵育5分钟，放在磁力架上室温静置5分钟，去除上清；加入200ul，80％的乙醇，漂洗磁珠30秒，该步骤重复一次；室温静置5分钟，晾干；加入40ul 10mm Tris-Hcl洗脱液，上下吹打10次，室温静置3分钟，放在磁力架上室温静置5分钟，转移出30ul上清到一个新的0.2mlPCR管中。
9)文库质检：
通过琼脂糖凝胶电泳来检测文库质量，使用2％的琼脂糖凝胶，120v，30分钟，凝胶成像，目标条带为270bp。
SEQ ID NO:1-4318具体序列如下：
Claims (10)
1.一种构建用于高通量检测目的基因循环肿瘤DNA靶向基因突变多样化的文库，其特征在于：以肿瘤患者循环体液为生物样本，提取低浓度游离核酸，并以其生物样本的为样品模板，利用多重PCR形式扩增样品模板的靶向基因外显子，而后对获得的扩增子进行末端修复及3’端连接“A”碱基，修饰后扩增子连接Illumina测序接头，再利用含有index的引物进行文库PCR，扩增产物即为循环肿瘤DNA靶向基因突变多样化的文库。
2.按权利要求1所述的构建用于高通量检测目的基因循环肿瘤DNA靶向基因突变多样化的文库，其特征在于：所述生物样本为肿瘤患者的离体体液为血液、尿液、胸腔积液、骨髓、腹水、盆腔积液、脊髓液或淋巴液唾液。
3.按权利要求1所述的构建用于高通量检测目的基因循环肿瘤DNA靶向基因突变多样化的文库，其特征在于：所述靶向基因为肿瘤热点突变基因、原癌基因、抑癌基因和靶向药物作用的基因。
4.按权利要求3所述的构建用于高通量检测目的基因循环肿瘤DNA靶向基因突变多样化的文库，其特征在于：所述靶向基因为ABL1、EGFR、GNAS、MLH1、RET、AKT1、ERBB2、HNF1A、MPLS、MAD4、ALK、ERBB4、HRAS、NOTCH1、SMARCB1、APC、FBXW7、IDH1、NPM1、SMO、ATM、FGFR1、JAK2、NRAS、SRC、BRAF、FGFR2、JAK3、PDGFRA、STK11、CDH1、FGFR3、KDR、PIK3CA、TP53、CDKN2A、FLT3KIT、PTEN、VHL、CSF1R、GNA11、KRAS、PTPN11、EZH2、TNNB1、GNAQ、MET、RB1和IDH2。
5.按权利要求3所述的构建用于高通量检测目的基因循环肿瘤DNA靶向基因突变多样化的文库，其特征在于：所述多重PCR反应体系为：DNA模板5ul；混合引物10ul；10X HiFi反应液5ul；2.5mM dNTPs 2.5ul；HiFi DNA聚合酶0.5ul；去离子水27ul；总共50ul反应体系；
多重PCR反应程序为：
其退火及延伸时间分别为30秒和1分钟，循环数为10-20循环；
所述混合引物为将多重PCR的引物等浓度混合，浓度为50-200nM；
其中，引物的长度通常为20-40nt，GC含量通常为40-60％。
6.按权利要求3所述的构建用于高通量检测目的基因循环肿瘤DNA靶向基因突变多样化的文库，其特征在于：所述混合引物包括SEQ ID NO:1-4318。
7.按权利要求3所述的构建用于高通量检测目的基因循环肿瘤DNA靶向基因突变多样化的文库，其特征在于：所述多重PCR产物平末端DNA上修饰磷酸基团，使用T4多聚核苷酸激酶催化磷酸基团在ATP和寡核苷酸链的5′-羟基末端进行交换(5′-OH+ATP----5′-P+ADP)；而后再在3’端连接“A”碱基，修饰后在测序接头序列中，引入6-20个随机的接头序列用来区分不同read的序列，再利用含有index的引物进行文库PCR，扩增产物即为循环肿瘤DNA靶向基因突变多样化的文库。
8.按权利要求7所述的构建用于高通量检测目的基因循环肿瘤DNA靶向基因突变多样化的文库，其特征在于：所述接头序列为
上游序列：5'P-NNN……NNNGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA-3’
下游序列：5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCNNN……NNNT-3’。
9.一种权利要求1所述的用于高通量检测目的基因循环肿瘤DNA靶向基因突变多样化的高通量检测方法，其特征在于：以肿瘤患者循环体液为生物样本，提取低浓度游离核酸，并以提取的生物样本低浓度游离核酸为样品模板，利用多重PCR形式扩增样品模板的靶向基因外显子，而后对获得的扩增子进行末端修复及3’端连接“A”碱基，修饰后扩增子连接Illumina测序接头，再利用含有index的引物进行PCR扩增，获得高通量检测。
10.一种用于高通量检测目的基因循环肿瘤DNA靶向基因突变多样化的试剂盒，其特征在于：试剂盒包括混合引物SEQ ID NO:1-4318，以及接头序列引物和含有index的引物。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20171208 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |