CN105696089A - 一种基于Ion Torrent测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法 - Google Patents

一种基于Ion Torrent测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于Ion Torrent测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法，包括多重PCR富集目的片段、引物清除、接头连接、文库扩增、文库检测等步骤。本发明的构建方法采用多对PCR引物对目的片段进行富集扩增，操作简单，成本低，降低了文库的损失，提高了文库构建成功率。本发明的文库构建方法适用于在Ion TorrentTM测序平台上进行BRCA1和BRCA2基因的DNA文库测序使用。

Description

一种基于Ion Torrent测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法
技术领域
本发明涉及基因测序领域，特别是高通量测序领域，具体是一种基于IonTorrent测序平台的乳腺癌基因BRCA1和BRCA2的DNA文库构建方法。
背景技术
新一代高通量基因检测技术，当今主要以Illumina公司的Hiseq，Miseq系列和Life公司的IonTorrentTM系列测序仪为代表，有着其他技术不可比拟的高通量、低成本等优势。已被广泛用于各类生物学研究和医学检测。在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行重头测序，获得该物种的参考序列，为后续研究奠定基础。对有参考序列的物种，进行全基因组重测序，在全基因组水平上检测突变位点，发现个体差异的分子基础。新一代测序技术通过全基因组测序构建了大量常规物种的基因组图谱，也促进了测序技术的高速发展。但全基因组结构复杂，周期长，费用高，限制了它的发展。
同时，高通量测序技术在基因诊断和基因治疗方面也有重要作用。某些疾病的易感基因通常只占基因组的很小一部分，对这些易感基因的研究并不需要对全基因组进行测序，而只需要对特定的几个基因进行研究。目标序列捕获测序技术的出现，使得对基因组特定区域的研究成为可能。这项技术首先合成大量能与基因组特定区域互补结合的寡聚核苷酸序列，通过PCR扩增富集目标区段，然后用高通量测序技术对这些区段进行测序。与全基因组测序相比，特定疾病易感基因测序费用更低，测序深度更高，测序结果更加精确，还可以检测到低频突变。
根据现有报道：BRCA1/2基因突变在遗传性乳腺癌患者中占有很大的比例(40％～45％)，且存在于80％的乳腺癌高发家族的患者中。携带BRCA1或BRCA2基因突变的人具有较高的患有遗传性乳腺癌和卵巢癌综合征的风险。乳腺癌相关基因BRCA1和BRCA2测序就是通过设计BRCA1与BRCA2基因区域的引物，通过多重PCR扩增，将目标区域DNA富集后进行高通量测序。采用BRCA1和BRCA2基因测序，研究者可以对乳腺癌相关基因BRCA1和BRCA2进行重点研究。这种高针对性的方法可以高效的发现，验证和筛选BRCA1和BRCA2基因变异。相比全基因组测序，乳腺癌相关基因测序对目标区域BRCA1和BRCA2基因有更准确快速的研究，适用于针对大量样本的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于IonTorrent测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于IonTorrent测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法，具体步骤如下：
(1)目标区域扩增：将待测样本的DNA以及多重PCR引物，经多重PCR反应，得到第一样本；
(2)引物清除：取第一样本与引物清除试剂混合进行反应，得到第二样本；
(3)接头连接：将第二样本与接头P1进行接头连接反应，得到第三样本；
(4)磁珠纯化：将第三样本进行磁珠纯化，得到第四样本；
(5)文库扩增：将第四样本加入扩增酶Mix和扩增引物进行PCR扩增，并进行磁珠纯化，得到目的DNA文库；
(6)文库检测：将得到的文库采用Qubit和11～13％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测文库浓度、文库片段大小及文库质量，即得；
所述11～13％的PAGE配方为：水，3～4mL；30％丙烯酰胺，2022～2062μL；5*TBE，1.2～1.8mL；9～11％AP，100～120μL；TEMED，9～11μL。
作为本发明进一步的方案：步骤(1)中的多重PCR引物为IonAmpliSeqTMBRCA1andBRCA2Panel。
作为本发明进一步的方案：步骤(1)中的反应体系为10μL体系，反应体系的组成成分具体为：
作为本发明进一步的方案：步骤(1)中PCR反应的循环数为18。
作为本发明进一步的方案：步骤(2)中的引物清除试剂为FuPaReagentTM，加入量为每个上述10μLPCR体系加入0.9～1.1μL引物清除试剂。
作为本发明进一步的方案：步骤(3)的接头P1为：
5'CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3'
5'ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT3'。
作为本发明进一步的方案：步骤(3)中的标签接头序列是由如下正反两个序列组成的AXAdapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT3'
5'ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC3'，
其中的AXAdapter选自：
A1Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTATTCGTCGAT3'
5'ATCGACGAATAGACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A2Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGGCAATTGCGAT3'
5'ATCGCAATTGCCTCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A3Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTAGTCGGACGAT3'
5'ATCGTCCGACTAACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A4Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGATCCATCGAT3'
5'ATCGATGGATCTGCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A5Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCGCAATTACGAT3'
5'ATCGTAATTGCGACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A6Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGAGACGCGAT3'
5'ATCGCGTCTCGAACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A7Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGCCACGAACGAT3'
5'ATCGTTCGTGGCACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A8Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCCTGAGATACGAT3'
5'ATCGTATCTCAGGCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A9Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAACCTCATTCGAT3'
5'ATCGAATGAGGTTCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A10Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTACAACCTCGAT3'
5'ATCGAGGTTGTAACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A11Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAACCATCCGCGAT3'
5'ATCGCGGATGGTTCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A12Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATCCGGAATCGAT3'
5'ATCGATTCCGGATCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A13Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCGACCACTCGAT3'
5'ATCGAGTGGTCGACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A14Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCGAGGTTATCGAT3'
5'ATCGATAACCTCGCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A15Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCCAAGCTGCGAT3'
5'ATCGCAGCTTGGACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A16Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTTACACACGAT3'
5'ATCGTGTGTAAGACTGAGTCGGAGACACGC3'。
作为本发明进一步的方案：所述接头连接反应的体系为14.9～16.1μL，接头连接反应的体系具体为：
作为本发明进一步的方案：步骤(4)中所用磁珠为XP磁珠。
作为本发明进一步的方案：步骤(5)中文库扩增酶Mix为PCRSuperMixHighFidelity，引物为LibraryAmplificationPrimerMix。
作为本发明进一步的方案：步骤(5)中文库扩增体系为25～27μL，具体为：向第四样本中加入24～26μLPCRSuperMixHighFidelity和0.5～1.5μL的LibraryAmplificationPrimerMix。
作为本发明再进一步的方案：步骤(5)中文库扩增的PCR循环为4～6。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的方法与以往的基于乳腺癌相关基因BRCA1和BRCA2的DNA文库的建库方法相比，步骤简单，目标区域富集后通过一次的PCR扩增，然后采用磁珠纯化产物，即得到测序文库；同时降低了建库的成本，减少了PCR扩增中引入突变的可能性，使得测序结果更加精确。
附图说明
图1是本发明基于IonTorrentTM测序平台的乳腺癌相关基因BRCA1和BRCA2的DNA文库构建方法的流程图。
图2是实施例1提供的BRCA1和BRCA2基因的DNA文库构建方法中PCR产物的12％聚丙烯酰胺凝胶图，其中泳道1、5为DNA分子标准(Takara,20bpDNAladder)，泳道2、3、4、6、7、8、9、10、11、12为建库后样本PCR5个循环后的产物。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明公开了乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的DNA文库构建方法，所用试剂均可由市场购得：其中，IonAmpliSeqTMBRCA1andBRCA2Panel(Life公司)，5*IonAmpliSeqTMHiFiMix(Life公司)，FuPaReagentTM(Life公司)，XP磁珠(Beckman公司)，接头P1和Adapter(BiooScientific)，PCRSuperMixHighFidelity(Life公司)，LibraryAmplificationPrimerMix(Life公司)。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：基于IonTorrentTM测序平台的乳腺癌相关基因BRCA1和BRCA2的DNA文库构建方法
本实施例采用以下试剂：IonAmpliSeqTMBRCA1andBRCA2Panel(Life公司)，5*IonAmpliSeqTMHiFiMix(Life公司)，FuPaReagentTM(Life公司)，XP磁珠(Beckman公司)，接头P1和Adapter(BiooScientific)，PCRSuperMixHighFidelity(Life公司)，LibraryAmplificationPrimerMix(Life公司)，无水乙醇，Nuclease-freewater，30％丙烯酰胺，5*TBE，10％过硫酸铵，TEMED。
本方法实验前需要新鲜配置一种试剂：70％乙醇。
本实验需用到的仪器和设备：离心机、磁力架、移液枪、PCR仪、震荡仪、荧光计2.0，垂直电泳仪。
主要实验步骤
(1)待测样本的DNA采集
在本实施例中，DNA样本来自血液或口腔上皮细胞。采用血液基因组DNA提取试剂盒(天根)提取基因组DNA或采用口腔拭子基因组DNA快速提取试剂盒(原平皓)，按照试剂盒说明书操作步骤提取。
(2)对待测样本的DNA进行2.0浓度测定
1)向样本管中加入1μLQubitdsDNAHSReagent和199μLQubitdsDNAHSbuffer，漩涡混匀4s；
2)向已添加工作液的样品管内吸弃1μL工作液，加入1μL的DNA样品(确保DNA加到工作液中)，漩涡混匀4s，每个管子的最终体积为200μL；
3)所有的管子在室温下避光孵育2min；
4)在Qubit2.0荧光计的主屏上，按“DNA”键，然后选择dsDNAHighSensitivity分析模式；
5)把样品管放入Qubit2.0荧光光度计，盖上盖子，按“Read”；
6)选择CalculateInitial初始浓度，然后选择VolumeofSampleUsed：1μL，此时显示的结果为样本初始浓度，单位ng/μL；
7)读取下一个样品：取出Qubit2.0荧光光度计中样品，放入新的样品，按“ReadNextSample”；
8)重复样本读数，直到所有样品读完。
(3)多重PCR扩增富集目标片段。按照以下体系加入各试剂进行PCR扩增：
PCR反应条件：
(4)引物清除
向PCR产物内加入1μLFuPaReagent(共11μL)，旋涡充分混匀，瞬离2s，根据如下程序进行反应：
(5)接头连接并纯化
1)稀释混合接头
2)向上一步的清除引物后的PCR反应产物中加入以下组分，漩涡充分混匀，瞬离2s。
将上述体系放入PCR仪内，按下列程序进行反应：
3)磁珠纯化连接产物，采用XP磁珠纯化产物：
a：将PCR产物转移至1.5mL离心管内，加入45μLXP磁珠，充分吹打混匀；
b：室温孵育5min；
c：将样本管放置磁力架上，等待3min至管内溶液完全澄清；
d：小心吸取上清液并弃去；
e：保持离心管在磁力架上，温和添加200μL新鲜配制的70％的酒精溶液30，小心去除酒精；
f：重复步骤e清洗一次。
g：室温风干磁珠5min，不要过度干燥(风干即可，不要开裂)；
接头P1为：
5'CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3'
5'ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT3'。
样品的AXAdapter分别如下：
A1Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTATTCGTCGAT3'
5'ATCGACGAATAGACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A2Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGGCAATTGCGAT3'
5'ATCGCAATTGCCTCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A3Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTAGTCGGACGAT3'
5'ATCGTCCGACTAACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A4Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGATCCATCGAT3'
5'ATCGATGGATCTGCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A5Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCGCAATTACGAT3'
5'ATCGTAATTGCGACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A6Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGAGACGCGAT3'
5'ATCGCGTCTCGAACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A7Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGCCACGAACGAT3'
5'ATCGTTCGTGGCACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A8Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCCTGAGATACGAT3'
5'ATCGTATCTCAGGCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A9Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAACCTCATTCGAT3'
5'ATCGAATGAGGTTCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A10Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTACAACCTCGAT3'
5'ATCGAGGTTGTAACTGAGTCGGAGACACGC3'。
(6)文库扩增，向纯化后风干的磁珠中加入25μL的扩增酶Mix和1μL的LibraryAmplificationPrimerMix，重悬磁珠混匀，磁力架上放置3min，取上清至PCR管中，涡旋混匀进行PCR扩增反应：
PCR反应条件：
(7)文库进行磁珠纯化，采用XP磁珠纯化产物
1)将PCR产物转移至1.5mL离心管内，加入25μL的XP磁珠，漩涡混匀或吹打混匀；
2)室温孵育5min；
3)将样本管子放置在磁力架上静止至少5min或直到溶液澄清；
4)小心将上清转移到新的1.5mL离心管内；
5)加入60μL的XP磁珠，吹打混匀；
6)室温孵育5min；
7)将样本管子放置在磁力架上静止3min或至溶液澄清，弃上清；
8)保持离心管在磁力架上，温和添加200μL新鲜配制的70％的酒精溶液，旋转离心管，小心去除酒精；
9)重复步骤8)再清洗一次；
10)室温风干5min，不能过度干燥(风干即可，不要开裂)；
11)取下离心管，加入30μL的LowTE溶液到样本管内，吹打重悬磁珠，旋涡混匀；
12)将样本管放置在磁力架上，静置2min，将洗脱的上清液(28μL)转移到新的离心管内；
(8)用2.0检测文库浓度
1)向样本管中加入1μLQubitdsDNAHSReagent和199μLQubitdsDNAHSbuffer，漩涡混匀4s；
2)向已添加工作液的样品管内吸弃3μL工作液，加入3μL的DNA样品(确保DNA加到工作液中)，漩涡混匀4s，每个管子的最终体积为200μL。
3)所有的管子在室温下避光孵育2min；
4)在2.0荧光计的主屏上，按“DNA”键，然后选择dsDNAHighSensitivity分析模式；
5)把样品管放入2.0荧光光度计，盖上盖子，按“Read”；
6)选择CalculateInitial初始浓度，然后选择VolumeofSampleUsed：3μL，此时显示的结果为样本初始浓度，单位ng/μL；
7)读取下一个样品：取出2.0荧光光度计中样品，放入新的样品，按“ReadNextSample”；
8)重复样本读数，直到所有样品读完；
(9)用12％PAGE检测文库片段大小，纯化好的DNA文库各取5μL上样检测，结果见附图2。
通过对IonTorrentTM平台的测序结果进行分析，所有样本的覆盖度均达到或超过97％，均一性平均达到100％，每次测序反应样本的数据量分布均匀。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (12)

1.一种基于IonTorren测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)目标区域扩增：将待测样本的DNA以及多重PCR引物，经多重PCR反应，得到第一样本；
(2)引物清除：取第一样本与引物清除试剂混合进行反应，得到第二样本；
(3)接头连接：将第二样本与接头P1进行接头连接反应，得到第三样本；
(4)磁珠纯化：将第三样本进行磁珠纯化，得到第四样本；
(5)文库扩增：将第四样本加入扩增酶Mix和扩增引物进行PCR扩增，并进行磁珠纯化，得到目的DNA文库；
(6)文库检测：将得到的文库采用Qubit和11～13％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测文库浓度、文库片段大小及文库质量，即得；
所述11～13％的PAGE配方为：水，3～4mL；30％丙烯酰胺，2022～2062μL；5*TBE，1.2～1.8mL；9～11％AP，100～120μL；TEMED，9～11μL。
2.根据权利要求1所述的基于IonTorren测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法，其特征在于，步骤(1)中的多重PCR引物为IonAmpliSeqTMBRCA1andBRCA2Panel。
3.根据权利要求1所述的基于IonTorren测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法，其特征在于，步骤(1)中的反应体系为10μL体系，反应体系的组成成分具体为：
4.根据权利要求1所述的基于IonTorren测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法，其特征在于，步骤(1)中PCR反应的循环数为18。
5.根据权利要求1所述的基于IonTorren测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法，其特征在于，步骤(2)中的引物清除试剂为FuPaReagentTM，加入量为每个上述10μLPCR体系加入0.9～1.1μL引物清除试剂。
6.根据权利要求1所述的基于IonTorren测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法，其特征在于，步骤(3)的接头P1为：
5'CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3'
5'ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT3'。
7.根据权利要求1所述的基于IonTorren测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法，其特征在于，步骤(3)中的标签接头序列是由如下正反两个序列组成的AXAdapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT3'
5'ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC3'，
其中的AXAdapter选自：
A1Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTATTCGTCGAT3'
5'ATCGACGAATAGACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A2Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGGCAATTGCGAT3'
5'ATCGCAATTGCCTCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A3Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTAGTCGGACGAT3'
5'ATCGTCCGACTAACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A4Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGATCCATCGAT3'
5'ATCGATGGATCTGCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A5Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCGCAATTACGAT3'
5'ATCGTAATTGCGACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A6Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGAGACGCGAT3'
5'ATCGCGTCTCGAACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A7Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGCCACGAACGAT3'
5'ATCGTTCGTGGCACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A8Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCCTGAGATACGAT3'
5'ATCGTATCTCAGGCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A9Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAACCTCATTCGAT3'
5'ATCGAATGAGGTTCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A10Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTACAACCTCGAT3'
5'ATCGAGGTTGTAACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A11Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAACCATCCGCGAT3'
5'ATCGCGGATGGTTCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A12Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATCCGGAATCGAT3'
5'ATCGATTCCGGATCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A13Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCGACCACTCGAT3'
5'ATCGAGTGGTCGACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A14Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCGAGGTTATCGAT3'
5'ATCGATAACCTCGCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A15Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCCAAGCTGCGAT3'
5'ATCGCAGCTTGGACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A16Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTTACACACGAT3'
5'ATCGTGTGTAAGACTGAGTCGGAGACACGC3'。
8.根据权利要求5所述的基于IonTorren测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法，其特征在于，所述接头连接反应的体系为14.9～16.1μL，接头连接反应的体系具体为：
9.根据权利要求1所述的基于IonTorren测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法法，其特征在于，步骤(4)中所用磁珠为XP磁珠。
10.根据权利要求1所述的基于IonTorren测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法，其特征在于，步骤(5)中文库扩增酶Mix为PCRSuperMixHighFidelity，引物为LibraryAmplificationPrimerMix。
11.根据权利要求1所述的基于IonTorren测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法，其特征在于，步骤(5)中文库扩增体系为25～27μL，具体为：向第四样本中加入24～26μLPCRSuperMixHighFidelity和0.5～1.5μL的LibraryAmplificationPrimerMix。
12.根据权利要求1所述的基于IonTorren测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法，其特征在于，步骤(5)中文库扩增的PCR循环为4～6。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107904666A (zh) * 2017-12-15 2018-04-13 中源协和基因科技有限公司 一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法
CN108753924A (zh) * 2018-06-08 2018-11-06 安徽鼎晶生物科技有限公司 一种肺癌高通量测序文库及其构建方法和应用
CN109629007A (zh) * 2018-12-07 2019-04-16 北京安智因生物技术有限公司 一种遗传性出凝血的基因文库构建方法和试剂盒
CN109680038A (zh) * 2018-12-07 2019-04-26 北京安智因生物技术有限公司 一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法和试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104789553A (zh) * 2015-04-08 2015-07-22 浙江圣庭生物科技有限公司 一种血液游离dna文库的构建方法
CN104946623A (zh) * 2015-04-08 2015-09-30 浙江圣庭生物科技有限公司 基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104789553A (zh) * 2015-04-08 2015-07-22 浙江圣庭生物科技有限公司 一种血液游离dna文库的构建方法
CN104946623A (zh) * 2015-04-08 2015-09-30 浙江圣庭生物科技有限公司 基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANNA KLUSKA等: ""New recurrent BRCA1/2 mutations in Polish patients with familial breast/ovarian cancer detected by next generation sequencing"", 《BMC MEDICAL GENOMICS》 *
JOS´E LUIS COSTA等: "Nonoptical Massive Parallel DNA Sequencing of BRCA1 and BRCA2 Genes in a Diagnostic Setting", 《HUMAN MUTATION》 *
YOSUKE HIROTSU等: "Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing", 《MOLECULAR GENETICS & GENOMIC MEDICINE》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107904666A (zh) * 2017-12-15 2018-04-13 中源协和基因科技有限公司 一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法
CN108753924A (zh) * 2018-06-08 2018-11-06 安徽鼎晶生物科技有限公司 一种肺癌高通量测序文库及其构建方法和应用
CN109629007A (zh) * 2018-12-07 2019-04-16 北京安智因生物技术有限公司 一种遗传性出凝血的基因文库构建方法和试剂盒
CN109680038A (zh) * 2018-12-07 2019-04-26 北京安智因生物技术有限公司 一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法和试剂盒

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