CN117286231A - 一种基于Ion Torrent测序平台的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种基于Ion Torrent测序平台的检测方法，涉及基因测序技术领域。该方法包括DNA提取、末端补平、接头连接、DNA纯化、文库扩增、文库检测、高通量测序和生物信息学分析。采用本方法，能够高可靠的得到文库，然后对文库进行测序，降低测序成本和周期。
Description
技术领域
本申请涉及基因测序技术领域，具体是一种基于IonTorrent测序平台的检测方法。
背景技术
随着基因测序技术的发展，高通量测序技术在临床实践中应用越来越广泛，如在高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面。高通量测序技术通常采用大规模平行测序技术，可实现多样本多位点的同时测序，大大提高了测序通量。目前，高通量测序技术在临床基因检测中被证实具有很高的准确度和灵敏度，然而受到文库构建过程及测序过程中的各种噪音及错误的影响，使得测序结果中出现低频突变时，很难区分其真实性。因此，亟需一种可靠性高的基因测序技术。
发明内容
本申请的目的在于提供一种基于IonTorrent测序平台的检测方法，以解决上述背景技术中提出的技术问题。
为实现上述目的，本申请公开了以下技术方案：一种基于IonTorrent测序平台的检测方法，该方法包括以下步骤：
步骤1-DNA提取：对全血DNA进行提取，富集外周血基因组DNA，对得到的DNA片段进行浓度测定；
步骤2-末端补平：将步骤1得到的DNA片段加入与黏性末端结合的引物，并与末端补平试剂混合后进行孵育，得到平末端DNA样本；
步骤3-接头连接：将步骤2得到的平末端DNA样本与P1接头、特异性接头以及接头连接反应试剂混合进行连接反应，得到连接接头DNA片段；
步骤4-DNA纯化：对步骤3得到的连接接头DNA片段进行磁珠纯化，去除多余的小片段接头及多余的引物，得到纯化DNA片段；
步骤5-文库扩增：将步骤4得到的纯化DNA片段加入文库扩增引物及文库扩增反应试剂进行PCR扩增，得到目标片段的DNA文库；
步骤6-文库检测：将步骤5得到的DNA文库用Qubit4.0定量设备检测文库浓度；
步骤7-高通量测序：采用Ion Proton测序平台对步骤6得到的DNA文库进行高通量测序；
步骤8-生物信息学分析：进行DNA测序和生物信息学分析。
作为优选，所述特异性接头为Y型高通量测序接头。
作为优选，所述文库扩增引物包括上游引物和下游引物；
所述上游引物包括沿5’至3’方向依次排列的上游通用引物序列和根据所述纯化DNA片段中的目标扩增区域设计的特异性上游引物序列；
所述下游引物包括沿5’至3’方向依次排列的下游通用引物序列和根据所述纯化DNA片段中的目标扩增区域设计的特异性下游引物序列。
作为优选，所述上游通用引物序列和所述下游通用引物序列分别为16SrRNA测序引物所述特异性上游引物序列和所述特异性下游引物序列分别为Ion Torrent测序平台的barcode序列。
作为优选，在步骤4中，所述的磁珠纯化具体包括：
采用1.2倍的AMPure XP磁珠对所述连接接头DNA片段进行纯化。
作为优选，在所述步骤5中，在得到目标片段的DNA文库之前，对所述纯化DNA片段进行PCR扩增后，采用磁珠进行纯化。
作为优选，在所述步骤5中，所述的磁珠纯化具体包括：
采用1.8倍的AMPure XP磁珠对PCR扩增后的所述纯化DNA片段进行纯化。
作为优选，在步骤8中，采用mothur软件包对步骤7得到的高通量测序结果进行生物信息学分析。
作为优选，所述步骤8还包括：采用Tmap比对工具对步骤7得到的高通量测序结果比对到GRCh37人类参考基因组上进行生物信息学分析。
有益效果：本申请的基于Ion Torrent测序平台的检测方法，通过对DNA片段依次进行末端补平、接头连接、DNA纯化、文库扩增、文库检测、高通量测序，从而高可靠的得到文库，然后对文库进行测序，降低测序成本和周期。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例中基于IonTorrent测序平台的检测方法的流程框图。
具体实施方式
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
在本文中，术语“包括”意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
参考图1所示的一种基于IonTorrent测序平台的检测方法，该方法包括以下步骤：
步骤1-DNA提取：对全血DNA进行提取，富集外周血基因组DNA，对得到的DNA片段进行浓度测定；
步骤2-末端补平：将步骤1得到的DNA片段加入与黏性末端结合的引物，并与末端补平试剂混合后进行孵育，得到平末端DNA样本；
步骤3-接头连接：将步骤2得到的平末端DNA样本与P1接头、特异性接头以及接头连接反应试剂混合进行连接反应，得到连接接头DNA片段；
步骤4-DNA纯化：对步骤3得到的连接接头DNA片段进行磁珠纯化，去除多余的小片段接头及多余的引物，得到纯化DNA片段；
步骤5-文库扩增：将步骤4得到的纯化DNA片段加入文库扩增引物及文库扩增反应试剂进行PCR扩增，得到目标片段的DNA文库；
步骤6-文库检测：将步骤5得到的DNA文库用Qubit4.0定量设备检测文库浓度；
步骤7-高通量测序：采用Ion Proton测序平台对步骤6得到的DNA文库进行高通量测序；
步骤8-生物信息学分析：进行生物信息学分析。
在本实施例中，所述特异性接头为Y型高通量测序接头。需要说明的是，为了提高建库后文库的适应性，即实现文库能够满足除Ion Torrent平之外的如Illumina平台等的测序使用，以便于对测序结果进行验证等效用，本实施例选用现有技术中的通用型测序接头。该种通用型测序接头可以参考公开号为CN202010407833.5的中国授权专利，具体的，该种Y型高通量测序接头包含第一、第二、第三和第四单链。其中，所述第一单链和第二单链的自由臂序列不互补，所述第一单链和第二单链经退火形成Y型结构双链；所述第三单链和第四单链的自由臂序列不互补，所述第三单链和第四单链经退火形成Y型结构双链；所述第一单链序列如下：自由臂序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3’；双链互补区域序列：5’-GCTCTTCCGATNNNNNNNNNNCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTA XXXXXX-3’；
所述第二单链序列如下：
自由臂序列：
5’-ACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGNNNNNNNNNN NNNNN-3’；
双链互补区域序列与第一单链的双链互补区序列互补；
所述第三单链序列如下：
自由臂序列：
5’-NNNNNNNNNNNNNNNACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3’；双链互补区域序列：5’-GCTCTTCCGATNNNNNNNNNNNNCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT XXXXXX-3’；
所述第四单链序列如下：
自由臂序列：
5’-ACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGNNNNNNNNNN NNNNN-3’；
双链互补区序列与第三单链双链互补区序列互补；
所述“XXXXXX”表示6～12个随机碱基组成的标签序列；
所述“N”表示A、T、C、G任意碱基，或者表示无碱基；
所述自由臂序列与双链互补区域序列依次连接。
此外，更为详细的接头数据，可以参考前述的公开号为CN202010407833.5的中国授权专利中的具体描述。
在本实施例中，所述文库扩增引物包括上游引物和下游引物。其中，所述上游引物包括沿5’至3’方向依次排列的上游通用引物序列和根据所述纯化DNA片段中的目标扩增区域设计的特异性上游引物序列，上游通用引物序列为5’-CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’；所述下游引物包括沿5’至3’方向依次排列的下游通用引物序列和根据所述纯化DNA片段中的目标扩增区域设计的特异性下游引物序列，下游通用引物序列为5’-GATGCTCTTCCGATCT-3’。所述上游通用引物序列和所述下游通用引物序列分别为16S rRNA测序引物所述特异性上游引物序列和所述特异性下游引物序列分别为Ion Torrent测序平台的barcode序列。
在本实施例中，步骤4中的磁珠纯化具体包括：采用1.2倍的AMPure XP磁珠对所述连接接头DNA片段进行纯化。
进一步地，在所述步骤5中，在得到目标片段的DNA文库之前，对所述纯化DNA片段进行PCR扩增后，采用磁珠进行纯化。步骤5中的磁珠纯化具体包括：采用1.2倍的AMPure XP磁珠对PCR扩增后的所述纯化DNA片段进行纯化。这样设计的好处是，依次通过1.2倍磁珠的纯化处理和1.8倍的磁珠的纯化处理，能够对所需的DNA片段中的冗余片段进行去除，从而提高DNA片段的有效浓度。
在本实施例中，步骤8采用mothur软件包对步骤7得到的高通量测序结果进行生物信息学分析。
进一步地，本申请还采用Tmap比对工具对步骤7得到的高通量测序结果比对到GRCh37人类参考基因组上进行生物信息学分析。
综上所述，本申请的基于Ion Torrent测序平台的检测方法，通过对DNA片段依次进行末端补平、接头连接、DNA纯化、文库扩增、文库检测、高通量测序，从而高可靠的得到文库，然后对文库进行测序，降低测序成本和周期。
最后应说明的是：以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基于Ion Torrent测序平台的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤1-DNA提取：对全血DNA进行提取，富集外周血基因组DNA，对得到的DNA片段进行浓度测定；
步骤2-末端补平：将步骤1得到的DNA片段加入与黏性末端结合的引物，并与末端补平试剂混合后进行孵育，得到平末端DNA样本；
步骤3-接头连接：将步骤2得到的平末端DNA样本与P1接头、特异性接头以及接头连接反应试剂混合进行连接反应，得到连接接头DNA片段；
步骤4-DNA纯化：对步骤3得到的连接接头DNA片段进行磁珠纯化，去除多余的小片段接头及多余的引物，得到纯化DNA片段；
步骤5-文库扩增：将步骤4得到的纯化DNA片段加入文库扩增引物及文库扩增反应试剂进行PCR扩增，得到目标片段的DNA文库；
步骤6-文库检测：将步骤5得到的DNA文库用Qubit4.0定量设备检测文库浓度；
步骤7-高通量测序：采用Ion Proton测序平台对步骤6得到的DNA文库进行高通量测序；
步骤8-生物信息学分析：进行生物信息学分析。
2.根据权利要求1所述的基于Ion Torrent测序平台的检测方法，其特征在于，所述特异性接头为Y型高通量测序接头。
3.根据权利要求1所述的基于Ion Torrent测序平台的检测方法，其特征在于，所述文库扩增引物包括上游引物和下游引物；
所述上游引物包括沿5’至3’方向依次排列的上游通用引物序列和根据所述纯化DNA片段中的目标扩增区域设计的特异性上游引物序列；
所述下游引物包括沿5’至3’方向依次排列的下游通用引物序列和根据所述纯化DNA片段中的目标扩增区域设计的特异性下游引物序列。
4.根据权利要求3所述的基于Ion Torrent测序平台的检测方法，其特征在于，所述上游通用引物序列和所述下游通用引物序列分别为16S rRNA测序引物所述特异性上游引物序列和所述特异性下游引物序列分别为Ion Torrent测序平台的barcode序列。
5.根据权利要求1所述的基于Ion Torrent测序平台的检测方法，其特征在于，在步骤4中，所述的磁珠纯化具体包括：
采用1.2倍的AMPure XP磁珠对所述连接接头DNA片段进行纯化。
6.根据权利要求1或5所述的基于Ion Torrent测序平台的检测方法，其特征在于，在所述步骤5中，在得到目标片段的DNA文库之前，对所述纯化DNA片段进行PCR扩增后，采用磁珠进行纯化。
7.根据权利要求6所述的基于Ion Torrent测序平台的检测方法，其特征在于，在步骤5中，所述的磁珠纯化具体包括：
采用1.8倍的AMPure XP磁珠对PCR扩增后的所述纯化DNA片段进行纯化。
8.根据权利要求1所述的基于Ion Torrent测序平台的检测方法，其特征在于，在步骤8中，采用mothur软件包对步骤7得到的高通量测序结果进行生物信息学分析。
9.根据权利要求8所述的基于Ion Torrent测序平台的检测方法，其特征在于，所述步骤8还包括：采用Tmap比对工具对步骤7得到的高通量测序结果比对到GRCh37人类参考基因组上进行生物信息学分析。
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