CN107709344B - 用于治疗黄病毒科病毒和癌症的核苷类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗或预防人类受试者或其他动物宿主中的黄病毒科病毒(包括HCV、黄热病病毒、登革热病毒、基孔肯亚病毒、和西尼罗病毒)、RSV、HEV和流感感染和癌症的化合物、组合物和方法。

Description

用于治疗黄病毒科病毒和癌症的核苷类似物
技术领域
本发明涉及用于治疗或预防丙型肝炎病毒(HCV)感染以及其他黄病毒、RSV、流感和癌症的化合物、方法及组合物。更具体地，本发明描述了某些核苷和核苷酸类似物、其药学上可接受的盐或其它衍生物，以及其在治疗黄病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、戊型肝炎病毒(HEV)、流感和癌症中的用途。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)在全世界已经感染了超过1.7亿人口。据估计，每年有三至四百万人被新感染，其中70％的人将发展为慢性肝炎。HCV导致所有的肝癌病例的50-76％，以及发达国家中所有肝移植的三分之二。照护标准(SOC)治疗[聚乙二醇干扰素α加利巴韦林(核苷类似物)]仅在50-60％的患者中有效且伴随显著的副作用。类似地，向SOC中加入第一代HCV蛋白酶抑制剂(例如博赛泼维(brocepravir)或特拉匹韦(telaprevir))改善了结果和治愈率，但副作用通常是严重的。因此，迫切需要强效且安全的新HCV药物。
丙型肝炎病毒基因组包含包封在核衣壳和脂质包膜中的正链RNA，并且由9.6kb核糖核苷酸组成，并具有编码约3000个氨基酸的大多肽的单独的开放阅读框(ORP)编码(Dymock等人Antiviral Chemistry&Chemotherapy 2000,11,79)。成熟之后，此多肽被细胞和病毒蛋白酶切割成至少10个蛋白，以产生结构和非结构(NS)蛋白。在HCV的情况下，成熟非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)的产生受到两种病毒蛋白酶的影响：1)金属蛋白酶，其在NS2-NS3接合处裂解；和2)包含在NS3(NS3蛋白酶)的N-末端区域内的丝氨酸蛋白酶，其介导NS3下游的所有随后的裂解。NS4A蛋白似乎具有多种功能，包括NS4A/NS3复合体形成，这似乎增强了NS3蛋白的蛋白水解效率。NS5B(本文中也称为HCV聚合酶)具有聚合酶活性，并参与从单链病毒RNA基因组(充当模板)合成双链RNA。NS5A是一种非结构56-58kDa蛋白，其作为复制复合体的组分调节HCV复制。NS5A被细胞蛋白激酶高度磷酸化，并且磷酸化位点在HCV基因型之间保存(Katze等人，2001；Kim等人，1999)。
由于缺乏用于HCV增殖的便利的细胞培养模型，选择性地抑制HCV复制的新型抗病毒策略的开发长期受到阻碍(“Recent Advances in Nucleoside MonophosphateProdrugs as Anti-hepatitis C Virus Agents”Bobeck,D.R.；Coats,S.J.；Schinazi,R.F.Antivir.Ther.2010；在Handbook of Experimental Pharmacology,vol.189,25-51:Antiviral Strategies(由Hans-Georg
Figure BDA0001532248680000021
和Ralf Bartenschlager编辑
Figure BDA0001532248680000022
Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2009)中的书籍章节：“Approaches for theDevelopment of Antiviral Compounds:The Case of Hepatitis C Virus.”RaymondF.Schinazi,Steven J.Coats,Leda C.Bassit,Johan Lennerstrand,James H.Nettles和Selwyn J.Hurwitz)。这个障碍首次在1999年通过建立HCV复制子***(Bartenschlager,R.,Nat.Rev.Drug Discov.2002,1,911–916和Bartenschlager,R.,J.Hepatol.2005,43,210–216)，以及在2005年通过开发稳健的HCV细胞培养模型(Wakita,T.等人，Nat.Med.2005,11,791-6；Zhong,J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2005,102,9294-9；Lindenbach,B.D.等人，Science2005,309,623-6)而被克服。
尽管可以利用疫苗(Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.2004,41,391-427)，但黄热病病毒(YFV)仍然是一个严重的人类健康问题，每年造成约30,000人死亡。YFV是最致命性的人类病毒感染之一(Expert Rev.Vaccines 2005,4,553-574)。在受感染的个体中，约15％将发展成严重的疾病，在那些个体中有20至50％的病死率。没有被批准的用于治疗YFV的特异性治疗。治疗是症状停止性(symptomatic-rest)，流体，并且布洛芬、萘普生、醋氨酚或扑热息痛可以减轻发热和疼痛症状。应当避免使用阿斯匹林。虽然病毒流行至非洲和南美洲，但YFV也可能在这些地区之外的地方爆发，并且已有这种输入病例的报道(J.TravelMed.2005,12(增刊1),S3–S11)。
西尼罗病毒(West Nile Virus，WNV)来自黄病毒科，并且主要是蚊媒疾病。它于1937年在乌干达的西尼罗河地区首次被发现。根据来自疾病控制和预防中心的报道，已在非洲、中东、欧洲、大洋洲、西亚和中亚以及北美洲发现了WNV。其在北美洲的首次出现开始于1999年的纽约市大都市地区。它在北美洲是季节性流行的，一般在夏季爆发且持续到秋季，呈现出对环境健康的威胁。它的自然循环是鸟-蚊-鸟和哺乳动物。蚊子、特别是尖音库蚊物种当以受感染的鸟为食时变得受感染。然后当受感染的蚊子叮咬时，其将WNV传播给其它鸟和包括人的哺乳动物。在人和马中，致命性脑炎是WNV感染最严重的表现。在一些受感染的鸟中，WNV还可以引起死亡。没有用于WNV感染的特异性治疗。在具有轻度症状的病例中，人们经受如发热和疼痛的症状，该症状在其自身传递，尽管甚至健康的人也会患病几周。在更严重的病例中，人们通常需要去医院，在那里他们可以接受支持性治疗。
登革热感染也来自黄病毒科，并且是新加坡最重要的虫媒感染(Epidemiol NewsBull 2006,32,62-6)。在全球，每年估计有5千万至1亿登革热(DF)病例以及几十万登革出血热(DHF)病例，且平均病死率是5％。许多患者从登革热感染中痊愈，伴随最少或没有遗留疾病。登革热感染通常是无症状的，但可以表现出典型的登革热、登革出血热或登革热休克综合征。即使对于门诊患者，对维持足够的水合的需要也是非常重要的。登革热感染可以通过静脉内补液治疗有效地控制，并且如果及早诊断，病死率可以保持低于1％。为了控制疼痛和发热，疑似具有登革热感染的患者都应给予醋氨酚制剂。阿斯匹林和非甾族抗炎药物治疗可能加重与一些登革热感染有关的出血倾向。然而，先前所述的登革热感染的一些表现包括肝功能衰竭(Dig Dis Sci 2005,50,1146-7)、脑病(J Trop Med Public Health1987,18,398-406)、以及格林-巴利综合征(Intern Med 2006,45,563-4)。
增殖性病症是严重危急生命的疾病中的一种，并且几十年来已对其进行了深入的研究。癌症现在是美国的第二主要死亡原因，且每年超过500,000人死于此增殖性病症。肿瘤是细胞生长不受调控的混乱的增殖。如果肿瘤具有侵袭性和转移特性，则它是恶性的或癌性。侵袭性是指肿瘤进入周围组织，穿透限定组织边界的基底层，进而常常进入身体的循环***的倾向。转移是指肿瘤迁移至身体其它区域，并在远离初始出现的部位建立增殖区域的倾向。
癌症在分子水平上还没有被完全理解。众所周知，将细胞暴露于致癌物如某些病毒、某些化学品或辐射，会导致DNA改变，这种改变使“抑制”基因失活或使“致癌基因”激活。抑制基因是生长调控基因，其一旦突变，便不再能控制细胞生长。致癌基因最初是正常基因(称为原癌基因(prooncongene))，其通过突变或表达环境的改变而变为转化基因(transforming gene)。转化基因的产物造成不适当的细胞生长。超过二十种不同的正常细胞基因可以通过遗传变化变为致癌基因(oncongene)。转化的细胞在许多方面不同于正常细胞，包括细胞形态、细胞与细胞的相互作用、膜含量、细胞骨架结构、蛋白质分泌、基因表达以及死亡(转化的细胞可以无限生长)。
身体的所有不同的细胞类型均可以转变成良性或恶性肿瘤细胞。最常见的肿瘤部位是肺，其次是结肠直肠、乳腺、***、膀胱、胰腺然后是卵巢。其它常见的癌症类型包括白血病、中枢神经***癌症，包括脑癌、黑素瘤、淋巴瘤、红白血病、子宫癌以及头颈癌。
癌症目前主要用以下三种方式的治疗中的一种或组合来治疗：手术、辐射及化疗。手术涉及整体摘除患病组织。虽然有时手术对摘除位于某些部位(例如乳腺、结肠和皮肤)的肿瘤有效，但其不能用于治疗位于其它区域如脊椎中的肿瘤或治疗扩散性肿瘤病况如白血病。
化疗涉及破环细胞复制或细胞代谢。它最常用于治疗白血病以及乳腺癌、肺癌和睾丸癌。目前存在五种主要类别的化疗剂用于治疗癌症：天然产物及其衍生物；蒽环霉素类；烷化剂；抗增殖剂(又称为抗代谢物)；以及激素剂。化疗剂经常被称为抗肿瘤剂。
若干合成核苷如5-氟尿嘧啶已经被鉴定出呈现抗癌活性。5-氟尿嘧啶已在临床上用于治疗恶性肿瘤，包括例如癌瘤、肉瘤、皮肤癌、消化器官癌以及乳腺癌。然而，5-氟尿嘧啶引起严重的不良反应，如恶心、脱发、腹泻、口炎、白细胞血小板减少、厌食、色素沉着及浮肿。
提供新的抗病毒剂和抗癌剂、包含这些试剂的组合物以及使用这些试剂的治疗方法，特别是用于治疗黄病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感和癌症，以及预防耐药黄病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感和癌症出现，将会是有利的。本发明提供这种药剂、组合物及方法。
用于联合治疗，包括但不限于，联合聚乙二醇干扰素(派罗欣)和利巴韦林，聚合酶抑制剂例如IDX-375和IDX-184(Idenix)、PSI-7851和索非布韦(sofosbuvir)(也称为Sovaldi，由Pharmasset/Gilead销售)、丹诺普韦(danoprevir)(InterMune/Genentech)、RG7128(Pharmasset/Genentech)、I ANA598(Anadys制药公司)、TMN-191(R7227)，联合RG7128和RG7227(Genentech，Pharmasset和Intermune)、ABT-072(雅培)、VX-916、VX-759、VX-222和VX-500(Vertex)、非利布韦(Filibuvir)(PF-00868554)(辉瑞)、GS 9190(Gilead)，单独或具有增强剂(booster)如利托那韦，和丝氨酸蛋白酶抑制剂如博赛泼维(Boceprevir)(SCH 503034)(先灵葆雅)、BILN-2061、特拉匹韦(Vertex)、ACH-1625(Achillion)、GS-9256(Gilead)、BI 201335(Boehringer Ingelheim Pharma)、Vaniprevir(MK-7009)(默克)、Ledispavir(Gilead)、Daclastavir(BMS)、GS-5816(Gilead)SCH900518(Narlaprevir)(先灵/默克)、TMC435(Medivir/Tibotec)。提供了丝氨酸蛋白酶抑制剂的另外的例子，例如，Reiser和Timm的“Serine protease inhibitors as anti-hepatitis Cvirus agents,”Expert Review of Anti-infective Therapy,7(5):537-547(2009年6月)，其内容在此通过引用并入本文。优选的联合将会是与其他泛基因型核苷(pangenotypic nucleoside)、蛋白酶抑制剂、NS4A抑制剂、NS5A抑制剂和/或NS5B抑制剂的联合。代表性的试剂描述于例如PCT/US11/49426、PCT/US10/23563、PCT/US12/38165、PCT/US13/67309和PCT/US11/58404中。
参照以下详细描述将更好地理解本发明。
附图说明
图1是示出了在Huh-7细胞中化合物9相对于索非布韦的三磷酸酯产生的图表。
图2是示出了在人肝细胞中化合物9相对于索非布韦的三磷酸酯产生的图表。
图3a和3b是示出了核苷前药9的线粒体毒性的3天评估的结果的图表，其显示细胞计数作为对照的比例和葡萄糖(图3a)和半乳糖(图3b)浓度(μM)的函数。
图3c和3d是示出了核苷前药23的线粒体毒性的3天评估的结果的图表，其显示细胞计数作为对照的比例和葡萄糖(图3c)和半乳糖(图3d)浓度(μM)的函数。
图3e和3f是示出了核苷前药22的线粒体毒性的3天评估的结果的图表，其显示细胞计数作为对照的比例和葡萄糖(图3a)和半乳糖(图3b)浓度(μM)的函数。
图4a和4b是示出了用化合物22(图4a)和23(图4b)处理的HepaRG细胞的发光(RLU)-药物浓度(μM)的结果的图表。平均值用标尺示出，并示出了拟合曲线。
图5是示出了rNTP掺入了POLRMT酶的图表。
图6a和6b是示出了化合物9(图6a)和索非布韦(图6b)从原代人肝细胞的细胞排出的图表和表格。结果来自47岁高加索男性供体的新鲜铺板的人类肝细胞(0.35×10-6)，其中细胞铺在24孔板中。将化合物以10μM的浓度预孵育12小时，在0、1、2、4、10、24和48小时收获细胞。单磷酸酯的结果显示为灰色，双磷酸酯为橙色，三磷酸酯为蓝色。
具体实施方式
在基于细胞的试验中，本文所述的化合物显示出针对HCV的抑制活性。因此，所述化合物可以用于治疗或预防宿主中的HCV，或降低病毒的生物活性。宿主可以是感染了HCV的哺乳动物且特别是人。所述方法包括施用有效量的一种或多种本文所述的化合物。
本文所述的化合物还显示出对针对HEV的抑制作用。因此，该化合物可以用于治疗或预防宿主中的HEV，或降低病毒的生物活性。宿主可以是感染了HEV的哺乳动物且特别是人。所述方法包括施用治疗上或预防上有效量的一种或多种本文所述的化合物。
本文还公开了药物制剂，所述药物制剂包括与药学上可接受的载体或赋形剂组合的一种或多种本文所述的化合物。在一个实施方案中，所述制剂包括至少一种本文所述的化合物和至少一种其它治疗剂。
参照以下定义将更好地理解本发明：
I.定义
术语“独立地”在本文中用于指示独立应用的变量在应用与应用之间独立地变化。因此，在化合物如R”XYR”中，其中R”是“独立地碳或氮”，两个R”均可以是碳，两个R”均可以是氮，或一个R”可以是碳且另一个R”是氮。
如本文所用，术语“对映异构体纯的”是指这样的化合物组合物，其包含至少约95％，且优选地约97％、98％、99％或100％的该化合物的单一对映异构体。
如本文所用，术语“基本上不含”或“基本上不存在”是指这样的化合物组合物，其包含按重量计至少85至90％，优选地按重量计95％至98％，且甚至更优选地按重量计99％至100％的该化合物的指定对映异构体。在优选的实施方案中，本文所述的化合物基本上不含对映异构体。
类似地，术语“分离的”是指这样的化合物组合物，其包含按重量计至少85至90％，优选地按重量计95％至98％，且甚至更优选地按重量计99％至100％的化合物，且其余包含其它化学物种或对映异构体。
除非另作说明，如本文所用的术语“烷基”是指饱和的直链、支链或环状伯烃、仲烃或叔烃，包括取代的和未被取代的烷基基团。烷基基团可以任选地被不另外干扰反应或在过程中提供改善的任意部分取代，包括但不限于卤基、卤代烷基、羟基、羧基、酰基、芳基、酰氧基、氨基、酰氨基、羧基衍生物、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫醇、亚胺、磺酰基(sulfonyl)、硫烷基(sulfanyl)、亚磺酰基(sulfinyl)、氨磺酰基(sulfamonyl)、酯、羧酸、酰胺、膦酰基(phosphonyl)、氧膦基、磷酰基(phosphoryl)、磷化氢、硫酯、硫醚、酰卤、酸酐、肟、肼、氨基甲酸酯、膦酸、膦酸酯，根据需要是未受保护或受保护的，如本领域技术人员已知，例如，如在Greene等人的Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley and Sons，第二版，1991中所教导的，该文献在此以引用的方式并入。具体地包括CF3和CH2CF3。
在正文中，每当使用术语C(烷基范围)，该术语独立地包括那类中的每个成员，就如同具体地和单独地列出一般。术语“烷基”包括C1-22烷基部分，术语“低级烷基”包括C1-6烷基部分。本领域技术人员应理解，相关烷基基团通过将后缀“-烷(ane)”替代为后缀“-基(-yl)”来命名。
如本文所用，“桥连烷基”是指双环或三环烷烃，例如2：1：1双环己烷。
如本文所用，“螺烷基”是指在单个(季)碳原子处连接的两个环。
术语“烯基”是指直链或支链的不饱和的烃基团，因为其含有一个或多个双键。本文所公开的烯基基团可以任选地被不会不利地影响反应过程的任意部分取代，包括但不限于针对烷基部分上的取代基所描述的那些。烯基基团的非限制性实例包括乙烯、甲基乙烯、异亚丙基(isopropylidene)、1,2-乙烷-二基、1,1-乙烷-二基、1,3-丙烷-二基、1,2-丙烷-二基、1,3-丁烷-二基以及1,4-丁烷-二基。
术语“炔基”是指直链或支链的不饱和无环烃基团，因为其含有一个或多个三键。炔基基团可以任选地被不会不利地影响反应过程的任意部分取代，包括但不限于如上针对烷基部分所描述的那些。合适的炔基基团的非限制性实例包括乙炔基、丙炔基、羟基丙炔基、丁炔-1-基、丁炔-2-基、戊炔-1-基、戊炔-2-基、4-甲氧基戊炔-2-基、3-甲基丁炔-1-基、己炔-1-基、己炔-2-基以及己炔-3-基、3,3-二甲基丁炔-1-基基团。
术语“烷基氨基”或“芳基氨基”是指分别具有一个或两个烷基或芳基取代基的氨基。
本文使用的术语“脂肪醇”是指链中具有4至26个碳，优选链中具有8至26个碳，最优选链中具有10至22个碳的直链伯醇。精确的链长随着来源而变化。代表性的脂肪醇包括月桂醇、硬脂醇和油醇。它们是无色的油状液体(碳数较少时)或蜡状固体，但是不纯的样品可以能会出现黄色。脂肪醇通常具有偶数个碳原子和连接至末端碳的单个醇基(-OH)。有些是不饱和的，有些是分支的。它们在工业中被广泛使用。与脂肪酸一样，它们通常由分子中的碳原子数指代，例如“C12醇”，即具有12个碳的醇，例如十二烷醇。
如本文所用且除非另外指明，术语“受保护的”是指添加到氧、氮或磷原子以防止它的进一步反应或出于其它目的的基团。有机合成领域的技术人员知晓多种氧和氮保护基团，并且描述于例如上述Greene等人的Protective Groups in Organic Synthesis中。
单独或组合的术语“芳基”意指含有一个、两个或三个环的碳环芳族体系，其中这种环可以以侧基方式(pendent manner)连接在一起或可以稠合。芳基的非限制性实例包括苯基、联苯、或萘基、或在从芳族环去除氢之后剩余的其它芳族基团。术语芳基包括取代的和未被取代的部分。芳基基团可以任选地被不会不利地影响过程的任意部分取代，包括但不限于如上针对烷基部分所描述的那些。取代的芳基的非限制性实例包括杂芳基氨基、N-芳基-N-烷基氨基、N-杂芳基氨基-N-烷基氨基、杂芳烷氧基(heteroaralkoxy)、芳基氨基、芳烷基氨基、芳硫基(arylthio)、单芳基酰氨基磺酰基、芳基磺酰氨基(arylsulfonamido)、二芳基酰氨基磺酰基、单芳基酰氨基磺酰基、芳基亚磺酰基、芳基磺酰基、杂芳硫基、杂芳基亚磺酰基、杂芳基磺酰基、芳酰基、杂芳酰基、芳烷酰基(aralkanoyl)、杂芳烷酰基、羟基芳烷基、羟基杂芳烷基、卤代烷氧基烷基、芳基、芳烷基、芳氧基、芳烷氧基、芳氧基烷基、饱和杂环基、部分饱和杂环基、杂芳基、杂芳氧基、杂芳氧基烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、芳基烯基以及杂芳基烯基、芳烷氧羰基(carboaralkoxy)。
术语“烷芳基”或“烷基芳基”是指具有芳基取代基的烷基基团。术语“芳烷基”或“芳基烷基”是指具有烷基取代基的芳基基团。
如本文所用的术语“卤基”包括氯、溴、碘和氟。
术语“酰基”是指羧酸酯，其中酯基基团的非羰基部分选自由直链、支链或环状烷基或低级烷基；烷氧基烷基，包括但不限于甲氧基甲基；芳烷基，包括但不限于苄基；芳氧基烷基，如苯氧基甲基；芳基，包括但不限于苯基，任选地被卤素(F、Cl、Br、I)取代；烷基，包括但不限于C1、C2、C3和C4，或烷氧基，包括但不限于C1、C2、C3和C4；磺酸酯，如烷基或芳烷基磺酰基，包括但不限于甲磺酰基；单、双或三磷酸酯；三苯甲基或单甲氧基三苯甲基；取代的苄基；三烷基甲硅烷基，例如二甲基-叔丁基甲硅烷基，或二苯基甲基甲硅烷基组成的组。酯中的芳基基团最适合地包含苯基基团。术语“低级酰基”是指其中非羰基部分是低级烷基的酰基基团。
术语“烷氧基”和“烷氧基烷基”包含具有烷基部分的直链或支链含氧基团，如甲氧基基团。术语“烷氧基烷基”还包含具有一个或多个连接到烷基基团的烷氧基基团以形成单烷氧基烷基和二烷氧基烷基基团的烷基基团。“烷氧基”基团可以进一步被一个或多个卤原子如氟、氯或溴取代，得到“卤烷氧基”基团。这种基团的实例包括氟甲氧基、氯甲氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟乙氧基、氟乙氧基、四氟乙氧基、五氟乙氧基和氟丙氧基。
术语“烷基氨基”表示“单烷基氨基”和“二烷基氨基”，其分别包含一个或两个连接到氨基基团的烷基基团。术语“芳基氨基”表示“单芳基氨基”和“二芳基氨基”，其分别包含一个或两个连接到氨基基团的芳基基团。术语“芳烷基氨基”包括连接到氨基基团的芳烷基基团。术语芳烷基氨基表示“单芳烷基氨基”和“二芳烷基氨基”，其分别包含一个或两个连接到氨基基团的芳烷基基团。术语芳烷基氨基进一步表示“单芳烷基单烷基氨基”，其包含连接到氨基基团的一个芳烷基基团和一个烷基基团。
如本文所用的术语“杂原子”是指氧、硫、氮和磷。
如本文所用的术语“杂芳基”或“杂芳族的”是指在芳族环中包含至少一个硫、氧、氮或磷的芳族。
术语“杂环的”、“杂环基”和“环杂烷基”是指在环中存在至少一个杂原子如氧、硫、氮或磷的非芳族环状基团。
杂芳基和杂环基团的非限制性实例包括呋喃基(furyl)、呋喃基(furanyl)、吡啶基、嘧啶基、噻吩基、异噻唑基、咪唑基、四唑基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并苯硫基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并咪唑基、嘌呤基、咔唑基、噁唑基、噻唑基、异噻唑基、1,2,4-噻二唑基、异噁唑基、吡咯基、喹唑啉基、噌啉基、酞嗪基、黄嘌呤基、次黄嘌呤基、噻吩、呋喃、吡咯、异吡咯、吡唑、咪唑、1,2,3-***、1,2,4-***、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、嘧啶或哒嗪，以及蝶啶基、氮丙啶、噻唑、异噻唑、1,2,3-噁二唑、噻嗪、吡啶、吡嗪、哌嗪、吡咯烷、噁嗪烷(oxazirane)、吩嗪、吩噻嗪、吗啉基、吡唑基、哒嗪基、吡嗪基、喹喔啉基、黄嘌呤基、次黄嘌呤基、蝶啶基、5-氮杂胞苷基、5-氮杂尿嘧啶基、***并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、腺嘌呤、N6-烷基嘌呤、N6-苄基嘌呤、N6-卤代嘌呤、N6-乙烯基嘌呤、N6-炔属嘌呤(N6-acetylenic purine)、N6-酰基嘌呤、N6-羟烷基嘌呤、N6-硫代烷基嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、6-氮杂嘧啶、2-巯基嘧啶、尿嘧啶、N5-烷基嘧啶、N5-苄基嘧啶、N5-卤代嘧啶、N5-乙烯基嘧啶、N5-炔属嘧啶、N5-酰基嘧啶、N5-羟烷基嘌呤及N6-硫代烷基嘌呤以及异噁唑基。杂芳族基团可以如上针对芳基所描述的那样任选地被取代。杂环或杂芳族基团可以任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由卤素、卤烷基、烷基、烷氧基、羟基、羧基衍生物、酰氨基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基组成的组。根据需要，杂芳族可以被部分或全部氢化。作为非限制性实例，二氢吡啶可以代替吡啶来使用。根据需要或期望，杂环或杂芳基基团上的官能性氧和氮基团可以被保护。合适的保护基团是本领域技术人员所熟知的，并且包括三甲基甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲基或取代的三苯甲基、烷基基团、酰基基团如乙酰基和丙酰基、甲磺酰基和对甲苯磺酰基。杂环或杂芳族基团可以被不会不利地影响反应的任意部分取代，包括但不限于如上针对芳基所描述的那些。
如本文所用的术语“宿主”是指病毒可以在其中复制的单细胞或多细胞有机体，包括但不限于细胞系和动物，并且优选是人。或者，宿主可以携带一部分病毒基因组，其复制或功能可以被本发明化合物改变。术语宿主具体是指受感染的细胞、被病毒基因组的全部或一部分转染的细胞，和动物，特别是灵长类动物(包括但不限于黑猩猩)和人。在本发明的大多数动物应用中，宿主是人类。然而，在某些适应症中，本发明明确地考虑到了兽医应用(如用于治疗黑猩猩)。
术语“肽”是指天然或合成化合物，其含有二至一百个氨基酸，所述氨基酸通过一个氨基酸的羧基基团连接到另一个氨基酸的氨基基团。
术语“药学上可接受的盐或前药”在整个本说明书中用于描述化合物的任何药学上可接受的形式(如酯)，其一旦施用于患者便提供该化合物。药学上可接受的盐包括衍生自药学上可接受的无机或有机碱和酸的那些盐。合适的盐包括衍生自碱金属如钾和钠、碱土金属如钙和镁与药学领域中熟知的许多其它酸的那些盐。
药学上可接受的前药是指在宿主中代谢，例如水解或氧化，以形成本发明化合物的化合物。前药的典型实例包括在活性化合物的官能部分上具有生物学不稳定的保护基团的化合物。前药包括可以被氧化、还原、氨基化、脱氨基化、羟基化、脱羟基化、水解、脱水、烷基化、脱烷基化、酰化、脱酰化、磷酸化或去磷酸化以产生活性化合物的化合物。本发明化合物的前药形式可以具有抗病毒活性，可以被代谢形成展现这种活性的化合物，或两者均可。
II.活性化合物
在一个实施方案中，活性化合物是式(A)或(B)化合物：
Figure BDA0001532248680000131
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
R1是H或Me，其中，当R1是Me时，其可以全部或部分是R或S或其任意混合物；
R2是H、N3、F、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基或(C2-8)炔基；
R4是H或P(O)R6R7，其中，当在R4的磷中心存在手性时，其可以全部或部分是Rp或Sp或其任意混合物，
R5是O、S、CH2、S、Se、CHF、CF2或C＝CH2，
当R5是O时，R3是H或CN，以及
当R5是CH2、CHF、CF2或C＝CH2时，R3选自由H、CN、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基、(C2-8)炔基和O-(C1-8)烷基组成的组，
R8选自由H、C(O)C1-8烷基、C(O)C1-8支链烷基、C(O)NH(C1-8)烷基、C(O)NH(C1-8)支链烷基、C(O)芳基、C(O)(C1-8)烷基-芳基、C(O)NH(C1-8)烷基-芳基、C(O)O(C1-8)烷基、C(O)O(C1-8)支链烷基、C(O)O(C1-8)烷基-芳基组成的组，或当OR8出现在式A或B中时其为衍生自α氨基酸的酯，
R6和R7独立地选自由以下组成的组：
(a)OR15，其中R15选自由H、
Figure BDA0001532248680000141
Li、Na、K、C1-20烷基、C3-6环烷基、C1-4(烷基)芳基、苄基、C1-6卤代烷基、C2-3(烷基)OC1-20烷基、
Figure BDA0001532248680000142
芳基和杂芳基组成的组，其中芳基包括苯基且杂芳基包括吡啶基，并且其中苯基和吡啶基任选地被零至三个取代基取代，所述取代基独立地选自由(CH2)0-6CO2R16和(CH2)0-6CON(R16)2组成的组；
R16独立地为H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、被取代的芳基、或被取代的杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基或环烷基取代的C1-5烷基；
(b)
Figure BDA0001532248680000143
(c)D-或L-氨基酸的酯
Figure BDA0001532248680000144
其中R17受限于天然L-氨基酸中存在的那些，以及R18是H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、被取代的芳基、或被取代的杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基或环烷基取代的C1-5烷基；
(d)R6和R7可以一起形成环
Figure BDA0001532248680000151
其中R19是H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪醇的碳链或被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、被取代的芳基、或被取代的杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基或环烷基取代的C1-5烷基；
(e)R6和R7可以一起形成环，所述环选自由
Figure BDA0001532248680000152
组成的组
其中：
R20是O或NH，以及
R21选自由H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪酸的碳链和被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、被取代的芳基、或被取代的杂芳基取代的C1-20烷基组成的组；其中取代基是C1-5烷基，或被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基或环烷基取代的C1-5烷基，
碱基选自由以下组成的组：
Figure BDA0001532248680000161
X1是CH、C-(C1-6)烷基、C-(C2-6)烯基、C-(C2-6)炔基、C-(C3-7)环烷基、C-(C1-6)卤代烷基、C-(C1-6)羟烷基、C-OR22、C-N(R22)2C-卤代、C-CN或N，
R22独立地为H、(C1-10)烷基、(C1-10)卤代烷基或(C3-7)环烷基，
R9是OH、NH2、O(C1-10)烷基、O(C3-7)环烷基、NH(C1-10)烷基、N((C1-10)烷基)2、NH(C3-7)环烷基、NH(CO)(C1-20)烷基、NH(CO)O(C1-20)烷基、NHOH、NHO(CO)(C1-20)烷基、NHO(CO)NH(C1-20)烷基，
R10是H、F或CH3，以及
X2是H、F、Cl、(C1-6)烷基、(C2-6)烯基、(C2-6)炔基、C-(C3-7)环烷基、C-(C1-6)卤代烷基、(C1-6)卤代烷基、(C3-7)环烷基、(C1-6)羟烷基、OR22、SR22、N(R22)2、NHC(O)OR22、NHC(O)N(R22)2、NHC(O)R22、CN或NH2。
这些化合物可以以β-D或β-L构型存在，然而β-D是优选的实施方案。
提供一组式(A)或式(B)化合物如下：
Figure BDA0001532248680000162
其中R4和碱基如上文所定义。
这些化合物也可以是β-D或β-L构型。
在一些实施方案中，本文所述化合物在一个或多个位置被氘化，该氘化可以存在于化合物的糖部分、化合物的碱基部分和/或化合物的前药部分的2’-位以外的任意位置。
这些分子式的代表性化合物示出如下：
Figure BDA0001532248680000171
Figure BDA0001532248680000181
Figure BDA0001532248680000191
Figure BDA0001532248680000201
Figure BDA0001532248680000211
Figure BDA0001532248680000221
Figure BDA0001532248680000231
Figure BDA0001532248680000241
Figure BDA0001532248680000251
Figure BDA0001532248680000261
Figure BDA0001532248680000271
或其药学上可接受的盐。
特别优选的化合物具有式：
Figure BDA0001532248680000272
(化合物9)，或其药学上可接受的盐。
另一个特别优选的化合物是化合物7(化合物9的5’-OH类似物)。该化合物是优选的化合物，因为它是用于制备化合物9和在5’-位具有不同前药部分的其它化合物的中间体。
III.立体异构现象和多晶型现象
本文所述的化合物可以具有不对称中心并且作为外消旋体、外消旋混合物、独立的非对映异构体或对映异构体存在，其中所有异构体形式都包括在本发明中。具有手性中心的本发明化合物可以以光学活性和外消旋形式存在和分离。一些化合物可以展现出多晶型现象。本发明包括本发明化合物的外消旋、光学活性、多晶型或立体异构形式或其混合物，其具有本文所述的有用的特性。光学活性形式可以通过例如以下方式来制备：通过再结晶技术、通过从光学活性起始物料合成、通过手性合成、或通过使用手性固定相进行色谱分离或通过酶促拆分来拆分外消旋形式。可以纯化各个化合物，然后衍生化该化合物以形成本文所述的化合物，或纯化所述化合物本身。
可以使用本领域中已知的任意方法来制备化合物的光学活性形式，所述方法包括但不限于通过再结晶技术、通过从光学活性起始物料合成、通过手性合成、或通过使用手性固定相进行色谱分离来拆分外消旋形式。
获得光学活性材料的方法的实例至少包括以下：
i)晶体的物理分离：该技术手工地分离各个对映异构体的肉眼可见的晶体。如果存在单独的对映异构体的晶体，即所述材料是团聚体，并且所述晶体在视觉上是不同的，则可以使用此技术；
ii)同时结晶：该技术将各个对映异构体从外消旋体溶液中单独结晶，只有当后者是呈固态的团聚体时才可能发生；
iii)酶促拆分：该技术借助对映异构体与酶的不同反应速率部分或完全分离外消旋体；
iv)酶促不对称合成：在该合成技术中，合成的至少一个步骤使用酶促反应以获得所需对映异构体的对映异构纯的或富集的合成前体；
v)化学不对称合成：该合成技术在产物中产生不对称性(即手性)的条件下从非手性前体合成所需的对映异构体，所述合成可以使用手性催化剂或手性助剂完成；
vi)非对映异构体分离：通过该技术，外消旋化合物与对映异构纯的试剂(手性助剂)反应，将各个对映异构体转化为非对映异构体。所得非对映异构体然后通过色谱法或结晶借助于其现在更明显的结构差异被分离且手性助剂随后被去除以获得所需的对映异构体；
vii)一级和二级不对称转化：通过该技术，平衡来自外消旋体的非对映异构体，使得在来自所需对映异构体的非对映异构体溶液中产生优势，或者来自所需对映异构体的非对映异构体的优先结晶作用破坏这种平衡，这样使得所有的物质最终原则上都被转化为来自所需对映异构体的结晶型非对映异构体。然后从非对映异构体释放所需对映异构体；
viii)动力学拆分：该技术是指借助在动力学条件下对映异构体与手性、非外消旋试剂或催化剂的不平等反应速率，来实现外消旋体的部分或完全拆分(或部分拆分的化合物的进一步拆分)；
ix)从非外消旋前体的对映体特异性合成：通过该合成技术，从非手性起始物料获得所需对映异构体，并且在合成过程中，其立体化学完整性未受到或仅仅受到最低程度的危害；
x)手性液相色谱法：通过该技术，外消旋体的对映异构体在液体流动相中借助于它们与固定相的不同相互作用(包括但不限于经由手性HPLC)而被分离。固定相可以由手性材料制成，或者流动相可以含有另外的手性材料以引起不同的相互作用；
xi)手性气相色谱法：通过该技术，将外消旋体挥发，然后借助于对映异构体在气态流动相中与含有固定的非外消旋手性吸附相的柱的不同相互作用将对映异构体分离；
xii)用手性溶剂萃取：通过该技术，借助于一种对映异构体优先溶解于特定的手性溶剂中而将对映异构体分离；
xiii)跨手性膜转运：通过该技术，将外消旋体放置为与薄膜屏障接触。屏障通常分离两种互溶流体，一种含有外消旋体，并且驱动力如浓度或压差引起优先跨膜屏障转运。由于膜的非外消旋手性性质只允许外消旋体的一种对映异构体通过，从而发生分离。
在一个实施方案中使用了手性色谱法，包括但不限于模拟移动床色谱法。多种手性固定相可以商购获得。
IV.盐或前药制剂
在化合物具有足够的碱性或酸性以形成稳定无毒的酸或碱盐的情况下，该化合物作为药学上可接受的盐来施用可能是恰当的。药学上可接受的盐的实例是与酸形成的有机酸加成盐，其形成生理学上可接受的阴离子，例如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、安息香酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐以及α-甘油磷酸盐。还可以形成合适的无机盐，包括但不限于硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐及碳酸盐。对于某些透皮施用，可以优选使用本文所述化合物的脂肪酸盐。脂肪酸盐可以帮助穿透角质层。合适的盐的实例包括化合物与硬脂酸、油酸、亚油酸(lineoleic acid)、棕榈酸、辛酸和癸酸的盐。
可以使用本领域公知的标准程序，例如使足够碱性的化合物如胺与合适的酸进行反应来获得药学上可接受的盐，提供生理学上可接受的阴离子。在化合物包括多个胺基基团的那些情况下，可以用任意数量的胺基基团形成盐。也可以制备羧酸的碱金属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙)盐。
前药是以非活性(或显著低活性)形式施用，并随后在体内代谢成活性代谢物的药理学物质。以较低的剂量将更多的药物送到所需靶点常常是使用前药的根本原因，并通常是由于更好的吸收、分布、代谢和/或***(ADME)特性。通常将前药设计成提高口服生物利用度，通常从胃肠道吸收差是限制因素。此外，使用前药策略可以提高药物对其预期靶点的选择性，从而降低偏离靶点效应的可能性。
V.治疗方法
本文所述的化合物可以用于治疗或预防丙型肝炎病毒(HCV)感染，以及其它黄病毒、RSV、戊型肝炎病毒(HEV)、流感和某些类型的癌症。
患有这些癌症之一，或感染了这些病毒(例如HCV或HEV)之一或其基因片段的宿主(包括但不限于人)，可以通过对患者施用有效量的在药学上可接受的载体或稀释剂存在下的活性化合物或其药学上可接受的前药或盐来治疗。可以通过任意适当途径，例如口服、胃肠外、静脉内、皮内、透皮、皮下或局部，以液体或固体形式来施用活性物质。
VI.联合或交替治疗
在一个实施方案中，本发明化合物可以与至少一种其它抗病毒剂一起使用，所述其它抗病毒剂选自由聚合酶抑制剂、IMPDH抑制剂、蛋白酶抑制剂以及基于免疫的治疗剂组成的组。
例如，当用于治疗或预防HCV感染时，活性化合物或其前药或药学上可接受的盐可以与另一种抗HCV联合或交替施用，所述另一种抗HCV包括但不限于上式那些。一般说来，在联合治疗中，有效剂量的两种或更多种试剂被一起施用，而在交替治疗期间，有效剂量的每一种试剂被依次施用。剂量将取决于药物的吸收、失活及***率以及本领域技术人员已知的其它因素。应注意，剂量值还将随待缓解的病况的严重性而变化。进一步应理解的是，对于任何特定受试者，应该根据个体的需要以及施用或监督该组合物的施用的人的专业判断随着时间来调整具体的剂量方案和安排。
可以与本文所公开的化合物联合使用的抗病毒剂的非限制性实例包括下表中的那些。
表1 FDA批准的抗HCV化合物和目前处于II或III期临床开发中的化合物*
Figure BDA0001532248680000321
改编自TAG渠道报告：
http://www.pipelinereport.org/sites/g/files/g575521/f/201306/HCV.pdf
1FDA批准的用于HCV感染的治疗
可以用于联合治疗的其他化合物包括：
Figure BDA0001532248680000331
和Faldepravir：
Figure BDA0001532248680000332
本文所述的化合物还可以与雷迪帕韦(Ledipasvir)联合，其具有下式：
Figure BDA0001532248680000341
所述化合物还可以用于治疗癌症。可以根据本发明的方法，用本文所述的化合物及这些化合物的药学上可接受的盐和前药来治疗的患者包括例如已被诊断为患有肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌或***区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、妇科肿瘤(例如子宫肉瘤、输卵管癌、子宫内膜癌、子***、***癌或外阴癌)、何杰金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌***癌(例如甲状腺癌、甲状旁腺癌或肾上腺癌)、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、***癌、慢性或急性白血病、儿童实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌(例如肾细胞癌、肾盂癌)、或中枢神经***肿瘤(例如原发性CNS淋巴瘤、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤或垂体腺瘤)的患者。
本发明还涉及用于抑制患者异常细胞增殖的方法和药物组合物，所述药物组合物包含一定量的本文所述的化合物或其药学上可接受的盐或前药、以及一定量的选自抗血管生成剂、信号转导抑制剂及抗增殖剂的一种或多种物质。当用于治疗癌症时，化合物可以与这些或其它类型的抗癌剂联合或交替施用。
抗血管生成剂，如MMP-2(基质-金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质-金属蛋白酶9)抑制剂和COX-II(环加氧酶II)抑制剂可以与本文所述的式1化合物和药物组合物联合使用。有用的COX-II抑制剂的实例包括CELEBREXTM(阿来考昔(alecoxib))、伐地考昔及罗非考昔。有用的基质金属蛋白酶抑制剂的实例描述于WO 96/33172(公开于1996年10月24日)、WO96/27583(公开于1996年3月7日)、欧洲专利申请号97304971.1(申请于1997年7月8日)、欧洲专利申请号99308617.2(申请于1999年10月29日)、WO 98/07697(公开于1998年2月26日)、WO 98/03516(公开于1998年1月29日)、WO 98/34918(公开于1998年8月13日)、WO 98/34915(公开于1998年8月13日)、WO98/33768(公开于1998年8月6日)、WO 98/30566(公开于1998年7月16日)、欧洲专利公布606,046(公开于1994年7月13日)、欧洲专利公布931,788(公开于1999年7月28日)、WO 90/05719(公开于1990年5月331日)、WO 99/52910(公开于1999年10月21日)、WO 99/52889(公开于1999年10月21日)、WO 99/29667(公开于1999年6月17日)、PCT国际申请号PCT/IB98/01113(申请于1998年7月21日)、欧洲专利申请号99302232.1(申请于1999年3月25日)、英国专利申请号9912961.1(申请于1999年6月3日)、美国临时申请号60/148,464(申请于1999年8月12日)、美国专利号5,863,949(授权于1999年1月26日)、美国专利号5,861,510(授权于1999年1月19日)以及欧洲专利公布780,386(公开于1997年6月25日)中，所有专利通过引用整体并入本文。优选的MMP抑制剂是不表现关节痛的那些。更优选的是相对于其它基质-金属蛋白酶(即MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12及MMP-13)选择性抑制MMP-2和/或MMP-9的那些。
本文所述的化合物还可以与信号转导抑制剂，如可以抑制EGFR(表皮生长因子受体)反应的试剂，如EGFR抗体、EGF抗体和作为EGFR抑制剂的分子；VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂，如VEGF受体和可以抑制VEGF的分子；和erbB2受体抑制剂，如与erbB2受体结合的有机分子或抗体，例如HERCEPTINTM(美国，加利福尼亚州，南旧金山市的Genentech公司)一起使用。
EGFR抑制剂描述于例如WO 95/19970(公开于1995年7月27日)、WO98/14451(公开于1998年4月9日)、WO 98/02434(公开于1998年1月22日)以及美国专利号5,747,498(授权于1998年5月5日)中，并且这种物质可以用于本文所述的本发明中。EGFR-抑制剂包括但不限于单克隆抗体C225和抗EGFR 22Mab(美国，纽约州，纽约市的英克隆***公司)、ABX-EGF(Abgenix/Cell Genesys)、EMD-7200(默克集团)、EMD-5590(默克集团)、MDX-447/H-477(美国，新泽西州，安纳达尔的Medarex公司和默克集团)、以及化合物ZD-1834、ZD-1838和ZD-1839(阿斯利康)、PKI-166(诺华)、PKI-166/CGP-75166(诺华)、PTK 787(诺华)、CP 701(Cephalon)、来氟米特(Pharmacia/Sugen)、CI-1033(Warner Lambert Parke Davis)、CI-1033/PD 183,805(Warner Lambert Parke Davis)、CL-387,785(Wyeth-Ayerst)、BBR-1611(Boehringer Mannheim GmbH/Roche)、Naamidine A(Bristol Myers Squibb)、RC-3940-II(Pharmacia)、BIBX-1382(Boehringer Ingelheim)、OLX-103(美国，新泽西州，怀特豪斯站的默克公司)、VRCTC-310(Ventech Research)、EGF融合毒素(马萨诸塞州，霍普金顿的Seragen公司)、DAB-389(Seragen/Lilgand)、ZM-252808(Imperical Cancer ResearchFund)、RG-50864(INSERM)、LFM-A12(Parker Hughes Cancer Center)、WHI-P97(ParkerHughes Cancer Center)、GW-282974(Glaxo)、KT-8391(Kyowa Hakko)及EGFR疫苗(YorkMedical/Centro de Immunologia Molecular(CIM))。这些及其它EGFR-抑制剂可以用于本发明中。
以下VEGF抑制剂也可以与本发明化合物联合：例如CP-547,632(纽约辉瑞公司)、AG-13736(Agouron Pharmceuticals公司，一家辉瑞公司)、SU-5416及SU-6668(美国，加利福尼亚州，南旧金山市的Sugen公司)和SH-268(先灵)。VEGF抑制剂描述于例如WO 99/24440(公开于1999年5月20日)、PCT国际申请PCT/IB99/00797(申请于1999年5月3日)、WO 95/21613(公开于1995年8月17日)、WO 99/61422(公开于1999年12月2日)、美国专利号5,834,504(授权于1998年11月10日)、WO 98/50356(公开于1998年11月12日)、美国专利号5,883,113(授权于1999年3月16日)、美国专利号5,886,020(授权于1999年3月23日)、美国专利号5,792,783(授权于1998年8月11日)、WO 99/10349(公开于1999年3月4日)、WO 97/32856(公开于1997年9月12日)、WO 97/22596(公开于1997年6月26日)、WO 98/54093(公开于1998年12月3日)、WO 98/02438(公开于1998年1月22日)、WO 99/16755(公开于1999年4月8日)以及WO 98/02437(公开于1998年1月22日)中，所有专利都以引用的方式整体并入本文。本发明中适用的一些具体VEGF抑制剂的其它实例是IM862(美国，华盛顿州，柯克兰市的Cytran公司)；Genentech公司(加利福尼亚州，南旧金山市)的抗VEGF单克隆抗体；以及核酶(angiozyme)，一种来自Ribozyme(科罗拉多州，博尔德市)和Chiron(加利福尼亚州，爱莫利维尔市)的合成核糖酶。这些及其它VEGF抑制剂可以用于如本文所述的本发明中。
此外，ErbB2受体抑制剂如CP-358,774(OSI-774)(它塞瓦)(OSI制药公司)、GW-282974(Glaxo Wellcome plc)以及单克隆抗体AR-209(美国，德克萨斯州，伍德兰市的Aronex制药公司)和2B-1(Chiron)可以与本发明化合物联合，例如以下专利中所示的那些：WO 98/02434(公开于1998年1月22日)、WO 99/35146(公开于1999年7月15日)、WO 99/35132(公开于1999年7月15日)、WO 98/02437(公开于1998年1月22日)、WO 97/13760(公开于1997年4月17日)、WO 95/19970(公开于1995年7月27日)、美国专利号5,587,458(授权于1996年12月24日)以及美国专利号5,877,305(授权于1999年3月2日)，所有专利都在此以引用的方式整体并入本文。可用于本发明中的ErbB2受体抑制剂还描述于1999年1月27日申请的美国临时申请号60/117,341和1999年1月27日申请的美国临时申请号60/117,346中，这两者都以引用的方式整体并入本文。erbB2受体抑制剂化合物和在上述PCT申请、美国专利和美国临时申请中描述的物质以及抑制erbB2受体的其它化合物和物质都可以根据本发明与本文所述的化合物一起使用。
化合物还可以与适用于治疗异常细胞增殖或癌症的其它试剂一起使用，包括但不限于能增强抗肿瘤免疫反应的试剂，如CTLA4(细胞毒性淋巴细胞抗原4)抗体，及能阻断CTLA4的其它试剂；以及抗增殖剂如其它法呢基蛋白转移酶抑制剂等。可以用于本发明的特定的CTLA4抗体包括美国临时申请60/113,647(申请于1998年12月23日)中描述的那些，该专利以引用的方式整体并入，然而，其它CTLA4抗体也可以用于本发明。
还可以使用其它抗血管生成剂，包括但不限于其它COX-II抑制剂、其它MMP抑制剂、其它抗VEGF抗体或其它血管形成效应物的抑制剂。
VIII.药物组合物
感染了HCV的宿主(包括但不限于人)可以通过对患者施用有效量的在药学上可接受的载体或稀释剂的存在下的活性化合物或其药学上可接受的前药或盐来治疗。可以通过任何适当途径，例如口服、胃肠外、静脉内、皮内、皮下或局部，以液体或固体形式来施用活性物质。
化合物的优选剂量将在以下范围内：在约0.01与约10mg/kg接受者体重/天之间、更一般在约0.1与5mg/kg接受者体重/天之间、且优选地在约0.5与约2mg/kg接受者体重/天之间。药学上可接受的盐和前药的有效剂量范围可以基于待递送的母体化合物的重量来计算。如果盐或前药本身展现活性，那么有效剂量可以如上使用盐或前药的重量或通过本领域技术人员已知的其它方式来估算。
化合物方便地以任何合适的单位剂型施用，包括但不限于含有7至600mg、优选地70至600mg活性成分/单位剂型的剂型。5-400mg的口服剂量通常是适宜的。
活性化合物在药物组合物中的浓度将取决于药物的吸收、失活及***率以及本领域技术人员已知的其它因素。应注意剂量值还将随待缓解的病况的严重性而变化。还应理解，对于任何具体的受试者而言，具体的剂量方案应根据个体需要和施用或监督组合物的施用的人员的职业判断随时间进行调整，而且本文所列举的浓度范围只是示例性的，而不是为了限制所要求保护的组合物的范围或实践。活性成分可以一次施用，或者可以将其分成许多较小的剂量，而以不同的时间间隔施用。
施用活性化合物的一个优选模式是口服。口服组合物通常将包含惰性稀释剂或可以食用的载体。可以将它们包封在明胶胶囊中，或者压制成片剂。为了口服治疗施用，可以将活性化合物加入赋形剂中并以片剂、锭剂或胶囊形式使用。药学上相容的粘合剂和/或佐剂物质可以作为所述组合物的一部分包括在内。
片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有任何以下成分或相似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶态二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或者调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。当所述单位剂型为胶囊时，除上述类型的物质外，还可以含有液体载体如脂肪油。另外，单位剂型还可以含有各种改变剂量单位的物理形式的其它物质，例如糖包衣物、虫胶或其它肠溶剂(enteric agent)。
所述化合物可以作为酏剂、悬浮液、糖浆剂、干胶片(wafer)、咀嚼胶等的组分施用。除(多种)活性化合物外，糖浆剂还可以含有作为甜味剂的蔗糖和某些防腐剂、染料和着色剂以及调味剂。
还可以将化合物、其药学上可接受的前药或盐与不损害所需作用的其它活性物质，或与补充所需作用的物质混合，如抗生素、抗真菌剂、抗炎药或其它抗病毒化合物。用于肠胃外、皮内、皮下或局部施用的溶液或悬浮液可以包含下列组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及紧张性调节剂如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以被包封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶内。
如果静脉内施用，那么优选载体是生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
透皮制剂
在一些实施方案中，组合物以透皮制剂的形式存在，例如在FDA批准的激动剂罗替戈汀透皮剂(Neupro贴剂)中所使用的。另一种合适的制剂是在题为“TransdermalTherapeutic System for Treating Parkinsonism”的美国公开号20080050424中描述的制剂。该制剂包括有机硅或基于丙烯酸酯的粘合剂，并且可以包括对活性物质具有增加的溶解度的添加剂，其量有效地增加基质对活性物质的溶解能力。
透皮制剂可以是单相基质，其包括背衬层、含活性物质的自粘基质和在使用前要去除的保护膜。更复杂的实施方案包含多层基质，其也可以包含非粘性层和控制膜。如果使用聚丙烯酸酯粘合剂，其可以与多价金属离子如锌、钙、铝或钛离子交联，例如乙酰丙酮铝和乙酰丙酮钛。
当使用有机硅粘合剂时，它们通常是聚二甲基硅氧烷。然而，原则上可以存在其它有机残基例如乙基或苯基，而不是甲基。因为活性化合物是胺，所以使用耐胺的粘合剂可能是有利的。代表性的耐胺性粘合剂描述于例如EP0180377中。
代表性的基于丙烯酸酯的聚合物粘合剂包括丙烯酸、丙烯酰胺、丙烯酸己酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸辛酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸己酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸辛酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮和它们的组合。
粘合剂必须对活性物质具有合适的溶解能力，并且活性物质最能够在基质内移动，并且能够穿过接触表面到达皮肤。本领域技术人员可以容易地配制具有活性物质的适当透皮转运的透皮制剂。
某些药学上可接受的盐倾向于更优选用于透皮制剂，因为它们可以帮助活性物质通过角质层的屏障。实例包括脂肪酸盐，例如硬脂酸盐和油酸盐。油酸盐和硬脂酸盐是相对亲脂性的，并且甚至可以作为皮肤中的渗透促进剂。
也可以使用渗透促进剂。代表性的渗透促进剂包括脂肪醇、脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪酸酰胺、甘油或其脂肪酸酯、N-甲基吡咯烷酮、萜烯如柠檬烯、α-蒎烯、α-萜品醇、香芹酮、香芹醇、柠檬烯氧化物、蒎烯氧化物和1,8-桉树脑。
通常可以通过将活性剂溶解或悬浮在乙醇或另一种合适的有机溶剂中，然后在搅拌下加入粘合剂溶液来制备贴剂。另外的辅助物质可以添加到粘合剂溶液、活性物质溶液或含活性物质的粘合剂溶液中。然后可以将溶液涂覆到合适的片材上，去除溶剂，将背衬层层压到基质层上，以及从整个层压材料冲压出贴片。
纳米颗粒组合物
本文所述的化合物还可以以纳米颗粒组合物的形式施用。
在一个实施方案中，控释纳米颗粒制剂包含待施用的纳米颗粒活性剂和速率控制聚合物，其具有施用后延长试剂释放的功能。在该实施方案中，组合物可以在施用后释放活性剂约2小时至约24小时或长达30天或更长的时期。包括纳米颗粒形式的活性剂的代表性控释制剂描述于例如美国专利8,293,277中。
纳米颗粒组合物包含本文所述活性剂的颗粒，其具有吸附在其表面上或与其表面缔合的非交联表面稳定剂。
纳米颗粒的平均粒度通常小于约800nm，更典型地小于约600nm，还更典型地小于约400nm，小于约300nm，小于约250nm，小于约100nm，或小于约50nm。在该实施方案的一个方面中，当通过光散射技术测量时，至少50％的活性剂颗粒分别具有小于约800、600、400、300、250、100或50nm的平均粒度。
各种表面稳定剂通常与纳米颗粒组合物一起使用以防止颗粒结块或聚集。代表性表面稳定剂选自由明胶、卵磷脂、葡聚糖、***树胶、胆固醇、黄芪胶、硬脂酸、苯扎氯铵、硬脂酸钙、单硬脂酸甘油酯、鲸蜡硬脂醇、聚西托醇(聚西托醇)乳化蜡、脱水山梨醇酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、胶体二氧化硅、磷酸酯、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、非结晶纤维素、硅酸镁铝、三乙醇胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、泰洛沙泊、泊洛沙姆、泊洛沙胺(poloxamines)、泊洛沙胺908、磺基琥珀酸钠的二烷基酯、月桂基硫酸钠、烷基芳基聚醚磺酸酯、蔗糖硬脂酸酯和蔗糖二硬脂酸酯的混合物、对异壬基苯氧基聚(缩水甘油)、SA9OHCO、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺、正癸基-D-吡喃葡萄糖苷、正癸基-D-吡喃麦芽糖苷、正十二烷基-D-吡喃葡萄糖苷、正十二烷基-D-麦芽糖苷、庚酰基-N-甲基葡糖酰胺、正庚基-D-吡喃葡萄糖苷、正庚基-D-硫代葡萄糖苷、正己基-D-吡喃葡萄糖苷、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺、正壬基-D-吡喃葡萄糖苷、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺、正辛基-D-吡喃葡萄糖苷和辛基-D-硫代吡喃葡萄糖苷组成的组。溶菌酶也可以用作纳米颗粒组合物的表面稳定剂。已知当通过静脉内(IV)或皮下(SQ)给予时，某些纳米颗粒例如聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)-纳米颗粒靶向肝脏。
由于HCV和其他病毒引起肝脏损伤并存在于肝脏中，因此在一个实施方案中，纳米颗粒或其它药物递送载体靶向肝脏。这样类型的肝靶向药物递送载体描述于Park等人的Mol Imaging.Feb 2011；10(1):69–77中，并使用磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)作为分子靶标。Park教导将此靶标用于肝细胞癌(HCC)，慢性持续性肝炎常导致的原发性肝癌。
在该实施方案的一个方面，该药物递送载体还用于将治疗剂靶向肝脏以治疗病毒感染。此外，由于本文所述的化合物具有抗癌用途，这种类型的***可以将化合物靶向肝脏并治疗肝癌。GPC3是硫酸乙酰肝素蛋白多糖，其在正常成人组织中不表达，但在高达80％的人肝细胞癌(HCC)中显着过表达。可以例如使用抗体介导的靶向和结合来靶向GPC3(参见Hsu等人，Cancer Res.1997；57:5179–84)。
在美国专利号7,304,045中描述了用于靶向肝脏的另一种类型的药物递送***。该'045专利公开了双颗粒肿瘤或癌靶向***，其包括与半乳糖胺缀合(conjugate)的第一配体介导靶向的纳米颗粒，其中配体在靶细胞上。第一纳米颗粒包括聚(γ-谷氨酸)/聚(丙交酯)嵌段共聚物和n个抗病毒化合物，在这种情况下是本文所述的化合物，在'045专利中是更昔洛韦。第二纳米颗粒包括聚(γ-谷氨酸)/聚(丙交酯)嵌段共聚物，内皮细胞特异性启动子和(单纯疱疹病毒)-(胸苷激酶)基因构建的质粒，并提供增强的通透性和滞留-介导的靶向。第一和所述第二纳米颗粒在配置用于递送至肝脏的溶液中混合。当待治疗的病症是肝肿瘤或癌症时，递送可以直接到或邻近肝肿瘤或癌症。
其中可以将纳米颗粒配制其中的代表性的速率控制聚合物包括壳聚糖、聚环氧乙烷(PEO)、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、***胶、琼脂、瓜尔胶、谷类胶、葡聚糖、酪蛋白、明胶、果胶、角叉菜胶、蜡、虫胶、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素(HPC)、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠(CMC)、聚环氧乙烷、烷基纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、亲水性纤维素衍生物、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、偏苯三酸乙酸纤维素、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯、聚乙烯基缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚甲基丙烯酸烷基酯、聚乙酸乙烯酯、衍生自丙烯酸或甲基丙烯酸及其相应的酯的聚合物、以及衍生自丙烯酸或甲基丙烯酸及其相应的酯的共聚物。
制备纳米颗粒组合物的方法描述于例如美国专利号5,518,187和5,862,999，均为“Method of Grinding Pharmaceutical Substances”；美国专利号5,718,388“ContinuousMethod of Grinding Pharmaceutical Substances”；和美国专利号5,510,118“Processof Preparing Therapeutic Compositions Containing Nanoparticles”中。
纳米颗粒组合物也描述于，例如，美国专利号5,298,262“Use of Ionic CloudPoint Modifiers to Prevent Particle Aggregation During Sterilization”；美国专利号5,302,401“Method to Reduce Particle Size Growth In Lyophilization”；美国专利号5,318,767“X-Ray Contrast Compositions Useful in Medical Imaging”；美国专利号5,326,552“Novel Formulation For Nanoparticulate X-Ray Blood Pool ContrastAgents Using High Molecular Weight Non-ionic Surfactants”；美国专利号5,328,404“Method of X-Ray Imaging Using Iodinated Aromatic Propanedioates”；美国专利号5,336,507“Use of Charged Phospholipids to Reduce Nanoparticle Aggregation”；美国专利号5,340,564“Formulations Comprising Olin 10-G to Prevent ParticleAggregation and Increase Stability”；美国专利号5,346,702“Use of Non-IonicCloud Point Modifiers to Minimize Nanoparticulate Aggregation DuringSterilization”；美国专利号5,349,957“Preparation and Magnetic Properties ofVery Small Magnetic-Dextran Particles”；美国专利号5,352,459“Use of PurifiedSurface Modifiers to Prevent Particle Aggregation During Sterilization”；美国专利号5,399,363和5,494,683均为“Surface Modified Anticancer Nanoparticles”；美国专利号5,401,492“Water Insoluble Non-Magnetic Manganese Particles asMagnetic Resonance Enhancement Agents”；美国专利号5,429,824“Use of Tyloxapolas a Nanoparticulate Stabilizer”；美国专利号5,447,710“Method for MakingNanoparticulate X-Ray Blood Pool Contrast Agents Using High Molecular WeightNon-ionic Surfactants”；美国专利号5,451,393“X-Ray Contrast Compositions Usefulin Medical Imaging”；美国专利号5,466,440“Formulations of Oral GastrointestinalDiagnostic X-Ray Contrast Agents in Combination with PharmaceuticallyAcceptable Clays”；美国专利号5,470,583“Method of Preparing NanoparticleCompositions Containing Charged Phospholipids to Reduce Aggregation”；美国专利号5,472,683“Nanoparticulate Diagnostic Mixed Carbamic Anhydrides as X-RayContrast Agents for Blood Pool and Lymphatic System Imaging”；美国专利号5,500,204“Nanoparticulate Diagnostic Dimers as X-Ray Contrast Agents for Blood Pooland Lymphatic System Imaging”；美国专利号5,518,738“Nanoparticulate NSAIDFormulations”；美国专利号5,521,218“Nanoparticulate Iododipamide Derivativesfor Use as X-Ray Contrast Agents”；美国专利号5,525,328“NanoparticulateDiagnostic Diatrizoxy Ester X-Ray Contrast Agents for Blood Pool andLymphatic System Imaging”；美国专利号5,543,133“Process of Preparing X-RayContrast Compositions Containing Nanoparticles”；美国专利号5,552,160“SurfaceModified NSAID Nanoparticles”；美国专利号5,560,931“Formulations of Compoundsas Nanoparticulate Dispersions in Digestible Oils or Fatty Acids”；美国专利号5,565,188“Polyalkylene Block Copolymers as Surface Modifiers forNanoparticles”；美国专利号5,569,448“Sulfated Non-ionic Block CopolymerSurfactant as Stabilizer Coatings for Nanoparticle Compositions”；美国专利号5,571,536“Formulations of Compounds as Nanoparticulate Dispersions inDigestible Oils or Fatty Acids”；美国专利号5,573,749“NanoparticulateDiagnostic Mixed Carboxylic Anydrides as X-Ray Contrast Agents for Blood Pooland Lymphatic System Imaging”；美国专利号5,573,750“Diagnostic Imaging X-RayContrast Agents”；美国专利号5,573,783“Redispersible Nanoparticulate FilmMatrices With Protective Overcoats”；美国专利号5,580,579“Site-specificAdhesion Within the GI Tract Using Nanoparticles Stabilized by High MolecularWeight,Linear Poly(ethylene Oxide)Polymers”；美国专利号5,585,108“Formulationsof Oral Gastrointestinal Therapeutic Agents in Combination withPharmaceutically Acceptable Clays”；美国专利号5,587,143“Butylene Oxide-Ethylene Oxide Block Copolymers Surfactants as Stabilizer Coatings forNanoparticulate Compositions”；美国专利号5,591,456“Milled Naproxen withHydroxypropyl Cellulose as Dispersion Stabilizer”；美国专利号5,593,657“NovelBarium Salt Formulations Stabilized by Non-ionic and Anionic Stabilizers”；美国专利号5,622,938“Sugar Based Surfactant for Nanocrystals”；美国专利号5,628,981“Improved Formulations of Oral Gastrointestinal Diagnostic X-Ray ContrastAgents and Oral Gastrointestinal Therapeutic Agents”；美国专利号5,643,552“Nanoparticulate Diagnostic Mixed Carbonic Anhydrides as X-Ray ContrastAgents for Blood Pool and Lymphatic System Imaging”；美国专利号5,718,388“Continuous Method of Grinding Pharmaceutical Substances”；美国专利号5,718,919“Nanoparticles Containing the R(-)Enantiomer of Ibuprofen”；美国专利号5,747,001“Aerosols Containing Beclomethasone Nanoparticle Dispersions”；美国专利号5,834,025“Reduction of Intravenously Administered Nanoparticulate FormulationInduced Adverse Physiological Reactions”；美国专利号6,045,829“NanocrystallineFormulations of Human Immunodeficiency Virus(HIV)Protease Inhibitors UsingCellulosic Surface Stabilizers”；美国专利号6,068,858“Methods of MakingNanocrystalline Formulations of Human Immunodeficiency Virus(HIV)ProteaseInhibitors Using Cellulosic Surface Stabilizers”；美国专利号6,153,225“Injectable Formulations of Nanoparticulate Naproxen”；美国专利号6,165,506“NewSolid Dose Form of Nanoparticulate Naproxen”；美国专利号6,221,400“Methods ofTreating Mammals Using Nanocrystalline Formulations of Human ImmunodeficiencyVirus(HIV)Protease Inhibitors”；美国专利号6,264,922“Nebulized AerosolsContaining Nanoparticle Dispersions”；美国专利号6,267,989“Methods forPreventing Crystal Growth and Particle Aggregation in NanoparticleCompositions”；美国专利号6,270,806“Use of PEG-Derivatized Lipids as SurfaceStabilizers for Nanoparticulate Compositions”；美国专利号6,316,029“RapidlyDisintegrating Solid Oral Dosage Form,"美国专利号6,375,986“Solid DoseNanoparticulate Compositions Comprising a Synergistic Combination of aPolymeric Surface Stabilizer and Dioctyl Sodium Sulfosuccinate”；美国专利号6,428,814“Bioadhesive nanoparticulate compositions having cationic surfacestabilizers”；美国专利号6,431,478“Small Scale Mill”；和美国专利号6,432,381“Methods for targeting drug delivery to the upper and/or lowergastrointestinal tract”中，所有这些通过引用并入本文。此外，2002年1月31日公开的，名为“Controlled Release Nanoparticulate Compositions”的美国专利申请号20020012675A1描述了纳米颗粒组合物，并且具体通过引用并入本文。
包括本文所述的化合物以及单磷酸酯前药和单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯类似物形式的纳米颗粒制剂可以用于治疗或预防黄病毒、RSV、HEV引起的感染和流感感染，以及治疗或预防某些类型的癌症，包括但不限于肝癌、急性骨髓性白血病、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、***癌、头颈癌、乳腺癌、头颈癌、胃癌、一些皮肤癌和本文其他地方描述的可以用抗癌核苷治疗的其他类型的癌症。
无定形小颗粒组合物描述于例如美国专利号4,783,484“ParticulateComposition and Use Thereof as Antimicrobial Agent”；美国专利号4,826,689“Method for Making Uniformly Sized Particles from Water-Insoluble OrganicCompounds”；美国专利号4,997,454“Method for Making Uniformly-Sized ParticlesFrom Insoluble Compounds”；美国专利号5,741,522“Ultrasmall,Non-aggregatedPorous Particles of Uniform Size for Entrapping Gas Bubbles Within andMethods”；和美国专利号5,776,496“Ultrasmall Porous Particles for EnhancingUltrasound Back Scatter”中。
控释制剂
在一个优选实施方案中，所述活性化合物与保护所述化合物免受体内快速清除的载体一起制备，如控释制剂，包括但不限于植入物和微囊化递送***。可以使用生物可降解性、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯及聚乳酸。例如，肠溶包衣的化合物可以用来保护胃酸引起的裂解。用于制备这种制剂的方法对本领域技术人员是显而易见的。合适的材料也可以商购获得。
脂质体悬浮液(包括但不限于靶向受感染细胞、具有针对病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)也优选作为药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法，例如如美国专利号4,522,811(以引用的方式并入)中所述来制备。例如，可以如下制备脂质体制剂：溶解合适的(多种)脂质(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰胆碱、花生四烯酰(arachadoyl)磷脂酰胆碱和胆固醇)于无机溶剂中，然后所述无机溶剂蒸发，在容器表面留下干脂质的薄膜。然后将活性化合物的水溶液引入容器中。随后用手转动(swirl)容器使脂质物质从容器壁上脱落并分散脂质聚集体，从而形成脂质体悬浮液。
用于描述本发明的术语是常用的且为本领域技术人员所知。如本文所用，以下缩写具有指定含义：
ACN 乙腈
aq 水溶液
BSA 二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺
BzCl 苯甲酰氯
CDI 羰基二咪唑
DIPEA 二异丙基乙胺(Hünig’s碱)
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐
EtOAc 乙酸乙酯
h 小时
HOBt N-羟基苯并***
LiHMDS 六甲基二硅基胺基锂
M 摩尔
min 分钟
Ms 甲磺酸
NCS N-氯代琥珀酰亚胺
NBS N-溴代琥珀酰亚胺
NFSI N-氟代苯磺酰亚胺
NIS N-碘代琥珀酰亚胺
NMI 1-甲基咪唑
Pyr 吡啶
rt或RT 室温
TBDPSCl 叔丁基(氯代)二苯基硅烷
TBAF 四丁基氟化铵
TBAT 三苯基二氟硅酸四丁基铵
TBTU O-(苯并三氮唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
TEA 三乙胺
THF 四氢呋喃
Ts 甲苯磺酸盐
IX.用于制备活性化合物的一般方法
用于简易制备活性化合物的方法是本领域已知的，并且来自已知方法的选择性组合。本文所公开的化合物可以如下所详细描述地制备，或通过本领域技术人员已知的其它方法来制备。本领域普通技术人员应当理解，在不背离本发明的精神且决不限制本发明的范围的情况下，可以进行细节的改变。
各种反应方案概述如下。
方案1是合成本发明活性化合物的一个非限制性实例，且特别是核苷1的合成方法。
方案2是合成本发明活性化合物的一个非限制性实例，且特别是核苷1的替代合成方法。
方案3是合成本发明活性化合物的一个非限制性实例，且特别是单磷酸酯前药I的合成方法。
方案4是合成本发明活性化合物的一个非限制性实例，且特别是单磷酸酯前药IV、V和VI的合成方法。
方案5是合成本发明活性化合物的一个非限制性实例，且特别是单磷酸酯前药VII的合成方法。
方案6是合成本发明活性化合物的一个非限制性实例，且特别是单磷酸酯前药VIII的合成方法。
式A的化合物可以通过首先制备核苷1制备，核苷1的制备转而由本领域的普通技术人员使用在以下文献中所概述的方法以及通过一般方案1-2来完成：(a)Rajagopalan,P.；Boudinot,F.D；Chu,C.K.；Tennant,B.C.；Baldwin,B.H.；Antiviral Nucleosides:Chiral Synthesis and Chemotheraphy:Chu,C.K.；编辑Elsevier:2003.b)RecentAdvances in Nucleosides:Chemistry and Chemotherapy:Chu,C.K.；编辑Elsevier:2002.c)Frontiers in Nucleosides&Nucleic Acids,2004,编辑R.F.Schinazi&D.C.Liotta,IHL Press,Tucker,GA,USA,pp:319-37d)Handbook of NucleosideSynthesis:Vorbruggen H.&Ruh-Pohlenz C.John Wiley&sons 2001)。具体地，核苷1可以通过在路易斯酸(例如TMSOTf)的存在下将糖2与受保护的、甲硅烷基化或游离的核苷碱基偶联来制备。3'-羟基和5'-羟基的脱保护得到核苷1。
Figure BDA0001532248680000501
方案1核苷1的合成方法。(碱基如活性化合物部分所定义)
在本文所述的方案中，如果核苷碱基包括可能在偶联步骤期间干扰或被分解或以其它方式转化的官能团，则可以使用合适的保护基团保护此类官能团。在偶联步骤之后，受保护的官能团(如果有的话)可以脱保护。
或者，核苷1可以由1'-卤代、1'-磺酸酯或1'-羟基化合物3制备。对于1'-卤代或1'-磺酸酯的情况，在碱如三乙胺或氢化钠存在下保护的或游离的核苷碱基，接着脱保护将得到核苷1。对于1'-羟基的情况，在光延(Mitsunobu)偶合剂如偶氮二甲酸二异丙酯存在下保护的或游离的核苷碱基，接着脱保护将得到核苷1。
Figure BDA0001532248680000502
方案2核苷1的替代合成方法。(碱基如活性化合物部分所定义)。
在从碱：1)
Figure BDA0001532248680000511
和2)
Figure BDA0001532248680000512
制备C-核苷的情况下，可以使用在WO09132123、WO09132135、WO2011150288和WO2011035250中描述的方法。
单磷酸酯前药I可以如方案3中所述由酚4开始制备。将4暴露于三氯氧磷或三氯硫磷(phosphorothioyl trichloride)，得到5，随后使其与氨基酯6反应，得到氨基磷酸酯7。接下来，可以通过使5'-羟基与氯磷酰基氨基丙酸酯7反应将核苷1转化为单磷酸酯类似物8。如果存在保护基团，则从8的碱基和/或糖去除保护基团，得到单磷酸酯前药I。
Figure BDA0001532248680000513
方案3单磷酸酯前药I的合成方法(碱基、R1、R2、R3、R5、R16、R17和R18如在活性化合物部分中所定义)。
单磷酸酯前药IV可以通过取代的吡啶9与三氯氧磷反应来制备。接下来，可以将所得中间体与L-氨基酸6的酯(方案4)反应得到11。接下来，可以通过使5'-羟基与氯代磷酰基底物11反应将核苷1转化为单磷酸酯类似物IV。必要时去除保护基，得到单磷酸酯前药IV。利用与R15OH或9取代6类似的方案，也可以制备单磷酸酯前药V和VI。
Figure BDA0001532248680000521
方案4单磷酸酯前药IV-VI的合成方法。(碱基、R1、R2、R3、R5、R16、R17和R18如活性化合物部分所定义)。
单磷酸酯前药VII可以通过使12与三氯氧磷反应得到13来制备(方案5)。接下来，可以通过使5'-羟基与氯磷酰基底物13反应将核苷1转化为单磷酸酯类似物VII。必要时去除保护基，得到单磷酸酯前药VII。
Figure BDA0001532248680000522
方案5单磷酸酯前药VII的合成方法。(碱基、R1、R2、R3、R5和R19如活性化合物部分所定义)。
单磷酸酯前药VIII可以通过使14与三氯氧磷反应得到15来制备(方案6)。接下来，可以通过使5'-羟基与氯磷酰基底物15反应将核苷1转化为单磷酸酯类似物VIII。必要时去除保护基，得到单磷酸酯前药VIII。
Figure BDA0001532248680000531
方案6单磷酸酯前药VIII的合成方法。(碱基、R1、R2、R3、R5和R21如活性化合物部分所定义的)。
氘的掺入
在核苷抗病毒剂的糖部分中的代谢位点处用氘单次或多次置换氢(碳-氢键至碳-氘键)预期将降低代谢速率。这可以提供相对较长的半衰期，并且较慢的从身体的清除率。治疗性核苷的缓慢代谢预期对治疗候选物增加额外的优势，而其他物理或生物化学性质不受影响。细胞内水解或氘交换可以导致氧化氘(D2O)释放。
将氘掺入氨基酸、酚、糖和碱的方法是本领域技术人员所熟知的。美国专利No.9,045,521中公开了代表性的方法。
已经开发了用于在糖和核苷阶段的氘掺入的各种酶方法和化学方法以提供高水平的氘掺入(D/H比)。氘交换的酶法通常具有低掺入水平。由于分离氘化的单核苷酸嵌段所需的繁琐的分离技术，酶掺入具有进一步的复杂性。Schmidt等人，Ann.Chem.1974,1856；Schmidt等人，Chem.Ber.,1968,101,590描述了5',5'-2H2-腺苷的合成，其由2',3'-O-异亚丙基腺苷-5'-羧酸或由甲基-2,3-异亚丙基-β-D-呋喃核糖酸(ribofuranosiduronicacid)制备，Dupre,M.和Gaudemer,A.,Tetrahedron Lett.1978,2783.Kintanar等人Am.Chem.Soc.1998,110,6367报道了使用硼氘化钠或氘化铝锂(98原子％2H掺入)还原合适的5'-醛，可以获得5'-氘化腺苷和5'(R/S)-氘化胸苷的非对映异构体混合物。Berger等人，Nucleoside&Nucleotides 1987,6,395描述了通过在2H2O/吡啶混合物(1:1)中加热醛然后用NaBD4还原醛，而将2'脱氧鸟苷的5'-醛衍生物转化成5'或4'-氘代-2'-脱氧鸟苷。
Ajmera等人，Labelled Compd.1986,23,963描述了获得4'-氘标记尿苷和胸苷(98原子％2H)的方法。Sinhababu等人J.Am.Chem.Soc.1985,107,7628证明了在糖合成过程中，通过使用硼氘化钠将1,2:5,6-二-O-异亚丙基-β-D-己呋喃-3-酮糖(1,2:5,6-di-O-isopropylidene-β-D-hexofuranos-3-ulose)立体选择性还原为1,2:5,6-二-O-异亚丙基-3-氘代-β-D-己呋喃核糖(1,2:5,6-di-O-isopropylidene-3-deuterio-β-D-ribohexofuranose)，随后进一步进行核苷合成，而在腺苷的C3'(97原子％2H)上掺入氘。Robins等人，Org.Chem.1990,55,410报道了在乙酸中通过硼氘化钠还原2'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)3-酮核苷，实现在腺苷的C3'处几乎完全立体选择性地掺入超过95％的原子2H的合成。David,S.和Eustache,J.,Carbohyd.Res.1971,16,46以及David,S.和Eustache,J.,Carbohyd.Res.1971,20,319描述了2'-脱氧-2'(S)-氘代-尿苷和胞苷的合成。通过使用1-甲基-2-脱氧-2'-(S)-氘代呋喃核糖苷进行该合成。
Radatus等人J.Am.Chem.Soc.1971,93,3086描述了合成2'-单氘化(R或S)-2'-脱氧胞苷的化学方法。这些结构是由选择性2-单氘化-2-脱氧-D-核糖合成的，它们是通过用氘化铝锂立体定向还原2,3-脱氢-六吡喃糖并氧化所得烯糖而获得的。Wong等人J.Am.Chem.Soc.1978,100,3548报道了通过涉及烯酮二硫缩醛衍生物的形成和LiAlD4还原的反应顺序，由D-***糖获得脱氧-1-氘代-D-赤-戊糖、2-脱氧-2(S)-氘代-D-赤-戊糖和2-脱氧-1,2(S)-二氘代-D-赤-戊糖。
Pathak等人J.,Tetrahedron 1986,42,5427报道了通过用LiAlD4还原性打开合适的甲基2,3-脱水-β-D-核糖或β-D-来苏呋喃糖苷(lyxofuranoside)来立体定向合成所有8种2'或2'-氘代-2'-脱氧核苷。Wu等人J.Tetrahedron 1987,43,2355描述了脱氧核糖核苷和核糖核苷的所有2',2”-二氘代-2'-脱氧核苷的合成，其从糖的C2'的氧化开始，随后用NaBD4或LiAlD4还原，随后通过三丁基锡氘化物脱氧。Roy等人J.Am.Chem.Soc.1986,108,1675报道了可以在2H2O中使用2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶由2-脱氧核糖5-磷酸酯制备2',2'-二氘代-2'-脱氧鸟苷和胸苷，达到大约90原子％的氘代。类似地，可以进行4',5',5'-2H3-鸟苷的合成。
因此，很明显，糖残基的每个位置都可以被选择性地标记。
开发了一种有用的立体定向氘化的替代方法来合成聚氘化糖。该方法在2H2O中使用氘代Raney镍催化剂在含羟基的碳(即含羟基的碳的亚甲基和次甲基质子)上用氘交换氢。
可以使用各种技术来合成完全氘化的脱氧核糖核苷和核糖核苷。因此，在一种方法中，通过氘化Raney镍-2H2O与糖的交换反应，制备了在2'、3'和4'位上特异性标记的许多氘代核苷。该方法由以下组成：通过Raney镍-2H2O交换反应在甲基β-D-吡喃***糖苷的2'、3'和4'位置进行氘化，然后通过氘代三丁基锡还原性消除‘2-羟基，得到甲基β-D-2',2',3',4'-2H4-2-脱氧吡喃核糖苷，其被转化为甲基β-D-2',2',3',4'-2H4-2'-脱氧呋喃核糖苷并进行糖基化，得到各种2',2',3',4'-2H4-核苷(>97原子％2H掺入H3'和H4')。
氘代酚的合成描述于例如Hoyer,H.(1950),Synthese des pan-Deutero-o-nitro-phenols.Chem.Ber.,83:131–136中。该化学物质可以适于制备具有氘标记的取代的酚。氘代酚及其取代的类似物可以用于例如制备氨基磷酸酯前药中的苯氧基。
氘代氨基酸的合成描述于例如Matthews等人Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects第497卷，第1期，1977年3月29日，第1–13页。这些技术和类似的技术可以用于制备氘代氨基酸，其可以用于制备本文所述的核苷的氨基磷酸酯前药。
用于合成本文所述化合物的氘代类似物的一种方法包括合成具有2'-氟，2'-氯取代的氘代呋喃核糖苷；并将核碱基连接到氘代呋喃核糖苷上以形成氘代核苷。可以通过修饰核苷上的5'-OH基团来形成前药，例如氨基磷酸酯前药。当使用氘代酚和/或氘代氨基酸时，可以制备氘代氨基磷酸酯前药。
另一种方法包括合成具有2'-氟，2'-氯取代的呋喃核糖苷并连接氘代核碱基以形成氘代核苷。该方法可以任选地使用氘代呋喃糖苷进行以提供额外的氘化。与上述方法一样，核苷可以转化为前药形式，该前药形式可以任选地包括额外的氘化。
第三种方法包括合成具有2'-氟，2'-氯取代的呋喃核糖苷，连接核碱基以形成核苷，并在氨基磷酸酯合成中使用一种或两种氘代氨基酸或酚类似物将该核苷转化为氨基磷酸酯前药。
因此，使用上述技术，可以在本文所述的核苷化合物的糖，碱基和/或前药部分中提供一个或多个氘原子。
具体实施例
按照以下实施例和反应顺序制备本发明代表性的具体化合物；通过实例说明提供了实施例和描述反应顺序的示意图，以帮助理解本发明，但不能将其解释为以任何方式限制随后的权利要求书中叙述的本发明。本发明化合物也可以用作随后的实施例中的中间体以产生本发明另外的化合物。没有必要试图对任何反应中获得的产率进行优化。本领域技术人员应知道如何通过反应时间、温度、溶剂和/试剂的常规改变来提高所述产率。
无水溶剂购自Aldrich Chemical Company公司(威斯康星州，密尔沃基市)和EMDChemicals公司(新泽西州，吉布斯敦市)。试剂购自商业来源。除非另外指出，否则在实施例中使用的材料得自易于获取的商业供应商，或者通过化学合成领域技术人员已知的标准方法合成。熔点(mp)是在电热数字熔点仪上测定，并且未校正。1H和13C NMR光谱用VarianUnity Plus 400光谱仪在室温下测定，且以距离内标四甲基硅烷的ppm低场报告。进行氘交换、去耦实验或2D-COSY以确定质子的归属。通过以下符号表示信号的多重度：s(单峰)，d(双重峰)，dd(两个双重峰)，t(三重峰)，q(四重峰)，br(宽峰)，bs(宽单峰)，m(多重峰)。所有J值都以Hz为单位。质谱是在Micromass Platform LC分光计上使用电喷雾技术测定的。元素分析通过Atlantic Microlab公司(佐治亚州，诺克罗斯市)进行。在Whatman LK6F硅胶板上进行分析TLC，且在Whatman PK5F硅胶板上进行制备TLC。柱色谱法在硅胶上或经由反相高效液相色谱法进行。
实施例1
核苷类似物9的制备
Figure BDA0001532248680000571
上面所示的与化合物1-5相关的技术可以用于制备本文所述的其它化合物，其包括与尿嘧啶不同的碱基。即，化合物5是本文所述的许多化合物的常见中间体。从化合物7和/或8开始，各种不同的前药可以连接到5'-OH位置。此外，可以制备化合物5的类似物，其在1'、3'、4'和5'位具有不同的官能度，并用作中间体以制备其他化合物。
实验
2-脱氧-2-溴-2-氟-3,5-二-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-D-核糖酸内酯(2、3)
在氮气氛下，向经火焰干燥的圆底烧瓶中加入1(5.6g，8.94mmol)和NBS(3.18g，17.9mmol)的45mL THF溶液。将该溶液冷却至-78℃，并逐滴加入1M LiHMDS的THF溶液(14.31mL，14.31mmol)。将反应混合物在-78℃下搅拌40分钟，然后用饱和NH4Cl溶液猝灭。使反应混合物升温至室温，并用乙酸乙酯(3×50mL)萃取水层。将合并的有机层用饱和NaHCO3、水和最后用盐水洗涤，用Na2CO3干燥，过滤并真空浓缩。粗产物的19F NMR显示大致1：1的非对映异构体混合物。通过使用0-1％EtOAc/己烷梯度的快速色谱法将粗产物纯化两次，得到2(1.82g，29％)和3(1.94g，31％)，呈白色泡沫状。
化合物2：1H NMR(CDCl3,400MHz):δ7.67-7.71(m,4H),7.36-7.54(m,16H),4.66(m,2H),3.67(m,2H),1.14(s,9H),0.96(s,9H)19F NMR(CD3OD,376MHz):-135.92。LR-MS：C21H26BrFN3O9P计算值705.81，实测702.2,704.4,706.2。
化合物3：1H NMR(CDCl3,400MHz):δ7.63-7.69(m,4H),7.32-7.50(m,16H),4.54(dd,J＝15.3,7.8Hz)4.24-4.26(m,1H),3.72(m,1H),3.47(dd,J＝12.7,3.47Hz)1.14(s,9H),0.87(s,9H)19F NMR(CDCl3,376MHz):-129.38(d,J＝14.45Hz)。
LR-MS：C37H42BrFO4Si2计算值705.81，实测702.2,704.4,706.2。
2-脱氧-2-溴-2-氟-3,5-二-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-D-呋喃核糖(4)
将化合物2(1.81g，2.57mmol)溶于THF(10mL)中并冷却至0℃。向该溶液中加入1MLiAl(OtBu)3H的THF溶液(5.14mL，5.14mmol)。使反应混合物升温至室温。两小时后，在0℃下用饱和NH4Cl淬灭反应。将反应混合物通过硅胶垫过滤并用乙酸乙酯洗涤。水层用乙酸乙酯(3×25mL)萃取，合并的有机层用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。溶液用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到粗产物4(1.63g，90％)，为异头物(anomeric)的混合物，其直接用于下一步。
19F NMR(CDCl3,376MHz):-131.4658(dd,J＝16.42,5.65Hz),-139.72.
1-甲磺酰基-2-脱氧-2-溴-2-氟-3,5-二-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-D-呋喃核糖(5)
将化合物4(1.6g，2.26mmol)溶于CH2Cl2(10mL)中并冷却至0℃。向该溶液中加入三乙胺(0.612mL，4.53mmol)，然后加入甲磺酰氯(0.263mmol，3.39mmol)。将反应搅拌1小时至室温。然后将反应混合物用CH2Cl2(100mL)稀释，用1N HCl，然后用5％NaHCO3和盐水洗涤。有机层用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到粗产物5(1.50g，85％)，呈粘性固体。该异头物的混合物直接用于下一步。
19F NMR(CDCl3,376MHz):-131.08(s),133.42(dd,J＝19.47,7.72Hz).
3,5-二-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2’-脱氧-2’-溴-2’-氟尿苷(6)
将尿嘧啶(0.187g，1.67mmol)和BSA(0.817mL，3.34mmol)的1,2-二氯乙烷(1mL)溶液在60℃下搅拌15分钟。将反应冷却至室温，加入化合物5(0.655g，0.835mmol)和TMSOTf(0.604mL，3.34mmol)。将反应容器在油浴中加热回流6小时。在0℃下通过加入5％NaHCO3水溶液(15mL)淬灭反应。水层用乙酸乙酯萃取，合并的有机层用饱和NaHCO3溶液、水和盐水洗涤。溶液用Na2SO4干燥，真空浓缩。通过快速色谱法(使用0-1％EtOAc/己烷梯度)纯化残余物，得到6(0.385g，57％)，作为2/1α/β混合物。
19F NMR(CDCl3,376MHz):-120.2470(t,J＝15Hz),138.31(t,J＝16Hz)；LR-MS：C41H46BrFN2O5Si2计算值801.90，实测802.6,825.4。
2’-脱氧-2’-溴-2’-氟尿苷(7，8)
向搅拌的化合物6(0.385g，0.48mmol)的THF(2.5mL)溶液中加入1M TBAF的THF溶液(0.962mL，0.962mmol)。将反应混合物搅拌1小时。减压蒸发溶剂，通过使用0-6％MeOH/CH2Cl2梯度的快速色谱法纯化残余物，得到7(β-异构体，28mg，18％)和8(α-异构体，60mg，38％)。
化合物7：1H NMR(CD3OD,400MHz):δ7.97(d,J＝8.2Hz,1H,H6),6.37(d,J＝16.2Hz,1H,H1’),5.77(d,J＝8.2,1H,H5),4.45(dd,J＝20.2,9.88Hz,1H,H3’),3.99(dd,J＝12.6,2.10Hz,1H,H5”),3.94(m,1H,H4’),3.81(dd,J＝12.7,2.6Hz)；19F NMR(CD3OD,376MHz):-122.58；LR-MS：C9H10BrFN2O5计算值325.09，实测327。
((((2R,3R,4S,5R)-4-溴-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-(2S)-丙酸异丙酯(9)
在氮气氛下，向搅拌的7(21mg，0.064mmol)和(2S)-2-((氯(苯氧基)磷酰基)氨基)-丙酸异丙酯(39mg，0.13mmol)的1mL无水THF溶液中，缓慢加入1-甲基咪唑(10μL，0.13.0mmol)。在0℃下搅拌2小时后，将反应搅拌2小时至室温。用异丙醇(0.2mL)淬灭反应。减压去除溶剂，通过使用0-6％MeOH/CH2Cl2的快速色谱法纯化残余物，得到8(17mg，45％)，为非对映体(Rp/Sp)混合物。
1H NMR(CD3OD,400MHz):δ7.58(2d融合,J＝8.2Hz,1H),7.39(m,2H),7.22-7.29(m,3H),6.35(2d融合,J＝16.9Hz,1H),5.66-5.73(2d,J＝8.2Hz,1H),4.96-5.01(m,1H),4.49-4.61(m,1H),4.36-4.46(m,2H),4.13-4.15(m,1H),3.88-3.97(m,1H),1.30-1.37(m,3H),1.24(m,6H)；19F NMR(CD3OD,376MHz):δ-122.08,-121.78；31P NMR(CD3OD,162MHz):δ3.63.3.54；LR-MS：C21H26BrFN3O9P计算值594.33，实测596.1。
Figure BDA0001532248680000611
根据Cen,Y.；Sauve,A.A.J.Org.Chem.2009,74,5779-5789中报道的方法合成(2R)-2-脱氧-2-溴-2-氟-3,5-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-D-核糖酸内酯(10)。
(2R)-2-脱氧-2-溴-2-氟-3,5-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-D-呋喃核糖(11)
在0℃下，将1M LiAl(OtBu)3H的THF(2.1mL，2.10mmol)溶液滴加到化合物10(650mg，1.42mmol)的THF(30mL)溶液中。将混合物升温至室温并搅拌1小时。在0℃下用饱和NH4Cl水溶液淬灭反应。用乙酸乙酯萃取混合物，用水洗涤两次，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到粗产物11(709mg)，为异头物的混合物，其直接用于下一步。
19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-121.45(dd,J＝11.8,6.4Hz),-128.60(d,J＝13.5Hz)。
(2R)-1-苯甲酰基-2-脱氧-2-溴-2-氟-3,5-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-D-呋喃核糖(12)
向化合物11(744mg，1.62mmol)的二氯甲烷(40mL)溶液中加入三乙胺(0.34mL，2.43mmol)。将反应冷却至0℃，滴加苯甲酰氯(0.23mL，1.94mmol)。在0℃下搅拌30分钟后，将混合物升温至室温并搅拌16小时。用甲醇(1mL)淬灭反应，依次用水和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过快速柱色谱法(己烷/乙酸乙酯20：1)纯化粗产物，得到化合物12(760mg，83％)。
19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-115.18(dd,J＝18.0,7.8Hz),-127.01(d,J＝13.2Hz)。
4-N-苯甲酰基-3’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧-2’-溴-2’-氟胞苷(13)
将化合物12(1.5g，2,67mmol)、4-N-苯甲酰基胞嘧啶(634mg，2.94mmol)和BSA(1.94mL，8.01mmol)的乙腈(10mL)溶液在室温下搅拌15分钟，然后加入TMSOTf(1.45mL，8.01mmol)。然后将反应容器放入微波反应器(CEM Discover)的空腔中，并在150℃下照射12分钟。在0℃下，通过加入5％NaHCO3水溶液淬灭反应。用乙酸乙酯萃取水层，合并的有机层用饱和NaHCO3溶液、水和盐水洗涤。溶液用Na2SO4干燥，真空浓缩。通过快速柱色谱法(己烷/乙酸乙酯2：1)纯化残余物，得到13α(300mg)和13β(200mg)。
化合物13α：1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)8.91(s,1H),7.94(d,J＝7.6Hz,2H),7.90(d,J＝7.6Hz,1H),7.70–7.47(m,4H),6.75(d,J＝8.0Hz,1H),4.65(dd,J＝13.5,7.2Hz,1H),4.25–4.18(m,1H),4.01–3.71(m,2H),2.78(s,1H),0.96(s,9H),0.21(s,3H),0.20(s,3H).19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-114.51(s)。
化合物13β：1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)8.24(d,J＝7.5Hz,1H),7.86(d,J＝7.5Hz,2H),7.60(ddd,J＝6.9,4.0,1.2Hz,1H),7.56–7.52(m,1H),7.48(dd,J＝10.5,4.8Hz,2H),6.72(d,J＝5.6Hz,1H),4.36(dd,J＝17.1,7.6Hz,1H),4.14–4.08(m,1H),3.95(dt,J＝4.9,2.2Hz,1H),3.84(dd,J＝12.4,2.8Hz,1H),0.94(s,9H),0.17(s,3H),0.15(s,3H).19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-121.28(dd,J＝12.0,7.8Hz)。LR-MS：C22H29BrFN3O5Si计算值542.48，实测542.1,544.1,576.0,578.0,1185.3,1187.3。
4-N-苯甲酰基-2’-脱氧-2’-溴-2’-氟胞苷(14)
向化合物13β(40mg，0.074mmol)的THF(8mL)溶液中加入Et3N.3HF(0.1mL，0.59mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌72小时。然后加入Et3N(0.1mL)以淬灭反应。在减压下去除挥发物之后，使用硅胶色谱法(CH2Cl2/MeOH95：5)纯化粗产物，得到化合物14(32mg，99％)。
1H NMR(CD3OD,400MHz)δ(ppm)8.56(d,J＝7.6Hz,1H),7.98(d,J＝6.8Hz,2H),7.67–7.53(m,4H),6.68(d,J＝5.6Hz,1H),4.28(dd,J＝16.8,7.6Hz,1H),4.01–3.93(m,2H),3.83(dd,J＝12,0,2.4Hz,1H)。19F NMR(CD3OD,376MHz)δ-123.50(d,J＝18.4Hz).LR-MS：C16H15BrFN3O5计算值428.21，实测428.0,430.0,857.0,859.0。
2’-脱氧-2’-溴-2’-氟胞苷(15)
向化合物14(32mg，0.074mmol)的MeOH(6mL)溶液中加入饱和NH3的MeOH溶液(2mL)。将反应混合物在25℃下搅拌12小时。在减压下去除溶剂后，使用硅胶色谱法(CH2Cl2/MeOH 3：1)纯化粗产物，得到核苷15(23mg，96％)。
1H NMR(CD3OD,400MHz)δ(ppm)7.96(dd,J＝7.6,1.8Hz,1H),6.60(d,J＝8.2Hz,1H),5.90(d,J＝7.6Hz,1H),4.20(dd,J＝17.6,7.2Hz,1H),3.96–3.89(m,1H),3.89–3.84(m,1H),3.78(dd,J＝12.4,3.3Hz,1H).19F NMR(CD3OD,376MHz)δ-123.82–-124.18(m).LR-MS：C9H11BrFN3O4计算值324.11，实测325.9,648.8。
3’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧-2’-溴-2’-氟胞苷(16)
向化合物13β(140mg，0.26mmol)的甲醇(24mL)溶液中加入饱和NH3的MeOH溶液(8mL)。在室温下3天后，将混合物真空浓缩，得到化合物16(103mg，90％)。粗物质不经进一步纯化即可以用于下一步。
1H NMR(CD3OD,400MHz)δ(ppm)8.00(dd,J＝7.6,1.4Hz,1H),6.63(d,J＝6.2Hz,1H),5.91(d,J＝7.6Hz,1H),4.36(dd,J＝17.1,7.4Hz,1H),3.98–3.90(m,1H),3.89–3.82(m,1H),3.73(dd,J＝12.5,2.9Hz,1H),0.98–0.95(m,9H),0.19(d,J＝2.9Hz,3H),0.18(s,3H).19F NMR(CD3OD,376MHz)δ-123.10(d,J＝11.1Hz).LR-MS：C15H25BrFN3O4Si计算值438.37，实测438.0,440.0,877.1,879.1。
3’,5’-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧-2’-溴-2’-氟胞苷(17)
将咪唑(18mg，0.26mmol)加入化合物16(26mg，0.086mmol)和TBDMSCl(26mg，0.17mmol)的混合物的二氯甲烷(4mL)溶液中。混合物在25℃下搅拌过夜，用水淬灭，粗品混合物用乙酸乙酯萃取。有机层用饱和NH4Cl水溶液洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过使用CH2Cl2/MeOH(10:1)的快速柱色谱法纯化粗产物，得到化合物17(27mg，83％)。
1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)7.75(dd,J＝7.5,1.0Hz,1H),6.69(d,J＝5.7Hz,1H),5.72(d,J＝7.5Hz,1H),4.23(dd,J＝16.8,7.5Hz,1H),3.97(dt,J＝11.6,2.6Hz,1H),3.83(dd,J＝7.5,2.3Hz,1H),3.78(dd,J＝11.7,2.2Hz,1H),0.93(s,9H),0.92(s,9H),0.16(s,3H),0.11(s,9H)。19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-121.70(dd,J＝16.9,4.6Hz)。13C NMR(CDCl3,101MHz)δ165.98(s),155.80(s),141.02(s),112.36(s),109.65(s),95.12(s),89.34(d,J＝19.0Hz),81.23(s),73.50(d,J＝25.3Hz),60.34(s),26.14(s),25.84(s),18.60(s),18.25(s),-4.12(s),-4.71(s),-5.19(s),-5.26(s)。
4-N-羧苄基-3’,5’-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧-2’-溴-2’-氟胞苷(18)
向化合物17(27mg，0.049mmol)和氯甲酸苄酯(21μL，0.15mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中加入DMAP(36mg，0.29mmol)。将反应在室温下搅拌1.5小时，用水淬灭，并用乙酸乙酯萃取。有机层用1N HCl、饱和NaHCO3、盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过快速色谱法(己烷/乙酸乙酯1:1)纯化粗产物，得到化合物18(25mg，74％)。
1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)8.18(d,J＝7.6Hz,1H),7.75(s,1H),7.37(brs,5H),7.22(d,J＝7.6Hz,1H),6.72(d,J＝4.5Hz,1H),5.22(brs,2H),4.26(dd,J＝16.6,7.8Hz,1H),4.02(d,J＝11.8Hz,1H),3.90(d,J＝7.7Hz,1H),3.81(dd,J＝11.8,1.9Hz,1H),0.96(s,9H),0.93(s,9H),0.16(s,3H),0.14(s,3H),0.13(s,3H),0.11(s,3H).19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-122.22(d,J＝16.6Hz)。
4-N-羧苄基-2’-脱氧-2’-溴-2’-氟胞苷(19)
向化合物18(25mg，0.036mmol)的THF(4mL)溶液中添加Et3N.3HF(0.06mL，0.36mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌36小时，然后加入Et3N(0.06mL)以猝灭反应。减压去除挥发物之后，使用硅胶色谱法(CH2Cl2/MeOH10:1)纯化粗产物，得到化合物19(11mg，67％)。
1H NMR(CD3OD,400MHz)δ(ppm)8.44(dd,J＝7.7,1.1Hz,1H),7.50–7.26(m,6H),6.64(d,J＝6.2Hz,1H),5.23(s,2H),4.25(dd,J＝17.2,7.6Hz,1H),3.98–3.91(m,2H),3.81(dd,J＝12.5,2.9Hz,1H).19F NMR(CD3OD,376MHz)δ-124.35(dd,J＝17.0,4.8Hz).LR-MS：C17H17BrFN3O6计算值458.24，实测458.0,460.0,917.0,919.0。
((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-(((苄氧基)羧基)氨基)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4-溴-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸异丙酯(20)
向化合物19(35mg，0.076mmol)的THF(3mL)溶液中加入NMI(30μL，0.38mmol)，然后加入(2S)-2-((氯(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯(70mg，0.23mmol)的THF(0.23mL)溶液。将混合物在室温下搅拌4小时，用水淬灭并用乙酸乙酯萃取。将有机层用水洗涤两次，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过快速色谱法(CH2Cl2/MeOH 20:1)纯化粗产物，得到化合物20(11mg，20％)。
1H NMR(CD3OD,400MHz)δ(ppm)8.00(ddd,J＝43.8,7.7,1.8Hz,1H),7.47–7.15(m,11H),6.65(dd,J＝9.0Hz,1H),5.24(s,2H),5.04–4.94(m,1H),4.59–4.35(m,2H),4.26–4.19(m,1H),4.16–4.12(m,1H),3.97–3.86(m,1H),1.38–1.31(m,3H),1.22(dd,J＝6.2,2.1Hz,6H).19F NMR(CD3OD,376MHz)δ-124.22–-124.67(m).31P NMR(CD3OD,162MHz)δ3.66(d,J＝13.5Hz).LR-MS：C29H33BrFN4O10P计算值727.48，实测729.1,730.4,1129.0。
((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4-溴-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸异丙酯(21)
向装有化合物20(23mg，0.032mmol)的乙醇(2mL)溶液的圆底烧瓶中加入1,4-环己二烯(0.1mL，0.70mmol)和Pd/C(10mg，0.01mmol)。在25℃下2小时后，将混合物在硅藻土垫上过滤，然后将滤液减压浓缩。通过快速柱色谱法(CH2Cl2/MeOH 10：1)纯化得到核苷酸21，产率55％(13mg)。
1H NMR(CD3OD,400MHz)δ(ppm)7.61(ddd,J＝28.8,7.6,2.3Hz,1H),7.40–7.34(m,2H),7.27–7.20(m,3H),6.61(dd,J＝11.2,8.4Hz,1H),5.86(dd,J＝12.0,7.6Hz,1H),5.04–4.95(m,1H),4.54–4.31(m,2H),4.19(ddd,J＝17.5,6.5,2.0Hz,1H),4.10(brs,1H),3.93–3.88(m,1H),1.37–1.31(m,3H),1.29(brs,2H),1.25–1.20(m,4H).19F NMR(CD3OD,376MHz)δ-124.36–-124.53(m).31P NMR(CD3OD,162MHz)δ3.57(d,J＝11.7Hz).LR-MS：计算C21H27BrFN4O8P593.34，实测595.1,597.0,1187.4。
实施例2
细胞毒性测定
如先前所述，在Vera、人PBM、CEM(人类淋巴母细胞)、MT-2和HepG2细胞中评估了化合物的毒性(参见Schinazi R.F.,Sommadossi J.-P.,Saalmann V.,Cannon D.L.,Xie M.-Y.,Hart G.C.,Smith G.A.&Hahn E.F.Antimicrob.Agents Chemother.1990,34,1061-67)。环己酰亚胺被包括在内作为阳性细胞毒性对照，且暴露于溶剂的未处理细胞被包括在内作为阴性对照。使用先前所述的半数有效方法从浓度-反应曲线获得细胞毒性IC50(参见Chou T.-C.&Talalay P.Adv.Enzyme Regul.1984,22,27-55；Belen’kii M.S.&SchinaziR.F.Antiviral Res.1994,25,1-11)。结果示于下表2中：
表2
细胞毒性，CC50,μM(％抑制)
Figure BDA0001532248680000671
实施例3
在HepG2细胞中的线粒体毒性测定：
i)化合物对细胞生长和乳酸产生的影响：对HepG2细胞生长的影响通过在0μM、0.1μM、1μM、10μM及100μM药物存在下孵育细胞来确定。将细胞(5×104个/孔)铺成在具有非必需氨基酸的最小必需培养基中的12孔细胞培养集群，所述最小必需培养基补充有10％胎牛血清、1％丙酮酸钠及1％青霉素/链霉素并且在37℃下孵育4天。孵育期结束时，使用血球计测定细胞数量。还由Pan-Zhou X-R,Cui L,Zhou X-J,Sommadossi J-P,Darley-Usmer VM."Differential effects of antiretroviral nucleoside analogs on mitochondrialfunction in HepG2cells,"Antimicrob.Agents Chemother.2000；44:496-503所教导。
为了测量化合物对乳酸产生的影响，来自储备培养物的HepG2细胞被稀释并以2.5×104个细胞/孔铺于12孔培养板中。可以添加各种浓度(0μM、0.1μM、1μM、10μM及100μM)的化合物，并将培养物在37℃下在湿润的5％CO2气氛中孵育4天。在第4天，测定每个孔中的细胞数量并收集培养基。将培养基过滤，并使用比色乳酸测定(Sigma-Aldrich)来测定培养基中的乳酸含量。因为乳酸产物可以被视为线粒体功能受损的标记物，所以在测试化合物存在下生长的细胞中检测到的乳酸产生的水平升高可以指示药物诱导的细胞毒性效应。
ii)化合物对线粒体DNA合成的影响：已开发了精确地定量线粒体DNA含量的实时PCR测定(参见Stuyver LJ,Lostia S,Adams M,Mathew JS,Pai BS,Grier J,Tharnish PM,Choi Y,Chong Y,Choo H,Chu CK,Otto MJ,Schinazi RF.Antiviral activities andcellular toxicities of modified 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrocytidineanalogs.Antimicrob.Agents Chemother.2002；46:3854-60)。此测定用于本申请中所述的所有研究，所述研究确定化合物对线粒体DNA含量的影响。在此测定中，低传代数的HepG2细胞以5,000个细胞/孔接种于涂布胶原的96孔板中。可以将测试化合物添加至培养基中以获得0μM、0.1μM、10μM及100μM的最终浓度。在培养第7天，细胞核酸可以通过使用可以商购获得的柱(RNeasy 96试剂盒；Qiagen)来制备。这些试剂盒共同纯化RNA和DNA，且因此将总核酸从柱上洗脱。线粒体细胞色素C氧化酶亚基II(COXII)基因及β-肌动蛋白或rRNA基因可以使用多重Q-PCR方案从5μL洗脱的核酸来扩增，其中合适的引物和探针用于目标和参考扩增两者。对于COXII，可以分别使用以下有义、探针及反义引物：5'-TGCCCGCCATCATCCTA-3',5'-四氯-6-羧基荧光素-TCCTCATCGCCCTCCCATCCC-TAMRA-3'及5'-CGTCTGTTATGTAAAGGATGCGT-3'。对于β-肌动蛋白基因(GenBank登录号E01094)的外显子3，有义、探针及反义引物分别是5'-GCGCGGCTACAGCTTCA-3',5'-6-FAMCACCACGGCCGAGCGGGATAMRA-3'及5'-TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。rRNA基因的引物和探针可以从Applied Biosystems商购获得。因为相等的扩增效率可以对于所有基因获得，所以比较CT方法可以用于研究线粒体DNA合成的潜在抑制。比较CT方法使用以下算术公式，其中目标(COXII基因)的量相对内源参照物(β-肌动蛋白或rRNA基因)的量进行归一化并且与校准器(在第7天时是没有药物的对照)有关。用于此方法的算术公式由2-ΔΔCT给出，其中ΔΔCT是(平均目标测试样品的CT-目标对照的CT)-(平均参考测试的CT-参考对照的CT)(参见Johnson MR,K Wang,JB Smith,MJ Heslin,RB Diasio.Quantitation ofdihydropyrimidine dehydrogenase expression by real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction.Anal.Biochem.2000；278:175-184)。在药物存在下生长的细胞中的线粒体DNA含量的下降指示线粒体毒性。
在HepG2细胞(14天测定)中评估了化合物7和9对线粒体和核DNA水平以及乳酸产生的影响，数据列于下表3中：
表3
Figure BDA0001532248680000691
1索非布韦数据在一个单独的实验中生成
数据显示，如本文所述，化合物7和9高达10μM时无毒性，且比索非布韦的毒性低。
实施例4
线粒体毒性-Glu/Gal
方案概要
将HepG2细胞铺在96或384孔组织培养聚苯乙烯板上。24小时后，向细胞中加入一系列浓度的测试化合物，并在补充有半乳糖或葡萄糖的培养基中孵育72小时。如果在含有半乳糖的培养基中生长的细胞比在含有葡萄糖的培养基中生长的细胞对测试化合物更敏感，则认为测试化合物引起线粒体毒性。
目的：测定在含有半乳糖或葡萄糖的培养基中生长的HepG2细胞对测试化合物的灵敏度。
实验步骤
将HepG2人肝细胞癌细胞铺在96或384孔组织培养聚苯乙烯平板上，所述平板含有补充有10％胎牛血清和抗生素且含有半乳糖或葡萄糖的培养基，并孵育过夜。向细胞中加入递增浓度的测试化合物(最终DMSO浓度为0.5％；对于8点剂量反应曲线，典型的最终测试化合物浓度为100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03μM；每个浓度n＝3次重复)，并将细胞孵育72小时。同时使用适当的对照作为质量控制。使用Hoechst染色和HCS读数器进行细胞计数来测定细胞活力。
数据分析
空白对照孔用于确定显着性限制。如果观察到清晰的剂量-反应关系，则确定AC50值。
核苷前药9对HepG2细胞中细胞计数的影响以及线粒体毒性Glu/Gal(3天测定)的结果示于下图3a-b中。
图3c-e示出了单磷非对映异构体23和22的Glu/Gal线粒体毒性数据。这些化合物的结构如下所示：
Figure BDA0001532248680000701
Figure BDA0001532248680000711
实施例5
在Neuro2A细胞中的线粒体毒性测定
为了估计本发明的化合物产生神经元毒性的可能性，小鼠Neuro2A细胞(美国典型培养物保藏中心131)用作模型***(参见Ray AS,Hernandez-Santiago BI,Mathew JS,Murakami E,Bozeman C,Xie MY,Dutschman GE,Gullen E,Yang Z,Hurwitz S,Cheng YC,Chu CK,McClure H,Schinazi RF,Anderson KS.Mechanism of anti-humanimmunodeficiency virus activity of beta-D-6-cyclopropylamino-2',3'-didehydro-2',3'-dideoxyguanosine.Antimicrob.Agents Chemother.2005,49,1994-2001)。抑制50％细胞生长所必需的浓度(CC50)可以使用基于3-(4,5-二甲基-噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物染料的测定如所述来测量。细胞乳酸和线粒体DNA水平在限定的药物浓度下的扰动可以如上所述进行。ddC和AZT可以用作对照核苷类似物。
实施例6
骨髓细胞毒性的测定
原代人骨髓单核细胞从Cambrex Bioscience(马里兰州，沃克斯维尔市)商购获得。CFU-GM测定在50单位/mL人重组粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子存在下使用双层软琼脂进行，而BFU-E测定使用含有1单位/mL***的乙基纤维素基质(参见SommadossiJP,Carlisle R.Toxicity of3’-azido-3’-deoxythymidine and 9-(1,3-dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine for normal human hepatopoietic progenitor cells invitro.Antimicrob.Agents Chemother.1987；31:452-454；Sommadossi,JP,Schinazi,RF,Chu,CK,and Xie,MY.Comparison of cytotoxicity of the(-)and(+)enantiomer of2’,3’-dideoxy-3’-thiacytidine in normal human bone marrow progenitorcells.Biochem.Pharmacol.1992；44:1921-1925)。每个实验都在来自三个不同供体的细胞中一式两份进行。AZT用作阳性对照。细胞在化合物存在下在37℃和5％CO2下孵育14-18天，并且大于50个细胞的集落使用倒置显微镜计数以测定IC50。50％抑制浓度(IC50)可以通过药物浓度的对数对BFU-E存活分数的最小二乘线性回归分析来获得。统计分析可以用Student's t检验针对独立的非成对样品进行。化合物7和9的骨髓细胞毒性结果示于表4。
表4
Figure BDA0001532248680000721
实施例7
HCV复制子测定1
将含有HCV复制子RNA的Huh 7Clone B细胞以5000个细胞/孔接种于96孔板中，并且在接种之后立即一式三份在10μΜ下测试化合物。五天孵育(37℃，5％CO2)之后，通过使用来自Gentra的versaGene RNA纯化试剂盒分离总细胞RNA。在单步多重实时RT-PCR测定中扩增复制子RNA和内部对照(TaqMan rRNA对照试剂，Applied Biosystems)。化合物的抗病毒有效性通过无药对照(ΔCt HCV)的阈值RT-PCR循环减去测试化合物的阈值RT-PCR循环来计算。3.3的ΔCt等于复制子RNA水平的1-log减少(等于减少90％的起始物料)。化合物的细胞毒性还通过使用ΔCt rRNA值来计算。(2'-C-Me-C)被用作阳性对照。为了测定EC90和IC50值2，首先将ΔCt:值转化为起始物料的分数3，然后用于计算％抑制。
参考文献：
1.Stuyver L et al.,Ribonucleoside analogue that blocks replication orbovine viral diarrhea and hepatitis C viruses in culture.Antimicrob.AgentsChemother.2003,47,244-254.
2.Reed IJ&Muench H,A simple method or estimating fifty percentendpoints.Am.J.Hyg.27:497,1938.
3.Applied Biosystems Handbook
化合物7、9、15、21、22和23对HCV 1b的半数有效浓度(EC50)范围示于表5中。
表5
Figure BDA0001532248680000731
A＝>10μM
B＝1-10μM
C＝0.1-1μM
D＝<0.1μM
化合物7、9、15和21-23的结构示于本文其他地方。
实施例8
使用CellTiter GLO的14天测定的HepaRG细胞(非增殖性肝细胞)中的IC50
HepaRG细胞在加药前一周铺板，以使细胞重新获得其最大的代谢活性和结构。向HepaRG细胞中加入递增浓度的测试化合物(最终DMSO浓度＝0.5％)；对于八点剂量反应曲线(每个浓度n＝3次重复)，最终测试化合物浓度为100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03μM，并且微组织以4次重复剂量孵育14天。同时使用适当的对照作为质量控制。在加药期后，去除培养基，使用CellTiter-
Figure BDA0001532248680000742
试剂测定细胞活力。随后将测试样品转移到白色测定板的指定孔中，并使用发光计测定发光。
数据分析
如果观察到清晰的剂量-反应关系，则也确定IC50值。
化合物22和23的结果列于表6和图4a和4b中。
表6
Figure BDA0001532248680000741
实施例9
NS5B酶测定
21-氨基酸C-末端截短的HCV NS5B RNA聚合酶可以从HCV复制子细胞克隆，用6-His-末端尾修饰，在原核表达载体(pQE60；Qiagen)中表达，随后在Talon钴亲和树脂柱(加利福尼亚州，帕洛阿尔托市Clontech)上纯化。1可以通过SDS-PAGE和Western印迹监测纯化。所得的纯化的蛋白质可以用50mM磷酸钠(pH 8.0)—300mM氯化钠—0.5％Triton X-100—50％甘油—2mM二硫苏糖醇透析过夜。当储存在-20℃时，透析液保持活性不变超过6个月。通过使用来自同一供应商的牛血清白蛋白标准品，可以用Coomassie Plus蛋白测定试剂(Pierce)定量蛋白质。
可以通过使用负IRES作为模板，监测32P标记的UMP掺入新合成的RNA链中来研究NS5B RNA聚合酶反应。稳态反应可以在50mM HEPES缓冲液(pH7.5)中含有2.8mg负IRES RNA模板，140单位抗核糖核酸酶(Ambion)，1.4mg NS5B，适量的[α-32P]UTP，各种浓度的天然和修饰的核苷酸，1mM MgCl2，0.75mM MnCl2和2mM二硫苏糖醇的140mL总体积中进行。核苷酸浓度可以根据抑制剂而变化。反应温度通常为约27℃。在所需时间，可以取20mL等分试样，通过将反应混合物与80mL含有12.5mM EDTA，2.25M NaCl和225mM柠檬酸钠的终止液混合来淬灭反应。为了确定天然核苷酸TP(NTP)底物的稳态参数，可以改变一种NTP浓度，并且可以将其他三种NTP的浓度固定在饱和浓度。为了确定A类似物的Ki，UTP、GTP和CTP的浓度可以分别固定为10、100和100mM，并且可以改变ATP和A类似物的浓度。通过使猝灭的反应混合物通过使用斑点印迹装置穿过Hybond N+膜(Amersham Biosciences)，可以将放射性RNA产物与未反应的底物分离。RNA产物可以保留在膜上，并且游离核苷酸可以被洗掉。膜可以用含有0.6M NaCl和60mM柠檬酸钠的溶液洗涤例如四次。在用水冲洗膜然后用乙醇冲洗后，可以切掉斑点并在Packard液体闪烁计数器中计数放射性。产物的量可以基于反应混合物中的总放射性计算。反应速率可以从产物形成的时间进程的斜率确定。为了测定抑制常数(Ki)，可以用不同浓度的底物和抑制剂确定反应速率，并拟合成竞争抑制方程：ν＝(Vmax·[s])/{Km·(1+[I]/Ki)+[S]}，其中ν是观察的速率，[S]是底物浓度，[I]是抑制剂浓度，Vmax是最大速率。Km是Michaelis常数，且Ki是抑制常数。
使用上面概述的方案，制备化合物、2'-甲基尿嘧啶(urindine)和2'-氟,2'-甲基尿苷的活性三磷酸酯并筛选。化合物、2'-甲基尿嘧啶和2'-氟,2'-甲基尿苷的活性三磷酸酯的比较结果示于表7中。
参考文献：
Stuyver LJ,Whitaker T,McBrayer TR,Hernandez-Santiago BI,Lostia S,Tharnish PM,Ramesh M,Chu CK,Jordan R,Shi J,Rachakonda S,Watanabe KA,Otto MJ,Schinazi RF.Ribonucleoside Analogue That Blocks Replication of Bovine ViralDiarrhea and Hepatitis C Viruses in Culture Antimicrob.Agents Chemother.2003,47,244.
表7
Figure BDA0001532248680000761
a体外EC50值是2至3个重复的平均±SD。
b2’-Me-2’-F-UTP是紫非布韦的活性代谢物。
实施例10
体外人类线粒体RNA聚合酶(POLRMT)测定
如先前所述(Arnold等人，2012)，使用POLRMT(INDIGO Biosciences)进行了体外RNA核苷酸掺入测定。简而言之，将32P-放射性标记的RNA引物(5'-UUUUGCCGCGCC)与3摩尔过量的适当的DNA模板(5'-GGGAATGCANGGCGCGGC，其中N位被A、T或C置换)杂交。将125nM的POLRMT与500nM的5'-放射性标记的RNA/DNA杂合体、10mM MgCl2和100μM相应的核苷三磷酸一起孵育。对于非核苷类似物，100μM的抑制剂与100μM的UTP同时加入。掺入在30℃进行2小时，通过加入10mM EDTA和甲酰胺使反应停止。样品在20％变性聚丙烯酰胺凝胶上可视化。通过将每种核苷三磷酸类似物的产物级分标准化为相应的天然核苷三磷酸的级分来分析数据。
我们测试了7的核苷三磷酸类似物是否是人线粒体RNA聚合酶(POLRMT)的底物。将100μM的每种rNTP与POLRMT酶一起孵育，并在2小时时评估适当的DNA/RNA引物/模板杂合体和掺入。将核苷三磷酸类似物掺入标准化为天然rNTP底物的掺入。如图5所示，与天然UTP相比7-TP掺入了7.4％。该值与索非布韦(3.1％)和2'-C-Me-UTP(9.8％)的活性代谢物相当。
实施例11
RNA合成和链终止
i)HCV NS5B的表达和纯化：***表达载体pET-22(Novagen)中的HCV NS5B序列在大肠杆菌BL21(DE3)中表达为C末端截短的酶(Δ21)，并利用金属离子亲和色谱(来自Clonetech的Talon试剂盒)纯化。通过测序(Sequetech)确认序列。
ii)标准反应条件：反应混合物由在含有40mM HEPES，pH 8，10mM NaCl，1mM二硫苏糖醇和0.2mM MnCl2的缓冲液中的1μM RNA模板(RNA20)，1.5μM HCV NS5B和0.25μM放射性标记的引物(P16)组成。此外，反应含有10μM GTP-UTP和3μM测试类似物-TP。30分钟后可停止反应，产物用异丙醇沉淀，在95℃热变性5分钟，并在12％聚丙烯酰胺，7M尿素凝胶上分离。对于用模板/引物掺入的核苷酸类似物的单个位点，可以确定抑制50％全长产物形成所需的链终止子的浓度(EC50)。
iii)数据采集和分析：用磷光成像仪(FLA-7000，Fujifilm)扫描和分析凝胶，并计算EC50值。
实施例12
核苷酸类似物对线粒体DNA聚合酶γ的DNA聚合酶和核酸外切酶活性的影响
i)人聚合酶γ的纯化：聚合酶γ的重组大和小亚基可以如先前所述进行纯化(参见Graves SW,Johnson AA,Johnson KA.Expression,purification,and initial kineticcharacterization of the large subunit of the human mitochondrial DNApolymerase.Biochemistry.1998,37,6050-8；Johnson AA,Tsai Y,Graves SW,JohnsonKA.Human mitochondrial DNA polymerase holoenzyme:reconstitution andcharacterization.Biochemistry 2000；39:1702-8)。可以在280nm下用分光光度法来测定蛋白质浓度，对于聚合酶γ的大和小亚基，消光系数分别是234,420和71,894M-1cm-1。
ii)核苷酸掺入的动力学分析：可以进行预稳态动力学分析以测定核苷-TP及天然dNTP底物的DNA聚合酶γ的掺入的催化效率(k/K)。这允许确定此酶掺入修饰的类似物和预测毒性的相对能力。核苷酸类似物通过DNA聚合酶γ掺入的预稳态动力学分析可以基本上如先前所述进行(参见Murakami E,Ray AS,Schinazi RF,Anderson KS.Investigatingthe effects of stereochemistry on incorporation and removal of 5-fluorocytidine analogs by mitochondrial DNA polymerase gamma:comparison of D-and L-D4FC-TP.Antiviral Res.2004,62,57-64；Feng JY,Murakami E,Zorca SM,JohnsonAA,Johnson KA,Schinazi RF,Furman PA,Anderson KS.Relationship betweenantiviral activity and host toxicity:comparison of the incorporationefficiencies of2',3'-dideoxy-5-fluoro-3'-thiacytidine-triphosphate analogs byhuman immunodeficiency virus type 1reverse transcriptase and humanmitochondrial DNA polymerase.Antimicrob Agents Chemother.2004,48,1300-6)。简言之，可以将聚合酶γ的大(250nM)和小(1.25mM)亚基和60nM DNA模板/引物在50mM Tris-HCl、100mM NaCl，pH 7.8中的预孵育混合物添加至含有MgCl2(2.5mM)及各种浓度的核苷酸类似物的溶液中。可以如先前所述对反应进行淬灭并且分析。数据可拟合至如上所述的相同方程式。
iii)人聚合酶γ3'5'核酸外切酶活性的测定：人聚合酶γ核酸外切酶活性可以通过在不存在dNTP的情况下测量分解产物的形成率来研究。反应可以通过添加MgCl2(2.5mM)至聚合酶γ大亚基(40nM)、小亚基(270nM)及1,500nM链终止模板/引物在50mM Tris-HCl、100mM NaCl，pH 7.8中的预孵育混合物中开始，并且在指定的时点用0.3M EDTA淬灭。所有反应混合物都可以在20％变性聚丙烯酰胺测序凝胶(8M尿素)上分析，在Bio-Rad GS-525分子图像***上成像，并且用Molecular Analyst(Bio-Rad)定量。对由早期时点形成的产物以时间函数进行绘图。数据可以通过线性回归与Sigma Plot(Jandel Scientific)拟合。可以将线的斜率除以反应中的活性酶浓度以计算核酸外切酶活性的kexo(参见Murakami E,Ray AS,Schinazi RF,Anderson KS.Investigating the effects of stereochemistryon incorporation and removal of 5-fluorocytidine analogs by mitochondrial DNApolymerase gamma:comparison of D-and L-D4FC-TP.Antiviral Res.2004；62:57-64；Feng JY,Murakami E,Zorca SM,Johnson AA,Johnson KA,Schinazi RF,Furman PA,Anderson KS.Relationship between antiviral activity and host toxicity:comparison of the incorporation efficiencies of2',3'-dideoxy-5-fluoro-3'-thiacytidine-triphosphate analogs by human immunodeficiency virus type1reverse transcriptase and human mitochondrial DNA polymerase.AntimicrobAgents Chemother.2004；48:1300-6)。
实施例13
核苷类似物三磷酸酯的合成
可以使用Ludwig和Eckstein的方法从相应的核苷来合成核苷类似物三磷酸酯。(Ludwig J,Eckstein F.“Rapid and efficient synthesis of nucleoside5'-O-(1-thiotriphosphates),5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one”J.Org.Chem.1989,54 631-5)。可以例如通过FPLC使用HiLoad 26/10Q Sepharose Fast Flow Pharmacia柱和TEAB缓冲液(pH 7.0)的梯度来纯化粗核苷类似物三磷酸酯。产物将通过UV光谱学、质子NMR、磷NMR、质谱学和/或HPLC中的一种或多种来表征。
所得的三磷酸酯可以用作如上所述的细胞药理学测定以及利用HCV和人Pol的动力学研究的对照。
实施例14
通过NTP's抑制人DNA聚合酶
研究目标
确定三磷酸核苷类似物是否抑制人DNA聚合酶Alpha、Beta和Gamma，并计算IC50值。
材料和方法
人DNA聚合酶α—酶购自Chimerx(cat#1075)，并根据他们的推荐进行了一些修改来分析。用无机焦磷酸酶(Sigma)处理2'-Me-UTP以去除任何焦磷酸盐污染物。将终浓度为500μM的2'-Me-UTP与1mM DTT、50mM Tris、50mM NaCl、6mM MgCl2和1单位的焦磷酸酶在37℃下孵育1小时，然后在95℃下灭活10分钟。将0.05单位的人DNA聚合酶α和退火至48nt DNA模板(5'-CAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAG C)的5'端放射性标记的24nt DNA引物(5'-TCAGGTCCCTGTTCGGGCGCCACT)的混合物与在60mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM乙酸镁，0.3mg/ml牛血清白蛋白，1mM二硫苏糖醇，0.1mM精胺，0.05mM各dCTP、dGTP、dTTP、dATP中的浓度递增(从0至100μM)的化合物混合，终反应体积为20μL，在37℃下5分钟(所有浓度代表混合后的最终浓度)。通过与0.3M(最终)EDTA混合使反应终止。产物在20％聚丙烯酰胺凝胶上分离并在Bio-Rad Molecular Imager FX上定量。将实验结果拟合至剂量反应方程式(y min+(y max)-(y min)))/(1+(化合物浓度)/IC50)^斜率)，以使用GraphpadPrism或SynergySoftware Kaleidagraph确定IC50值。将数据标准化至对照。
人DNA聚合酶β—酶购自Chimerx(cat#1077)，并根据他们的推荐进行了一些修改来分析。将0.1单位的人DNA聚合酶β和退火至48nt DNA模板(5'-CAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAG C)的5'端放射性标记的24nt DNA引物(5'-TCAGGTCCCTGTTCGGGCGCCACT)的混合物与在50mM Tris-HCl(pH8.7)，10mM KCl，10mMMgCl2，0.4mg/ml牛血清白蛋白，1mM二硫苏糖醇，15％(v/v)甘油，和0.05mM各dCTP、dGTP、dTTP、dATP中的浓度递增(从0至100μM)的化合物混合，终反应体积为20μl，在37℃下5分钟(所有浓度代表混合后的最终浓度)。通过与0.3M(最终)EDTA混合使反应终止。产物在20％聚丙烯酰胺凝胶上分离并在Bio-Rad Molecular Imager FX上定量。将实验结果拟合至剂量反应方程式(y min+(y max)-(y min)))/(1+(化合物浓度)/IC50)^斜率)，以使用Graphpad Prism或SynergySoftware Kaleidagraph确定IC50值。将数据标准化至对照。
人DNA聚合酶γ—酶购自Chimerx(cat#1076)，并根据他们的推荐进行了一些修改来分析。将0.625单位的人DNA聚合酶γ和退火至36nt DNA模板(5'-TCTCTAGAAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGC)的5'端放射性标记的24nt DNA引物(5'-TCAGGTCCCTGTTCGGGCGCCACT)的混合物与在50mM Tris-HCl(pH 7.8)，100mM NaCl，5mM MgCl2，和0.05mM各dCTP、dGTP、dTTP、dATP中的浓度递增(从0至100μM)的化合物混合，终反应体积为20μl，在37℃下200分钟(所有浓度代表混合后的最终浓度)。通过与0.3M(最终)EDTA混合使反应终止。产物在20％聚丙烯酰胺凝胶上分离并在Bio-Rad Molecular Imager FX上定量。将实验结果拟合至剂量反应方程式(y min+(y max)-(y min)))/(1+(化合物浓度)/IC50)^斜率)，以使用Graphpad Prism或SynergySoftware Kaleidograph确定IC50值。将数据标准化至对照。
结果
针对人DNA聚合酶α、β和γ测试了7-TP以测定IC50值。发现7-TP对于人DNA聚合酶α、β和γ的IC50’>100μM。
实施例15
HepG2细胞中的细胞药理学
HepG2细胞可以从美国典型培养物保藏中心(马里兰州，罗克维尔市)处获得，并且在225cm2组织培养烧瓶中，在补充有非必需氨基酸、1％青霉素-链霉素的最低必需培养基中生长。培养基可以每三天更新一次，并且细胞可以每周传代一次进行培养。在以暴露于30mL胰蛋白酶-EDTA 10分钟分离贴壁单层且用培养基连续洗涤三次之后，汇合的HepG2细胞可以2.5×106个细胞/孔的密度接种于6孔板中并且暴露于10μΜ[3H]标记的活性化合物(500dpm/pmol)达规定的时间段。
细胞被维持在37℃和5％CO2气氛下。在选定的时间点，将细胞用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次。
细胞内活性化合物及其各自的代谢物是通过在-20℃下用60％甲醇孵育细胞沉淀过夜，然后在冰浴中用另外20pal的冷甲醇萃取1小时来提取。然后将提取物合并，在轻柔过滤的空气流下干燥并储存于-20℃直到HPLC分析。
实施例16
Huh7细胞中的细胞药理学
与HepG2细胞药理学概述的方法类似，将化合物在Huh-7细胞中以50μM的浓度一式三份孵育4小时。3TC用作阳性对照并一式两份进行，同时将DMSO(10μL)作为空白对照以一式两份孵育。使用冰冷的70％甲醇作为提取溶剂。ddATP(10nM)用作内标。
化合物9相对于索非布韦(SOF)在Huh-7细胞中的三磷酸酯产生示于图1和下表8中。
表8
Figure BDA0001532248680000831
*7在LC-MS的正和负模式中均显示出非常差的信号(LLOQ是大约200pmol/millon细胞)
实施例17
PBM细胞中的细胞药理学
将测试化合物在PBM细胞中以50μM在37℃下孵育4小时。然后去除含有药物的培养基，用PBS洗涤PBM细胞两次以去除细胞外药物。使用1mL 70％冰冷的甲醇(含有10nM内标ddATP)从10×106个PBM细胞提取细胞内药物。沉淀后，将样品在室温下保持15分钟，随后涡旋30秒，然后在-20℃下储存12小时。然后将上清液蒸发至干。干样品可储存在-20℃下，直到LC-MS/MS分析。在分析前，将每个样品在100μL流动相A中重构，并在20,000g下离心以去除不溶性颗粒。
梯度分离在Hypersil GOLD柱(100×1.0mm，3μm粒度；美国，马萨诸塞州，沃尔瑟姆市Thermo Scientific)上进行。流动相A由2mM磷酸铵和3mM己胺组成。乙腈在15分钟内从10％增加至80％，并在80％保持3分钟。10％乙腈下的平衡持续15分钟。
总运行时间为33分钟。将流速保持在50μL/min，并使用10μL注射。自动进样器和柱室通常分别保持在4.5和30℃。
第一个3.5分钟的分析被转移至废物。质谱仪在正电离模式下以3.2kV的喷雾电压操作。
实施例18
西尼罗病毒药物灵敏度测定也可以如先前在以下文献中所述来进行：Song,G.Y.,Paul,V.,Choo,H.,Morrey,J.,Sidwell,R.W.,Schinazi,R.F.,Chu,C.K.Enantiomericsynthesis of D-and L-cyclopentenyl nucleosides and their antiviral activityagainst HIV and West Nile virus.J.Med.Chem.2001,44,3985-3993。
实施例19
黄热病药物灵敏度测定也可以如先前在以下文献中所述来进行：Julander,J.G.,Furuta,Y.,Shafer,K.,Sidwell,R.W.Activity of T-1106in a Hamster Model ofYellow Fever Virus Infection.Antimicrob.Agents Chemother.2007,51,1962-1966。
实施例20
Mondotte等人的The essential role of a particular viral protein(Denguevirus envelope protein(E))in viral propogation.J.Virol.2007年7月,第81卷第13期，7136-7148公开了可以用于鉴定用于治疗由登革热病毒引起的感染的化合物的测定，并且该测定可以用于鉴定本文所述的对登革热有活性的那些化合物。
另一种测定法描述于Levin,14th International Symposium on Hepatitis CVirus&Related Viruses,Glasgow,UK,9-13 2007年9月中。该测定涉及人和登革热病毒聚合酶，其中推定的化合物可以针对酶测试，优选一式两份，在一定浓度范围内，例如从0.8mM至100mM。化合物也可以与对照(无抑制剂)，溶剂稀释(0.016％至2％DMSO)和参考抑制剂一起进行。
用于登革热的合适的高通量测定描述于Lim等人，Antiviral Research,第80卷，第3期，2008年12月，360–369页中。登革热病毒(DENV)NS5在其N末端氨基酸序列处具有甲基转移酶(MTase)活性并且使得在病毒基因组RNA中形成1型帽结构m7GpppAm2'-O。对于DENV22'-O-MTase活性的最佳体外条件可以使用纯化重组蛋白及短的生物素化GTP-带帽RNA模板来表征。衍生自初始速度的稳态动力学参数可以用于确立针对化合物测试的稳固的闪烁亲近测定。通过Lim等人，Antiviral Research，第80卷，第3期，2008年12月，第360-369页的预孵育研究显示MTase-AdoMet和MTase-RNA复合物具有同样的催化能力并且所述酶支持随机的bi动力学机制。Lim用竞争性抑制剂S-腺苷-同型半胱氨酸及两个同系物西萘芬净和脱氢西萘芬净验证了测定。存在于DENV2MTase的N末端处的GTP-结合袋先前被假定为帽结合位点。此测定允许快速且高灵敏度的检测2'-O-MTase活性并且可以容易地适于抑制性化合物的高通量筛选。
实施例21
抗诺瓦克病毒(Norovirus)活性
化合物可以通过抑制诺瓦克病毒聚合酶和/或解旋酶，通过抑制在复制周期中所需的其它酶或通过其它途径展现抗诺瓦克病毒活性。
目前没有被批准用于诺瓦克病毒感染的药物治疗(http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/revb/gastro/norovirus-qa.htm)，并且这大概至少部分是由于缺乏细胞培养***的可用性。近来，已经开发用于原始的诺瓦克G-I菌株的复制子***(Chang,K.O.等人(2006)Virology 353:463-473)。
诺瓦克病毒复制子和丙型肝炎复制子都需要病毒解旋酶、蛋白酶和聚合酶的作用以便进行复制子的复制。最近，已经报道利用诺瓦克病毒基因组I和II接种体的体外细胞培养传染性测定(Straub,T.M.等人(2007)Emerg.Infect.Dis.13(3):396-403)。此测定利用在微载体珠上的小肠上皮细胞在旋转壁式生物反应器中进行。传染性测定可以用于筛选进入抑制剂。
实施例22
诺瓦克病毒感染的诊断
可以通过使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定检测受影响的人的粪便中的病毒RNA来诊断诺瓦克病毒感染。可以从症状开始之后48至72小时内采集的粪便样本中鉴定病毒，但也可以使用RT-PCR对症状开始之后长达7天采集的样品获得令人满意的结果。其它诊断方法包括电子显微镜和血清学测定：至少相隔三周收集的双份血清中的滴度有升高。还可以利用可商购的酶联免疫测定法，但它们倾向于具有相对较低的灵敏度，这限制了其对爆发的病因学诊断的使用。经常使用诺瓦克病毒感染的临床诊断，特别是当肠胃炎的其它病原体已被排除时。
实施例23
抗基孔肯亚(Chikungunya)活性
抗基孔肯亚活性可以如“Anti-Chikungunya Viral Activities ofAplysiatoxin-Related Compounds from the Marine Cyanobacterium Trichodesmiumerythraeum”Gupta,D.K.；Kaur,P.；Leong,S.T.；Tan,L.T.；Prinsep,M.R.；Chu,J J.H.MarDrugs.Jan 2014；12(1):115–127；10.3390/md12010115以及其中引用的参考文献所概述地进行评价。
实施例24
抗癌测定
抗癌测定可以在以下参考文献和其中引用的那些参考文献中找到：
“Handbook of Anticancer Drug Development”Lippincott Williams&Wilkins,by Daniel R.Budman,Alan Hilary Calvert,Eric Keith Rowinsky,2003(400页)
“Apoptosis assays for quantifying the bioactivity of anticancer drugproducts”Joslyn K.Brunelle,Baolin Zhang Drug Resistance Updates,13(6)2010,第172–179页。
实施例25
抗RSV活性
抗RSV活性可以如下面的参考文献中所概述的进行评价：
“Polyadenylation-dependent screening assay for respiratory syncytialvirus RNA transcriptase activity and identification of an inhibitor”StephenW.Mason,Carol Lawetz,Yvon Gaudette,Florence
Figure BDA0001532248680000871
Erika Scouten,Lisette Lagacé,Bruno Simoneau1Michel Liuzzi.Nucl.Acids Res.(2004)32(16):4758-4767；doi:10.1093/nar/gkh809.
“Screening and evaluation of anti-respiratory syncytial viruscompounds in cultured cells”Lundin A1,
Figure BDA0001532248680000872
T,Trybala E.Methods MolBiol.2013；1030:345-63.doi:10.1007/978-1-62703-484-5_27.
“A fluorescence-based high-throughput antiviral compound screeningassay against respiratory syncytial virus”Kwanten L1,De Clerck B,RoymansD.Methods Mol Biol.2013；1030:337-44.doi:10.1007/978-1-62703-484-5_26。
实施例26
抗流感活性
抗流感活性可以如下文参考文献中所概述的进行评价：Schmidtke et al.,“Arapid assay for evaluation of antiviral activity against coxsackie virus B3,influenza virus A,and herpes simplex virus type 1,”J Virol Methods.2001Jun；95(1-2):133-43。
Ching-Yao Su,"High-throughput identification of compounds targetinginfluenza RNA-dependent RNA polymerase activity,”PNAS,vol.107no.45,19151–19156(November 9,2010)。
“In vitro and in vivo assay systems for study of influenza virusinhibitors”Robert W.Sidwell；Donald F.Smee.Antiviral Research 48(1)2000,第1–16页。
“A cell-based luminescence assay is effective for high-throughputscreening of potential influenza antivirals”James W.Noah；William Severson；Diana L.Noah；Lynn Rasmussen；E.Lucile White；Colleen B.Jonsson.AntiviralResearch 73(1)2007,第50–59页。
“High-Throughput Screening of a 100,000-Compound Library forInhibitors of Influenza A Virus(H3N2)”William E.Severson；Michael McDowell；Subramaniam Ananthan；Dong-Hoon Chung；Lynn Rasmussen；Melinda I.Sosa；E.LucileWhite；James Noah；Colleen B.Jonsson.J Biomol Screen 2008 13:879-887,doi:10.1177/1087057108323123。
实施例27
抗HEV活性
戊型肝炎病毒(HEV)是导致肝炎的主要原因。戊型肝炎病毒(HEV)是印度次大陆，东南亚和中亚，中东，墨西哥和非洲部分地区的急性肝炎的主要原因。它与消耗粪便污染的饮用水有关。虽然HEV与一般人群的低死亡率相关，但第二个和第三个月的孕妇在暴发性肝炎和胎儿丢失方面的风险较高(病例死亡率为10～24％)。
有几种可以用于鉴定HEV感染的商业HEV诊断测定(Myint等人，J ClinMicrobiol.2006Apr；44(4):1581–1583)。Myint确定HEV病毒血症是普遍的，诊断评分最高(灵敏度为85％)。病毒血症也出现拖延，从疾病发病开始，持续≥2周。鉴于这些发现，并且在没有参考血清学测定的情况下，HEV RT-PCR可以用作HEV检测的参考测定。
由于病毒血症并不总是与HEV感染的自然过程中的抗体反应相一致，单独或与IgM一起检测IgA可以为HEV感染的诊断提供更好的特异性和更长的阳性持续时间(Takahashi,M.,S.Kusakai,H.Mizuo,K.Fujimura,K.Masuko,Y.Sugai T.Aikawa,T.Nishizawa,andH.Okamoto.2005.Simultaneous detection of immunoglobulin A(IgA)and IgMantibodies against hepatitis E virus(HEV)is highly specific for diagnosis ofacute HEV infection.J.Clin.Microbiol.43:49-56)。
可以使用商业的IgM抗HEV测定，例如WRAIR测定(沃尔特·里德陆军研究所(Walter Reed Army Institute of Research))和Genelabs IgM测定(新加坡GenelabsDiagnostics(GLD)公司)。
可以使用用于检测总Ig或IgG抗HEV的商业酶免疫测定(EIA)，包括Abbott IgG抗HEV EIA(德国，威斯巴登-达尔肯海姆Abbott Diagnostika)，GLD IgG(新加坡GenelabsDiagnostics(GLD)公司)和WRAIR总Ig抗HEV EIA(沃尔特·里德陆军研究所)。
在这些筛选中，Myint指出，Abbott免疫球蛋白G(IgG)，Genelabs IgG和沃尔特·里德陆军研究所(WRAIR)IgM测定法的灵敏度约为90％，Abbott IgG和WRAIR总Ig和IgM测定的特异性均超过90％。
目前鉴定的所有HEV菌株似乎属于相同的血清型，并且重组HEV抗原与所有地理起源的血清反应良好。然而，Myint研究指出，用于有症状的HEV感染的血清学检测的灵敏度比用于无症状HEV感染的大。
实施例28
人肝细胞中的细胞内代谢
将新鲜铺板的人原代肝细胞(马里兰州，巴尔的摩BioreclamationIVT)以每孔1×106接种于12孔板中。适应过夜后，将肝细胞暴露于50μM的化合物。在4小时后，从细胞层中去除培养基，并用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次以去除任何残留培养基。将细胞重悬于含20nM ddATP的70％甲醇中，于-20℃过夜。将上清液在空气流下干燥，并将干燥的样品储存在-20℃直至通过LC-MS/MS分析。在人肝细胞中化合物9相对于索非布韦的三磷酸酯产生示于图2中。结果显示，在相同的细胞系中，在同一溶度下，当将化合物9孵育于人肝细胞中时，比孵育索非布韦时产生的活性三磷酸酯多出约300％。
图6a-b示出了原代人肝细胞中化合物9(图6a)和索非布韦(图6b)的细胞排出(cellular egress)。结果列于表9(化合物9)和10(索非布韦)中。
表9
时间(小时) 9-MP 9-DP 9-TP
0 168±35 361±27 2045±21
1 192±1.4 461±8.7 2072±25
2 166±21 472±11 1882±92
4 167±17 440±12 1733±45
10 103±13 270±27 1020±131
24 87.3±6.8 192±13 441±30
48 66.8±6.2 83.6±2.7 74.3±8.3
T<sub>1/2</sub>(小时) 31.0 18.9 9.9
表10
时间(小时) 2’-F,2’Me UMP 2’-F,2’Me UDP 2’-F,2’Me UTP MI
0 185±31 254±1.0 2600±79 276±19
1 216±14 311±9.1 2585±117 230±16
2 239±24 332±4.9 2632±143 183±13
4 261±40 415±50 2903±129 119±0.03
10 129±21 182±34 1296±189 8.2±2.8
24 59.2±10 111±17 860±73 0.91±0.12
48 BLOQ 10.5±2.6 129±25 BLOQ
t<sub>1/2</sub>(小时) 9.8 8.7 10.4 2.8
本发明的范围不限于本文所述的具体实施方案。实际上，除了所描述的那些之外，对于本领域技术人员来说根据前面的描述和附图，本发明的各种修改将变得显而易见。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文引用了各种出版物，其全部公开内容通过引用并入。

Claims (9)

1.一种化合物，其具有下式中的一种：
Figure FDF0000016146480000011
Figure FDF0000016146480000012
或其药学上可接受的盐。
2.权利要求1所述的化合物，其中部分氘化糖。
3.权利要求1所述的化合物，其具有下式：
Figure FDF0000016146480000013
4.一种药物组合物，其包含权利要求1的化合物，和药学上可接受的载体。
5.权利要求4所述的药物组合物，其中所述组合物是透皮组合物或纳米颗粒组合物。
6.权利要求4所述的药物组合物，其还包含第二抗病毒剂。
7.权利要求6所述的药物组合物，其中所述第二抗病毒剂选自由干扰素、利巴韦林、NS3蛋白酶抑制剂、NS5A抑制剂、非核苷聚合酶抑制剂、解旋酶抑制剂、聚合酶抑制剂、核苷酸或核苷类似物、IRES依赖性翻译的抑制剂及其组合组成的组。
8.权利要求1所述的化合物在制备用于治疗感染了HCV的宿主的药剂中的用途。
9.权利要求8所述的用途，其中所述化合物与另外的抗黄病毒科病毒剂联合施用。
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