CN110724174B - 吡咯并三嗪类化合物、组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种吡咯并三嗪类化合物、组合物及其应用，该吡咯并三嗪类化合物具有式(I)所示结构

其中，R₁–R₁₁的定义如权利要求1所定义。上述吡咯并三嗪类化合物具有较优的抗病毒效果，特别是对于猫冠状病毒，可以用于制备治疗抗猫冠状病毒感染的疾病，例如猫感染性腹膜炎。

Description

吡咯并三嗪类化合物、组合物及其应用

技术领域

本发明涉及病毒感染药物领域，特别涉及吡咯并三嗪类化合物、组合物及其应用。

背景技术

猫冠状病毒(FCoV)是一种正链RNA病毒，它的直径为80～160nm，是有包膜的单管RNA，作为一种常见的传染性病毒，它通过猫的粪便传播。FCoV的感染猫会有5-10％的概率突变成传染性腹膜炎(FIP)，猫传染性腹膜炎是猫的一种慢性、进行性、传染性疾病，主要以腹膜炎、胸腔大量积水为特征。病猫致死率较高，大多数药物对其没有治疗效果。猫冠状病毒一种很容易发生突变的RNA病毒，在复制的过程中，其错误修复机制的酶活性很低，所以它产生变异的速度会非常快，而疫苗是要根据病毒的固定基因或蛋白进行开发研究，所以它的疫苗比较难开发。目前对于猫传染性腹膜炎的治疗主要是采用保守治疗，配合使用广谱抗生素和抗病毒药物预防二次感染，但此类药物副作用大且无法治愈。由于猫传染性腹膜炎尚无有效对症治疗药物，因此开发相应疗法存在需求。

发明内容

基于此，有必要提供一种吡咯并三嗪类化合物、组合物及其应用，该吡咯并三嗪类化合物具有抗病毒的作用，特别是抗猫冠状病毒。

一种吡咯并三嗪类化合物，具有式(I)所示结构

其中，R₁和R₂各自独立地为OR₁₂或NR₁₃R₁₄；或R₁、R₂与和与R₁和R₂相连的P一起组成取代或未取代的5-8元杂环；

R₁₂选自取代或未取代芳基、取代或未取代杂芳基或

R₁₃和R₁₄中有一个为

另一个为H或

R₃-R₁₁、R₁₅、R₁₆、R₁₇和R₁₈各自独立地选自：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳香基团、取代或未取代的杂芳香基团、酮基、羰基、羧基、酯基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、氨基、氰基、氨基甲酰基、卤甲酰基、异氰基、异氰酸酯基、硫氰酸酯基、异硫氰酸酯基、羟基、硝基或卤素；

R₁₉和R₂₀各自独立地选自：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳香基团、或取代或未取代的杂芳香基团。

在其中一实施例中，具有式(II)所示结构：

在其中一实施例中，R₁₂选自苯基、萘基、蒽基、吡啶基或

所述苯基、萘基、蒽基或吡啶基任选进一步被一个或多个以下基团取代：C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、3-8元环烷基、羟基、氰基或卤素；

R₁₃和R₁₄中有一个为

另一个为H；

R₁₅、R₁₆、R₁₇和R₁₈各自独立地选自：H、C1-C8烷基或3-8元环烷基；所述C1-C8烷基或3-8元环烷基任选进一步被一个或多个以下基团取代：C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、3-8元环烷基、羟基、氰基或卤素；

R₁₉和R₂₀各自独立地选自：H、C1-C8烷基或3-8元环烷基。

在其中一实施例中，R₁₂选自苯基、萘基、蒽基、吡啶基或

在其中一实施例中，R₁₃和R₁₄中有一个为

另一个为H。

在其中一实施例中，所述苯基、萘基、蒽基或吡啶基任选进一步被甲氧基或卤素取代，且所述取代为对位取代。

在其中一实施例中，R₁₅、R₁₆、R₁₇和R₁₈各自独立地选自：H或C1-C6烷基。

在其中一实施例中，R₁₉和R₂₀各自独立地选自：H或C1-C6烷基。

在其中一实施例中，R₁₉和R₂₀各自独立地选自：异丙基、叔丁基、1-乙基丁基。

在其中一实施例中，所述R₁和R₂各自独立地取自如下结构：

在其中一实施例中，所述吡咯并三嗪类化合物具有式(III)所示结构

R₂₁选自：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳香基团、取代或未取代的杂芳香基团、酮基、羰基、羧基、酯基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、氨基、氰基、氨基甲酰基、卤甲酰基、异氰基、异氰酸酯基、硫氰酸酯基、异硫氰酸酯基、羟基、硝基或卤素。

在其中一实施例中，所述R₂₁选自C1-C8烷基、芳基或杂芳基，所述C1-C8烷基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个以下基团取代：C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、3-8元环烷基、羟基、氰基或卤素。

在其中一实施例中，所述R₂₁选自芳基或杂芳基，所述芳基或杂芳基任选进一步被卤素取代。

在其中一实施例中，所述R₂₁为对位卤素取代苯基。

在其中一实施例中，所述R₂₁为对位氯取代苯基。

在其中一实施例中，所述R₅为H、羟基、卤素或C1-C6烷基。

在其中一实施例中，所述R₅为H、羟基、F或甲基。

在其中一实施例中，所述R₇选自：H、C1-C6烷基、氰基或卤素。

在其中一实施例中，所述R₇选自：H、甲基、乙基、氰基或F。

在其中一实施例中，R₉-R₁₁各自独立地为H、C1-C6烷基或卤素。

在其中一实施例中，所述R₉-R₁₁均为H。

上述吡咯并三嗪类化合物的制备方法，包括以下步骤：

提供式(I-1)所示化合物；

使式(I-1)所示化合物和式(I-2)所示化合物反应，即得式(I)所示化合物；

其中，X表示离去基团。

在其中一实施例中，所述X为

或卤素。

在其中一实施例中，提供式(I-1)所示化合物的步骤包括以下步骤：

将式(I-3)和式(I-4)反应，制得式(I-1)；

其中M表示卤素。

一种吡咯并三嗪类组合物，包括第一组分和第二组分，所述第一组分为上述吡咯并三嗪类化合物，所述第二组分为干扰素诱导剂。

在其中一实施例中，所述干扰素诱导剂为TLR7激动剂和STING激动剂中的一种或多种。这两种激动剂与先天免疫相关，是干扰素IFN的刺激基因，可以上调IFN表达。例如STING激动剂的作用机理：一般情况下真核细胞的DNA会固定的活动于细胞核内，只有发生意外状况时DNA才会涌入到细胞质中，比如细胞受损，开始凋亡，比如有外界病原(病毒、细菌等)的侵入，带入外源DNA片段等。这个时候细胞质中的DNA sensor就会及时发现，并启动相应的补救措施。这类DNA sensor一方面能够直接抵抗病毒或细菌的复制，另一方面迅速直接激活机体的免疫能力。细胞会根据这些可靠的信号，通过不同通路做出反应：比如通过NFκB激活下游的炎症因子，或者通过Caspase 1激活下游释放IL-1β等细胞因子，或者经p62和NDP52的介导诱发自噬(autophagy)，比如经Caspase 9诱发凋亡(apoptosis)或RIP3激活焦亡(necrosis)等同归于尽的方式。由此可见，干扰素诱导剂可以作为该药物的辅助剂共同杀灭病毒。

在其中一实施例中，所述TLR7激动剂为PF-4878691、Gardiquimod或Resiquimod；所述STING激动剂为CAS号为2138498-18-5的化合物或CAS号为2138299-29-1的化合物。

在其中一实施例中，所述吡咯并三嗪类组合物中还包括药学上可接受的辅料。

一种吡咯并三嗪类化合物的盐，由上述吡咯并三嗪类化合物制备而成。

上述吡咯并三嗪类化合物或上述吡咯并三嗪类组合物在制备抗病毒药物中的用途。

在其中一实施例中，所述抗病毒药物为用于治疗猫冠状病毒感染所引起的疾病的药物。

在其中一实施例中，猫冠状病毒感染所引起的疾病为猫感染性腹膜炎。

一种治疗猫冠状病毒感染所引起的疾病的方法，包括以下步骤：

实施有效剂量的上述吡咯并三嗪类化合物或上述吡咯并三嗪类组合物。

上述吡咯并三嗪类化合物具有较优的抗病毒效果，特别是对于猫冠状病毒，可以用于制备治疗抗猫冠状病毒感染的疾病，例如猫感染性腹膜炎。

且上述吡咯并三嗪类化合物通过采用呋喃取代吡咯并三嗪作为母核，并创新性的在呋喃取代基上引入磷酸酯基，相比于传统的核苷类化合物，水溶性得到了改善，克服了传统药物的难容，脂水分配系数clogP小于0，透过细胞膜的性能很差，体内生物利用度很低等缺点。另外，由于核苷类药物在体内显示药效需要被磷酸激酶磷酸化后才能体现，而一磷酸化步骤又是决速步骤，一磷酸化的水平直接影响药效的发挥，这样的核苷药物在成药性上存在着较大的缺陷，而上述吡咯并三嗪类化合物很好地改善了上述缺点，提高透膜率和生物利用度，并最终大幅提高药效，降低用药量，减少发生副作用的可能。

附图说明

图1表示20只试验猫治疗前后体重变化图(纵轴单位：公斤)；

图2表示20只试验猫治疗前后白细胞数目变化(纵轴单位：1×10⁹个/升)；

图3表示20只试验猫治疗前后白球比变化。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

定义和通用术语

除非有相反陈述，否则下列用在说明书和权利要求书中的术语具有下述含义。

本发明中术语“任选地被一个或多个取代基取代”是指被一个或多个取代基取代，或者未取代。具体地，“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“C1-C8烷基任选被一个或多个羟基取代”意味着羟基可以但不必须存在，该说明包括C1-C8烷基被羟基取代的情形和C1-C8烷基不被羟基取代的情形。

“烷基”是指饱和脂肪族烃基，包括直链和支链基团。C₁-C₆烷基是指含有1至6个碳原子的烷基。非限定性实施例包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基。C₁-C₄烷基烷基是指含有1至4个碳原子的烷基。在一实施例中，C₁-C₄烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基。烷基可以是取代的或未取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代。

“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃基取代基。3-8元环烷基是指包括3至8个碳原子。在一实施例中，3-8元单环环烷基为环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等。多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。环烷基可以是任选被一个或一个以上的取代基取代。

“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其中一个或多个环原子选自氮、氧或S(O)_m(其中m是整数0至2)的杂原子，优选氮或氧杂原子；但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的环部分，其余环原子为碳。4-10元杂环基是指环包含4至10个环原子，其中1～3个是杂原子；优选杂环基环包含5至6个环原子，其中1～2个是杂原子。在一实施例中，单环杂环基为二氢呋喃基、四氢呋喃基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基或高哌嗪基等。

“芳基”指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，优选为6至10元，更优选苯基和萘基，最优选苯基。芳基环可以稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，芳基可以是取代的或未取代的。

5-10元“杂芳基”指包含1至4个杂原子，5至10个环原子的杂芳族体系，其中杂原子包括氧、硫和氮。杂芳基优选为是5元或6元，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其与母体结构连接在一起的环为杂芳基环。杂芳基可以任选取代或未取代。

本发明中取代基“氨基”包括伯仲叔氨基，具体地，氨基包括-NR₂₀R₂₁，其中，R₂₀和R₂₁为氢原子或任意可选基团，例如：H、取代或未取代的直链烷基、取代或未取代的支链烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳香基团、或取代或未取代的杂芳香基团等。

烷氧基包括-O-(烷基)和-O-(环烷基)。其中烷基、环烷基的定义如上所述。在一实施例中，C₁-C₄烷氧基为甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基或环丁氧基。烷氧基可以是任选取代的或未取代。

“羰基”是指“-CO-”；“羧基”指-COOH；“酯基”指“-COOR₂₂”，氨基甲酰基指“-CONR₂₂R₂₃”其中R₂₂和R₂₃为任意可选基团，例如：H、取代或未取代的直链烷基、取代或未取代的支链烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳香基团、或取代或未取代的杂芳香基团等。

本发明的化合物可以以非溶剂化形式和含有药学上可接受的溶剂(如水、乙醇等)的溶剂化形式存在，即包括溶剂化和非溶剂化形式。

表示与母核的连接位点。

本发明中，某可取代位点可被一个或多个取代基取代，且当该可取代位点存在多个取代基时，多个取代基可以彼此相同或不同。

“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分。例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

组合物中所含有的赋形剂，可以为一种或多种缓冲剂、稳定剂、抗粘剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、吸附剂、涂料(肠的或缓释的)防腐剂、抗氧化剂，不透明的剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、调味剂和其它已知的添加剂。

“可药用的盐”即“医药上可接受的盐”，是指医药上可接受的化合物的有机或无机盐。

当化合物是酸性或包括足够酸性生物电子等排体时，适当的“可药用的盐”指从医药上可接受的包括无机碱和有机碱的无毒碱中制备的盐。该盐衍生自含有铝、铵、钙、铜、铁、铁、锂、镁、锰盐、锰、钾、钠、辛等的无机碱。特定的实施方式包括铵、钙、镁、钾和钠盐。盐衍生自医药上可接受的有机无毒碱，该有机无毒碱包括一级、二级和三级胺的盐、包括自然存在的取代胺的取代胺、环胺和碱性离子交换树脂，如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N，N.sup.1-二苄基乙二胺、乙二胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基六氢吡啶、还原葡糖胺、氨基葡萄糖、组氨酸、海巴明、异丙胺、赖氨酸、葡甲胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙基胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等等。

当化合物是碱性的或包括足够碱性生物电子等排体时，盐可以从医药上可接受的无毒酸中制备，包括无机和有机酸。这样的酸包括乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡萄糖酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、苦杏仁酸，甲基磺酸、粘液酸、硝酸、双羟萘酸、泛酸、磷酸、硫酸、琥珀酸、酒石酸、对甲苯磺酸等等。特定的实施方式包括柠檬酸、氢溴酸、盐酸、磷酸、硫酸、马来酸、酒石酸。其它示例性的盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐，硫酸盐，磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸、乳酸、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、葡萄糖酸盐，葡萄糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲基磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(例如，1，1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。

另外，包含化合物的药物制剂可以为片剂、胶囊剂、口服液体剂、丸剂、颗粒剂、散剂、软膏剂、贴剂、栓剂、***片、滴眼剂、眼膏剂、眼膏剂、滴耳剂、喷剂、气雾剂、吸入剂、注射剂等。

术语“治疗有效量”是指有效化合物或药物试剂的用量，改善、治愈或治疗疾病或病症的一种或多种症状的必要的最小量。

另外，本发明所述的化合物和药物组合物可单独给药，也可以与其他药剂联合施用。对于与一种以上的活性剂的联合治疗，当该活性剂在分开的剂量制剂中时，该活性剂可以分开施用或联合施用。另外，一种药剂的施用可在另一种药剂施用之前、同时或之后进行。当与其他药剂联合施用时，第二药剂的“有效量”将视所用药物的类型而定。

施用途径

本发明的一种或多种化合物通过适合于受治疗的病猫的任何途径施用。合适的途径包括口服、直肠、鼻、肺、局部(包括口腔和舌下)、和胃肠外(包括皮下、肌内)等。

本发明的化合物或药物组合物也可以包含在试剂盒中。

需要说明的是，本发明未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅是出于解释说明的目的，而不限制本发明的范围和实质。

实施例1

中间体1的制备

(2R)-异丙基2-((全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基丙酸酯的制备如下所述：

向反应烧瓶中加入10g(0.6mol)L-丙氨酸异丙酯盐酸盐、100ml二氯甲烷(DCM)和12g三乙胺(Et₃N)，冷却至-78℃，搅拌10分钟，然后缓慢滴加二氯磷酸苯酯的二氯甲烷溶液(13g/50ml)。滴完后，然后将温度升高到-20℃，持续反应搅拌1小时。然后将13g五氟苯酚50ml二氯甲烷中，并逐滴添加到上述反应溶液中。滴加完成后，升温至25℃搅拌反应，用薄层色谱法监测反应。反应完成后，抽滤除去沉淀。有机相在减压浓缩，得到26g粗产品。粗产物用20ml乙酸乙酯和100ml石油醚中再结晶,得到10.3g白色产品化，即中间体1。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ(ppm):7.43-7.40(m，2H)，7.25-7.23(m，3H)，6.88(d，1H)，4.91-4.85(m，1H)，3.95-3.87(m，1H)，1.28(d，3H)，1.16(d，6H)

实施例2

中间体2的制备

(3R,4R,5R)-2-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-4-(苄氧基)-5-(苄氧基甲基)-3-氟四氢呋喃-2-醇的制备，具体如下所述：

向反应瓶中加入3.4g 7-溴吡咯并[2,1-f][1,2,4]-三嗪-4-胺、4.5mL三甲基氯硅烷(TMSCl)和70mL四氢呋喃(THF)，室温搅拌2小时。然后将反应液冷却至-78℃，滴加55mL，1.0M正丁基锂己烷溶液(n-BuLi)，滴加完毕搅拌30分钟，然后滴加含5.4g(3R,4R,5R)-4-(苄氧基)-5-(苄氧基甲基)-3-氟二氢呋喃-2(3H)-酮的70mL THF溶液。滴加完毕搅拌反应30分钟，然后加入42mL乙酸淬灭反应。将反应液浓缩，加入500mL乙酸乙酯稀释并用250mL饱和NaCl溶液洗涤。有机层经无水MgSO₄干燥，过滤并减压浓缩。所得粘稠液体用硅胶柱层析色谱分离，得到2.6g白色固体产品。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.06(s,1H),7.87(s,1H),7.82(s,1H),7.65(s,1H),7.26(m,10H),6.94(m,1H),6.72(m,1H),6.09(m,1H),5.33(m,1H),4.66(m,6H),4.72(m,2H).

(2R，3R,4R,5R)-2-(4-氨基吡咯并[2，1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-4-(苄氧基)-5-(苄氧基甲基)-3-氟四氢呋喃-2-甲腈的制备，具体如下所述：

向反应瓶中加入2g(3R,4R,5R)-2-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-4-(苄氧基)-5-(苄氧基甲基)-3-氟四氢呋喃-2-醇、100mL二氯甲烷、3.4mL三甲基腈硅烷(TMSCN)、2.79g三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf)。将该溶液在-20℃下搅拌4小时。反应完毕向反应液中加入50mL饱和NaHCO₃溶液，加入300mL乙酸乙酯和100mL水。将有机层分离并用100mL饱和NaCl溶液洗涤，用MgSO₄干燥，过滤并减压浓缩。所得粘稠液体用硅胶柱层析色谱分离，得到0.82g白色固体。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.02(s,1H),7.95(s,1H),7.31(m,10H),7.01(d,1H),6.93(d,1H),6.88(d,1H),6.71(d,1H),5.86(d，1H),5.56(d,1H),4.72(m,7H),3.87(m,2H),3.71(m,2H).MS m/z 474[M+H]。

(2R,3R,4R,5R)-2-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-甲腈的制备如下所述：

向反应瓶中加入1.1g(2R，3R,4R,5R)-2-(4-氨基吡咯并[2，1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-4-(苄氧基)-5-(苄氧基甲基)-3-氟四氢呋喃-2-甲腈和120mL二氯甲烷，搅拌冷却至0℃。将77mL 1.0M BBr₃的二氯甲烷溶液加入到反应液中，搅拌2小时。然后将反应液冷却至-78℃，加入34mL三乙胺，然后加入200mL甲醇，升温至室温。反应液减压浓缩，加入200mL饱和碳酸氢钠溶液和200mL二氯甲烷，萃取分液，有机相减压浓缩。将浓缩液用硅胶柱层析色谱分离，得到0.34g白色固体，即中间体2。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ8.08(s,1H),7.27(d,1H),7.16(d,1H),5.41(d,1H),4.20(m,2H),3.98(d,1H),3.76(d,1H).MS m/z 294[M+H]。

实施例3

中间体3的制备

7-((2S，3R，4R，5R)-4-(苄氧基)-5-((苄氧基)甲基)-3-氟-2-甲基四氢呋喃-2-基)吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺的制备如下所述：

向反应瓶中加入3.6g起始核苷和200mL无水THF，搅拌冷却至0℃，加入20mL 3N的甲基氯化镁THF溶液，反应液搅拌过夜。反应完毕加入70mmol乙酸淬灭反应，减压浓缩得到粘稠液体。将粗物质溶于150mL无水二氯甲烷中，加入2mL甲磺酸，在室温下搅拌12小时，然后加入35mmol三乙胺淬灭。将混合物减压浓缩并将残余物进行硅胶柱层析分离，得到1.53g甲基取代的核苷。

¹H NMR(400MHz,CD₃Cl)δ7.86(s,1H),7.26-7.39(m,10H),6.76(d,1H),6.71(d,1H),6.22(s,2H),5.52(d,1H),4.41-4.74(m,4H),4.20-4.25(m,1H),3.64-4.01(m,3H),1.75(d,3H).MSm/z 463[M+H].

(2R,3R,4R,5S)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-4-氟-2-(羟甲基)-5-甲基四氢呋喃-3-醇的制备如下所述

采用实施例2的相同的方法制备中间体3。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ7.88(s,1H),7.23(d,1H),6.88(d,1H),5.36(d,1H),3.97-4.11(m,2H),3.82(d,1H),3.65(d,1H),1.66(d,3H).MS m/z 283[M+H]

实施例4

中间体4的制备

(2R,3R,4S,5R)-2-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-甲腈的制备如下所述：

向反应瓶中加入5g 7-溴吡咯并[2,1-f][1,2,4]-三嗪-4-胺和10mL无水THF。搅拌条件下加入7mL TMSCl。反应液冷却至-78℃，此后缓慢加入10mL 1.0M正丁基锂己烷溶液。滴完后在-78℃下搅拌10分钟，然后通过注射器加入10g内酯。反应1小时后，加入30mL乙酸淬灭反应。反应液减压浓缩，加入400mL二氯甲烷和200mL水中，萃取分液，有机层分离并用100mL饱和氯化钠溶液洗涤，再用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩有机相。将浓缩产物用硅胶柱层析分离，用20％乙酸乙酯的石油醚溶液洗脱，得到3.6g白色固体产物。MS m/z553[M+H]。

向反应瓶中加入2g上述核苷产物和80mL无水二氯甲烷，搅拌冷却至0℃，加入2mLTMSCN，搅拌反应10分钟。将8mL TMSOTf缓慢加入到该反应中，搅拌反应1小时。然后将反应液加入到200mL二氯甲烷中，加入200mL饱和碳酸氢钠水溶液。萃取分液，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩。浓缩液用20％乙酸乙酯的石油醚溶液洗脱，硅胶柱层析分离，得到白色产品1.75g。

¹H NMR(400MHz,CD₃Cl)δ7.95-7.89(d,1H),7.29-7.44(m,13H),7.12-7.20(m,1H),6.83-6.88(m,1H),6.71-6.77(m,1H),6.42(bs,2H),5.11(d,0.5H),4.97(d,0.5H),4.32-4.86(m,7H),4.09-4.19(m,2H),3.62-3.91(m,2H).MS m/z 562[M+H].

采用实施例2的相同的方法制备中间体4。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ7.92(s,1H),7.81-8.00(s,2H),6.86-6.90(m,2H),

6.09(d,1H),5.18(s,1H),4.91(s,1H),4.64(t,1H),4.03-4.07(m,1H),3.95(s,1H),

3.49-3.65(m,2H).MS m/z 292.2[M+H],

实施例5

化合物1的制备

(2s)-异丙基-2-((((2R，3R，4R，5S)-5-(4-氨基吡咯[2,1-f]-[1,2,4]三嗪-7-基)-4-氟-3-羟基-5-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基(苯氧基)磷酸基)氨基)丙酸酯

向反应瓶中加入1.0g核苷化合物(中间体3)和50mL四氢呋喃，冰浴冷却。缓慢滴加6.1mL 1M叔丁基氯化镁。滴加完毕在室温下搅拌反应60分钟。然后加入1.8磷酸酯化合物(中间体1)，反应液室温下搅拌反应24小时。反应完毕后将反应混合物加入到100mL乙酸乙酯中，加入20mL碳酸氢钠水溶液洗涤，萃取分液，有机相用硫酸钠干燥并真空浓缩。通过硅胶柱色谱法(甲醇/二氯甲烷＝1/10的溶液)纯化得到1.2g白色固体，即化合物1。¹HNMR(400MHz,CD₃CN)δ7.86(s,1H),7.16-7.44(m,5H),6.70-6.82(m,2H),6.13(,s,2H),5.36(d,1H),4.91-5.00(m,1H),3.85-4.45(m,6H),3.57(m,1H),1.74(m,3H),1.17-1.35(m,9H).MSm/z 552[M+H].

实施例6

化合物2的制备：

(2s)-异丙基-2-(((((2r，3r，4r，5r)-5-(4-氨基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酸基)氨基)丙酸酯

采用实施例5的相同的方法制备化合物2。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.92(m,1H),7.34-7.16(m,5H),6.99-6.91(m,2H),5.60(m,1H),4.51-4.16(m,4H),4.13-3.91(m,3H),1.34-1.19(m,9H).MS m/z 563.0[M+H].

实施例7

化合物3的制备：

(S)-2-(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丁酯的制备如下所述

采用实施例5的相同的方法制备化合物3。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.85(s,1H),7.33-7.25(m,2H),7.20-7.11(m,3H),6.90(d,1H),6.86(d,1H),4.91(t,1H),4.80(d,1H),4.43-4.35(m,1H),4.32-4.23(m,1H),4.18(t,1H),3.83(q,2H),1.26(d,3H),1.19(d,6H).MS m/z 561.0[M+H]

实施例8

化合物4的制备：

(2R，3R，4R，5S)-2-(4-氨基吡咯[2,1-氟][1,2,4]三嗪-7-基)-5-(((4-(4-氯苯基)-2-氧代-1,3,2-二氧磷腈-2-基)氧基)甲基)-3-氟-4-羟基四氢呋喃-2-甲基

向反应瓶中加入1.40g核苷化合物(中间体3)、2mL三乙胺和100mL四氢呋喃，降温至-20℃。然后加入1.40g 2-氯-4-苯基-1,3,2-二氧杂磷-2-酮。然后在-20℃下搅拌反应2小时。反应完毕后将反应混合物减压浓缩后加入到200mL乙酸乙酯和100mL水中，滴加浓盐酸调节水相pH值到5，萃取分液，有机相用硫酸钠干燥并真空浓缩。浓缩物通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/石油醚＝2/1的溶液)纯化得到0.95g白色固体，即化合物4。¹H NMR(400MHz,CD₃CN)δ7.88(s,1H)，7.46-7.47(m,4H),6.71-6.83(m,2H),6.14(,s,2H),5.38(d,1H),4.92-5.01(m,1H),4.52-4.55(m,1H),3.86-4.46(m,8H),2.23-2.28(m,1H),2.13-2.17(m,1H),MS m/z 514.2[M+H]

实施例9

化合物5的制备：

(2R，3R，4R，5R)-2-(4-氨基吡咯[2,1-氟][1,2,4]三嗪-7-基)-5-(((4-(4-氯苯基)-2-氧代-1,3,2-二氧磷腈-2-基)氧基)甲基)-3-氟-4-羟基四氢呋喃-2-腈

向反应瓶中加入1.50g核苷化合物(中间体2)、2mL三乙胺和100mL四氢呋喃，降温至-20℃。然后加入1.45g 2-氯-4-苯基-1,3,2-二氧杂磷-2-酮。然后在-20℃下搅拌反应2小时。反应完毕后将反应混合物减压浓缩后加入到200mL乙酸乙酯和100mL水中，滴加浓盐酸调节水相pH值到5，萃取分液，有机相用硫酸钠干燥并真空浓缩。取100mg浓缩物进行制备型HPLC，得到16mg化合物5。LCMS m/z 525[M+H]。

实施例10

化合物6的制备

(2R，3R，4S，5R)-2-(4-氨基吡咯[2,1-氟][1,2,4]三嗪-7-基)-5-(((4-(4-氯苯基)-2-氧代-1,3,2-二氧磷腈-2-基)氧基)3,4-二羟基四氢呋喃-2-腈

向反应瓶中加入0.80g核苷(中间体4)、1mL三乙胺和60mL四氢呋喃，降温至-20℃。然后加入0.65g 2-氯-4-苯基-1,3,2-二氧杂磷-2-酮。然后在-20℃下搅拌反应2小时。反应完毕后将反应混合物减压浓缩后加入到100mL乙酸乙酯和50mL水中，滴加浓盐酸调节水相pH值到5，萃取分液，有机相用硫酸钠干燥并真空浓缩。取50mg浓缩物进行制备型HPLC，得到12mg化合物6。LCMS m/z 523[M+H]。

实施例11

向反应瓶中加入4.40g磷酸对硝基苯酯、3mL三乙胺和100mL二氯甲烷。然后加入4.60g氯甲基碳酸异丙酯。然后在45℃下搅拌反应2小时。反应完毕后将反应混合物加入到200mL乙酸乙酯和100mL水中，滴加浓盐酸调节水相pH值到3～4，萃取分液，有机相用硫酸钠干燥并真空浓缩。所得残留物用硅胶柱层析分离，洗脱剂乙酸乙酯/石油醚＝1/3，得到中间体5(双异丙氧羰基氧甲基磷酸对硝基苯酯)6.57g，MS m/z 452[M+H]

实施例12

化合物7的制备：

向反应瓶中加入0.85g核苷化合物(中间体3)和40mL四氢呋喃，冰浴冷却。缓慢滴加3.2mL 1M叔丁基氯化镁。滴加完毕在室温下搅拌反应80分钟。然后加入2.3g磷酸酯化合物(中间体5)，反应液室温下搅拌反应24小时。反应完毕后将反应混合物加入到150mL乙酸乙酯中，加入50mL碳酸氢钠水溶液洗涤，萃取分液，有机相用硫酸钠干燥并真空浓缩。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/石油醚＝1/5的溶液)纯化得到0.35g白色固体，即化合物7。

¹H NMR(400MHz,CD₃CN)δ7.88(s,1H),6.72-6.83(m,2H),6.14(,s,2H),5.75-5.62(m,4H),5.37(d,1H),4.94-5.02(m,1H),4.85-4.89(m,2H),4.12-4.45(m,2H),3.58(m,1H),1.73(m，3H),1.18-1.34(m,12H).MS m/z 595.5[M+H]

实施例13

化合物8的制备：

采用实施例13的相同的方法制备化合物8。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.92(m,1H),6.99-6.91(m,2H),5.75-5.62(m,4H),5.60(m,1H),4.85-4.89(m,2H),4.51-4.16(m,2H),4.13-3.91(m,2H),1.18-1.34(m,12H).MS m/z 606.5[M+H]

实施例14

化合物9的制备：

采用实施例13的相同的方法制备化合物9。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.85(s,1H),6.90(d,1H),6.86(d,1H),5.75-5.62(m,4H),4.85-4.89(m,2H),4.64(t,1H),4.43-4.35(m,1H),4.32-4.23(m,1H),,4.13-3.91(m,2H),1.18-1.34(m,12H).MS m/z 604.5[M+H]

抗病毒活性测定方法：

猫传染性腹膜炎病毒细胞的保护测定使用猫肾(CRFK)细胞和FIPV-79-1146(猫传腹病毒)。通俗的讲就是混合病毒和细胞，并在测试化合物的存在下温育7天。预滴定病毒，使对照孔出现由于病毒复制引起的85％至95％的细胞凋亡。由于测试化合物可以抑制病毒复制，所以有受试化合物存在的条件下可以观察到抗病毒效果。每个测定板包含细胞对照孔(仅细胞)、病毒对照孔(细胞和病毒)、化合物毒性对照孔(仅细胞和化合物)、化合物比色对照孔(仅化合物)以及实验孔(化合物、细胞和病毒)。通过MTS(MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓)细胞增殖试剂盒测定细胞的EC₅₀(50％细胞存活的浓度)以及细胞毒性CC₅₀(导致50％细胞死亡的浓度)。

细胞制备：

猫肾(CRFK)细胞(美国典型培养物保藏中心(ATCC)商购)在补充有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(2.0mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中生长。使用标准细胞培养物技术以1：10的分流比一周两次地继代培养该细胞。使用血球计数仪和台盼蓝排除法进行总细胞数和生存力百分数测定。对于测定中使用的细胞，细胞生存力必须大于95％。在测定前一天以1x10⁴个细胞/孔的浓度在96孔组织培养板中接种细胞。

病毒制备：

用于测定的病毒是猫传腹病毒FIPV-79-1146(美国典型培养物保藏中心(ATCC)商购)在CRFK细胞中生长，产生病毒并作为储备病毒池。每次测定，从-70℃条件下移除病毒的预滴定等分部分，并在生物安全柜中将其解冻到室温。然后将病毒悬浮并稀释到组织培养基中，使得加入到每个孔的病毒的量是被确定为产生感染后4-5天在85％到95％的细胞杀死之间的量。

细胞染色：

在感染5天后，用MTS细胞增殖试剂盒染色测定细胞存活率并量化化合物毒性。通过由定量分析代谢活性细胞的线粒体酶代谢MTS产生的可溶性甲臜产物，测得细胞存活率和化合物的细胞毒性。每个孔加入20-25μL的MTS试剂，然后在37℃、5％CO₂条件下温育微量滴定板4-6小时，然后测定细胞存活率。在490/650nm下按分光光度法SpectraMax Plus板读数器对该板读数。

数据分析：

使用计算机计算化合物对病毒抑制的EC₅₀和细胞毒性CC₅₀。下表1为测试化合物的活性结果。

表1

受试物	EC<sub>50</sub>(μM)	CC<sub>50</sub>(μM)
			化合物1	c	d
化合物2	1.24	d
			化合物3	0.031	c
化合物4	c	d
			化合物5	0.84	d
化合物6	0.046	d
			化合物7	c	d
化合物8	c	d
			化合物9	0.016	c
中间体4	0.78	d

a:0.1～1μM b：1～3μM c:3μM～5μM d：大于5μM

从上表1的测量数值可以看到，中间体4在经过磷酸酯化后，三种不同的磷酸酯化合物(化合物3、化合物6和化合物9)的抗病毒活性提高了数十倍，这样的一个活性提高可以极大的降低药物的使用量，提高成药性。

猫传染性腹膜炎的药效实验

实验方法:

将20mg化合物9溶解于5mL由30％丙二醇、50％PEG400(聚乙二醇400)、20％乙醇的混合溶液中制成给药溶液，采用注射方式给药。配制液保存于4℃冰箱中，注射前使其变至室温，用1ml一次性注射器吸取相应的量，排清气泡。注射时选择皮肤较软，皮下组织疏松而且血管较少的部位，如颈部或股内侧皮下进行注射。给药剂量设定为0.2mg/kg，为文章传统该类药物剂量的10％及5％(传统剂量为2mg/kg及4mg/kg)，注射频次为每天一次。每隔1周进行采血，进行血常规及相应生化指标测定，试验结束以猫的血生化指标恢复正常为结束标志，讨论核心指标为体重、白细胞和白球比。

下表2为试验的20只猫的编号、临床形式的猫传染性腹膜炎(FIP)。

表2

图1表示20只猫治疗前后体重变化图(纵轴单位：公斤)；图2表示治疗前后试验猫白细胞数目变化(纵轴单位：1×10⁹个/升)；图3表示治疗前后白球比变化。

从图1可以看出，治疗后猫的体重均大于治疗前，从图2可以看出治疗后白细胞数目均高于治疗前。且从图3可以看出，20只试验猫在开始治疗时白球比水平较低，然后通过治疗，白球比值在治疗的第5周左右达到了0.70以上的正常水平；白细胞数目有所提升至正常水平；各试验猫体重回升，证明药物无明显毒性作用。

此次试验，所有猫均被治愈，没有复发，疗效显著好于文章中的20％复发率。根据相应试验对照，在猫注射中间体4后48小时会出现尿液发黄，而注射化合物9的猫在10小时后即会出现该现象，这是湿性传腹猫开始排腹水的典型症状，说明化合物9的起效更快，从此次治疗试验来看，本发明提供的吡咯并三嗪类化合物可以以相当于报道十分之一的剂量达到更好的疗效，具有十分突出的药效改善，极大的改善了成药性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种吡咯并三嗪类化合物，其特征在于，具有以下结构

2.权利要求1所述的吡咯并三嗪类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述中间体(5)的制备方法为：

4.一种吡咯并三嗪类组合物，其特征在于，包括第一组分和第二组分，所述第一组分为权利要求1所述的吡咯并三嗪类化合物，所述第二组分为干扰素诱导剂。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述干扰素诱导剂为TLR7激动剂和STING激动剂中的一种或多种。

6.权利要求1所述的吡咯并三嗪类化合物在制备抗病毒药物中的用途，所述抗病毒药物为用于治疗猫冠状病毒感染所引起的疾病的药物。

7.权利要求4或5所述的吡咯并三嗪类组合物在制备抗病毒药物中的用途，所述抗病毒药物为用于治疗猫冠状病毒感染所引起的疾病的药物。

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