CN107663521B - 血浆游离核酸提取试剂盒及其应用 - Google Patents
血浆游离核酸提取试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了血浆游离核酸提取试剂盒及其应用,其中,该试剂盒包括:(1)磁珠裂解结合液,(2)第一清洗液,(3)第二清洗液,(4)洗脱液。利用本发明的血浆游离核酸提取试剂盒能够快速提取血浆中的游离脱氧核糖核酸,且其使用快速简便,无需离心只需半小时就可以完成一次批量提取,且获得的核酸质量好,用于后续测序和检测的结果准确可靠,完全适用于现在的无创产前基因检测技术,在科学研究和临床检测方面都有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及血浆游离核酸提取试剂盒及其应用。
背景技术
目前现有的传统核酸提取技术中所包含的沉淀和离心等操作需要用到大量的生物样本,而且传统提取技术步骤较为繁杂,费时长,收率低,很难实现自动化操作,大部分方法还需要操作人员直接接触有毒的化学试剂,因此,随着分子生物学以及高分子材料学的快速发展,传统的从液相***中分离提取核酸的方式逐渐被以固相吸附物载体为基础的新方法所取代。
这类新兴的核酸分离提取方法主要包括:旋转离心柱提取法、玻璃粉吸附法、二氧化硅基质法、阴离子交换法、纳米磁珠提取法等。目前离心柱法提取核酸应用得很普及,市场上的多数质粒DNA提取试剂盒都是在离心柱法的基础上发展而来的。该方法采用特殊的硅基质吸附材料,特点是:高盐酸性缓冲液存在时可特异性吸附DNA,除去RNA与蛋白质等不能结合的杂质,而低盐碱性缓冲液可洗脱结合在吸附柱上的DNA,然而这种方法的缺点是样本需求量大,耗费样品较多,对于某些珍稀样本其应用受到很大的局限,同时离心柱法提取核酸需要反复离心,不便于高通量、自动化操作,特别是在基因诊断、突发疫情的监测和控制等领域,另外使用离心柱法提取核酸需要大量的操作人员及仪器设备才能满足需求。
因而,目前的核酸提取尤其是血浆游离核酸的提取方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明的一个目的在于提出一种高效、低成本的血浆游离核酸的提取手段。
需要说明的是,本发明是基于发明人的下列研究和发现才完成的:
目前新兴的核酸分离提取方法例如旋转离心柱提取法、玻璃粉吸附法、二氧化硅基质法、阴离子交换法,纳米磁珠法等,不管是采用具体的哪种方法来分离和提取核酸,总的来说,这类方法的大致原理主要可以分为三个步骤,第一步是利用裂解液促使细胞破碎,使细胞中的核酸释放出来。第二步是把释放的核酸特异地吸附在特定的载体上,并且这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力,而对其他的生化组分如蛋白质、多糖、脂类不能具有亲和力和吸附力。第三步是把吸附在特定载体上的核酸洗脱下来,从而得到纯化的核酸。
由于离心柱法存在的种种不足,为了适应现代分子生物学检测实验高通量、高灵敏度、自动化操作的需要,运用磁珠提取核酸的方法应运而生了。磁珠法提取核酸的重大改进在于使用了一种由无机磁性粒子与高分子材料结合形成的高亲和力的复合磁性微球,由于其自身兼具高分子微球和磁性粒子的众多特性,故在没有外加磁场的情况下在溶液中分散均匀、稳定,而一旦增加了外加磁场则可简单快速地分离。该方法是纳米科技与生物技术的完美结合,具有其他核酸提取方法无法比拟的优势,主要体现在:(1)能够实现高通量操作和自动化,目前已有96孔的核酸自动提取仪,用一个样品的提取时间即可实现对96个样品的处理,效率直接提高96倍,符合生物学高通量的操作要求,使得传染性疾病暴发时能得到快速及时有效的应对;(2)操作简单、用时短,整个提取流程只有短短几步,基本上可以在30—40min完成;(3)安全无毒,不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒溶剂,对实验操作人员的伤害少,符合现代以人为本,安全至上的理念;(4)磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大;(5)磁珠提取核酸的方法采用智能化软件操作***,既能控制孔间污染又能避免批次间的污染;同时保证实验结果的稳定性和重复性,避免人工操作引起的差异及错误;(6)成本低廉,便于广泛应用。由于磁珠合成采用的都是低价无机和有机原料,无须特殊的仪器设备,使得最终的合成和研发成本都很低,符合我国的基本国情和经济现状,便于广泛应用。
利用磁珠法提取核酸除了磁珠外还需搭配一套核酸提取试剂,成功的核酸分离纯化需要四个重要的步骤:组织或细胞的破碎和裂解,核蛋白复合体的变性,核酸酶的灭活以及污染物的去除。理想的抽提方法可以获取高质量的靶核酸,同时没有蛋白,糖,脂和其它核酸污染。
现代传统的核酸抽提方法主要包括盐酸胍,酚-氯仿抽提法,碱抽提法,溴化十六烷基三甲铵(CTAB)抽提法,溴化乙锭一氯化铯(EtBr-CsCI)梯度离心法和寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸(Oligo(dT))-纤维素层析法等。
现代主要常用核酸提取的试剂包括:盐酸胍,异硫氰酸胍,十二烷基肌氨酸钠,十二烷基硫酸钠,十六烷基三甲基溴乙胺,EDTA,蛋白酶K,柠檬酸钠,Tris-HCl,异丙醇,70%乙醇,聚乙二醇PEG等,以下介绍其中重要化合物所起到相关作用。
盐酸胍:盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂,可以使蛋白变性,强度一般,可以保护DNA完整流出。
异硫氰酸胍:强用力的蛋白质变性剂,能迅速溶解蛋白质,导致细胞结构破碎,核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂,在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍,它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态。含有强力的阴离子和阳离子基团,它们可以形成较强的氢键。在还原剂存在的情况下,异硫氰酸胍可以断裂氢键,而去垢剂,如SDS存在的情况下,可以破坏疏水作用。
十二烷基肌氨酸钠:作用使蛋白质解体,变性。
十二烷基硫酸钠(SDS):阴离子去垢剂,高温(55-65℃)裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,形成SDS/蛋白质/多糖复合物,释放核酸,提高盐(KAc或NaAc)浓度并降低温度(冰浴),使SDS/蛋白质/复合物转变为溶解度更小的钾盐酸形式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全、离心后除去沉淀,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀水相中的DNA。操作简单,温和,可提取到高分子量的DNA。SDS能裂解细胞,使细胞中的蛋白质和核酸之间常借着静电引力或配位键结合,阴离子去污剂能够破坏这种价键,使染色体离析,蛋白变性,释放核酸。
此外,SDS还有以下作用:
(1)SDS是一种阴离子表面活性剂,能使蛋白质的氢键和疏水键打开,并结合到蛋白质的疏水部位;
(2)SDS可引起蛋白质构象改变;
(3)SDS是一种良好的解离剂,可使蛋白质溶解,变性;
(4)形成SDS-蛋白质复合物,并使复合物带负电。
乙二胺四乙酸(EDTA):酶抑制剂,螯合二价金属,抑制金属依赖性的酶,螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制细胞中DNase的活性,该酶可降解DNA。EDTA是去垢剂,结合离子用,而它结合的部分离子是能够诱发或者促进RNA酶活性的,比如Ca2+。EDTA是一种二价离子熬合剂,能熬合Mg2+和Ca2+等二价阳离子,而多种RNA酶的活性是需要依赖二价阳离子的,所以EDTA能通过熬合二价阳离子来抑制RNA酶的活性,碱性条件下才能够溶解,要和NaOH粉末混合后,再加水,然后用NaOH水溶液调节pH。0.01M,DNase酶基本失活。
蛋白酶K:切割活性较广的丝氨酸蛋白酶,切割脂族和芳香族氨基酸的羧基端肽键,将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来。蛋白酶K在较广的pH范围内均有活性(pH 4-12.5)温度范围37-60度盐浓度3M GuHCl或4M尿素中均有活性,在一些去污剂:Tween20(5%)和SDS(1%)条件下也有活性。蛋白酶K消化裂解法适用于所有标本的消化处理,尤以DNA样品为佳.如组织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌物、尿,粪便等。蛋白酶K的一般工作浓度是50—100μg/ml。蛋白酶(蛋白酶K或链酶蛋白酶)可以降解蛋白质,灭活核酸酶(DNase和RNase),DNase和RNase也用于去除不需要的核酸。
柠檬酸钠:它可以控制反应体系的离子强度,同时还有一定的缓冲作用,保证体系PH的相对稳定状态,总之柠檬酸钠在这里的作用类似于食物中的防腐剂。
异丙醇:主要作用是沉淀核酸。
70%乙醇:70%乙醇可以洗涤并沉淀DNA,乙醇对于蛋白质、核酸的沉淀效应随分子量加大而增大,小分子的核酸和蛋白质碎片是可以溶于75%乙醇的。漂洗DNA,是为了去除残余的盐类,去除过量SDS和酚等杂物,因为SDS在70%的乙醇中保持溶解状态,不与DNA共沉淀,从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。
聚乙二醇(PEG):有机聚合物,无毒,亲水性强,相对分子量6-20k,沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关,同时受离子强度、溶液pH值和温度等因素的影响,采用该方法可将病毒浓缩10倍以上。为一种非离子多聚物,多离子多聚物是六十年代发展起来的一类重要沉淀剂。基于多聚物的沉淀作用主要依赖于多聚物的浓度和被沉淀物的分子量大小,Laurent等(1967)提出PEG的沉淀机理主要是通过空间位置排斥,使液体中的微粒(包括生物大分子、病毒和细菌等)被迫集聚在—起而引起沉淀的发生。PEG最早应用于提纯免疫球蛋白(IgG)和沉淀一些细菌病毒,今年来逐渐应用于核酸和酶的分离纯化,特别是用PEG分离质粒DNA,已相当普遍。
为了对目前的核酸提取手段进行进一步优化,发明人旨在利用磁珠作为载体,自主研发整套提取试剂,以便能够快速提取血浆中游离脱氧核糖核酸(血浆里存在的细胞外游离DNA,这种微量DNA大部分源自于细胞凋亡后所释放并流入血液中,理想的抽提方法可以获取高质量的靶核酸,同时没有蛋白,糖,脂和其它核酸污染)。进而,经过一系列的理论研究和实验探索,发明人成功地创造了一种血浆游离核酸提取试剂盒以及相应的提取方法。
因而,在本发明的第一方面,本发明提供了一种血浆游离核酸提取试剂盒,根据本发明的实施例,该试剂盒包括:
(1)磁珠裂解结合液,包括:
100mM-1M pH 8.1-8.4的Tris-HCl缓冲液;
10mM-500mM的EDTA缓冲液;
0.1%-30%(w/v)的SDS缓冲液;
0.1%-10%(w/v)的柠檬酸钠缓冲液;
1%-50%(w/v)的聚乙二醇溶液;
0.1-10M的异硫氰酸胍溶液;以及
余量的水,
其中,在使用前,需向所述磁珠裂解结合液中添加10-20%(w/v)的异丙醇,
(2)第一清洗液,包括:
0.1-10M的异硫氰酸胍溶液;
100mM-1M pH 8.1-8.4的Tris-HCl缓冲液;
10mM-500mM的EDTA缓冲液;以及
余量的水,
其中,在使用前,需向所述第一清洗液中添加20-30%(w/v)的无水乙醇,
(3)第二清洗液,包括:
1mM-5M的Trizma Base缓冲液;
1mM-5M的NaCl溶液;
至少0.04%(w/v)的NaN3溶液;以及
余量的水,
其中,在使用前,需向所述第二清洗液中添加1-10倍体积的无水乙醇,
(4)洗脱液,包括:
1mM-0.5M的Trizma Base缓冲液;
1mM-500mM的EDTA缓冲液;以及
余量的水。
根据本发明的实施例,本发明的血浆游离核酸提取试剂盒中包含的核酸提取试剂主要包括:磁珠裂解结合液,第一清洗液,第二清洗液和洗脱液。其大致提取原理是利用裂解液分离核酸同时里面含有的高盐成分可以使核酸吸附于磁珠表面,同时使用清洗液去除残留盐,蛋白,糖,脂以及其它核酸污染物,最后加入洗脱液重新将核酸洗脱下来。
发明人发现,利用本发明的血浆游离核酸提取试剂盒能够快速提取血浆中的游离脱氧核糖核酸,且其使用快速简便,无需离心只需半小时就可以完成一次批量提取,且获得的核酸质量好,用于后续测序和检测的结果准确可靠,完全适用于现在的无创产前基因检测技术,在科学研究和临床检测方面都有重要的意义。
根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,Tris-HCl缓冲液的pH为8.1-8.4时,提取效果好,而pH为8.2-8.3时提取效果更突出。
根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,Tris-HCl缓冲液的浓度为120mM。由此,细胞裂解效果好。
根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,Tris-HCl缓冲液的浓度为130mM。由此,能够有效使细胞裂解。
根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,Tris-HCl缓冲液的浓度为140mM。由此,能够有效使细胞裂解。根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,EDTA缓冲液的浓度为118mM。由此,细胞裂解效果好。
根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,EDTA缓冲液的浓度为128mM。由此,能够有效使细胞裂解。
根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,EDTA缓冲液的浓度为138mM。由此,能够有效使细胞裂解。
根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,SDS缓冲液的浓度为8.2%(w/v)。由此,细胞裂解效果好。
根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,SDS缓冲液的浓度为9.2%(w/v)。由此,细胞裂解效果好。
根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,SDS缓冲液的浓度为7.2%(w/v)。由此,细胞裂解效果好。
根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,柠檬酸钠缓冲液的浓度为2.5%(w/v)。由此,细胞裂解效果好。
根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,柠檬酸钠缓冲液的浓度为3.0%(w/v)。由此,细胞裂解效果好。
根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,柠檬酸钠缓冲液的浓度为3.5%(w/v)。由此,细胞裂解效果好。
根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,聚乙二醇溶液的浓度为5%(w/v)。由此,细胞裂解效果好。
根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,聚乙二醇溶液的浓度为6%(w/v)。由此,细胞裂解效果好。
根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,聚乙二醇溶液的浓度为7%(w/v)。由此,细胞裂解效果好。
根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,异硫氰酸胍溶液的浓度为4.2M。由此,细胞裂解效果好。
根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,异硫氰酸胍溶液的浓度为4.5M。由此,细胞裂解效果好。
根据本发明的实施例,在所述磁珠裂解结合液中,异硫氰酸胍溶液的浓度为4.8M。由此,细胞裂解效果好。
根据本发明的实施例,在所述第一清洗液中,Tris-HCl缓冲液的pH为8.1-8.4时,蛋白质去除效果好,从而最终核酸提取效果好,而pH为8.2-8.3时提取效果更突出。
根据本发明的实施例,在所述第一清洗液中,异硫氰酸胍溶液的浓度为6M。由此,对蛋白质杂质的去除效果好。
根据本发明的实施例,在所述第一清洗液中,异硫氰酸胍溶液的浓度为6.5M。由此,蛋白质杂质去除效果好。
根据本发明的实施例,在所述第一清洗液中,异硫氰酸胍溶液的浓度为7M。由此,蛋白质杂质去除效果好。
根据本发明的实施例,在所述第一清洗液中,Tris-HCl缓冲液的浓度为94mM。由此,蛋白质杂质去除效果好。
根据本发明的实施例,在所述第一清洗液中,Tris-HCl缓冲液的浓度为90mM。由此,蛋白质杂质去除效果好。
根据本发明的实施例,在所述第一清洗液中,Tris-HCl缓冲液的浓度为85mM。由此,蛋白质杂质去除效果好。
根据本发明的实施例,在所述第一清洗液中,EDTA缓冲液的浓度为52mM。由此,蛋白质杂质去除效果好。
根据本发明的实施例,在所述第一清洗液中,EDTA缓冲液的浓度为60mM。由此,蛋白质杂质去除效果好。
根据本发明的实施例,在所述第一清洗液中,EDTA缓冲液的浓度为64mM。由此,蛋白质杂质去除效果好。
根据本发明的实施例,在所述第二清洗液中,Trizma Base缓冲液的浓度为60mM。由此,清洗效果好。
根据本发明的实施例,在所述第二清洗液中,Trizma Base缓冲液的浓度为65mM。
根据本发明的实施例,在所述第二清洗液中,Trizma Base缓冲液的浓度为70mM。
根据本发明的实施例,在所述第二清洗液中,NaCl溶液的浓度为200mM。
根据本发明的实施例,在所述第二清洗液中,NaCl溶液的浓度为250mM。
根据本发明的实施例,在所述第二清洗液中,NaCl溶液的浓度为300mM。
根据本发明的实施例,在所述第二清洗液中,NaN3溶液的浓度为0.04%(w/v)及以上时均能够达到清洗的效果,但采用0.04%(w/v)的NaN3溶液时,成本更低。
根据本发明的实施例,在所述洗脱液中,Trizma Base缓冲液的浓度为100mM。
根据本发明的实施例,在所述洗脱液中,Trizma Base缓冲液的浓度为150mM。
根据本发明的实施例,在所述洗脱液中,Trizma Base缓冲液的浓度为200mM。
根据本发明的实施例,在所述洗脱液中,EDTA缓冲液的浓度为5mM。
根据本发明的实施例,在所述洗脱液中,EDTA缓冲液的浓度为10mM。
根据本发明的实施例,在所述洗脱液中,EDTA缓冲液的浓度为15mM。
在本发明的第二方面,本发明提供了一种血浆游离核酸提取方法。根据本发明的实施例,利用前面所述的血浆游离核酸提取试剂盒从血浆样品中提取游离核酸。
发明人发现,根据本发明的血浆游离核酸提取方法,通过上述的血浆游离核酸提取试剂盒,能够快速提取血浆中的游离脱氧核糖核酸。且该方法快速简便,无需离心只需半小时就可以完成一次批量提取,获得的核酸质量好,用于后续测序和检测的结果准确可靠,完全适用于现在的无创产前基因检测技术,在科学研究和临床检测方面都有重要的意义。
根据本发明的实施例,该方法包括以下步骤:
将磁珠、蛋白酶K溶液与血浆样品混合,以便获得第一混合物;
向所述磁珠裂解结合液中添加10-20%(w/v)的异丙醇,然后加入所述第一混合物中,以便获得第二混合物;
将所述第二混合物进行静置处理,以便获得经过静置处理的混合物;
将所述经过静置处理的混合物置于磁力架上,待磁珠完全被吸附后去掉上清液,并取下吸附有核酸的磁珠,然后对所述吸附有核酸的磁珠进行第一清洗处理,所述第一清洗处理采用添加了20-30%(w/v)的无水乙醇的第一清洗液进行;
将经过第一清洗处理的磁珠置于磁力架上,去除上清液后取下,然后进行第二清洗处理,所述第二清洗处理采用添加了1-10倍体积的无水乙醇的第二清洗液进行;
将经过第二清洗处理的磁珠置于磁力架上,去除上清液后取下,然后进行第三清洗处理,所述第三清洗处理采用添加了1-10倍体积的无水乙醇的第二清洗液进行;
将经过第三清洗处理的磁珠置于磁力架上,去除上清液,并置于室温下晾干,
将晾干的磁珠与洗脱液混合,以便对所述晾干的磁珠进行洗脱处理;以及
将洗脱处理产物置于磁力架上,以便获得核酸。
由此,核酸提取效果好。
根据本发明的实施例,所述磁珠为羟基磁珠。
根据本发明的实施例,所述蛋白酶K溶液的浓度为1~100mg/ml。
根据本发明的实施例,所述磁珠、蛋白酶K溶液、血浆样品、磁珠裂解结合液、第一清洗液、第二清洗液和洗脱液的体积比为:1:1:20:28:50:50:4~5。由此,核酸提取效果好。
根据本发明的实施例,将所述第二混合物进行静置处理包括:将所述第二混合物静置5分钟后,进行震荡或用移液器吹打,然后再静置5分钟。由此,有利于各混合物充分反应。
根据本发明的实施例,晾干的磁珠表现为肉眼观察磁珠无明显反光。
需要说明的是,本发明的方法利用磁珠作为载体同时搭配发明人自主研发的血浆游离核酸提取试剂盒,能够快速提取血浆中游离脱氧核糖核酸,且获得的核酸质量好,用于后续测序和检测的结果准确可靠。
另外,本发明使用的磁珠采用二氧化硅为材质,同时磁珠表面包被有羟基官能团,原理同传统固相硅类介质相同,可以在高盐离子浓度和低pH条件下吸附核酸,而在低盐离子浓度和高pH条件下进行核酸分离。
并且,需要说明的是,随着无创产前检测技术的普及,传统离心柱DNA提取法已经无法满足大批量核酸提取,而本发明的血浆游离核酸提取试剂盒及提取方法,快速简便,无需离心只需半小时就可以完成一次批量提取,同时也可以利用自动化移液工作站完成操作,完全适用于现在的无创产前基因检测技术,在科学研究和临床检测方面都有重要的意义。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1显示了根据本发明一个实施例,其中4个核酸样品的片段大小检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品,例如可以采购自Illumina公司。
实施例1
发明人按照以下方法生产本发明的血浆游离核酸提取试剂盒,具体如下:
一、下面列举了本实施例中采用的部分试剂、仪器:
试剂盒生产原材料供应
配制本发明试剂盒中各试剂的原材料均由海外知名生物耗材生产企业提供。
主要材料以及供应商如下表格:
试剂盒生产条件与生产能力
该产品生产需要在净化间(十万级)中配制或者在超净工作台中完成。
该产品现处于小规模生产时期,具体产量需要根据市场需求来生产。
试剂盒生产过程需要设备以及耗材
生产所需设备:
1.工业搅拌器
2.称量天平
3.漩涡震荡器
4.离心机
5.移液器
6.量筒
试剂盒生产所需耗材:
1.称量纸
2.试剂勺
3.搅拌桶
4.保存管以及广口瓶
5.枪头
试剂盒生产产品标准,质控和成产成本控制
本产品品质标准参考目前国外进口商品化试剂盒性能参数。
试剂盒生产产品质控所需仪器:
1.荧光检测仪
2.生物分析仪
3.小型离心机
4.振荡器
试剂盒生产产品质控所需耗材:
1.光学EP管
2. 1.5ml EP管
3. 96孔纯化板
试剂盒生产产品质控方法:片段选择质控(采用Agilent 2100生物分析仪)
具体方法:
配制好的成品将采用小量临床血浆样本进行提取测试,提取后的核酸采用1-Ad建库方法测试,建库完成后采用安捷伦2100生物分析仪进行片段大小检测以及测量建库后核酸浓度,两项测试均通过即代表该产品符合质量标准。
二、生产方法
本发明的血浆游离核酸提取试剂盒的组成及配方如下:
(1)磁珠裂解结合液,包括:
120mM pH 8.2的Tris-HCl缓冲液;
118mM的EDTA缓冲液;
8.2%(w/v)的SDS缓冲液;
2.5%(w/v)的柠檬酸钠缓冲液;
5%(w/v)的聚乙二醇溶液;
4.2M的异硫氰酸胍溶液;以及
余量的水,
其中,在使用前,需向所述磁珠裂解结合液中添加16%(w/v)的异丙醇,
(2)第一清洗液,包括:
6M的异硫氰酸胍溶液;
94mM pH 8.2的Tris-HCl缓冲液;
52mM的EDTA缓冲液;以及
余量的水,
其中,在使用前,需向所述第一清洗液中添加25%(w/v)的无水乙醇,
(3)第二清洗液,包括:
60mM的Trizma Base缓冲液;
200mM的NaCl溶液;
0.04%(w/v)的NaN3溶液;以及
余量的水,
其中,在使用前,需向所述第二清洗液中添加5倍体积的无水乙醇,
(4)洗脱液,包括:
100mM的Trizma Base缓冲液;
5mM的EDTA缓冲液;以及
余量的水。
基于上述组成和配方,配制各试剂,由此制备获得本发明的试剂盒。
其中,各缓冲液(即母液)的配制方法包括:
1.Tris-HCl缓冲液:按照配比,将Tris和水混合,配制成1M溶液,并用HCl调节pH至8.2;
2.NaCl溶液:按照配比,将NaCl和水混合,配制成5M溶液;
3.NaN3溶液:按照配比,将NaN3配制成2%(w/v)溶液;
4.EDTA缓冲液:按照配比,将乙二胺四乙酸和水混合,配制成0.5M溶液;
5.异硫氰酸胍溶液:按照配比,将异硫氰酸胍和水混合,配制成6M溶液;
6.聚乙二醇溶液:按照配比,将聚乙二醇和水混合,配制成50%(w/v)溶液;
7.SDS缓冲液:按照配比,将十二烷基硫酸钠和水混合,配制成30%(w/v)溶液;
8.柠檬酸钠缓冲液:按照配比,将柠檬酸钠和水混合,配制成20%(w/v)溶液;
9.Trizma Base缓冲液:按照配比,将Trizma Base和水混合,配制成0.5M溶液。
实施例2
根据实施例1的方法制备本发明的血浆游离核酸提取试剂盒,区别仅在于试剂盒的组成及配方不同,具体地,本实施例的试剂盒组成好配方如下:
(1)磁珠裂解结合液,包括:
130mM pH 8.3的Tris-HCl缓冲液;
128mM的EDTA缓冲液;
9.2%(w/v)的SDS缓冲液;
3.0%(w/v)的柠檬酸钠缓冲液;
6%(w/v)的聚乙二醇溶液;
4.5M的异硫氰酸胍溶液;以及
余量的水,
其中,在使用前,需向所述磁珠裂解结合液中添加10%(w/v)的异丙醇,
(2)第一清洗液,包括:
6.5M的异硫氰酸胍溶液;
90mM pH 8.2的Tris-HCl缓冲液;
60mM的EDTA缓冲液;以及
余量的水,
其中,在使用前,需向所述第一清洗液中添加20%(w/v)的无水乙醇,
(3)第二清洗液,包括:
65mM的Trizma Base缓冲液;
250mM的NaCl溶液;
0.04%(w/v)的NaN3溶液;以及
余量的水,
其中,在使用前,需向所述第二清洗液中添加1倍体积的无水乙醇,
(4)洗脱液,包括:
150mM的Trizma Base缓冲液;
10mM的EDTA缓冲液;以及
余量的水。
实施例3
根据实施例1的方法制备本发明的血浆游离核酸提取试剂盒,区别仅在于试剂盒的组成及配方不同,具体地,本实施例的试剂盒组成好配方如下:
(1)磁珠裂解结合液,包括:
140mM pH 8.4的Tris-HCl缓冲液;
138mM的EDTA缓冲液;
7.2%(w/v)的SDS缓冲液;
3.5%(w/v)的柠檬酸钠缓冲液;
7%(w/v)的聚乙二醇溶液;
4.8M的异硫氰酸胍溶液;以及
余量的水,
其中,在使用前,需向所述磁珠裂解结合液中添加20%(w/v)的异丙醇,
(2)第一清洗液,包括:
7M的异硫氰酸胍溶液;
85mM pH 8.2的Tris-HCl缓冲液;
64mM的EDTA缓冲液;以及
余量的水,
其中,在使用前,需向所述第一清洗液中添加30%(w/v)的无水乙醇,
(3)第二清洗液,包括:
70mM的Trizma Base缓冲液;
300mM的NaCl溶液;
0.04%(w/v)的NaN3溶液;以及
余量的水,
其中,在使用前,需向所述第二清洗液中添加10倍体积的无水乙醇,
(4)洗脱液,包括:
200mM的Trizma Base缓冲液;
15mM的EDTA缓冲液;以及
余量的水。
实施例4
采用现有NIFTY检测流程测试实施例1制备获得的本发明的血浆游离核酸提取试剂盒的提取效果,即从临床血浆DNA提取到文库制备到上机测序最终进行数据分析对比,完整收集到整个流程的数据并且进行比较。具体如下:
一、DNA提取
利用实施例1制备获得的血浆游离核酸提取试剂盒,根据本发明的血浆游离核酸提取方法,对16个血浆样品(来源:深圳临检正常临床样本,见表1)进行游离核核酸提取。
具体步骤如下:
1.实验前按照需求准备好1.5mL保存管或96孔纯化板(适用于大批量提取);
2.单管或每孔添加10ul羟基磁珠与10ul蛋白酶K溶液(浓度为50mg/ml);
3.再加入200ul血浆;
4.漩涡震荡(管)或用移液器吹打(孔)(充分混匀);
5.加入280ul磁珠裂解结合液;
6.漩涡震荡或用移液器吹打(充分混匀);
7.静置5分钟后再次漩涡震荡或用移液器吹打(充分混匀);
8.静置5分钟;
9.放置磁力架静置1分钟,待磁珠完全被吸附后去掉上清液;
10.取下磁力架后,向磁珠中加500ul第一清洗液,震荡或移液器混匀后静置1分钟;
11.放置磁力架去除上清液后取下并加入500ul第二清洗液,震荡或移液器混匀后重新放置磁力架,去除上清液;
12.重复步骤11;
13.尽量去除上清液然后室温静置晾干,肉眼观察吸附的磁珠无明显反光(液体)后取下磁力架;
14.加入约50ul洗脱液洗脱,使磁珠充分与洗脱液混匀;
15.静置2分钟后放置磁力架,得到纯净核酸。
由此,获得16个血浆样品的核酸提取样品。
其中,实验以Magen商品化核酸提取试剂盒为对照,对照组的核酸提取按照其试剂盒的说明书中的操作指南进行。
参照下表1,16支临床血浆样品编号中含有对应的编号,尾部编号依次81-96,其中81-88号为本发明核酸提取试剂盒测试样本,称为测试组,89-96号为Magen商品化核酸提取试剂盒对照样本,称为对照组。
二、建库、测序
利用上述获得的16个血浆样品的核酸提取样品,进行建库和测序:
——建库方法使用华大基因公司特有文库制备方法,手工建库;
——测序平台采用华大基因BGISEQ-500平台。
并且,从提取后建库浓度以及片段大小两个角度来评价本发明的DNA提取效果。
其中,测序质控点:
1、建库PCR后进行利用安捷伦2100生物分析仪进行片段大小检测
结果发现,全部测试组的DNA片段大小,片段范围分布基本一致,且测试组和对照组的片段大小无明显差异。其中,图1显示了其中4个样本的片段大小检测结果。如图1所示,A、B均为测试组的片段大小检测结果;C,D为对照组的片段大小检测结果,结果显示测试组和对照组的片段大小无明显差异。
2、建库PCR后进行BMG浓度检测(即利用荧光检测仪检测DNA含量)
BMG浓度检测结果如下表所示:
表1
上述结果表明,所有核酸样品浓度均达到上机标准。
综上,从结果来看,利用本发明提取方法提取的游离核酸在片段大小,核酸浓度均达到现有上机测序标准。其中测试组(81-88)号平均建库浓度达到17.91ng/ul,而对照组(89-96)号平均建库浓度达到16.39ng/ul。结果显示测试组的平均建库浓度比对照组好。
最终测序结果:
1、测试条件以及目的
如前所述,本试验设置测试组和对照组,测试的目的是通过对比两组测序数据差异,评价发明人自主研发的本发明的血浆核酸提取试剂盒的可行性,及其相对于商品化核酸提取试剂盒的效果。
2、测试结果
表2 BGI-500测序结果
3、测试结论
从测序分析结果来看,唯一比对率与原始数据积累平均值越高越好,由于测试样品对象为人类,GC含量平均值通常在38~41左右。从本次测试结果(见表2)来看,测试组(发明人自主研发的本发明的血浆核酸提取试剂盒)比对照组(Magen商品化提取试剂盒)的核酸提取效果好。
此外,需要说明的是,本实施例完全采用市面通用测序平台对本发明的血浆游离核酸提取试剂盒进行测试,基因测序大致分为四部分:核酸提取,核酸文库制备,上机测序以及信息分析处理。上机测序前对核酸文库制备量有严格要求,文库量需达到一定值才可上机测序。因而,上述测试结果,真实可靠。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种血浆游离核酸提取方法,其特征在于,利用血浆游离核酸提取试剂盒从血浆样品中提取游离核酸;
包括以下步骤:
将磁珠、蛋白酶K溶液与血浆样品混合,以便获得第一混合物;
向所述磁珠裂解结合液中添加10-20%(w/v)的异丙醇,然后加入所述第一混合物中,以便获得第二混合物;
将所述第二混合物进行静置处理,以便获得经过静置处理的混合物;
将所述经过静置处理的混合物置于磁力架上,待磁珠完全被吸附后去掉上清液,并取下吸附有核酸的磁珠,然后对所述吸附有核酸的磁珠进行第一清洗处理,所述第一清洗处理采用添加了20-30%(w/v)的无水乙醇的第一清洗液进行;
将经过第一清洗处理的磁珠置于磁力架上,去除上清液后取下,然后进行第二清洗处理,所述第二清洗处理采用添加了1-10倍体积的无水乙醇的第二清洗液进行;
将经过第二清洗处理的磁珠置于磁力架上,去除上清液后取下,然后进行第三清洗处理,所述第三清洗处理采用添加了1-10倍体积的无水乙醇的第二清洗液进行;
将经过第三清洗处理的磁珠置于磁力架上,去除上清液,并置于室温下晾干,
将晾干的磁珠与洗脱液混合,以便对所述晾干的磁珠进行洗脱处理;以及
将洗脱处理产物置于磁力架上,以便获得核酸;
所述磁珠采用二氧化硅材质、且表面包被有羟基官能团;
所述血浆游离核酸提取试剂盒,包括:
(1)磁珠裂解结合液,包括:
100mM-1M pH 8.1-8.4的Tris-HCl缓冲液;
10mM-500mM的EDTA缓冲液;
0.1%-30%(w/v)的SDS缓冲液;
0.1%-10%(w/v)的柠檬酸钠缓冲液;
1%-50%(w/v)的聚乙二醇溶液;
0.1-10M的异硫氰酸胍溶液;以及
余量的水,
其中,在使用前,需向所述磁珠裂解结合液中添加10-20%(w/v)的异丙醇,
(2)第一清洗液,包括:
0.1-10M的异硫氰酸胍溶液;
85mM-1M pH 8.1-8.4的Tris-HCl缓冲液;
10mM-500mM的EDTA缓冲液;以及
余量的水,
其中,在使用前,需向所述第一清洗液中添加20-30%(w/v)的无水乙醇,
(3)第二清洗液,包括:
1mM-5M的Trizma Base缓冲液;
1mM-5M的NaCl溶液;
至少0.04%(w/v)的NaN3溶液;以及
余量的水,
其中,在使用前,需向所述第二清洗液中添加1-10倍体积的无水乙醇,
(4)洗脱液,包括:
1mM-0.5M的Trizma Base缓冲液;
1mM-500mM的EDTA缓冲液;以及
余量的水。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在所述磁珠裂解结合液中,Tris-HCl缓冲液的浓度为120mM,
任选地,在所述磁珠裂解结合液中,EDTA缓冲液的浓度为118mM,
任选地,在所述磁珠裂解结合液中,SDS缓冲液的浓度为8.2%(w/v),
任选地,在所述磁珠裂解结合液中,柠檬酸钠缓冲液的浓度为2.5%(w/v),
任选地,在所述磁珠裂解结合液中,聚乙二醇溶液的浓度为5%(w/v),
任选地,在所述磁珠裂解结合液中,异硫氰酸胍溶液的浓度为4.2M。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在所述第一清洗液中,异硫氰酸胍溶液的浓度为6M,
任选地,在所述第一清洗液中,Tris-HCl缓冲液的浓度为94mM,
任选地,在所述第一清洗液中,EDTA缓冲液的浓度为52mM。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在所述第二清洗液中,Trizma Base缓冲液的浓度为60mM,
任选地,在所述第二清洗液中,NaCl溶液的浓度为200mM。
5.根据权利要求1所述的血浆游离核酸提取试剂盒,其特征在于,在所述洗脱液中,Trizma Base缓冲液的浓度为100mM,
任选地,在所述洗脱液中,EDTA缓冲液的浓度为5mM。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述蛋白酶K溶液的浓度为1~100mg/ml。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述磁珠、蛋白酶K溶液、血浆样品、磁珠裂解结合液、第一清洗液、第二清洗液和洗脱液的体积比为:1:1:20:28:50:50:4~5。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,将所述第二混合物进行静置处理包括:将所述第二混合物静置5分钟后,进行震荡或用移液器吹打,然后再静置5分钟,
任选地,晾干的磁珠表现为肉眼观察磁珠无明显反光。
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