CN109504678A

CN109504678A - 基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒及应用

Info

Publication number: CN109504678A
Application number: CN201811619024.XA
Authority: CN
Inventors: 宋卉; 迟海洋; 方春生; 王笑丹; 余永红
Original assignee: Guangdong Food and Drugs Vocational College
Current assignee: Guangdong Food and Drugs Vocational College
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2019-03-22

Abstract

本发明公开了基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒及应用，属于分子生物技术领域，试剂盒包括裂解结合液、缓冲液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液，裂解结合液包含以下浓度的组分：异硫氰酸胍5～8mol/L、糖原60～100mg/L、Tris‑Cl 10～30mmol/L、EDTA 1～3mol/L、Triton X‑100 0.2％～0.5％(v/v)和异丙醇30％～40％(v/v)，裂解液结合液的溶剂为无菌水。本发明试剂盒的中裂解结合液将裂解液与结合液合二为一，大大地增强提取效率；另外，本发明试剂盒中试剂预分装在孔板内，实现核酸自动化的磁珠法提取。

Description

基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒及应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，尤其涉及基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒及应用。

背景技术

核酸提取的技术主要有酚-氯仿抽提法、碱抽提法和磁珠法，磁珠法中有使用96深孔板搭配Smart32核酸自动提取仪进行提取。然而这些方法均存在一些不足，如酚-氯仿抽提法能够获得较好质量的核酸，其用到的化学物质(如：氯仿、苯酚等)的毒性不可忽略，对操作人员的安全有很大威胁，而且整个提取过程耗时长。另外，现有技术没有完全实现自动化，多数是半自动化的，这给操作人员带来极大的不便。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒及应用，本发明试剂盒的中裂解结合液将裂解液与结合液合二为一，大大地增强提取效率；另外，本发明试剂盒中试剂预分装在孔板内，实现核酸自动化的磁珠法提取。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒，其包括裂解结合液、缓冲液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液，所述裂解结合液包含以下浓度的组分：异硫氰酸胍5～8mol/L、糖原60～100mg/L、Tris-Cl10～30mmol/L、EDTA 1～3mol/L、Triton X-100 0.2％～0.5％(v/v)和异丙醇30％～40％(v/v)，所述裂解液结合液的溶剂为无菌水。

异硫氰酸胍作为蛋白变性剂，通过变性蛋白从而裂解细胞。糖原可作为核酸助沉剂。Tris-Cl溶液在裂解过程中使DNA保持稳定的二级结构。EDTA是一种能与Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺等二价金属离子结合的螯合剂，其作为核酸酶抑制剂。Triton X-100是一种非离子型表面活性剂，其能够溶解细胞内的脂质，增加细胞膜的通透性，有助于核酸的释放。本发明裂解结合液将裂解液与结合液合二为一，既能裂解细胞，又能为核酸与磁珠的结合提供合适的环境，减少了操作步骤和提高核酸提取的质量。

作为上述技术方案的改进，试剂盒还包含消化液，所述消化液包含以下浓度的组分：Nacl 10～20mmol/L和SDS 0.01％～0.05％(w/v)，所述消化液的溶剂为无菌水。

在处理干血片、口拭子等复杂样本时，需要对样本进行初步消化，有助于更好的裂解。其中，NaCl提供了一个高盐环境，有助于蛋白质变性；SDS是常用的离子型表面活性剂，可使细胞膜裂解，通过与膜蛋白疏水部分结合并使其与膜分离，高浓度的SDS还可以破坏蛋白质中的离子键和氢键等非共价键，从而改变蛋白质的构象。

作为上述技术方案的改进，所述缓冲液包含浓度为0.1％～1％(v/v)的TritonX-100，所述缓冲液的溶剂为无菌水；缓冲液有助于磁珠与磁棒更好的结合。

作为上述技术方案的改进，所述洗涤液Ⅰ包含以下浓度的组分：高氯酸钠0.5～2mol/L和乙醇40％～60％(v/v)，所述洗涤液Ⅰ的溶剂为无菌水；所述洗涤液Ⅱ包含浓度为40％～60％(v/v)的乙醇，所述洗涤液Ⅱ的溶剂为无菌水。

洗涤液Ⅰ可以洗去沾在核酸表面的蛋白质，其中高氯酸钠为强氧化剂，也是高离液盐，能有效洗去蛋白质。洗涤液Ⅱ洗去沾在核酸表面的盐离子。

作为上述技术方案的改进，所述洗脱液包含浓度为10～30mmol/L且pH为8的Tris-Cl，所述洗脱液的溶剂为无菌水。洗脱液可以溶解核酸，稳定保存DNA和RNA。

作为上述技术方案的改进，所述裂解结合液包含以下浓度的组分：异硫氰酸胍6mol/L、糖原80mg/L、Tris-Cl 20mmol/L、EDTA 2mol/L、Triton X-100 0.5％

(v/v)和异丙醇35％(v/v)，所述裂解液结合液的溶剂为无菌水；

所述消化液包含以下浓度的组分：Nacl 10mmol/L和SDS 0.03％(w/v)，所述消化液的溶剂为无菌水；

所述缓冲液包含浓度为0.2％(v/v)的Triton X-100，所述缓冲液的溶剂为无菌水；

所述洗涤液Ⅰ包含以下浓度的组分：高氯酸钠2mol/L和乙醇50％(v/v)，所述洗涤液Ⅰ的溶剂为无菌水；所述洗涤液Ⅱ包含浓度为50％(v/v)的乙醇，所述洗涤液Ⅱ的溶剂为无菌水；

所述洗脱液包含浓度为20mmol/L且pH为8的Tris-Cl，所述洗脱液的溶剂为无菌水。

作为上述技术方案的进一步改进，所述裂解结合液、缓冲液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液预分装在孔板中，试剂预分装后孔板进行分膜处理。

作为上述技术方案的更进一步改进，所述试剂盒采用预分装孔板模式，所述孔板为96孔，第1列和第7列预分装的是裂解结合液，第2列和第8列预分装的是磁珠和缓冲液，第3列和第9列预分装的是洗涤液Ⅰ，第4、5列和10、11列预分装的是洗涤液Ⅱ，第6列和第12列预分装的是洗脱液。

作为上述技术方案的更进一步改进，预分装的裂解结合液的体积为200μl，预分装的磁珠液的体积为20μl，预分装的缓冲液的体积为200μl，预分装的洗涤液Ⅰ的体积为500μl，预分装的洗涤液Ⅱ的体积为500μl，预分装的洗脱液的体积为100μl。

作为上述技术方案的更进一步改进，当样本为液体时，裂解结合液中加入20μl蛋白酶K和200μl样本；当样本为非液体时，将样本剪成碎块，并加入2ml消化液和200μl蛋白酶K，消化结束后即得混合液，向裂解结合液中加入200μl混合液；所述蛋白酶K的浓度为20mg/ml。

另外，本发明还提供预分装孔板模式的试剂盒在核酸自动提取仪smart 32或S48的程序，仅列出96孔板中1～6列孔：

1)第1列孔内通过裂解结合液，先释放核酸；

2)磁棒转到第2列孔内，在缓冲液的作用下吸附磁珠；

3)带有磁珠的磁棒转到第1列孔内，磁珠与核酸结合；

4)带有核酸的磁棒转到第3列孔内，在洗涤液Ⅰ的作用下洗去核酸上的蛋白质；

5)带有核酸的磁棒转到第4列孔内，在洗涤液Ⅱ的作用下洗去核酸上多余的糖类、盐类等杂质；

6)带有核酸的磁棒转到第5列孔内，继续在洗涤液Ⅱ的作用下洗去核酸上面多余的糖类、盐类等杂质；

7)带有核酸的磁棒转到第6列孔，在55℃干燥4分钟，使残余的乙醇挥干；然后在洗脱液的作用下，使核酸从磁珠上分离下来，从而达到洗脱的目的；

8)带有磁珠的磁棒转到第4列孔，将磁珠弃下，实验结束。

另外，本发明还提供液体样本的核酸提取方法，所示液体样本为全血、血清、血浆或唾液，其包括以下步骤：

1)将预分装深孔板颠倒混匀后瞬时离心10s，小心撕开封膜，并在第1列孔中加入200μl的待测样本和20微升蛋白酶K；

2)在核酸提取仪上设置提取程序，然后进行核酸的全自动提取；

3)提取程序运行完成后，取出预分装深孔板，其中第6列孔的溶液即为核酸溶液。

另外，本发明还提供非液体样本的核酸提取方法，所示非液体样本为干血片，其包括以下步骤：

1)用剪刀将非液体样本剪成碎片；

2)在5ml离心管中加入碎片、2ml消化液和200μl蛋白酶K；

3)振荡混匀，高速离心10s，56℃温育30min，其间不时颠倒180度振荡，消化结束后即得混合液；

4)将预分装深孔板颠倒混匀后瞬时离心10s，小心撕开封膜，并在第1列孔中加入200μl混合液；

5)在核酸提取仪上设置提取程序，然后进行核酸的全自动提取；

6)提取程序运行完成后，取出预分装深孔板，其中第6列孔的溶液即为核酸溶液。

本发明有益效果：本发明提供基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒及应用，本发明试剂盒具有以下优点：

1)提取效率高：裂解结合液将裂解液与结合液合二为一，不仅能够强力快速裂解样本释放大量核酸，而且能够为磁珠结合核酸提供稳定的环境，大大地增强提取效率，更经济有效；

2)缩短提取时间：本试剂盒采用的是预分装孔板模式，加样时间在5分钟以内，自动化程度高，32个样本能够同时在30min内完成，而于手提法(每一步都人工操作，误差大)等试剂盒提取30个左右样本至少需要120min，本发明试剂盒大大缩减了提取所需时间和人力劳动；

3)自动化程度高，减少人为的失误和实验带来的误差。

附图说明

图1为全血样本的实时荧光定量PCR的图谱；

图2为干血片样本的实时荧光定量PCR的图谱。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例提供一种基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒，其包括裂解结合液、消化液缓冲液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液，裂解结合液由以下浓度的组分组成：异硫氰酸胍6mol/L、糖原80mg/L、Tris-Cl 20mmol/L、EDTA 2mol/L、Triton X-100 0.5％(v/v)和异丙醇35％(v/v)，裂解液结合液的溶剂为无菌水；

消化液由以下浓度的组分组成：Nacl 10mmol/L和SDS 0.03％(w/v)，消化液的溶剂为；缓冲液是浓度为0.2％(v/v)的Triton X-100无菌水溶液；洗涤液Ⅰ由以下浓度的组分组成：高氯酸钠2mol/L和乙醇50％(v/v)，洗涤液Ⅰ的溶剂为无菌水；洗涤液Ⅱ是浓度为50％(v/v)的乙醇无菌水溶液；洗脱液是浓度为20mmol/L且pH为8的Tris-Cl无菌水溶液。

另外，本发明试剂盒还可以采用预分装孔板模式。

实施例2

本实施例提供一种基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒，其包括裂解结合液、消化液缓冲液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液，裂解结合液由以下浓度的组分组成：异硫氰酸胍5mol/L、糖原60mg/L、Tris-Cl 30mmol/L、EDTA 3mol/L、Triton X-100 0.2％(v/v)和异丙醇30％(v/v)，裂解液结合液的溶剂为无菌水；

消化液由以下浓度的组分组成：Nacl 17mmol/L和SDS 0.01％(w/v)，消化液的溶剂为；缓冲液是浓度为0.1％(v/v)的Triton X-100无菌水溶液；洗涤液Ⅰ由以下浓度的组分组成：高氯酸钠0.5mol/L和乙醇40％(v/v)，洗涤液Ⅰ的溶剂为无菌水；洗涤液Ⅱ是浓度为40％(v/v)的乙醇无菌水溶液；洗脱液是浓度为10mmol/L且pH为8的Tris-Cl无菌水溶液。

另外，本发明试剂盒还可以采用预分装孔板模式。

实施例3

本实施例提供一种基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒，其包括裂解结合液、消化液缓冲液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液，裂解结合液由以下浓度的组分组成：异硫氰酸胍8mol/L、糖原100mg/L、Tris-Cl 10mmol/L、EDTA 1mol/L、Triton X-100 0.4％(v/v)和异丙醇40％(v/v)，裂解液结合液的溶剂为无菌水；

消化液由以下浓度的组分组成：Nacl 20mmol/L和SDS 0.05％(w/v)，消化液的溶剂为；缓冲液是浓度为1％(v/v)的Triton X-100无菌水溶液；洗涤液Ⅰ由以下浓度的组分组成：高氯酸钠1.7mol/L和乙醇60％(v/v)，洗涤液Ⅰ的溶剂为无菌水；洗涤液Ⅱ是浓度为60％(v/v)的乙醇无菌水溶液；洗脱液是浓度为30mmol/L且pH为8的Tris-Cl无菌水溶液。

另外，本发明试剂盒还可以采用预分装孔板模式。

液体样本核酸提取

预分装孔板模式的试剂盒在核酸自动提取仪smart 32中进行核酸提取，孔板为96孔，表1中仅列出96孔板中1～6列孔。

表1

液体样本的核酸提取方法包括以下步骤：

1)将预分装深孔板颠倒混匀后瞬时离心10秒，小心撕开封膜，并在第1列入200μl的待测样本和20微升蛋白酶K；

2)按照上面表1在核酸提取仪上设置提取程序，然后进行核酸的全自动提取；

非液体样本核酸提取

非液体样本的核酸提取方法包括以下步骤：

1)用剪刀将非液体样本剪成碎片；

2)在5ml离心管中加入碎片、2ml消化液和200μl蛋白酶K；

3)振荡混匀，高速离心10秒，56℃温育30min，其间不时颠倒180度振荡，消化结束后即得混合液；

4)将预分装深孔板颠倒混匀后瞬时离心10秒，小心撕开封膜，并在第1列孔加入200μl混合液；

5)按照上面表1在核酸提取仪上设置提取程序，然后进行核酸的全自动提取；

提取效率比较

采用实施例1的试剂盒与美基生物科技有限公司的6310试剂盒对全血进行提取，并OD值检测：使用超微量分光光度计K5500plus对实验组和对照组提取得到的DNA进行OD值检测，检测结果如表2所示。

表2

如表2所示本发明方法从血液中提取得到的DNA产物浓度高、纯度优，且试剂盒测试结果较稳定。

试剂盒灵敏度和稳定性测试

1)采用实施例1的试剂盒与美基生物科技有限公司的6310试剂盒对全血进行提取，提取之后进行实时荧光定量PCR操作：以提取基因中GAPDH为扩增目的基因。如表3和图1所示，本发明试剂盒的Cq值更小，CV值在10％以内；由此可见，本发明试剂盒的灵敏度更好。

表3

Cq	6310试剂盒	本发明试剂盒
			M1	24.30	23.02
M2	24.26	23.03
			M3	24.26	23.11
CV值	0.10％	0.21％

2)采用实施例1的试剂盒与美基生物科技有限公司的6310试剂盒对干血片进行提取，提取之后进行实时荧光定量PCR操作：以提取基因中GAPDH为扩增目的基因。如表4和图2所示，本发明试剂盒稳定性较好；表4中Noct表示未扩增出。

表4

Cq	6310试剂盒	本发明试剂盒
			M1	28.25	26.67
M2	28.61	26.88
			M3	Noct	26.83
M4	Noct	27.05
			CV值	0.90％	0.58％

以上仅列出本发明实施例1中试剂盒进行性能测定，本发明其他实施例中试剂盒也可以取得类似的技术效果。

最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒，其特征在于，包括裂解结合液、缓冲液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液，所述裂解结合液包含以下浓度的组分：异硫氰酸胍5～8mol/L、糖原60～100mg/L、Tris-Cl 10～30mmol/L、EDTA 1～3mol/L、Triton X-100 0.2％～0.5％(v/v)和异丙醇30％～40％(v/v)，所述裂解液结合液的溶剂为无菌水。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包含消化液，所述消化液包含以下浓度的组分：Nacl 10～20mmol/L和SDS 0.01％～0.05％(w/v)，所述消化液的溶剂为无菌水。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包含浓度为0.1％～1％(v/v)的Triton X-100，所述缓冲液的溶剂为无菌水。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液Ⅰ包含以下浓度的组分：高氯酸钠0.5～2mol/L和乙醇40％～60％(v/v)，所述洗涤液Ⅰ的溶剂为无菌水；所述洗涤液Ⅱ包含浓度为40％～60％(v/v)的乙醇，所述洗涤液Ⅱ的溶剂为无菌水。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包含浓度为10～30mmol/L且pH为8的Tris-Cl，所述洗脱液的溶剂为无菌水。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解结合液包含以下浓度的组分：异硫氰酸胍6mol/L、糖原80mg/L、Tris-Cl 20mmol/L、EDTA 2mol/L、Triton X-100 0.5％(v/v)和异丙醇35％(v/v)，所述裂解液结合液的溶剂为无菌水；

7.如权利要求1～6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解结合液、缓冲液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液预分装在孔板中，试剂预分装后孔板进行分膜处理。

8.如权要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用预分装孔板模式，所述孔板为96孔，第1列和第7列预分装的是裂解结合液，第2列和第8列预分装的是磁珠和缓冲液，第3列和第9列预分装的是洗涤液Ⅰ，第4、5列和10、11列预分装的是洗涤液Ⅱ，第6列和第12列预分装的是洗脱液。

9.如权要求8所述的试剂盒，其特征在于，预分装的裂解结合液的体积为200μl，预分装的磁珠液的体积为20μl，预分装的缓冲液的体积为200μl，预分装的洗涤液Ⅰ的体积为500μl，预分装的洗涤液Ⅱ的体积为500μl，预分装的洗脱液的体积为100μl。

10.如权要求8所述的试剂盒在核酸提取中的应用，其特征在于，当样本为液体时，裂解结合液中加入20μl蛋白酶K和200μl样本；当样本为非液体时，将样本剪成碎块，并加入2ml消化液和200μl蛋白酶K，消化结束后即得混合液，向裂解结合液中加入200μl混合液；所述蛋白酶K的浓度为20mg/ml。