CN110257368A - 从含有游离核酸的样品中分离游离核酸的方法和*** - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从含有游离核酸的样品中分离游离核酸的方法，其包括在测试样品中加入蛋白酶K和与裂解‑结合溶液，离心后加入醇类物质并与固相载体接触，使样品中的游离核酸结合到所述固相载体，再用一种或多种洗涤溶液洗涤所述固相载体，最后向所述固相载体加入洗脱液，得到目标产物游离核酸；其中所述裂解‑结合溶液的pH为酸性，且所有步骤在常温条件下进行。本发明还公开了一种分离游离核酸的***，其包括裂解‑结合溶液、洗涤溶液、洗脱溶液，以及储液管、核酸纯化柱管，和真空适配管。本发明所述的分离游离核酸的方法和***，操作简便，成本经济，适用性广，得率高纯度可靠，具有广泛的应用价值和良好的市场前景。

Description

从含有游离核酸的样品中分离游离核酸的方法和***

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及从含有游离核酸的样品中分离游离核酸的方法和***。

背景技术

游离核酸广泛应用于分子生物学领域的研究和临床分析。尤其是在精准医学快速发展的今天，诸多基于液体活检技术的检测和诊断都需要先从样品比如说血浆样品中分离获取细胞游离核酸。现有技术中大量存在分离来自细胞核酸的方法和试剂盒，但鉴于游离核酸具有微量及小片段的特征，在提取过程中容易丢失，目前市场上对于分离游离核酸的选择很有限。常用的核酸提取方法有硅胶膜吸附柱法、酚-氯仿法和磁珠法。硅胶膜吸附柱法快速简便纯度高，但是现有产品更适用于分离较完整的基因组DNA而不是游离核酸；酚-氯仿法的优点是成本低，但是效率低重复率差而且有毒；磁珠法通量高自动化程度好速度快，但是纯度低且易出现盐分残留，不适用微量核酸。

对于主流的核酸分离方法：硅胶膜吸附柱法，最新研究发现DNA与柱表面结合的主要方式是其磷酸基团与柱表面硅烷醇基团之间形成的氢键。加入缓冲液形成阳离子桥的作用是帮助DNA与硅烷醇形成氢键，故缓冲液中盐离子的种类和浓度都对DNA与柱表面的结合效率起到至关重要的影响。同时，pH值和温度也是影响结合纯度和得率的重要因素。目前市场的核酸分离产品主要采取先裂解样本和结合到柱相分离的步骤，使用不同的缓冲液和温度、pH条件，通常在热水浴孵育裂解样本后还要冷却放置后才能结合上柱，步骤繁杂，操作条件苛刻，不能很好地满足大量多次分离获取游离核酸的需求。

发明内容

如何在保证得率和纯度的前提下，尽量减少游离核酸分离提取所需的步骤，放宽反应条件，节约时间和经济成本，是本发明主要解决的技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供一种从含有游离核酸的测试样品中分离游离核酸的方法，其包括：

1)在所述测试样品中加入蛋白酶K和裂解-结合溶液得到待结合样品；

2)将所述待结合样品离心后加入醇类物质；

3)将上一步加入了醇类的待结合样品与固相载体接触，使所述待结合样品中的游离核酸结合到所述固相载体；

4)用一种或多种洗涤溶液洗涤所述固相载体，用于去除目标产物游离核酸以外的物质；

5)向所述固相载体加入洗脱液，用于洗脱结合于所述固相载体的游离核酸，得到目标产物游离核酸；

其中所述裂解-结合溶液的pH为酸性，且上述所有步骤在常温下进行。

另一方面，本发明还提供一种用于从含有游离核酸的测试样品中分离游离核酸的***，其包括适用于所述本发明从含有游离核酸的样品中分离游离核酸的方法的裂解-结合溶液、洗涤溶液、以及洗脱溶液。

具体实施方式

本发明发明人经过大量探索性研究，提供了一种从含有游离核酸的样品中分离游离核酸的方法，所述分离游离核酸的方法操作简单、结果可靠，尤其对于非核来源的游离核酸具有良好的分离提取效果，在此基础上完成了本发明。

本发明第一方面提供一种从含有游离核酸的测试样品中分离游离核酸的方法，其包括：

1)在所述测试样品中加入蛋白酶K和裂解-结合溶液得到待结合样品；

2)将所述待结合样品离心后加入醇类物质；

3)将上一步加入了醇类的待结合样品与一固相载体接触，使所述待结合样品中的游离核酸结合到所述固相载体；

4)用一种或多种洗涤溶液洗涤所述固相载体，用于去除目标产物游离核酸以外的物质；

5)向所述固相载体加入洗脱液，用于洗脱结合于所述固相载体的游离核酸，得到目标产物游离核酸样本。

其中所述裂解-结合溶液的pH为酸性，其与测试样品的体积比在0.5～2之间，优选为1：1，且上述所有步骤在常温条件下进行。该固相载体通常可以是核酸吸附纯化柱，进一步可以是表面为硅胶膜的DNA或RNA吸附纯化柱。不同步骤要求不同的pH值和温度，是现有技术中裂解样品和结合固相载体需要在不同条件下分阶段完成，导致实验步骤冗余的关键原因。pH值是影响DNA与硅胶膜结合的重要因素，因为它直接影响DNA和硅-氧键水化形成的硅烷醇基团的带电性，而后者又是盐桥和氢键形成的基础。DNA在pH值3-9的广泛条件下呈酸性，二氧化硅处在pH值5-7这个区间时，其表面的硅烷醇基团较多，有利于DNA吸附。但如果pH超过7，二氧化硅表面电荷大幅改变，通过氢键吸附DNA的能力将开始降低，所以DNA与硅胶膜结合一般在酸性pH值条件下完成。但是，由于提取核DNA需要先破坏细胞膜，裂解缓冲液中通常需要包含用于破坏细胞膜的表面活性剂，而表面活性剂通常在碱性条件下才能稳定存在，所以现有技术通常选择碱性裂解液裂解含核酸的样本再在酸性结合溶液存在下将核酸结合到核酸纯化柱，这就造成了成本的增加和步骤的冗余。裂解和结合两者对温度的要求也不同。裂解离心后需要热水浴孵育，但水浴的高温可能使DNA结构不稳定。为了使DNA与硅烷醇基团顺利合成氢键，通常需要将孵育后的样本置于冰上数分钟冷却充分，如此一来又增加了制冰成本和冷却步骤的时间成本。对于上述现有技术的缺陷，本发明的一处创新是不依赖碱性稳定的表面活性剂，将裂解溶液和结合溶液合而为裂解-结合溶液，一次加入，常温操作，离心后只需再加入易获得且成本低廉的乙醇或异丙醇，就能上柱结合，简便易行。

本发明所述分离游离核酸的方法中，步骤1)包括加入裂解-结合溶液和蛋白酶K。所述裂解-结合溶液可以包括离液盐，其作用是发挥离液活性，即破坏水分子之间的氢键网络，通过减弱疏水效应而影响溶液中蛋白质、核酸的天然状态的稳定性，帮助DNA分子与硅烷醇基团形成氢键。同时它们还能灭活RNase和DNase等核酸酶，保护核酸分子的完整性。离液盐通常可以是胍盐，具体的可以是硫氰酸胍、异硫氰酸胍或盐酸胍等。蛋白酶K是比活性很高的强力蛋白溶解酶，用于溶解样本中主要的非目标大分子：蛋白质，是游离核酸分离试剂中的重要角色。本发明分离方法选用的蛋白酶K终浓度在15mg/mL～40mg/mL之间。所述裂解-结合溶液通常还可以包括尿素，用于配合蛋白酶K裂解样本中的蛋白质。所述裂解-结合溶液还可以包括Tris-HCl和/或TritonX-100，用于为DNA提供稳态环境。裂解-结合溶液的pH值通常在3.0～5.5之间，这是由于分离游离核酸不需要用于破坏细胞膜的在碱性条件下才能稳定存在的表面活性剂，使得裂解和结合都可在酸性条件下完成。本发明所述的分离方法，步骤1)中除了加入分离-结合溶液和蛋白酶K外，还可以加入载体RNA。由于游离核酸在起始样本中含量很低，而结合和洗脱效率很大程度上受到起始浓度的影响，加入载体RNA可同时优化结合效率和洗脱效率，用于提高得率。在提取游离RNA时载体RNA还能起到减少RNA酶对游离RNA的降解从而保护RNA的作用。本发明所述的分离方法，在步骤1)和2)之间还包括对待结合样本的孵育步骤，用以充***解样本。孵育温度可以在50℃～70℃之间，时间为半小时，所述孵育步骤还包括孵育后的短暂离心。孵育和离心后只需加入醇类物质涡旋混匀，待上柱结合的样本即制备完成。加入醇类的目的是通过降低水溶液的介电常数促进DNA与硅烷醇基团的结合。对于已经形成的DNA-硅烷醇沉淀复合物，醇类可以洗去残留的盐离子，但又不破坏所述沉淀复合物。所述醇类使用常见的乙醇或异丙醇即可。

本发明所述分离游离核酸的方法中，步骤3)中所述的待结合样品与核酸吸附纯化柱的结合通常在常温和负压条件下进行，优选的，所述负压在-300mbar到-800mbar之间，既使待结合样品中的游离核酸最大程度地结合上柱以保证得率，又不至于导致吸附纯化柱堵塞。对于少数非目标分子极难通过核酸纯化柱管的情况，本发明步骤3)还可以包括对待结合样品中的非目标组分进行加压过滤。比如说，所述加压过滤可以是用与储液管内径尺寸相匹配的柱塞进行手动加压过滤，也可以是自动加压过滤装置提供的自动加压过滤。此步骤仅在少数样品成分复杂极难过柱的情况下选用。为了保证整个抽提过程的密封性，在本发明游离核酸分离***的储液管底部或真空适配管顶部可以设置有O型密封圈，用于保障与核酸纯化柱管顶端和末端连接处的气密性，防止液体渗漏。

本发明所述分离游离核酸的方法中，步骤4)中所述的洗涤溶液可以为一种或多种，优选的可以为两种，分别是洗涤溶液1和洗涤溶液2，且两者皆加入无水乙醇帮助洗去残留的盐离子。更优选的，所述洗涤溶液1也含有胍盐或其它离液盐以维持DNA-硅烷醇复合物的稳定性。进一步优选的，洗涤溶液1为弱酸性，其pH在6～7之间，洗涤溶液2为弱碱性，其pH在7～8之间时，洗涤效果最佳，既不影响目标复合物的稳定性又能最大程度的洗去杂分子。加入每种洗涤溶液后的洗涤次数为一次或多次，洗涤方法可以是真空抽滤、离心过滤或两者的结合。在本发明的一个实施例中，加入洗涤溶液2后采取了先真空抽滤后再离心过滤的洗涤方法，得到了良好的抽提效果。

本发明所述分离游离核酸的方法中，步骤5)所述的洗脱溶液与初始测试样本，比如说可以是血浆样本的体积比在1：125到1：50之间为合适。具体地说，对于5mL血浆样本，洗脱溶液的体积可以在40ul到100ul的区间内选择。在本发明的一个实施例中，对于5mL血浆样本，洗脱溶液的体积在从40ul到100ul的四个梯度中取得了相近的抽提效果。所述洗脱溶液可以包含Tris盐酸，pH值在7.0～9.0之间，洗脱效果明显优于使用纯水。本发明所述的分离方法还可以包括对所述步骤5)得到的溶于洗脱溶液的游离核酸进行定量。由于提取的游离核酸浓度通常很低，所以不适合用紫外吸收等粗放的定量方法，而应选取灵敏度较高的定量方法，比如PCR法，具体的比如可以是荧光定量PCR等。

本发明所述分离游离核酸的方法既可以用于分离游离DNA又可以用于分离游离RNA，分离RNA时可以在步骤1)加入载体RNA提高得率。本发明所述方法可以从血浆、组织、尿液、体液或唾液样品等广泛来源的样本中分离游离核酸，应用范围广。

本发明另一方面提供一种从含有游离核酸的测试样品中分离游离核酸的***，其包括适用于本发明第一方面所述的从含有游离核酸的测试样品中分离游离核酸的方法的裂解-结合溶液、洗涤溶液和洗脱溶液。本发明分离游离核酸的***中，所述裂解-结合溶液、洗涤溶液和洗脱溶液的主要成分在本发明第一方面已经详细描述，在此不作赘述。

本发明从含有游离核酸的测试样品中分离游离核酸的***还可以包括用于容纳所述测试样品和试剂的储液管，内设核酸纯化柱并可与所述储液管相连的核酸纯化柱管，以及用于连接所述核酸纯化柱管与真空抽滤组件的真空适配管。本发明一实施例中比较了不同厂商的核酸纯化柱和本发明分离试剂的搭配，选出了最优组合作为本发明游离核酸分离***的组成部分。储液管用于容纳测试样品和与所述测试样品反应的各种试剂，其末端可与核酸纯化柱管顶端紧密相连。核酸纯化柱管内设预有核酸纯化柱，其顶端可与所述储液管末端相连，其末端又可与真空适配管的顶端相连。真空适配管用于连接核酸纯化柱管末端和真空抽滤组件，当真空泵开启时，由储液管、核酸纯化柱管、真空适配管、真空抽滤组件组成的连接***能形成抽提所需的负压状态。

本发明所提供的从含有游离核酸的测试样品中分离游离核酸的***中，还可以包括以下组分或组件的一种或多种：蛋白酶K，载体RNA，废液收集管，以及加压装置。所述加压装置可以是与储液管内径相匹配的加压柱塞。储液管末端或真空适配管顶端还可以设置有O型密封圈，分别与核酸纯化柱管的顶端和末端相匹配，用于加强气密性防止液体渗漏。这些组分、组件及其优选方案也已在本发明第一方面详细描述。

本发明的有益效果在于，首先，基于分离游离核酸不需要破坏细胞膜的特点，将裂解溶液和结合溶液，以及裂解步骤和结合前的准备步骤合而为一，简化了操作的同时节约了时间和经济成本；其次，除了裂解后的水浴孵育，所有操作在常温下进行，宽松了实验条件，降低了操作失误的几率，也节省了转换温度条件所需的操作时间和实现该条件的成本；再次，本发明所需的各种辅助试剂和设备皆为常用，入手门槛低，有利于大量多次常规提取需求的满足；最后，本发明所述方法和***既能用于分离DNA也可以用于分离RNA，并适用于各种不同来源的原始样本，应用范围广泛。综上所述，本发明所述的分离游离核酸的方法和***，操作简便，成本经济，适用性广，得率高纯度可靠，具有广泛的应用价值和良好的市场前景。

附图说明

图1是用本发明一实施例中分离游离核酸方法的基本流程图

图2是本发明方法一实施例和现有技术用于分离游离核酸的结果对比图

图3是本发明一实施例中不同洗脱溶液体积下分离游离核酸的结果对比图

实施例1.用本发明方法对血浆游离DNA进行分离的操作流程

主要试剂与材料

1.本发明提供的游离核酸分离***：

包括储液管，核酸纯化柱管，真空适配管，废液收集管，蛋白酶K计130mg，裂解-结合溶液计270mL，洗涤溶液浓缩液W1计41mL，洗涤溶液浓缩液W2计20mL，洗脱溶液EB计10mL。其中核酸纯化柱管采用MACHEREY-NAGEL生产的DNA Plasma.

2.仪器及其它试剂

仪器：台式离心机(适用1.5mL离心管，离心力可达13000×g以上)，离心机(适用15mL离心管，离心力可达2500×g以上)，水浴锅，真空泵，真空适配组件采用QIAgen生产的QIAvac 24Plus vacuum manifold，以及1.5mL离心管若干。

3.其它试剂：无水乙醇，异丙醇，PBS溶液或生理盐水；

实验方法

实验方法的基本流程如图1所示。

一、样本准备

1.用常规方法于2小时内从新鲜血液中制备2～5mL血浆，操作中避免吸到血细胞或沉淀物。

1)如果血浆体积不足2mL，用PBS溶液或生理盐水补齐至2mL。

2)如果血浆体积2～3mL，用PBS溶液或生理盐水补齐至3mL。

3)如果血浆体积3～4mL，用PBS溶液或生理盐水补齐至4mL。

4)如果血浆体积4～5mL，用PBS溶液或生理盐水补齐至5mL。

二、试剂准备

1.向2～6℃保存的130mg蛋白酶K中加入5.2mL去离子水，充分混匀溶解。

2.向41mL洗涤溶液浓缩液W1中加入25mL无水乙醇，充分混匀备用。

3.向20mL洗涤溶液浓缩液W2中加入80mL无水乙醇，充分混匀备用。

三、游离核酸的分离纯化步骤

1.将准备好血浆样本小心转移至15mL离心管中。

2.向装有2～5mL血浆的15mL离心管加入与血浆等体积的裂解-结合溶液PL和100uL上一步备好的蛋白酶K，充分颠倒混匀15-20次，25℃下2500g离心10秒。

3.将离心后的样本放置水浴锅56℃孵育30分钟，注意水浴锅的水应没过15mL离心管液面。

4.将真空泵和QIAvac 24Plus vacuum manifold真空适配组件连接好，将与样本管数相应的真空适配管***真空适配组件的小孔中，依次连接真空适配管、核酸纯化柱管及储液管，确保各个装置紧密连接，并备好废液收集管。

5.步骤3结束后将样本取出，25℃下2500g离心10秒，并根据样本体积加入相应体积的异丙醇：

①2mL血浆样本加入1mL异丙醇。

②3mL血浆样本加入1.5mL异丙醇。

③4mL血浆样本加入2mL异丙醇。

④5mL血浆样本加入2.5mL异丙醇。

加入异丙醇后充分颠倒混匀15-20次，25℃下2500g离心10秒。

6.将离心后的样本小心转入连接好的储液管中，打开真空泵，将负压控制在-300～-800mbar范围内，使液体平缓穿过核酸纯化柱管内的核酸纯化柱，防止液体渗漏，防止样本损失和交叉污染。

7.待所有液体穿过核酸纯化柱管后，关掉真空泵，小心将储液管拆下并丢弃。

8.保持核酸纯化柱管的开盖状态，加入600μL上一步备好的洗涤溶液W1，打开真空泵，使所有液体穿过核酸纯化柱。

9.重复步骤8。

10.保持核酸纯化柱管的开盖状态，加入800μL上一步备好的洗涤溶液W2，打开真空泵，使所有液体穿过核酸纯化柱。

11.重复步骤10。

12.保持核酸纯化柱管的开盖状态，小心将核酸纯化柱管拆下并放入步骤4备好的废液收集管中，再次加入800μL洗涤溶液W2，盖紧盖子，颠倒2-3次后在25℃下13000g离心1分钟。

13.将核酸纯化柱管小心取出，转入一新的废液收集管，25℃下13000g离心3分钟。

14.将核酸纯化柱管小心取出，转入一新的废液收集管后，轻轻揭开核酸纯化柱管的盖子，加入40～100ul洗脱溶液，室温放置3min。

15.将加入洗脱溶液的样本以13000g离心1分钟，收集到的液体即为分离好的血浆游离核酸样本，将其转入新的干净1.5mL离心管，于2-8℃保存并于24小时内使用，或-20℃长期保存。

实施例2.不同分离试剂与核酸纯化柱组合的性能对比实验

一、主要试剂与材料：

1.新鲜血浆样本12例，每例2mL。

2.不同游离核酸分离试剂与核酸纯化柱的组合，具体如下：

A：FavorPrep Circulating Nucleic Acid Isolation Kit，包括整套试剂盒的试剂与纯化柱；

B：FavorPrep Circulating Nucleic Acid Isolation Kit中的试剂搭配MACHEREY-NAGEL的DNA Plasma核酸纯化柱；

C：本发明游离核酸分离***，包括实施例1中所述的试剂、耗材和MACHEREY-NAGEL的DNA Plasma核酸纯化柱；

D：QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit中的试剂搭配MACHEREY-NAGEL的DNA Plasma核酸纯化柱；

E：实施例1中所述的本发明游离核酸分离***的试剂搭配FavorPrepCirculating Nucleic Acid Isolation Kit核酸纯化柱；

F：实施例1中所述的本发明游离核酸分离***的试剂搭配FavorPrep ViralNucleic Acid Extraction KitⅠ核酸纯化柱。

共6种条件组合，每种条件各使用2例2mL的血浆样本。

二、实验方法：

按照实施例1所述的游离核酸的分离纯化步骤以及各试剂盒和核酸纯化柱的说明书中的操作方法分离血浆样本中的游离DNA，洗脱溶液体积均为100μL.

三、用PCR法定量检测分离得到的游离DNA.

检测引物及探针由百利格生物合成，其序列如下所示。

F858-SL1：TTCCGCACCCAGCAGTTT

R858-SL1：TGTCAAGATCACAGATTTTGGGC

MGB858-SL1：GCCAGGAACGTACTGGTG

反应体系如表1所示，其中校准品按照常规分子克隆方法构建。

表1.

反应程序如表2所示。

表2.

四、结果与讨论：

6种条件组合的定量检测结果如图2所示。其中每个柱形顶部的数值为该条件下2个样本所得cfDNA拷贝数的算术平均值。

由图2可见，采用本发明游离核酸分离***得到的产物cfDNA拷贝数最多，显示出本发明分离***对游离核酸良好的分离效果。

实施例3.洗脱溶液体积对比实验

一、主要试剂与材料

新鲜血浆样本8例，每例5mL。

本发明分离游离核酸的***，包括实施例1中所述的试剂、耗材和MACHEREY-NAGEL的DNA Plasma核酸纯化柱。

二、实验方法

按照实施例1所述的游离核酸的分离纯化步骤分离血浆样本中的游离DNA，洗脱溶液体积分别采用40μL，50μL，60μL以及100μL四个梯度。

三、用PCR法定量检测分离得到的游离DNA

其中，检测引物及探针由百利格生物合成，其序列与实施例2中所述相同。

PCR检测体系与反应程序也与实施例2相同。

四、结果与讨论

4个梯度洗脱溶液体积的定量检测结果如图3所示。其中每个柱形顶部的数值为该洗脱溶液体积下2个样本所得cfDNA拷贝数的算术平均数。

由图3可见，对于4个不同梯度体积的洗脱溶液，提取效果差别不明显，用40～100μL体积的洗脱溶液，均可达到较大样本5mL血浆中的游离核酸的提取需求。

序列表

<110> 上海臻迪基因科技有限公司

<120> 从含有游离核酸的测试样品中分离游离核酸的方法和***

<130> 20190507

<141> 2019-05-16

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttccgcaccc agcagttt 18

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtcaagatc acagattttg ggc 23

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccaggaacg tactggtg 18

Claims (10)

1.一种从含有游离核酸的测试样品中分离游离核酸的方法，其包括：

1)在所述测试样品中加入蛋白酶K和裂解-结合溶液得到待结合样品；

2)将所述待结合样品离心后加入醇类物质；

3)将上一步加入了醇类的待结合样品与固相载体接触，使所述待结合样品中的游离核酸结合到所述固相载体；

4)用一种或多种洗涤溶液洗涤所述固相载体，用于去除目标产物游离核酸以外的物质；

5)向所述固相载体加入洗脱液，用于洗脱结合于所述固相载体的游离核酸，得到目标产物游离核酸；

其特征在于，所述裂解-结合溶液的pH为酸性，且上述所有步骤在常温条件下进行。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述裂解-结合溶液与所述测试样品的体积比为0.5～2；

优选的，所述裂解-结合溶液与所述测试样品体积比为1：1；

所述裂解-结合溶液中包括离液盐和/或尿素；

优选的，所述离液盐为胍盐；

更优选的，所述胍盐为硫氰酸胍、异硫氰酸胍或盐酸胍；

和/或，所述裂解-结合溶液还包括Tris盐酸和/或TritonX-100；

和/或，所述裂解-结合溶液的pH值在3.0～5.5之间；

和/或，所述醇类物质为乙醇或异丙醇。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤3)中所述待结合样品和所述固相载体的结合是在负压条件下进行；优选的，所述负压在-300mbar到-800mbar之间；

和/或，所述步骤3)还包括对所述待结合样品中的非目标组分进行加压过滤；

优选的，所述加压过滤是手动加压过滤。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤4)中所述的洗涤溶液为多种，每种洗涤溶液的洗涤次数为一次或多次；

优选的，所述的洗涤溶液为洗涤溶液1和洗涤溶液2两种；

更优选的，所述洗涤溶液1也含有胍盐和/或Tris盐酸；

更优选的，所述洗涤溶液1为弱酸性，洗涤溶液2为弱碱性；

更优选的，所述洗涤溶液1和2中还包括无水乙醇；

和/或，洗涤所述固相载体的方法是真空抽滤和/或离心过滤。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述步骤1)还包括在所述测试样品中加入载体RNA；

和/或，在步骤1)和2)之间还包括孵育步骤；

优选的，孵育温度为50℃～70℃；

更优选的，所述孵育步骤还包括孵育后的短暂离心。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述蛋白酶K的终浓度在15mg/mL～40mg/mL之间；

和/或，所述洗脱溶液包含Tris盐酸且其pH值在7.0～9.0之间；

和/或，所述洗脱溶液与初始测试样品的体积比为1：125～1：50；

和/或，还包括对所述步骤5)得到的目标产物游离核酸进行定量；

优选的，所述定量方法为PCR法。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述游离核酸是游离DNA或游离RNA，所述测试样品是血浆样品、组织样品、尿液、体液或唾液样品；

和/或，所述固相载体是核酸吸附纯化柱；

优选的，所述核酸吸附纯化柱是硅胶膜核酸吸附纯化柱。

8.一种从含有游离核酸的测试样品中分离游离核酸的***，其特征在于，

包括适用于如权利要求1～7中任一权利要求所述的从含有游离核酸的测试样品中分离游离核酸的方法的裂解-结合溶液、洗涤溶液和洗脱溶液。

9.如权利要求8所述的***，其特征在于，

还包括用于容纳所述测试样品和试剂的储液管，内设核酸纯化柱并可与所述储液管相连的核酸纯化柱管，以及用于连接所述核酸纯化柱管与真空抽滤组件的真空适配管。

10.如权利要求9所述的***，其特征在于，

还包括以下组分的一种或多种：蛋白酶K，载体RNA；

和/或，以下组件的一种或多种：废液收集管，加压装置；

优选的，所述加压装置为与储液管内径匹配的加压柱塞；

和/或，所述储液管末端和/或真空适配管顶端设有O型密封圈，分别用于匹配所述核酸纯化柱管的顶端和末端。