CN105112400A

CN105112400A - 一种提取游离dna的试剂盒

Info

Publication number: CN105112400A
Application number: CN201510551073.4A
Authority: CN
Inventors: 杜波; 李明珍; 代东发; 胡莹; 张鑫媛
Original assignee: Zhen (beijing) Technology Co Ltd
Current assignee: Zhen (beijing) Technology Co Ltd
Priority date: 2015-08-31
Filing date: 2015-08-31
Publication date: 2015-12-02

Abstract

本发明提供了一种提取游离DNA的试剂盒，属于高通量DNA检测技术领域。本发明的一种提取游离DNA的试剂盒采取两步法磁珠吸附进行血浆或尿液中游离DNA的提取，第一步采用低浓度的异丙醇，磁珠主要吸附500bp以上的DNA大片段；第二步调高异丙醇的浓度，磁珠主要吸附500bp以下DNA小片段，从而实现两步法提取大于500bp和小于500bp两种DNA片段。本发明还提供了适用于本发明方法的标准品，其为127bp和208bp的DNA片段。本发明的试剂盒可用于产前诊断和早期肿瘤筛查，在临床医学领域具有广阔的应用前景。

Description

一种提取游离DNA的试剂盒

技术领域

本发明涉及高通量DNA检测技术领域，具体地，涉及一种提取血浆或尿液中游离DNA的试剂盒及其应用。

背景技术

游离DNA(cellfreeDNA,cfDNA)是一种无细胞状态的胞外DNA，主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA一蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在。健康人外周血也存在cfDNA，但肿瘤患者的外周血cfDNA含量与健康人外周血cfDNA相比较有显著性的增高，且肿瘤患者外周血DNA中存在基因突变、重组、缺失等。肿瘤患者外周血游离DNA主要为肿瘤细胞的坏死或凋亡、微转移灶或循环肿瘤细胞的裂解和增殖旺盛的肿瘤细胞所释放。

肿瘤基因检测最直接的对象是患者原代组织标本，但对于那些未进行过手术的肿瘤患者，肿瘤标本不易获取，而活检穿刺的技术虽已较为成熟，但患者接受度相对较低，尤其对那些已发生多处转移的患者。即便之前留有标本，但往往是几个月前甚至是几年前保存的局部标本，鉴于肿瘤基因组的动态性与异质性，它们反映的信息已经是过时的或者代表的信息不全。临床研究表明，cfDNA能良好地反映患者整体的肿瘤负荷、恶性程度、转移能力以及实时的基因突变信息，与肿瘤组织的基因信息具有较好的一致性。一项多中心研究发现，非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆中循环游离肿瘤DNA(circulating-freetumorDNA)的表皮生长因子受体(EGFR)突变和患者肿瘤组织中的DNA的突变直接相关。研究纳入了1060例EGFR突变阳性且处于不同阶段的患者，分析并对比了患者的肿瘤组织及其配对的血浆DNA，结果发现652名患者的肿瘤组织和配对血浆中的EGFR的突变状态一致，这些患者中94％的个体的检测敏感性为66％，特异性为100％。对同一患者的两份血浆进行重复性实验，结果显示重复性较高，而且突变一致性达到了97％。通过对人体外周血cfDNA突变检测已广泛应用于临床指导，cfDNA的突变情况称为肿瘤的一个标志，血浆cfDNA的筛查成为个性化疾病治疗的趋势。因而，选择cfDNA作为基因检测的样品来源，可以保证肿瘤治疗在取样信息上的全面精准，且与组织活检相比具有检查微创小、无放射性污染、经济等优点，并允许对治疗反应进行实时监测。

血浆cfDNA提取的质量是对DNA突变检测的保障，目前提取cfDNA的方法主要有酚氯仿异戊醇法，柱提法，磁珠法。传统的酚氯仿异戊醇法对血浆cfDNA的提取是将血浆中所有DNA提取出来，不能将血浆中大小片段分离，提取效率低，需借助其他手段提高其效率。柱提法提取效率高，但也不能将不同大小的DNA片段分离开。磁珠法是利用纳米级磁珠微珠表面的功能团吸附核酸，利用磁珠与溶液的体积比来对不同大小DNA进行分选，既可得到较高的回收率，又可以对cfDNA进行分选。研究提示肿瘤患者外周游离DNA片段较正常人游离DNA小，结肠癌患者血浆中80％以上的游离DNA片段均小于145bp，这提示肿瘤细胞释放的游离DNA可能小片段比例较大，因此将肿瘤患者外周游离DNA大小片段分离，对进一步基于外周循环肿瘤细胞细胞DNA监测肿瘤基因信息具有重要意义。

游离DNA检测就是对潜在的高危个体筛检、肿瘤的实时监测、预后评估、个体化用药指导有效的液态活检方法。目前，在肿瘤患者血浆和血清游离DNA中发现存在癌基因的甲基化、突变及微卫星改变等早期肿瘤细胞DNA的特征。游离DNA的检测被认为是一个潜在的肿瘤早期诊断和预后判断的有力手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、成本低廉、能够分别提取大、小DNA片段的提取游离DNA的试剂盒。

本发明所述的大、小DNA片段是指大于500bp大DNA片段和小于500bp的小DNA片段。

本发明提供的一种提取游离DNA的试剂盒，其含有磁珠、蛋白酶K、异丙醇、BindingBuffer。

本发明的试剂盒还含有标准品，所述标准品为127bp和208bp的人源DNA片段。

所述的游离DNA来自外周血或尿液。

本发明的试剂盒，其工作程序包括以下步骤：

(1)分离人类外周血血浆或提取尿液；

(2)一次结合：按照与血浆或尿液的体积比1:5-1:10加入蛋白酶K，按照与血浆或尿液的体积比1:5-1:10加入磁珠，体系中还加入BindingBuffer和异丙醇，异丙醇在整个体系中的体积比为2％-12％；振荡混匀，整个体系于55℃-60℃加热10-20min，置于磁性分离器上静置，吸取上清液于另一个容器中，收集磁珠进行洗涤、再干燥和洗脱得到纯化的500bp以上大小的大片段DNA；

(3)二次结合：将步骤(2)中的上清液中分别加入磁珠和异丙醇，其中，磁珠与上清液的体积比为1:15-1:20，异丙醇在整个体系中的体积比为40％-50％；混合均匀后于室温静置，再于磁性分离器上静置，弃上清液；洗涤磁珠，再经干燥和洗脱得到纯化的500bp以下大小的小片段DNA。

优选地，本发明的试剂盒工作程序包括以下步骤：

(1)分离人类外周血血浆或提取尿液；

(2)一次结合：按照与血浆或尿液的体积比1：5-1:6加入蛋白酶K，按照与血浆或尿液的体积比1:5-1:6加入磁珠，体系中还加入LysisBuffer和异丙醇，其中LysisBuffer与血浆或尿液的体积比为2:1-1:1，异丙醇在该体系中的体积比为4％-6％；振荡混匀，整个体系于55℃加热10-15min，置于磁性分离器上静置2min，吸取上清液于另一个容器中，收集磁珠进行洗涤、再干燥和洗脱得到纯化的500bp以上大小的大片段DNA；

(3)二次结合：将步骤(2)中的上清液中分别加入磁珠和异丙醇，其中，磁珠与上清液的体积比为1:16-17，异丙醇在整个体系中的体积比为42％-45％；混合均匀后于室温静置10min，在于磁性分离器上静置2min，弃上清液；洗涤磁珠，再干燥和洗脱得到纯化的500bp以下大小的小片段DNA。

在本发明的一个实施例中，对于上述步骤(2)中对磁珠的洗涤、干燥、洗脱方法分别为：

洗涤：(1)加入600μlWashingBufferI，用移液器缓慢吹打磁珠10次；(2)使充分磁珠重悬。室温放置0.5～1min。磁性分离，用移液器吸去上清液。重复步骤(1)一次；(3)加入800μlWashingBufferII，用移液器缓慢吹打磁珠10次，使磁珠充分重悬。室温放置0.5～1min。磁性分离，用移液器吸去上清液。(4)重复步骤(3)一次，尽量除尽洗涤液。

干燥：保持离心管于磁力架上，打开盖子风干至磁珠表面无明显光泽(3～5min)。干燥时间不宜过长，以防止磁珠干燥过度，造成核酸难以洗脱。

洗脱：加入50μlElutionBuffer。将离心管置于55℃加热10min(期间颠倒混匀一次)。磁性分离，将上清液移至新的离心管，即为纯化得到的游离DNA。

进一步地，本发明提供了一种从人类外周血或尿液中提取大于500bp游离DNA的试剂盒，其工作程序为：

(1)分离人类外周血血浆或提取尿液；

(2)一次结合：按照与血浆或尿液的体积比1：5-10加入蛋白酶K，按照与血浆或尿液的体积比1:5-10加入磁珠，体系中还加入BindingBuffer和异丙醇，异丙醇在该体系中的体积比为2％-12％，优选4％-6％；振荡混匀，整个体系于55℃加热10-15min，置于磁性分离器上静置2min，吸取上清液于另一个容器中，收集磁珠进行洗涤、再干燥和洗脱得到纯化的500bp以上大小的大片段DNA。

本发明提供了一种提取血浆或尿液中游离DNA的方法，包括以下步骤：

(1)分离人类外周血血浆或提取尿液；

本发明还提供了异丙醇在提取血浆或尿液中游离DNA中的应用。

具体地，所述的应用包括以下步骤：

(1)分离人类外周血血浆或提取尿液；

本发明提供了一种标准品在检测本发明上述试剂盒或本发明提取血浆或尿液中游离DNA方法的回收效率中的应用，所述标准品为127bp和208bp的人源DNA片段。

本发明提供了上述试剂盒或上述方法在制备产前诊断试剂盒中的用途。

本发明提供了上述试剂盒或上述方法在制备肿瘤早期筛查试剂盒中的用途。

本发明的提取游离DNA的试剂盒具有以下优点及有益效果：

(1)能够提取到大于500bp的游离DNA和小于500bp的游离DNA，回收率高，达60％-70％。

(2)本发明方法操作简单，通过调节异丙醇在体系中的浓度就能实现大、小片段DNA的准确提取，为无创产前诊断、疾病早期筛查和预后监控提供了重要技术手段。

附图说明

图1为1188bpDNA片段PCR扩增电泳图，泳道1为提取前样本PCR产物电泳图；泳道2为一次结合后回收DNA大片段样本PCR产物电泳图；泳道3为1kbDNAladder；泳道4为一次结合后剩余部分样本PCR产物电泳图。

图2为不同浓度异丙醇提取大片段游离DNA的回收DNA浓度测定图。

图3为标准品不同浓度下，一次结合后DNA回收量结果图。

图4为二次结合后DNA片段2100分析。

图5为标准品不同浓度下，二次结合后DNA回收量结果图。

图6为标准品不同浓度下，二次结合后DNA回收率。

图7为本发明试剂盒提取肿瘤患者血浆游离DNA的回收量。

图8为2100分析恶性肿瘤患者外周血游离DNA(二次结合后DNA回收片段)。

图9为2100分析恶性肿瘤患者尿液游离DNA(二次结合后DNA回收片段)。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。

本发明所用的试剂配制如下：

BindingBuffer配制:318.4gGuHCl(3.3mol/L),43.8NaCl(0.75mol/L),4.2gSDS(0.014mol/L)，70gTritonX-100(0.11mol/L)，加入800ml超纯水，加入5ml(1.28mol/L)EDTA，50ml(1mol/LTris-HCl)，加超纯水至1L。

1.28mol/LEDTA的配制:称取18.61gEDTA至50mL烧杯中，并加入40mL超纯水。将烧杯置于磁力搅拌器上，一边搅拌一边加入NaOH固体直至溶液变澄清。然后将EDTA溶液转移至50mL量筒中，加入纯化水至总体积为50mL,将pH调至8.0。

1mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液配制:称取12.11gTris至100mL烧杯中，并加入80mL超纯水使其完全溶解。然后用PB-21型pH计测定pH，并用浓盐酸进行pH的调节。最后将溶液转移至100mL容量瓶中，继续加入纯化水至总体积为100mL。

WashingBufferI配制：60gGuHCl(0.63mol/L),26.3gNaCl(0.45mol/L),10gTween20(8.2mmol/L)加超纯水至1L。

WashingBufferII配制:121.1gTris(1mol/L),加入600ml超纯水，加入26％无水乙醇(260ml)，用浓盐酸将溶液pH的调节至8.0，加超纯水至1L。

ElutionBuffer配制:1.2gTris(0.01mol/L),加入800ml超纯水，完全溶解后，滴加浓盐酸调节pH至8.0。

实施例1一种提取血浆中大片段游离DNA(大于500bp)的方法

采用不同异丙醇体积浓度梯度(2％,4.5％，7％，9.5％，12％)，采用一步法磁珠结合提取游离DNA大片段。

实验体系(100l血浆+230μl检测试剂)，检测试剂包括蛋白酶K、磁珠、异丙醇和BindingBuffer。血浆为：在健康人血浆中掺入已知浓度的127bp和208bp的DNA片段，以两种片段为标准品，片段大小的选择模拟血浆中cfDNA的大小(140-150bp)，掺入DNA片段的终浓度为0ng/ml、7.5ng/ml、15ng/ml、30ng/ml、60ng/ml、120ng/ml。每个样本做3个平行。

提取大片段DNA(＞500bp)的具体方法为：

(1)每管100μl血浆中分别加入10μl的蛋白酶K，20μl的磁珠、(6.6μl异丙醇和193.6μlBindingBuffer；15μl的异丙醇和185μl的BindingBuffer；31.5μl异丙醇和168.5μlBindingBuffer；23μl异丙醇和177μlBindingBuffer；39.6μl异丙醇和160.4μlBindingBuffer)；漩涡振荡混合均匀。将离心管置于55℃加热10min(期间需颠倒混匀一次)。将离心管置于磁性分离器上静置2min，用移液器吸取上清液至另一个新的1.5ml离心管中，收集磁珠进行洗涤。

(2)加入600μlWashingBufferI，用移液器缓慢吹打磁珠10次，使充分磁珠重悬。室温放置0.5～1min。磁性分离，用移液器吸去上清液。

(3)重复步骤(2)一次。

(4)加入800μlWashingBufferII，用移液器缓慢吹打磁珠10次，使磁珠充分重悬。室温放置0.5～1min。磁性分离，用移液器吸去上清液。

(5)干燥：保持离心管于磁力架上，打开盖子风干至磁珠表面无明显光泽(3～5min)。干燥时间不宜过长，以防止磁珠干燥过度，造成核酸难以洗脱。

(6)洗脱：加入50μlElutionBuffer。将离心管置于55℃加热10min(期间颠倒混匀一次)。磁性分离，将上清液移至新的离心管，即为纯化得到的游离大片段DNA。

结果验证：PCR扩增1188bpDNA电泳图如图1所示，分别将DNA提取前的血浆样本，本实施例一次结合后从磁珠上回收的DNA样本，一次结合后上清液中剩余部分样本进行PCR扩增1188bp片段，引物序列(上游引物：5’-TTCACTGCAATCTTTCGAGGC-3’，下游引物：5’-GTCAGAATTTGAGTTCGTATT-3’)电泳图可见提取前及一次结合回收后的样本均可扩增得到1188bp产物，而一次结合后上清液中剩余部分样本扩增产物电泳未显示明确的1188bp片段，这提示一次结合后回收的DNA片段为大片段(大于500bp)，剩余样本为小片段。

不同异丙醇浓度(2％,4.5％，7％，9.5％，12％)提取DNA大片段定量结果，见图2。结果说明，异丙醇体积浓度为2％-12％范围内，均能实现较高效率的回收大片段DNA。

对上述一次结合后的磁珠进行漂洗和洗脱，并进行Qubit定量。最后通过Qubit检测提取出的DNA的浓度，以计算回收率。结果见图3。

实施例2一种提取血浆中小片段游离DNA(小于500bp)的方法

1、二次结合参照实施例1记载的方法(即一次结合法)，将实施例1中的步骤(1)获得的上清液中加入分别加入(20μl的磁珠和189μl的异丙醇；20μl的磁珠和230μl的异丙醇；20μl的磁珠和286μl的异丙醇；20μl的磁珠和350μl的异丙醇，20μl的磁珠和428μl的异丙醇)漩涡振荡混合均匀，异丙醇体积浓度分别为36％、41％、46％、51％、56％。将离心管于室温静置10min。将离心管置于磁性分离器上静置2min，用移液器吸去上清液。

2、洗涤(1)加入600μlWashingBufferI，用移液器缓慢吹打磁珠10次，使充分磁珠重悬。室温放置0.5～1min。磁性分离，用移液器吸去上清液。(2)重复洗涤步骤(1)一次。(3)加入800μlWashingBufferII，用移液器缓慢吹打磁珠10次，使磁珠充分重悬。室温放置0.5～1min。磁性分离，用移液器吸去上清液。(4)重复步骤(3)一次，尽量除尽洗涤液。

3、干燥保持离心管于磁力架上，打开盖子风干至磁珠表面无明显光泽(3～5min)。干燥时间不宜过长，以防止磁珠干燥过度，造成核酸难以洗脱。

4、洗脱加入50μlElutionBuffer。将离心管置于55℃加热10min(期间颠倒混匀一次)。磁性分离，将上清液移至新的离心管，即为纯化得到的游离DNA。

将实施例2分别获得的DNA片段按照AgilentHighSensitivityDNAAssay试剂盒步骤进行样本预处理，采用2100生物分析仪检测样本DNA片段大小及浓度，结果见图4，二次结合后回收的游离DNA片段大小在500bp以下。

对上述二次结合后的磁珠进行漂洗和洗脱，并进行Qubit定量。最后通过Qubit检测提取出的DNA的浓度，以计算回收量和回收率。结果见图5、图6，二次结合后DNA回收率较好，均在60％以上。

实施例3提取游离DNA的试剂盒的组装与应用

本发明试剂盒含有磁珠、蛋白酶K、异丙醇、BindingBuffer、标准品以及其他常用的磁珠洗涤、洗脱用试剂。

根据实施例1、2的记载，本发明试剂盒的工作程序如下：

1、分离人外周血血浆或尿液。

2、一次结合、磁珠的洗涤、干燥和洗脱以及DNA的提取。

在100μl血浆中，分别加入10μl的蛋白酶K、185μl的BindingBuffer、15μl的异丙醇和20μl的磁珠，漩涡振荡混合均匀。将离心管置于55℃加热10min(期间需颠倒混匀一次)。将离心管置于磁性分离器上静置2min，用移液器吸取上清液至另一个新的1.5ml离心管中，收集磁珠进行洗涤(使用自备的800μl80％乙醇对磁珠洗涤两次后，再按照实施例1的步骤(5)、(6)对其进行干燥和洗脱，得到纯化的500bp以上的大片段DNA。

3、二次结合、磁珠的洗涤、干燥和洗脱以及DNA的提取

在上述步骤中吸取的上清液中，分别加入20μl的磁珠和230μl的异丙醇，漩涡振荡混合均匀。将离心管于室温静置10min,将离心管置于磁性分离器上静置2min，用移液器吸去上清液。参照实施例2的步骤2、3、4的方法对磁珠进行洗涤、干燥和洗脱，得到纯化的500bp以下的小片段DNA。

实施例4本发明试剂盒提取外周血游离DNA的应用

采用本发明实施例3的游离DNA提取试剂盒提取恶性肿瘤患者外周血游离DNA。在签署知情同意书及满足纳入条件前提下，选择恶性肿瘤患者，记录基本临床资料，留取外周血5ml。分离肿瘤患者血浆2000rpm，10min，25℃。分离2-2.5ml血浆；取100μl。

按照实施例3的试剂盒的工作程序，对临床分离的肿瘤患者血浆进行游离DNA的提取。

分别对一次结合后、二次结合后获得的游离DNA进行分析。按照AgilentHighSensitivityDNAAssay试剂盒步骤进行样本预处理，采用2100生物分析仪检测样本DNA片段大小及浓度，回收量见图7，结果表明采用两步法磁珠分离回收到的大部分恶性肿瘤患者的外周血游离DNA大小约在150bp～200bp左右(结果见图8)。

实施例5本发明试剂盒提取尿液中游离DNA的应用

采用游离DNA提取试剂盒提取恶性肿瘤患者尿液游离DNA。在签署知情同意书及满足纳入条件前提下，选择恶性肿瘤患者，记录基本临床资料，留取尿液50ml。

将尿液进行分装，每10ml尿液与6M硫氰酸胍，颠倒8次混匀，加入1ml的树脂，拧紧样品盖，室温震荡过夜，将管放置到试管架上，静置，确保树脂沉淀下来，采用过滤器洗脱树脂上的液体，之后按照实施例3的试剂盒的工作程序，对临床分离的肿瘤患者尿液进行游离DNA的提取。分别对一次结合后、二次结合后获得的游离DNA进行分析。按照AgilentHighSensitivityDNAAssay试剂盒步骤进行样本预处理，采用2100生物分析仪检测样本DNA片段大小及浓度，结果表明采用两步法磁珠分离回收到的大部分恶性肿瘤患者的尿液游离DNA大小约在150bp～200bp左右，结果见图9。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种提取游离DNA的试剂盒，其特征在于，含有磁珠、蛋白酶K、异丙醇、BindingBuffer。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其还含有标准品，所述标准品为127bp和208bp的人源DNA片段。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的游离DNA来自外周血或尿液。

4.如权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序包括以下步骤：

(1)分离人类外周血血浆或提取尿液；

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序包括以下步骤：

(1)分离人类外周血血浆或提取尿液；

(2)一次结合：按照与血浆或尿液的体积比1：5-1:6加入蛋白酶K，按照与血浆或尿液的体积比1:5-1:6加入磁珠，体系中还加入BindingBuffer和异丙醇，其中BindingBuffer与血浆或尿液的体积比为2:1-1:1，异丙醇在该体系中的体积比为4％-6％；振荡混匀，整个体系于55℃加热10-15min，置于磁性分离器上静置2min，吸取上清液于另一个容器中，收集磁珠进行洗涤、再干燥和洗脱得到纯化的500bp以上大小的大片段DNA；

6.一种提取血浆或尿液中游离DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分离人类外周血血浆或提取尿液；

(2)一次结合：按照与血浆或尿液的体积比1:5-1:10加入蛋白酶K，按照与血浆或尿液的体积比1:5-1:10加入磁珠，体系中还加入BindingBuffer和异丙醇，异丙醇在整个体系中的体积比为2％-12％；振荡混匀，整个体系于55℃-60℃加热20-30min，置于磁性分离器上静置，吸取上清液于另一个容器中，收集磁珠进行洗涤、再干燥和洗脱得到纯化的500bp以上大小的大片段DNA；

7.异丙醇在提取血浆或尿液中游离DNA中的应用。

8.一种标准品在检测权利要求1-5任一所述试剂盒或权利要求6所述方法的回收效率中的应用，所述标准品为127bp和208bp的人源DNA片段。

9.权利要求1-5任一所述的试剂盒或权利要求6所述的方法在制备产前诊断试剂盒中的用途。

10.权利要求1-5任一所述的试剂盒或权利要求6所述的方法在制备肿瘤早期筛查试剂盒中的用途。